CN110160974A

CN110160974A - 一种检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒

Info

Publication number: CN110160974A
Application number: CN201910451956.6A
Authority: CN
Inventors: 张海军; 董海静; 王甜甜
Original assignee: Tianjin Your Health Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Your Health Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2019-08-23

Abstract

本发明公开了一种检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1：缓冲液I0.1～200mmol/l、防腐剂0.1～1ml/l、胆固醇酯酶1000～2000U/l、胆固醇氧化酶500～1000U/l、表面活性剂I0.1～100g/l、磷酸酯酶1000～3000U/l、显色剂0.1～3mmol/l；所述试剂R2：缓冲液II0.1～200mmol/l、防腐剂0.1～1ml/l、表面活性剂II0.1～100g/l、过氧化物酶2000～5000U/l、4‑氨基安替比林0.1～5mmol/l。本发明过氧化物酶法测定基于特殊的表面活性剂、酶、特定的脂蛋白反应，样本无需处理，直接用于全自动生化分析仪检测，可以同时检测人血清或血浆样本，操作简便，提高了检测效率，降低了检测成本。

Description

一种检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒

技术领域

本发明涉及检测脂蛋白胆固醇试剂盒，尤其是一种检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒。

背景技术

人体血浆中胆固醇的存在和运输形式为血浆脂蛋白，即非极性的脂类包括胆固醇和亲水性的载脂蛋白结合。血浆脂蛋白按照密度不同主要可分为四种：高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL)和乳糜微粒(CM)。低密度脂蛋白(LDL)是一种运载胆固醇进入外周组织细胞的脂蛋白颗粒，其主要功能是把胆固醇运输到全身各处细胞，运输到肝脏合成胆酸。可根据其颗粒大小以及致密度的不同分型，分别为A、B两型：A型为较大颗粒，即过去通常说的LDL颗粒；B型主要右较小颗粒组成，相比粒子较小，是高密度的LDL。小而密低密度脂蛋白胆固醇(sd LDL)就指是通常的低密度脂蛋白胆固醇LDL(Large LDL)颗粒较小密度较大的亚组份。

相对于低密度脂蛋白胆固醇(LDL)来说，小而密低密度脂蛋白胆固醇(sd LDL)有如下特征：与LDL-C受体的亲和力更低，血浆半衰期更长，清除缓慢；体积小，因而对动脉内膜的穿透力更强；更容易被氧化而被巨噬细胞摄取形成泡沫细胞，沉积在血管内壁上。

低密度脂蛋白胆固醇(LDL)是冠心病发生的一个风险因子，并且在冠心病的发展过程中起到重要作用。而小而密低密度脂蛋白胆固醇(sd LDL)作为LDL的主要组分，相对与大而轻低密度脂蛋白(L LDL)而言，由于其对血管壁的高侵入性，与LDL受体的低亲和性、更长的血浆半衰期且对于氧化应激的低耐受性，导致小而密低密度脂蛋白胆固醇(sd LDL)更容易致动脉粥样硬化。最近有研究表明，小而密低密度脂蛋白胆固醇(sd LDL)是冠心病的一个独立风险因子。

目前检测小而密低密度脂蛋白胆固醇(sd LDL)方法包括：

1.传统方法：主要包括超速离心法、梯度凝胶电泳法、高效液相色谱法等，但由于操作较繁琐、分辨率和特异性均不高等缺点，并不适用于大批量样本的临床常规检测。

2.非匀相测定法：主要包括肝素镁沉淀法和肝素锰沉淀法，原理是通过选择性沉淀lbLDL、中间密度脂蛋白和极低密度脂蛋白，收集含sdLDL和高密度脂蛋白的上清液，再测定上清液中LDL－C含量，从而实现对sdLDL－C的定量检测。该方法不需特殊仪器设备，较LDL亚组分传统检测方法简便；但存在预先沉淀处理容易产生不完全沉淀的缺点，易造成最终测定结果的不准确；且不适用于全自动生化分析仪，因此，研发一种完全自动化的sdLDL－C检测方法成为近年来LDL亚组分研究的热点之一。

3.匀相法：该检测技术实现了对样品的直接测定，满足了全自动生化分析仪对样品检测的要求。聚氧乙烯苄基苯基醚衍生物可选择性地与富含三酰甘油脂蛋白的HDL反应，而神经鞘磷脂酶可与lbLDL反应，由此产生的胆固醇酯可进一步被胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和氧化氢酶分解；聚氧乙烯苯乙烯苯基醚衍生物则可保护sdLDL不与上述酶类反应，并选择性地被聚氧乙烯烷基醚分解，产生的胆固醇酯与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶反应。该原理实现了临床sdLDL－C检测的完全自动化，该法与LDL亚组分传统检测方法具有良好的相关性，准确度高、稳定性强，从而为临床sdLDL－C检测的推广与应用提供了基石。

4.过氧化物酶法：本测定基于特殊的表面活性剂和酶，进而选择性与特定的脂蛋白反应，样本无需处理，正确度高，精密度好，直接用于全自动生化分析仪检测，操作简便等优点。由此，sdLDL－C的检测将进一步在临床被推广与应用，有望带动动脉硬化性心血管疾病(ASCVD)防控和危险评估领域的新发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，所述试剂盒基于过氧化物酶法的反应方法，能够直接检测样品中小而密低密度脂蛋白胆固醇的含量。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：本发明的检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；

所述试剂R1组分及浓度如下：

所述试剂R2组分及浓度：

所述缓冲液I与所述缓冲液II均为PIPES，MOPS，HEPES中至少一种，所述缓冲液I和所述缓冲液II的PH值均为6.0-8.0。

所述试剂R1中表面活性剂I为PEG2000，PEG6000，PEG8000，吐温20，吐温40，吐温60，吐温80中至少一种；试剂R2中表面活性剂为B-66，PEGME，曲拉通100中至少一种。

所述防腐剂为叠氮钠和Proclin300中至少一种。

所述显色剂为苯酚、N-乙基-N-(2-羟基-3-黄丙基)-3-甲基苯胺钠盐和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐中至少一种。

上述的试剂盒在检测小而密低密度脂蛋白胆固醇含量的应用。

本发明的有益效果是：能够使用全自动生化分析仪直接测定血清小而密低密度脂蛋白胆固醇容量,适合临床和实验室对小而密低密度脂蛋白胆固醇含量测定的需要。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；

所述试剂R1组分及浓度如下：

所述试剂R2组分及浓度：

所述防腐剂为叠氮钠和Proclin300中至少一种。

所述的试剂盒中，所述胆固醇酯酶的1个酶活力单位指的是：在37℃、30℃，pH8.0条件下，每分钟水解1μmol胆固醇酯的酶活定义为1U；

所述胆固醇氧化酶的1个酶活力单位指的是：在37℃、pH7.0条件下，每分钟生成1μmol过氧化氢的酶活定义为1U；

所述过氧化物酶的1个酶活力单位指的是：在37℃、20℃，pH7.0条件下，20s内生成1mg红紫棓精定义为1U。

所述过磷酸酯酶的1个酶活力单位指的是：以0.5mmol/L对-硝基苯磷酸二钠为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1mol对硝基苯酚的酶量定义为1U。

一种小而密低密度脂蛋白胆固醇含量的检测方法，包括如下步骤：将待测样品与上述的试剂盒组分混合，反应，检测，即得到所述待测样品中小而密低密度脂蛋白胆固醇的含量。

所述待测样品为血清或血浆中的至少一种。

本发明用于测定血清小而密低密度脂蛋白胆固醇时,应使用全自动生化分析仪，试剂与样本比例为R1:R2:样本＝150μl：30μl：3μl。在主波长600nm副波长700nm，水浴37℃条件下，先将R1与样本混合反应5分钟，测定吸光度A，再加入R2，混匀后反应5分钟测得吸光度B，可以计算出使用R1和R2测得的吸光度差值ΔA＝B-A，与校准品吸光度差值进行比对即可测得所测样本中sd-ldl的浓度。

本发明产品的性能要求:试剂空白：A600nm(主)/700nm(副)下测定空白吸光度≤0.05。精密度：变异系数(CV％)不大于10％。线性：在[0.104，2.59]mmol/L([4.0，100.0]mg/dL)范围内，线性相关系数r≥0.990,在[0.104，0.777]mmol/L([4.0，30.0]mg/dL)范围内测定的线性偏差应不超过±0.0777mmol/L(±3mg/dL)，在(0.777，2.59]mmol/L((30，100.0]mg/dL)范围内测定的线性偏差应不超过±10％。灵敏度：样本浓度为2.59mmol/L(100.0mg/dL)时，其吸光度变化在0.0500～0.2500之间。

下面结合实施例对本发明进行详细描述

实施例1

本发明试剂盒的R1和R2试剂按下述成分和含量配置:R1试剂各成分浓度为

所述的R2试剂各成分浓度为:

使用全自动生化分析仪，测定方法采用点法,试剂与样本比例为R1:R2:样本＝150μl：30μl：3μl。在主波长600nm副波长700nm，水浴37℃条件下，先将R1与样本混合反应5分钟，测定吸光度A，再加入R2，混匀后反应5分钟测得吸光度B，可以计算出使用R1和R2测得的吸光度差值ΔA＝B-A，与校准品吸光度差值进行比对即可测得所测样本中sd-ldl的浓度。

重复测10次取平均值,实测结果如下:平均值为1.44mmol/L,精密度为1.24％,小于10％。试剂空白：0.0048。线性：r为0.9993,在[0.104，0.777]mmol/L([4.0，30.0]mg/dL)范围内测定的线性偏差最大0.0424mmol/L，在(0.777，2.59]mmol/L((30，100.0]mg/dL)范围内测定的线性偏差最大5.1％。灵敏度：样本浓度为2.59mmol/L(100.0mg/dL)时，其吸光度变化为0.1262。所有结果符合要求。

实施例2

所述的R2试剂各成分浓度为:

重复测10次取平均值,实测结果如下:平均值为1.46mmol/L,精密度为1.22％,小于10％。试剂空白：0.0052。线性：r为0.9996,在[0.104，0.777]mmol/L([4.0，30.0]mg/dL)范围内测定的线性偏差最大0.0451mmol/L，在(0.777，2.59]mmol/L((30，100.0]mg/dL)范围内测定的线性偏差最大3.9％。灵敏度：样本浓度为2.59mmol/L(100.0mg/dL)时，其吸光度变化为0.1283。所有结果符合要求。

实施例3

所述的R2试剂各成分浓度为:

重复测10次取平均值,实测结果如下:平均值为1.39mmol/L,精密度为1.54％,小于10％。试剂空白：0.0042。线性：r为0.9991,在[0.104，0.777]mmol/L([4.0，30.0]mg/dL)范围内测定的线性偏差最大0.0466mmol/L，在(0.777，2.59]mmol/L((30，100.0]mg/dL)范围内测定的线性偏差最大5.1％。灵敏度：样本浓度为2.59mmol/L(100.0mg/dL)时，其吸光度变化为0.1301。所有结果符合要求。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims

1.一种检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；

所述试剂R1组分及浓度如下：

所述试剂R2组分及浓度：

2.根据权利要求1所述检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液I与所述缓冲液II均为PIPES，MOPS，HEPES中至少一种，所述缓冲液I和所述缓冲液II的PH值均为6.0-8.0。

3.根据权利要求1所述检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中表面活性剂I为PEG2000，PEG6000，PEG8000，吐温20，吐温40，吐温60，吐温80中至少一种；试剂R2中表面活性剂为B-66，PEGME，曲拉通100中至少一种。

4.根据权利要求1所述检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠和Proclin300中至少一种。

5.根据权利要求1所述检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，所述显色剂为苯酚、N-乙基-N-(2-羟基-3-黄丙基)-3-甲基苯胺钠盐和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐中至少一种。

6.权利要求1-5中任何一项所述的试剂盒在检测小而密低密度脂蛋白胆固醇含量的应用。