CN108424952A - 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述试剂盒为液体双试剂，由试剂R1和试剂R2组成；所述试剂R2由以下组分组成：浓度为0.1‑1.0mol/L的缓冲液，浓度为100‑200U/L的过氧化物酶，浓度为1.0‑2.5mol/L的4‑氨基安替比林，浓度为40‑60.0mmol/L的曲拉通，浓度为2.5‑5ml/L的稳定剂。本发明所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，试剂R1和试剂R2中均含有稳定剂，可以显著延长小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂的开瓶稳定性和效期稳定性，且试剂的准确度高，灵敏高，批间精密度好，能满足临床检验需要。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。
背景技术
血浆脂蛋白分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白(CVLDL)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)4类，脂蛋白在人体内主要起运输作用，将胆固醇传递到机体各组织器官发挥其相应的生理更能。临床上将低密度脂蛋白胆固醇作为血脂异常诊疗中的常规检测项目，Austin等将低密度脂蛋白胆固醇根据密度分为2个亚型，颗粒较大、密度接近1.02g/mL的A型，和颗粒较小、密度接近1.06g/mL的B型，即为小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)。临床研究表明小而密低密度脂蛋白胆固醇水平高者发生心肌梗死的危险性增加3倍，sdLDL-C最为冠心病的危险性因子，其风险评估水平优于传统的危险因素指标，如三酰甘油、LDL-C和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。National Cholesterol Education Program,将sdLDL-C列入新发现的重要心血管病危险因素之一。
目前已有的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒一般有效期时间短，开瓶稳定性差，这极大地造成了医疗资源的浪费。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，以延长小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的有效时间，增强稳定性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述试剂盒为液体双试剂，由试剂R1和试剂R2组成；所述试剂R1由以下组分组成：浓度为0.1-1.0mol/L的缓冲液，浓度为100-300U/L的过氧化氢酶，浓度为1-5mmol/L的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)，浓度500-2000U/L的胆固醇酯酶，浓度为500-1600U/L的胆固醇氧化酶，浓度为50-100KU/L的磷脂酶，浓度为0.3-1.5g/L的聚乙二醇3-苄基苯基醚，浓度为0.5-1.5g/L的聚氧乙烯苄基苯乙烯醚，浓度为2.5-5ml/L的稳定剂；所述试剂R2由以下组分组成：浓度为0.1-1.0mol/L的缓冲液，浓度为100-200U/L的过氧化物酶，浓度为1.0-2.5mol/L的4-氨基安替比林，浓度为40-60.0mmol/L的曲拉通，浓度为2.5-5ml/L的稳定剂。
进一步的，所述缓冲液为3-(N-吗啉代)丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-乙烷磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液或N-氨基甲酰甲基乙磺酸缓冲液中的一种。
进一步的，所述缓冲液的pH值为7.0-7.4。
进一步的，所述磷脂酶为鞘磷脂酶,lb-LDL颗粒表面存在着大量的磷脂质，鞘磷脂酶能优先分解lb-LDL，从而剩余sd-LDL。
一种上述的稳定剂，其由以下组分组成：葡聚糖、二氯乙酰氨、二硫苏糖醇、苯酚和丙三醇。
进一步的，所述葡聚糖的浓度为0.25-0.5％,二氯乙酰胺的浓度为0.5-2.0％，二硫苏糖醇的浓度为0.5-2.0g/L，苯酚的浓度为0.1-0.5mol/L,丙三醇的浓度为1-10ml/L。
相对于现有技术，本发明所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒具有以下优势：
本发明所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒为液体双试剂，由试剂R1和试剂R2组成，其中剂R1和试剂R2中均含有稳定剂，可以显著延长小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂的开瓶稳定性和效期稳定性，使小而密低密度脂蛋白胆固醇试剂的有效期延长至18个月，开瓶稳定性延长至2个月，且试剂的准确度高，灵敏高，批间精密度好，能满足临床检验需要。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的线性检测关系图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
本发明所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的检测原理为：
使用聚乙二醇3-苄基苯基醚，聚氧乙烯苄基苯乙烯醚，分别作为表面活性剂和保护剂，以及磷脂酶，选择性地将高密度脂蛋白(HDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)及乳糜微粒(CM)解离，磷脂酶分解表面富含磷脂质的lbLDL，保护剂保护sdLDL组分不与磷脂酶、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶反应，使sdLDL完整保留下来。HDL、VLDL、CM被解离后释放出来的胆固醇酯被胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶分解掉，使其不参与显色反应，lbLDL被磷脂酶分解。剩余的sdLDL通过表面活性剂B解除保护，参与完整的Trinder反应进行显色测定sdLDL-C，其中检测试剂中均含有稳定剂，可以显著延长小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂的开瓶稳定性和效期稳定性。
本发明所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述试剂盒为液体双试剂，由试剂R1和试剂R2组成；所述试剂R1由以下组分组成：浓度为0.1-1.0mol/L的缓冲液，浓度为100-300U/L的过氧化氢酶，浓度为1-5mmol/L的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)，浓度500-2000U/L的胆固醇酯酶，浓度为500-1600U/L的胆固醇氧化酶，浓度为50-100KU/L的磷脂酶，浓度为0.3-1.5g/L的聚乙二醇3-苄基苯基醚，浓度为0.5-1.5g/L的聚氧乙烯苄基苯乙烯醚，浓度为2.5-5ml/L的稳定剂；所述试剂R2由以下组分组成：浓度为0.1-1.0mol/L的缓冲液，浓度为100-200U/L的过氧化物酶，浓度为1.0-2.5mol/L的4-氨基安替比林，浓度为40-60.0mmol/L的曲拉通，浓度为2.5-5ml/L的稳定剂。
所述缓冲液为3-(N-吗啉代)丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-乙烷磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液或N-氨基甲酰甲基乙磺酸缓冲液中的一种；所述缓冲液的pH值为7.0-7.4；所述磷脂酶为鞘磷脂酶,lb-LDL颗粒表面存在着大量的磷脂质，鞘磷脂酶能优先分解lb-LDL，从而剩余sd-LDL。
一种上述的稳定剂，其由以下组分组成：葡聚糖、二氯乙酰氨、二硫苏糖醇、苯酚和丙三醇。
所述葡聚糖的浓度为0.25-0.5％,二氯乙酰胺的浓度为0.5-2.0％，二硫苏糖醇的浓度为0.5-2.0g/L，苯酚的浓度为0.1-0.5mol/L,丙三醇的浓度为1-10ml/L。
本发明所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的使用方法为：
1)检测仪器：37℃恒温装置的生化分析仪。
2)待测样本：空腹采集，新鲜不溶血血清，样本采集后应尽快分析，样本对热敏感，如未能及时检测应置于-20℃保存，最长可达30天，不能反复冻融。
3)基本参数：
4)检测方法：
5)计算结果：sdLDL-C(mmol/L)＝ΔAT/ΔAS×Cs
其中，ΔAT为样品管吸光度；ΔAS为校准管吸光度；Cs为校准品浓度值。
实施例1
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的液体双试剂具体成分如下：
1)准确度测定。
用同一质控品(LEVEL 1和LEVEL 2)重复测定3次，取平均值，与质控品靶值相对偏差应控制在10％范围内，质控品靶值检测结果见表1；不加稳定剂的对比试剂与本发明所述的检测试剂盒试剂开瓶2个月的检测结果见表2；不加稳定剂的对比试剂本发明所述的检测试剂盒试剂18个月的检测结果见表3。
表1质控品靶值检测结果
| 质控品 | 靶值(mmol/L) | 范围(mmol/L) |
| LEVEL1 | 0.8 | 0.72-0.88 |
| LEVEL2 | 2.01 | 1.809-2.211 |
表2开瓶2个月准确度检测结果
表3 18个月准确度检测结果
表2中的结果显示对比试剂仅在1个月内表现出良好的测定结果，在开瓶2个月时测定值偏离靶值幅度较大，而本发明所述的试剂盒的试剂在开瓶2个月，对同一质控测定3次，相对偏差均小于5％，表明本发明所述的试剂盒试剂在开瓶后期非常稳定，准确性良好，上机稳定性高。
表3中的结果显示对比试剂仅在1年内表现出良好的测定结果，在18个月时测定值偏离靶值幅度较大，而本发明试剂在18个月，对同一质控测定3次，相对偏差均小于5％，表明试剂在开瓶后期非常稳定，准确性良好，效期能达到18个月。
2)精密度检测，精密度检测结果见表4。
表4精密度检测结果
| 样本号 | 检测结果 |
| 1 | 1.23 |
| 2 | 1.23 |
| 3 | 1.24 |
| 4 | 1.25 |
| 5 | 1.23 |
| 6 | 1.24 |
| 7 | 1.25 |
| 8 | 1.24 |
| 9 | 1.23 |
| 10 | 1.25 |
| 11 | 1.23 |
| 12 | 1.23 |
| 13 | 1.24 |
| 14 | 1.23 |
| 15 | 1.23 |
| 16 | 1.24 |
| 17 | 1.24 |
| 18 | 1.23 |
| 19 | 1.24 |
| 20 | 1.25 |
| 平均值 | 1.24 |
| CV％ | 0.62％ |
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。表4中的结果显示，本发明试剂盒试剂在18个月后对同一样本连续检测20次，相对偏差达到0.62％，小于5％，表明本发明试剂具有良好的稳定性。
3)线性测定。
使用去离子水将试剂稀释成6个梯度浓度，每个梯度浓度检测3次，取平均值，对测定值与预期值作回归分析，计算r值和相对偏差，结果见图1，通过图1得到线性方程为：y＝1.0619x-0.0229，结果表明本试剂盒试剂相关性良好。
实施例2
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的液体双试剂具体成分如下：
与实施例1的方法相同，对上述试剂做准确度、精密度和线性范围试验，结果表明，准确度、精密度和线性范围与实例1所述试剂的数据间的差异在正产的误差范围内。
实施例3
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的液体双试剂具体成分如下：
表5为上述试剂做的空白吸光度检测试验结果。
表5空白吸光度检测结果
表5空白吸光度检测结果显示，不添加二硫苏糖醇的对比试剂在开瓶1个月时空白吸光度明显增大，本实施例所述试剂盒试剂的空白吸光度在开瓶1个月后≤0.20，本实施例所述试剂盒试剂中一定比例的二硫苏糖醇起到了保护酶的作用，二硫苏糖醇作为还原剂能保护试剂中4-氨基安替比邻被氧化而导致空白增大。
由以上实施例可知，本发明所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，可以显著延长小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂的开瓶稳定性和效期稳定性，且试剂的准确度高，灵敏高，批间精密度好，能满足临床检验需要。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为液体双试剂，由试剂R1和试剂R2组成；
所述试剂R1由以下组分组成：浓度为0.1-1.0mol/L的缓冲液，浓度为100-300U/L的过氧化氢酶，浓度为1-5mmol/L的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)，浓度500-2000U/L的胆固醇酯酶，浓度为500-1600U/L的胆固醇氧化酶，浓度为50-100KU/L的磷脂酶，浓度为0.3-1.5g/L的聚乙二醇3-苄基苯基醚，浓度为0.5-1.5g/L的聚氧乙烯苄基苯乙烯醚，浓度为2.5-5ml/L的稳定剂；
所述试剂R2由以下组分组成：浓度为0.1-1.0mol/L的缓冲液，浓度为100-200U/L的过氧化物酶，浓度为1.0-2.5mol/L的4-氨基安替比林，浓度为40-60.0mmol/L的曲拉通，浓度为2.5-5ml/L的稳定剂。
2.根据权利要求1所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为3-(N-吗啉代)丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-乙烷磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液或N-氨基甲酰甲基乙磺酸缓冲液中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液的pH值为7.0-7.4。
4.根据权利要求1所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：所述磷脂酶为鞘磷脂酶。
5.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于：其由以下组分组成：葡聚糖、二氯乙酰氨、二硫苏糖醇、苯酚和丙三醇。
6.根据权利要求5所述的一种稳定剂，其特征在于：所述葡聚糖的浓度为0.25-0.5％,二氯乙酰胺的浓度为0.5-2.0％，二硫苏糖醇的浓度为0.5-2.0g/L，苯酚的浓度为0.1-0.5mol/L,丙三醇的浓度为1-10ml/L。
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