CN103276051B - 一种碱性磷酸酶检测试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碱性磷酸酶检测试剂，该试剂包括稀释液和反应试剂，其中稀释液为缓冲液、表面活性剂、防腐剂、去胆红素干扰剂、维生素C氧化酶；其中所述反应试剂为2-氨基-2-甲基-丙醇、醋酸镁、硫酸锌、羟乙基乙二胺三乙酸、对硝基苯磷酸二钠、十二烷基硫酸钠、防腐剂、冻干保护剂。本发明的测定试剂具有良好的灵敏度、准确度、精密度及线性，能完全满足临床检验要求。

Description

一种碱性磷酸酶检测试剂

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种用于POCT分析仪的碱性磷酸酶检测试剂。

背景技术

肝病是一种常见的危害性极大的疾病，对其的及时诊断及治疗对于疾病的预防及诊疗有重要作用，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）广泛分布于人体各脏器中，其中以肝脏最多。临床上，ALP主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查，患这些疾病时，肝细胞过度制造ALP，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清ALP明显升高。目前ALP普遍采用各种大型全自动生化分析仪检测，但由于大型全自动生化分析仪设备价格高，且操作复杂，操作人员需有相关的专业知识和接受相应的培训，使用配套条件要求高，需配备稳压电源、纯水机等，并且占地面积大，维护费用高，需要专业人员定期保养，因此基层医疗机构或家庭个人都没有条件购买和使用。此外，大型医院患者多，检测手续繁琐、流程长、等待时间长，这也给患者带来了巨大的时间负担，更重要的是病人因不能得到及时诊断而贻误治疗，甚至会失去生命。

即时检验（point-of-care testing，POCT）是一项新兴的技术领域，主要特点是快速得出结果，操作简便，容易使用和小型化。随着诊断和辅助技术的进步，以及人们对疾病的认识及治疗水平提高的要求，POCT逐渐受到关注。事实上POCT在欧美市场已逐渐成为体外诊断试剂与仪器领域的重要研究项目，已有不少产品投入市场，但这类POCT仪器目前有一个重要缺陷，就是分析仪及试剂耗材特别昂贵，对于中国这样具有庞大基层医疗系统，且试剂使用量极大的国家来说，目前欧美开发的仪器及配套试剂耗材显然都面临挑战。

微流控芯片技术是21世纪世界最为重要的前沿技术之一，它把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成到一块几十平方厘米（甚至更小）的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，是用以取代常规生物或化学实验室的各种功能的一种技术。将微流控芯片技术引入到POCT设备，开创了POCT发展的新局面，可使以往实验室繁复之全血定量、血球血清分离、血清稀释及同步测定等步骤，在芯片在线自动化作业完成，达到多种标记同步检测目的。结合微流控芯片技术的POCT分析仪兼具高准确度、低需血量、操作简单、检测试剂用量少、成本低等优点，如保生国际生医有限公司的POCT仪，Abaxis公司的Piccolo，Axis-Shield公司的Afinion等，此类POCT分析仪均可实现少量样品即可分析、操作简便、无交叉污染、可自动化作业，非常适用于中国这样具有庞大基层医疗系统且试剂使用量极大的国家。

随着“十一五”计划针对三级及二级医院基础设备的购置与加强，目前中级以上医院已具备良好的软硬件设施，但是基层医疗机构特别是卫生院、卫生所等单位其全自动生化检验仪器设施普遍不足，也没有足够数目的检验专业人员，因此建立操作简易、价格低廉、实时报告的POCT分析系统对发挥广大基层医院在疾病预防及诊疗中的作用有重要的意义。而提供一种可用于上述引入微流控芯片技术的POCT分析仪的碱性磷酸酶检测试剂成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种可用于引入微流控芯片技术的POCT分析仪的碱性磷酸酶检测试剂。

本发明可用于上述POCT分析仪（引入微流控芯片技术）的ALP测定试剂是按以下技术方案实现的。

一种可用于POCT分析仪的ALP测定试剂，包括稀释液和反应试剂，其中稀释液是由以下成分组成：

缓冲液（pH6.5-7.5）   0.01-1.0mol/L，

表面活性剂   0.1-10.0%（质量百分比），

防腐剂   0.1-10.0%，

去胆红素干扰剂   1-10mol/L或1-100KU/L，

维生素C氧化酶   1-100KU/L；

其中所述反应试剂是由以下成分组成：

2-氨基-2-甲基-丙醇（pH10.0-11.0）   0.1-1.0mol/L，

醋酸镁   5-100mmol/L，

硫酸锌   5-100mmol/L，

羟乙基乙二胺三乙酸   5-100mmol/L，

对硝基苯磷酸二钠   20-100mmol/L，

十二烷基硫酸钠   10-30g/L，

防腐剂   0.1-1g/L，

冻干保护剂   10-30g/L。

其中所述缓冲液（包括稀释液中缓冲液和反应试剂中的缓冲液）可以是三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环已胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-(环已胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液的一种或几种。

所述的表面活性剂为非离子表面活性剂，如选自TWEEN系列(如吐温（TWEEN）20、吐温40、吐温60、吐温80)，SPAN系列(如司班（SPAN）20、司班40、司班60、司班80)，TRITON系列(如TritonX-100、TritonX-114、TritonX-405)中具体物质的一种或几种（即可以是TWEEN系列、SPAN系列或TRITON系列中的一种具体物质，或每种系列中一种以上的具体物质，或两种或以上系列中的一种具体物质）。

所述去胆红素干扰剂为亚铁氰化钾、高铁氰化钾、胆红素氧化酶中的一种或几种。

所述防腐剂（包括稀释液中防腐剂和反应试剂中的防腐剂）选自山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、proclin系列防腐剂（如Proclin300）中的一种具体物质或尼泊金酯（如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯）中的一种具体物质。

所述冻干保护剂选海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、吐温80、曲拉通X-100、脂肪醇聚氧乙烯醚（Brij-35）中的一种或者几种。

所述ALP测定试剂中稀释液为液体状态，反应试剂为干粉状态。

所述ALP测定试剂的稀释液的制备方法如下：将所述试剂成分按照配方比例加入蒸馏水后混合搅匀。

所述ALP测定试剂的反应试剂的制备方法如下：将所述试剂成分按照配方比例加入蒸馏水后混合搅匀，将0.5-10μl反应试剂加入到反应检测槽，经冻干（行业常规技术）或2-8℃挥干24～72h。

所述ALP测定试剂的测试条件如下：温度：37℃；检测主波长405nm，副波长750nm。

本发明所述的微流控芯片技术是将基本操作单元集成到一块几十平方厘米（甚至更小）的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统的一种技术。其特点在于芯片一般分为上下两层，上层有用于加样的通孔，下层包括样品槽、稀释液槽、样品定量槽、稀释液定量槽、储液槽、多个预装有反应试剂的反应检测槽、一组用于系统校正的自检槽、一组溢流槽、多组控制流体流动的不同形状的微流道等。其检测方法一般包括以下步骤：（1）将样品溶液及稀释液经各自通孔注入到所述的样品槽及稀释液槽中；（2）启动电机旋转所述的芯片；（3）样品溶液在离心力作用下实现固液分离和定量，同时稀释液进入稀释液定量槽；（4）定量的样品与稀释液流入混合槽进行混合；（5）混合后的液体进入反应检测槽与反应试剂进行反应；（6）通过与芯片配套的检测设备在反应检测槽中进行原位检测。

所述ALP测定试剂的测定方法如下：将5-20μl样品加入到样品槽，将20-100μl稀释液加入到稀释液槽，启动电机，37℃反应1min后记录吸光度A1，继续反应5-9min后记录吸光度A2。

所述ALP测定试剂的反应原理为：样本先与稀释液进行混合孵育，以去除样本中的胆红素、维生素C及血脂等干扰物质，混合液进入反应检测槽后，对硝基苯磷酸二钠在碱性溶液中为无色，在ALP催化下，分裂出磷酸酰基，生产游离的对硝基苯酚（4-NP）。后者在碱性溶液中转变为醌式结构，呈现较深的黄色。在波长405nm处检测吸光度增高速率，可计算出ALP的活性单位。

本发明的优点和有益效果：本发明的试剂具有良好的灵敏度、准确度、精密度及线性，能完全满足临床检验要求。本发明的试剂可用于引入微流控芯片技术的POCT分析仪，从而实现操作简易、价格低廉、实时报告的POCT分析系统的建立。

附图说明

图1以标准血清样品外添加不同浓度的分析物进行检测，ALP线性结果图。

图2与全自动生化分析仪上测定的ALP结果值进行比较图，其中X轴代表全自动生化分析仪日立7180上测定数据，Y轴代表POCT分析仪上测定数据。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1

稀释液：

三羟甲基氨基缓冲液（pH7.0）   0.1mol/L

TWEEN80   5%

Proclin300   0.1%

胆红素氧化酶   1KU/L

维生素C氧化酶   1KU/L

反应试剂：

2-氨基-2-甲基-丙醇（pH10.0）   0.1mol/L

醋酸镁   5mmol/L

硫酸锌   5mmol/L

羟乙基乙二胺三乙酸   5mmol/L

对硝基苯磷酸二钠   20mmol/L

十二烷基硫酸钠   10g/L

山梨酸钾   0.1g/L

牛血清白蛋白   5g/L

实施例2

稀释液：

三羟甲基氨基缓冲液（pH7.5）   0.5mol/L

TRITONX-100   5%

对羟基苯甲酸甲酯   1%

亚铁氰化钾   1mol/L

维生素C氧化酶   2KU/L

反应试剂：

2-氨基-2-甲基-丙醇（pH10.5）   0.2mol/L

醋酸镁   10mmol/L

硫酸锌   10mmol/L

羟乙基乙二胺三乙酸   20mmol/L

对硝基苯磷酸二钠   40mmol/L

十二烷基硫酸钠   20g/L

Proclin300   1g/L

海藻糖   10g/L

实施例3

稀释液：

3-吗啉丙磺酸缓冲液（pH6.5）   1.0mol/L

SPAN20   10%

苯甲酸钠   1%

高铁氰化钾   10mol/L

维生素C氧化酶   10KU/L

反应试剂：

2-氨基-2-甲基-丙醇（11.0）   1.0mol/L

醋酸镁   100mmol/L

硫酸锌   100mmol/L

羟乙基乙二胺三乙酸   80mmol/L

对硝基苯磷酸二钠   50mmol/L

十二烷基硫酸钠   30g/L

Proclin300   1g/L

脂肪醇聚氧乙烯醚   10g/L

下面结合表格对本发明实施例1所得试剂的性能进行说明。

1、精密度

表1、精密度评估结果

2、线性

以从医院收集来的高浓度血清标本稀释成不同浓度的分析物进行检测，ALP线性结果见图1。

3、方法学比对试验

与全自动生化分析仪上测定的ALP结果值进行比较，结果如图2，其中X轴代表全自动生化分析仪日立7180上测定数据，Y轴代表引入微流控芯片技术的POCT分析仪（台湾保生国际，Amishield，TMO-100）上测定数据。

4、检测灵敏度

检测灵敏度的评估方法用10-20个空白样本讯号强度的标准差，及3-15个最低非零样本讯号强度的标准差，用统计软件EPEvaluatorrelease6计算所得。实验结果显示本发明试剂有很好的灵敏度，能完全符合美国临床实验室改进修正法规。

表2试剂检测灵敏度

从上述检测结果可知，本发明试剂具有良好的灵敏度、准确度、精密度及线性，能完全满足临床检验要求。

Claims (5)

1.一种碱性磷酸酶检测试剂，其特征在于：该试剂包括稀释液和反应试剂，其中稀释液是由以下成分组成：

缓冲液：pH 6.5-7.5    0.01-1.0 mol/L，

表面活性剂           质量百分比为0.1-10.0%，

防腐剂                 质量百分比为0.1-10.0%，

去胆红素干扰剂          1~10 mol/L或1~100 KU/L，

维生素C氧化酶          1-100 KU/L；

其中所述反应试剂是由以下成分组成：

2-氨基-2-甲基-丙醇：pH 10.0-11.0   0.1~1.0 mol/L，

醋酸镁                    5-100 mmol/L，

硫酸锌                   5-100 mmol/L，

羟乙基乙二胺三乙酸       5-100 mmol/L，

对硝基苯磷酸二钠         20-100 mmol/L，

十二烷基硫酸钠          10-30 g/L，

防腐剂                   0.1-1 g/L，

冻干保护剂               10-30 g/L；

所述的表面活性剂为选自TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列中具体物质的一种或几种;

所述的去胆红素干扰剂为亚铁氰化钾、高铁氰化钾、胆红素氧化酶中的一种或几种;所述的防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、proclin系列防腐剂中的一种具体物质或尼泊金酯中的一种具体物质。

2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶检测试剂，其特征在于：所述的缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双(2-羟基乙烷磺酸) 缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环已胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-(环已胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶检测试剂，其特征在于：所述的proclin系列防腐剂为Proclin300。

4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶检测试剂，其特征在于：所述的尼泊金酯为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯中的一种。

5.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶检测试剂，其特征在于：所述的冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、吐温80、曲拉通X-100、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种或者几种。