CN104678107A - 一种游离脂肪酸的定量测定方法、试剂及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种定量测定人体血清中游离脂肪酸含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化镁、脂酰辅酶A合成酶、抗坏血酸氧化酶、辅酶A、ATP、4-氨基安替吡啉；所述试剂II含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、苯氧基乙醇、脂酰辅酶A氧化酶、过氧化物酶、色原、表面活性剂。本发明采用的试剂盒及检测方法只需几微升血清，无需离心或电泳等分离处理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。

Description

一种游离脂肪酸的定量测定方法、试剂及试剂盒

技术领域

本申请涉及一种人体血清中游离脂肪酸的定量测定方法、试剂及试剂盒。

背景技术

游离脂肪酸是中性脂肪分解成的物质。当肌肉活动所需能源——肝糖耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪成为游离脂肪酸来充当能源使用。所以，游离脂肪酸可说是进行持久活动所需的物质。

游离脂肪酸增高常见于甲亢，乙醇中毒，糖尿病急性心肌梗塞，肝性脑病，长期禁食，糖原累积病等。

降低见于甲状腺机能减退，脑垂体功能不全，阿狄森氏病。餐后可引起生理性降低。

目前临床一般采用酶法测定游离脂肪酸的含量，但现有方法存在稳定性差、线性范围窄、操作繁琐、耗时长、价格昂贵、过度浪费资源的缺点，不适于常规检验，尤其是大规模流行病学检查或临床大批量标本诸多项目的同时检测。

发明内容

本申请的目的是提供一种能够应用于大规模临床试验的人体血清中游离脂肪酸的定量测定方法、试剂及试剂盒。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种定量测定人体血清中游离脂肪酸含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化镁、脂酰辅酶A合成酶、抗坏血酸氧化酶、辅酶A、ATP、4-氨基安替吡啉；所述试剂II含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、苯氧基乙醇、脂酰辅酶A氧化酶、过氧化物酶、色原、表面活性剂。

进一步的，所述色原为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)，所述表面活性剂为吐温-20。

进一步的，所述试剂I中磷酸二氢钠含量为30-150mmol/L、磷酸氢二钠含量为30-150mmol/L、氯化镁含量为1-10mmol/L、脂酰辅酶A合成酶含量为0.3-50U/ml、抗坏血酸氧化酶含量为1.5-50U/ml、辅酶A含量为0.5-20mmol/L、ATP含量为1-10mmol/L、4-氨基安替吡啉含量为0.5-2mmol/L。

进一步的，所述试剂I中磷酸二氢钠含量为100mmol/L、磷酸氢二钠含量为100mmol/L、氯化镁含量为3mmol/L、脂酰辅酶A合成酶含量为0.3U/ml、抗坏血酸氧化酶含量为1.5U/ml、辅酶A含量为0.9mmol/L、ATP含量为5mmol/L、4-氨基安替吡啉含量为1.5mmol/L。

进一步的，所述试剂II中磷酸二氢钠含量为30-150mmol/L、磷酸氢二钠含量为30-150mmol/L、苯氧基乙醇含量为0.1-0.5％、脂酰辅酶A氧化酶含量为10-50U/ml、过氧化物酶含量为5-10U/ml、色原含量为1-50mmol/L、表面活性剂含量为0.1-0.5％(V/V)。

进一步的，所述试剂II中磷酸二氢钠含量为100mmol/L、磷酸氢二钠含量为100mmol/L、苯氧基乙醇含量为0.3％、脂酰辅酶A氧化酶含量为10U/ml、过氧化物酶含量为7.5U/ml、色原含量为1.2mmol/L、表面活性剂含量为0.2％(V/V)。

本发明试剂盒中两种试剂配置工艺如下：

(1)配制试剂I：把称量好的磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化镁、脂酰辅酶A合成酶、抗坏血酸氧化酶、辅酶A、ATP、4-氨基安替吡啉溶解到配制的1/2体积的纯化水中溶解，搅拌15分钟待全部溶后，调PH至7.2定容至配制的体积。

(2)配制试剂II：把称量好的磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、苯氧基乙醇、脂酰辅酶A氧化酶、过氧化物酶、色原、表面活性剂溶解到配制的1/2体积的纯化水中溶解,搅拌15分钟待全部溶后,调PH至7.2定容至配制的体积。

(3)将上述配制的试剂灌装分至小瓶，以供医疗检验用。

(4)要求配制上述两种试剂的操作过程均在无菌车间里进行。

本发明所有原料均购自上海聚创生物科技有限公司。

本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中游离脂肪酸含量的试剂盒，其中装有上述定量测定人体血清中游离脂肪酸含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。

本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中游离脂肪酸含量的方法，该方法包括向血清样品中加入所述试剂I，37℃孵育2-5分钟，在一定的波长下测定样品吸光度A1；然后向样品中加入试剂II，继续孵育5分钟后在上述波长下测定吸光度A2，由下式(1)计算△A样本；用同样的方法测定校准液的吸光度值△A标准；再通过下式(2)计算得到血清样品的游离脂肪酸含量：

△A＝A2-A1    (1)

血清中游离脂肪酸含量(mmol/L)＝△A样本/△A标准×标准液浓度    (2)

标准品购自于RANDOX公司。

本方法的原理为：

本发明直接定量测定人血清样品中游离脂肪酸含量的试剂盒，是将分别放置的上述试剂I和试剂II以不同的规格装入试剂盒包装中。该试剂盒具有多种不同的规格，可以分别适用于目前在临床实验室普遍使用的各种国内外品牌的自动生化分析仪器。

本发明采用的试剂盒及检测方法只需几微升血清，无需离心或电泳等分离处理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。

具体实施方式

实施例一

按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II：

试剂I:

试剂II:

在样品管中将300μl试剂I和5μl血清样品混合，在37℃下孵育2-5分钟，使用日立7180型全自动生化分析仪，在主波长546nm，副波长600nm处测定吸光度A1，然后向样品中加入75μl试剂II，混匀，在37℃下孵育5分钟，测定相同波长下的吸光度A2。根据如下公式(1)计算△A样本。用同样的方法和条件测定标准液的吸光度值，并计算△A标准。然后根据公式(2)计算得到血清样品的游离脂肪酸含量：

△A＝A2-A1    (1)

血清中游离脂肪酸含量(mmol/L)＝△A样本/△A标准×标准液浓度(2)

本申请所用标准品购自上海聚创生物科技有限公司

实施例二

按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II：

试剂I:

试剂II:

在样品管中将300μl试剂I和5μl血清样品混合，在37℃下孵育2-5分钟，使用雅培C16000型全自动生化分析仪，在主波长546nm，副波长600nm处测定吸光度A1，然后向样品中加入75μl试剂II，混匀，在37℃下孵育5分钟，测定相同波长下的吸光度A2。根据如下公式(1)计算△A样本。用同样的方法和条件测定标准液的吸光度值，并计算△A标准。然后根据公式(2)计算得到血清样品的游离脂肪酸含量：

△A＝A2-A1    (1)

血清中游离脂肪酸含量(mmol/L)＝△A样本/△A标准×标准液浓度(2)

实施例三

按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II：

试剂I:

试剂II:

在样品管中将300μl试剂I和5μl血清样品混合，在37℃下孵育2-5分钟，使用奥林帕斯AU400型全自动生化分析仪，在主波长546nm，副波长600nm处测定吸光度A1，然后向样品中加入75μl试剂II，混匀，在37℃下孵育5分钟，测定相同波长下的吸光度A2。根据如下公式(1)计算△A样本。用同样的方法和条件测定标准液的吸光度值，并计算△A标准。然后根据公式(2)计算得到血清样品的游离脂肪酸含量：

△A＝A2-A1    (1)

血清中游离脂肪酸含量(mmol/L)＝△A样本/△A标准×标准液浓度(2)

实施例四

使用本实施例1中所列的试剂，按照实施例1所述的方法和条件对100例血清样品的血清中游离脂肪酸含量进行测定，每份血清样品同时以市售血清中游离脂肪酸含量测定试剂盒(北京九强生物技术股份有限公司)进行对照性测定。

1 SPSS定量统计分析

1.1 统计描述

表1 描述统计量

表2 描述统计量

1.2 配对T检验

表3 成对样本相关系数

	N	相关系数	Sig.
				对1对照数据&本发明数据	200	.999	.000

表4 成对样本检验

表5 成对样本检验

	t	df	Sig.(双侧)
				对1对照数据-本发明数据	.827	199	.409

其中，P＝0.409，＞0.05，表明两组数据相互独立，是两个不同试剂盒的结果

1.3 双变量相关性

表6 相关性

**.在.01水平(双侧)上显著相关。

R＝0.999

1.4 新型回归分析及散点图

表7 模型汇总

模型	R	R方	调整R方	标准估计的误差
					1	.999a	.998	.998	.02657

a.预测变量:(常量),本发明数据。

表8 系数^a

a.因变量:对照数据

方程：Y＝0.9971*X+0.0003，r＝0.999，X轴：对照数据，Y轴：本发明数据

2 临床结果定性统计分析

临床研究游离脂肪酸测定试剂盒与对照产品测定结果分析：

交叉列表分析

表9 临床确诊与对照组试剂

以对照产品为参照组：

阳性符合率＝[58/(58+0)]×100％＝100％

阴性符合率＝[142/(142+0)]×100％＝100％

总的一致性＝[(142+58)/200]×100％＝100％

3 性能指标分析

3.1 准确性

用已知游离脂肪酸定值血清进行三次平行测量测定，取均值，得出：

表10

3.2 重复性

同一批次试剂对同一标本进行10次重复测定，计算标本测定结果平均值，得出批内不精密度:CV≤5.0％。

表11

3.3 线性范围

选取游离脂肪酸高浓度血清，用生理盐水进行倍比稀释，取五个梯度浓度，每个浓度重复测定3次取平均值，计算理论浓度与相应测定浓度均值进行线性回归分析，计算相关系数r，理论值为横坐标，实测值为纵坐标作散点图，发现两者有良好线性关系，进行直线回归统计分析，并有统计学意义(p<0.0001)。

定值为2.87mmol/L，回归方程为Y＝125.477X-2.235,

表12

表明本法在0-3mmol/L血清游离脂肪酸浓度范围内，实测值与理论值相关系数为r:0.997。

4 讨论和结论

上述100例标本中，游离脂肪酸异常标本30例，游离脂肪酸正常标本70例通过交叉列表分析、SPSS软件统计，数据统计结果显示：本发明准确度高、重复性好、线性范围宽，与对照产品在阳性符合率、阴性符合率、总的一致性及相关性等方面符合较好。因此，本发明的的游离脂肪酸测定试剂盒能够满足临床性能要求，有效性强，安全性高，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (7)

1.一种定量测定人体血清中游离脂肪酸含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化镁、脂酰辅酶A合成酶、抗坏血酸氧化酶、辅酶A、ATP、4-氨基安替吡啉；所述试剂II含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、苯氧基乙醇、脂酰辅酶A氧化酶、过氧化物酶、色原、表面活性剂。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂I中磷酸二氢钠含量为30-150mmol/L、磷酸氢二钠含量为30-150mmol/L、氯化镁含量为1-10mmol/L、脂酰辅酶A合成酶含量为0.3-50U/ml、抗坏血酸氧化酶含量为1.5-50U/ml、辅酶A含量为0.5-20mmol/L、ATP含量为1-10mmol/L、4-氨基安替吡啉含量为0.5-2mmol/L。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂I中磷酸二氢钠含量为100mmol/L、磷酸氢二钠含量为100mmol/L、氯化镁含量为3mmol/L、脂酰辅酶A合成酶含量为0.3U/ml、抗坏血酸氧化酶含量为1.5U/ml、辅酶A含量为0.9mmol/L、ATP含量为5mmol/L、4-氨基安替吡啉含量为1.5mmol/L。

4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂II中磷酸二氢钠含量为30-150mmol/L、磷酸氢二钠含量为30-150mmol/L、苯氧基乙醇含量为0.1-0.5％、脂酰辅酶A氧化酶含量为10-50U/ml、过氧化物酶含量为5-10U/ml、色原含量为1-50mmol/L、表面活性剂含量为0.1-0.5％。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂II中磷酸二氢钠含量为100mmol/L、磷酸氢二钠含量为100mmol/L、苯氧基乙醇含量为0.3％、脂酰辅酶A氧化酶含量为10U/ml、过氧化物酶含量为7.5U/ml、色原含量为1.2mmol/L、表面活性剂含量为0.2％。

6.一种定量测定人体血清中游离脂肪酸含量的试剂盒，其特征在于，其中装有权利要求1至5中任一所述的定量测定人体血清中游离脂肪酸含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。

7.一种定量测定人体血清中游离脂肪酸含量的方法，该方法包括向血清样品中加入所述试剂I，37℃孵育2-5分钟，在一定的波长下测定样品吸光度A1；然后向样品中加入试剂II，继续孵育5分钟后在上述波长下测定吸光度A2，由下式(1)计算△A样本；用同样的 方法测定校准液的吸光度值△A标准；再通过下式(2)计算得到血清样品的游离脂肪酸含量：

△A＝A2-A1  (1)

血清中游离脂肪酸含量(mmol/L)＝△A样本/△A标准×标准液浓度  (2) 。