CN109521013A - 一种游离脂肪酸检测试剂盒及生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种游离脂肪酸检测试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，试剂R1包括如下成分：试剂R2包括如下成分：该游离脂肪酸检测试剂盒即开即用，无需配制，并且长期存放的稳定性较好。本发明还提出一种游离脂肪酸检测试剂盒的生产工艺。
Description
技术领域
本发明涉及一种游离脂肪酸检测试剂盒，属于诊断试剂盒技术领域。
背景技术
游离脂肪酸(NEFA)是指血清中未与甘油、胆固醇等发生酯化的脂肪酸，又称非酯化脂肪酸或未酯化脂肪酸，正常情况下，血浆中游离脂肪酸的含量极少，仅占总脂肪酸含量的5％～10％，游离脂肪酸在血浆中的半衰期2～3min，主要与血清蛋白结合转运到全身组织利用。游离脂肪酸有很强的细胞毒性，可损害细胞膜、线粒体和溶酶体膜等，引起细胞内微器损害，而且能增强细胞因子毒性，在学多疾病的病理生理中起重要作用。
游离脂肪酸是中性脂肪分解成的物质，是重要的致胰岛素抵抗的物质，是反映脂质代谢、糖代谢、内分泌机能等非常灵敏的指标。通过检测血清中脂肪酸水平，可研究糖尿病与脂质及脂肪酸的关系。血中游离脂肪酸可反映人体脂肪代谢情况及血脂水平。NEFA增高多见于肥胖，糖尿病，心肌梗塞，甲状腺机能亢进，肢端肥大症，严重肝病和饥饿；NEFA降低见于甲状腺机能减退，脑垂体功能不全，阿狄森氏病，此外餐后可引起生理性降低。
目前现有技术中对于血液中游离脂肪酸的测定需要比较复杂的配液过程，并且存放时间受环境条件影响较大，长期存放的稳定性差。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提出一种游离脂肪酸检测试剂盒，即开即用，无需配制，并且长期存放的稳定性较好。
为实现上述目的，本发明的一种游离脂肪酸检测试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其中：
试剂R1包括如下成分：
试剂R1包括如下成分：
试剂R2包括如下成分：
进一步地，试剂R1包括如下成分：
试剂R2包括如下成分：
进一步地，在试剂R2中，表面活性剂包括己醇聚醚-4羧酸、萘磺酸甲醛聚合物，己醇聚醚-4羧酸和萘磺酸甲醛聚合物的质量比为1:2。
进一步地，保护剂包括蔗糖、无脂肪酸牛血清白蛋白，在试剂R1中，蔗糖的含量为20.0g/L，无脂肪酸牛血清白蛋白的含量为0.5g/L，在试剂R2中，蔗糖的含量为60.0g/L，无脂肪酸牛血清白蛋白的含量为1.5g/L。
进一步地，在试剂R1中，所述显色剂采用4-氨基安替比林，在试剂R2中，所述色原底物采用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐。
进一步地，在试剂R1中，金属离子螯合剂采用二乙基三胺五乙酸。
进一步地，在试剂R1中，酶反应加速剂采用MgCl2·6H2O。
进一步地，在试剂R1中，磷酸盐缓冲溶液采用K2HPO4、KH2PO4配制而成，K2HPO4的含量为9.4g/L，KH2PO4的含量为1.2g/L。
进一步地，试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
本发明检验游离脂肪酸的方法应用了TRINDER反应的原理，游离脂肪酸、三磷酸腺苷和辅酶A在乙酰辅酶A合成酶的作用下，可以生成乙酰辅酶A，进一步的，乙酰辅酶A在乙酰辅酶A氧化酶的作用下生成H2O2。在过氧化物酶和H2O2的作用下试剂R1中的4-氨基安替比林与试剂R2中的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐结合形成稳定的红色醌类物质，使用自动生化分析仪对其在546nm处测定吸光度，吸光度变化程度与样品中的游离脂肪酸含量呈正比，从而对样品中的游离脂肪酸含量进行测定。
黄素腺嘌呤二核苷酸二钠是乙酰辅酶A氧化酶的辅酶，在反应中起到递氢体的作用，有助于提高反应的灵活性，使氧化反应更完全，保证了反应高效、稳定的进行。
磷酸盐缓冲液和三羟甲基氨基甲烷缓冲液，为辅酶A，乙酰辅酶A合成酶和乙酰辅酶A氧化酶的反应提供稳定的、适宜的PH环境。
金属离子螯合剂DTPA能迅速与钙镁铁铅铜锰等离子生成水溶性络合物，尤其对高价态显色金属络合能力强，可以降低或消除尤其是重金属离子对酶活性的抑制作用，增强酶促反应的稳定性。
MgCl2·6H2O作为酶反应加速剂，可以激活酶的活性。
叠氮化钠作为防腐剂，能够防止溶液中微生物生长，以保持试剂的稳定性。
保护剂采用的蔗糖和牛血清白蛋白在提高生物制品稳定性上具有相互配合，相互协调的作用，能够协同提高生物制品稳定性。蔗糖属于非还原性二糖，自身的化学及生物性质非常稳定，作为生物制品(例如蛋白质)的保护剂，能够保证生物制品结构的稳定性，并且在溶液中易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的粘性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，以达到保护的目的。牛血清白蛋白作为生物制品的另一种保护剂，其可以提高生物制品的稳定性。牛血清白蛋白量过多(>5％)，会影响背景(空白)信号，使本底增高，影响测定准确定，如果牛血清白蛋白量过少，则起不到保护作用。并且本发明中选取的牛血清白蛋白必须不含有脂肪酸类杂质，脂肪酸会引起假阳性反应，造成检测结果的不准确。
己醇聚醚-4羧酸是一种水溶性低泡沫的阴离子表面活性剂。萘磺酸甲醛聚合物能够与阴离子和非离子表面活性剂复配，具有优良扩散性，对蛋白质具有良好的亲和力。这两种表面活性剂单一加入时，可以进一步保护试剂中酶原料的稳定性。两种表面活性剂同时混合复配，产生协同增效作用，使试剂的开瓶稳定性和长期存储稳定性较好。
胆红素等还原性物质可以与色原底物竞争H2O2，从而使得氧化过程中产生的H2O2被消耗，使得TRINDER反应生成的红色醌类化合物减少，造成测定结果偏低。亚铁氰化钾是一种氧化剂，可以将样本中的胆红素转化成胆绿素，从而消除胆红素对检测结果的干扰。
本发明还提出一种游离脂肪酸检测试剂盒的生产工艺，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
本发明的一种游离脂肪酸检测试剂盒，即开即用，无需配制，并且长期存放的稳定性较好。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步描写和阐述。
图1是本发明首选实施方式的游离脂肪酸检测试剂盒的测定值与理论值的线性范围示意图；
图2是本发明首选实施方式的游离脂肪酸检测试剂盒的测定值与理论值的样本相关性示意图。
具体实施方式
下面将结合附图、通过对本发明的优选实施方式的描述，更加清楚、完整地阐述本发明的技术方案。
实施例1：游离脂肪酸检验试剂盒的生产，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
其中步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
实施例2：游离脂肪酸检验试剂盒的生产，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
其中步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
实施例3：S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
其中步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
实施例4：游离脂肪酸检验试剂盒的生产，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
其中步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
实施例5：游离脂肪酸检验试剂盒的生产，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
其中步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
对比例1：一种游离脂肪酸检验试剂盒，与实施例1的区别在于，在试剂R2中，未添加己醇聚醚-4羧酸和萘磺酸甲醛聚合物。
对比例2：一种游离脂肪酸检验试剂盒，与实施例1的区别在于，在试剂R2中，未添加己醇聚醚-4羧酸。
对比例3：一种游离脂肪酸检验试剂盒，与实施例1的区别在于，在试剂R2中，未添加萘磺酸甲醛聚合物。
本发明的游离脂肪酸检测试剂盒适用且不限于日立7060、日立7080、日立7170、日立7600、日立7180、东芝400、岛津8000、罗氏P800、雅培2000、贝克曼CX、贝克曼DX、贝克曼LX、奥林巴斯400、奥林巴斯640、奥林巴斯2700、奥林巴斯5400等全自动生化分析仪。
本发明的游离脂肪酸检测试剂盒检测游离脂肪酸的测定方法如下：
全自动生化分析仪的主波长设置为546nm，副波长设置为700nm，采用两点终点法。加入样本、校准液或质控品5μl，之后再加入试剂R1 240μl混匀，于37℃孵育3min～5min后读取吸光度A1，之后再加入60μl的试剂R2混匀，于37℃孵育5min后，读取吸光度A2，并计算ΔA＝A2-A1。根据公式：NEFA浓度(mmol/L)＝标准品浓度×ΔA样品/ΔA标准品，计算样品中的游离脂肪酸浓度。
本发明的一种游离脂肪酸检测试剂盒性能测试如下：
试验中采用的校准液和质控品均采用朗道公司的产品，校准方法采用校准液两点定标线性处理，定标数据如表1。
表1：定标数据(单位mmol/L)：
试验1：线性范围
取临床高值标本，将高值标本按0、1/8、1/4、2/4、3/4、1的稀释比例稀释，每个样品测3次，取平均值数据记录如表2。根据图1可见，本发明试剂盒的最高检测范围可达4.2mmol/L，判定依据R2≥0.990。
表2：线性范围验证结果(单位：mmol/L)：
| 稀释比例 | NEFA理论值 | NEFA实测均值 |
| 0 | 0 | 0.03 |
| 1/8 | 0.525 | 0.54 |
| 1/4 | 1.05 | 1.08 |
| 1/2 | 2.1 | 2.18 |
| 3/4 | 3.15 | 3.11 |
| 1 | 4.2 | 4.25 |
试验2：精密度试验
1、批内精密度
取一个低值的游离脂肪酸含量的样品和一个高值的游离脂肪酸含量的样品各20次，测定本发明试剂盒的批内精密度，试验结果见表3。
表3：批内精密度试验结果(单位：mmol/L)
2、批间精密度
使用实施例1、实施例2和实施例3制得的游离脂肪酸检测试剂盒分别测定同一人的血清样品20次，数据记录如表4。
表4：批间精密度试验结果(单位：mmol/L)
试验3：稳定性试验
1、开瓶稳定性
将本发明试剂盒试剂开口放置2-8℃冰箱内，取2只高低值标本，分装放置-20℃保存，每10天取高低值各1只检测3次，取平均值记录如表5。
表5：开瓶稳定性试验结果(单位：mmol/L)
2、效期稳定性
将本发明试剂盒放置2-8℃，取2只高低值标本，分装放置-20℃保存，每3个月取高低值各1只检测3次，取平均值记录如表6。
表6：效期稳定性试验结果(单位：mmol/L)
试验4：样品相关性试验
取40例标本，标本浓度范围分布为低、中、高全覆盖，检测三次取平均值，记录如表7。
表7：样品相关性试验结果(单位：mmol/L)
综上所述，本发明的一种游离脂肪酸检测试剂盒，即开即用，无需配制，并且长期存放的稳定性较好。
上述具体实施方式仅仅对本发明的优选实施方式进行描述，而并非对本发明的保护范围进行限定。在不脱离本发明设计构思和精神范畴的前提下，本领域的普通技术人员根据本发明所提供的文字描述、附图对本发明的技术方案所作出的各种变形、替代和改进，均应属于本发明的保护范畴。本发明的保护范围由权利要求确定。
Claims (10)
1.一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其中：
试剂R1包括如下成分：
试剂R2包括如下成分：
2.如权利要求1所述的一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于，
试剂R1包括如下成分：
试剂R2包括如下成分：
3.如权利要求2所述的一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于，在试剂R2中，所述表面活性剂包括己醇聚醚-4羧酸、萘磺酸甲醛聚合物，所述己醇聚醚-4羧酸和萘磺酸甲醛聚合物的质量比为1:2。
4.如权利要求1所述的一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于，所述保护剂包括蔗糖、无脂肪酸牛血清白蛋白，在试剂R1中，所述蔗糖的含量为20.0g/L，所述无脂肪酸牛血清白蛋白的含量为0.5g/L，在试剂R2中，所述蔗糖的含量为60.0g/L，所述无脂肪酸牛血清白蛋白的含量为1.5g/L。
5.如权利要求1所述的一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于，在试剂R1中，所述显色剂采用4-氨基安替比林，在试剂R2中，所述色原底物采用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐。
6.如权利要求1所述的一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于，在试剂R1中，所述金属离子螯合剂采用二乙基三胺五乙酸。
7.如权利要求1所述的一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于，在试剂R1中，所述酶反应加速剂采用MgCl2·6H2O。
8.如权利要求1所述的一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于，在试剂R1中，所述磷酸盐缓冲溶液采用K2HPO4、KH2PO4配制而成，所述K2HPO4的含量为9.4g/L，所述KH2PO4的含量为1.2g/L。
9.如权利要求1所述的一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
10.一种用于生产权利要求1-9任意项所述游离脂肪酸检测试剂盒的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190326 |