CN108103142A - 一种游离脂肪酸检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种游离脂肪酸检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种游离脂肪酸检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒含有试剂A和B，所述试剂A组分为：磷酸二氢钠、辅酶A、三磷酸腺苷、酰基辅酶A合成酶、MgCl2、Trinder底物、磁化水适量，调节pH到7.2；所述试剂B组分如下：磷酸二氢钠、4‑氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶、黄素腺嘌呤二核苷酸、EDTA‑2Na、N‑椰油酰基谷氨酸钠、脂肪醇聚氧乙烯硫酸钠、N‑酰基‑L‑丝氨酸钠、甘露醇、柠檬酸钠、磁化水适量，调节pH7.2。本发明试剂盒具有酶活性高且稳定，存放时间长等优点。在35‑37℃保存15天左右，检测结果偏差只有1.99％，并且灵敏度提高3.45％。

Description

一种游离脂肪酸检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，特别涉及一种游离脂肪酸检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
游离脂肪酸，即非酯化脂肪酸，它是人体内脂肪代谢的中间产物，也是细胞膜脂质结构的底物和前列腺素等细胞内信号分子的供体。当肌肉活动所需能源-肝糖耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪成为游离脂肪酸来充当能源使用。虽然游离脂肪酸只占身体脂肪很少的一部分，但却满足了能量需求的很大部分，故而是监控人体脂代谢、糖代谢的重要指标。游离脂肪酸不仅能够反映人体脂肪代谢情况及血脂水平、评价血糖及辅助诊断糖尿病，还能反映人体内多种其他病理、生理情况，如胰岛素抵抗、肥胖、恶性疾病、代谢综合征和心血管疾病等。
游离脂肪酸在ATP、辅酶A的存在下，经脂酰辅酶A合成酶作用，生成脂酰辅酶A；脂酰辅酶A被脂酰辅酶A氧化酶氧化，生成反式-烯酰辅酶A和过氧化氢；而生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下，与Trinder色原及4-氨基安替比林生成红色醌亚胺物，该物质的生成量与样本中的游离脂肪酸含量呈正比，通过测定其吸光度即可得到样品中游离脂肪酸的浓度。
传统市售酶法游离脂肪酸试剂盒均选用单一的稳定剂，由于游离脂肪酸试剂盒成分比较复杂含有多种酶，其试剂盒稳定性直接与酶活性相关，而酶的活性易受各种因素的干扰，比如pH、温度、紫外线、重金属盐、抑制剂、激活剂等，导致试剂盒缺乏稳定性，保存时间短，影响临床使用。单一的稳定剂已越来越不能满足对试剂盒稳定性的要求。并且由于酶的使用量大，试剂容易出现沉淀。为此，专利申请号CN 106191206A公开了游离脂肪酸检测试剂盒及制备方法，该试剂盒含有试剂1和试剂2，试剂1组成如下：磷酸二氢钠50mmoL/L，辅酶A 0.05mmol/L、三磷酸腺苷3mmol/L、酰基辅酶A合成酶0.4KU/L、MgCL22mmol/L、Trinder底物0.5g/L，调节pH到7.2；试剂2组成如下：磷酸二氢钠60mmol/L、黄素腺嘌呤二核苷酸2mmoL/L、4-氨基安替比林10mmoL/L、酰基辅酶A氧化酶40KU/L、过氧化物酶40KU/L、烷基糖苷APG0810 1-1.5g/L、甘露醇0.5g/L、EDTA-2Na 1g/L、十二烷基聚氧乙烯醚2-3g/L，调节pH到7.2。该报道采用“烷基糖苷APG0810和十二烷基聚氧乙烯醚”两种非离子型表面活性剂配合EDTA-2Na和甘露醇的技术手段，起到稳定4-氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶等的活性，从而解决现有单一稳定剂试剂盒稳定性差，保存时间短的问题。但由于试剂盒灵敏度与酶活性关系紧密，而上述报道披露的试剂盒仅是在保证酶原本活性的基础上延长了存放时间，并没有从本质上提升试剂盒的灵敏度。因此，如何提高试剂盒中酶活性且保证存放时间成为目前亟需解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种游离脂肪酸检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒含有试剂A和B，试剂B中采用磁化水作溶剂，相比双蒸水能提高试剂中酶的活性，又能改善其他成分在溶液中的分布情况，使其呈规律性分布；再采用N-椰油酰基谷氨酸钠、脂肪醇聚氧乙烯硫酸钠、N-酰基-L-丝氨酸钠配合EDTA-2Na协同稳定的技术手段，保证各种酶在高活性的基础上延长保存时间。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种游离脂肪酸检测试剂盒，包括试剂A和B，其特征在于：
所述试剂A组分如下：
磷酸二氢钠100-120mmol/L
辅酶A 0.09-0.12mmol/L
三磷酸腺苷5-6.5mmol/L
酰基辅酶A合成酶0.8-1.0ku/L
MgCl2 3.5-4.2mmol/L
Trinder底物1.0-1.2g/L
磁化水适量
调节pH到7.2；
所述试剂B组分如下：
磷酸二氢钠120-155mmol/L
4-氨基安替比林28-35mmol/L
酰基辅酶A氧化酶78-95ku/L
过氧化物酶80-92KU/L
黄素腺嘌呤二核苷酸4.2-4.9mmol/l
EDTA-2Na 2-2.4g/L
N-椰油酰基谷氨酸钠3.0-4.2g/L
脂肪醇聚氧乙烯硫酸钠1.5-2.9g/L
N-酰基-L-丝氨酸钠2.4-3.5g/L
甘露醇1-1.5g/L
柠檬酸钠24-35mmol/L
磁化水适量
调节pH7.2。
所述的一种游离脂肪酸检测试剂盒，试剂A和试剂B的体积比为4:1。
上述的游离脂肪酸检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
试剂A的制备：
1)取去离子水2000-2500ml，经磁感应强度0.08-0.12T磁处理，得磁化水；
2)取磁化水850-900ml，加入磷酸二氢钠，充分溶解，用磷酸钠调节pH到7.2，依次加入辅酶A、三磷酸腺苷、酰基辅酶A合成酶、MgCl2、Trinder底物，振荡摇匀后，加入磁化水至1000ml，继续振荡均匀，得试剂A；
试剂2的制备：
取磁化水800-850ml，加入磷酸二氢钠和柠檬酸钠，充分溶解，用磷酸钠调节PH到7.2，依次加入黄素腺嘌呤二核苷酸、4氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶、EDTA-2Na、N-椰油酰基谷氨酸钠、脂肪醇聚氧乙烯硫酸钠、N-酰基-L-丝氨酸钠及甘露醇，振荡摇匀后，加入磁化水至1000ml，继续振荡均匀，得试剂B。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明将EDTA-2Na、N-椰油酰基谷氨酸钠、脂肪醇聚氧乙烯硫酸钠、N-酰基-L-丝氨酸钠和甘露醇配合应用，对酶活性起到协同促进作用，最大程度提高试剂中酶的活性，从而提高检测灵敏度；同时，试验发现该五种表面活性剂协同应用，对试剂中酶的活性具有更好的稳定性，在35-37℃保存15天左右，检测结果偏差只有1.99％，并且灵敏度提高3.45％；
2)本发明试剂盒具有良好的自我杀菌能力，能够有效避免微生物感染造成的检测偏差；同时试剂中金属离子仅有Na+和Mg2+，对检测干扰最低，检测精确度明显提高；
3)本发明经大量试验选用磁能量最佳的磁化水作溶剂，不仅有效提升酶活性，又能改善其他成分在溶液中的分布情况，使其呈规律性分布，检测速度更快，大大减少了检测时间。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，以便于同领域技术人员的理解。
实施例1
一种游离脂肪酸检测试剂盒，包括试剂A和B，其中：
所述试剂A组分如下：
磷酸二氢钠100-120mmol/L
辅酶A 0.09-0.12mmol/L
三磷酸腺苷5-6.5mmol/L
酰基辅酶A合成酶0.8-1.0ku/L
MgCl2 3.5-4.2mmol/L
Trinder底物1.0-1.2g/L
磁化水适量
调节pH到7.2；
所述试剂B组分如下：
磷酸二氢钠120-155mmol/L
4-氨基安替比林28-35mmol/L
酰基辅酶A氧化酶78-95ku/L
过氧化物酶80-92KU/L
黄素腺嘌呤二核苷酸4.2-4.9mmol/l
EDTA-2Na 2-2.4g/L
N-椰油酰基谷氨酸钠3.0-4.2g/L
脂肪醇聚氧乙烯硫酸钠1.5-2.9g/L
N-酰基-L-丝氨酸钠2.4-3.5g/L
甘露醇1-1.5g/L
柠檬酸钠24-35mmol/L
磁化水适量
调节pH7.2。
试剂A和试剂B的体积比为4:1。
试剂A的制备：
1)取去离子水2000-2500ml，经磁感应强度0.08-0.12T磁处理，得磁化水；
2)取磁化水850-900ml，加入磷酸二氢钠，充分溶解，用磷酸钠调节pH到7.2，依次加入辅酶A、三磷酸腺苷、酰基辅酶A合成酶、MgCl2、Trinder底物，振荡摇匀后，加入磁化水至1000ml，继续振荡均匀，得试剂A；
试剂2的制备：
取磁化水800-850ml，加入磷酸二氢钠和柠檬酸钠，充分溶解，用磷酸钠调节PH到7.2，依次加入黄素腺嘌呤二核苷酸、4氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶、EDTA-2Na、N-椰油酰基谷氨酸钠、脂肪醇聚氧乙烯硫酸钠、N-酰基-L-丝氨酸钠及甘露醇，振荡摇匀后，加入磁化水至1000ml，继续振荡均匀，得试剂B。
实施例2
对照组A1：对比实施例1，将试剂A和B中的磁化水替换成双蒸水，其余组分及用量完全相同；
对照组A2：对比实施例1，去除试剂B中的EDTA-2Na，减少的量用水补齐，其余操作同实施例1相同；
对照组A3：对比实施例1，去除试剂B中的甘露醇，减少的量用水补齐，其余操作同实施例1相同；
对照组A4：对比实施例1，去除试剂B中的N-椰油酰基谷氨酸钠，减少的量用水补齐，其余操作同实施例1相同；
对照组A5：对比实施例1，去除试剂B中的脂肪醇聚氧乙烯硫酸钠，减少的量用水补齐，其余操作同实施例1相同；
对照组A6：对比实施例1，去除试剂B中的N-酰基-L-丝氨酸钠，减少的量用水补齐，其余操作同实施例1相同；
对照组A7：对比实施例1，去除试剂B中的柠檬酸钠，减少的量用水补齐，其余操作同实施例1相同；
稳定性试验：
使用已知游离脂肪酸含量的同一待检品对检测试剂盒的储存稳定性进行试验。试剂盒置于35-37℃的环境中，分别在1天、5天、8天、10天、12、15天对待检品进行检测，使用检测结果来表征其稳定性。下表中数据均为3次检测的平均值。
从上表可知，采用双蒸水替代磁化水作溶剂时，在保存15天时其偏差明显增加，说明磁化水作溶剂对本发明试剂具有很好的稳定性，而对比A1-7可知，当试剂B中缺少任一表面活性剂时，其稳定性均有不同程度的下降，说明本发明采用的多种表面活性剂协同作用具有促进试剂稳定的作用。

Claims (3)

1.一种游离脂肪酸检测试剂盒，包括试剂A和B，其特征在于：
所述试剂A组分如下：
磷酸二氢钠100-120mmol/L
辅酶A 0.09-0.12mmol/L
三磷酸腺苷5-6.5mmol/L
酰基辅酶A合成酶0.8-1.0ku/L
MgCl2 3.5-4.2mmol/L
Trinder底物1.0-1.2g/L
磁化水适量
调节pH到7.2；
所述试剂B组分如下：
磷酸二氢钠120-155mmol/L
4-氨基安替比林28-35mmol/L
酰基辅酶A氧化酶78-95ku/L
过氧化物酶80-92KU/L
黄素腺嘌呤二核苷酸4.2-4.9mmol/l
EDTA-2Na 2-2.4g/L
N-椰油酰基谷氨酸钠3.0-4.2g/L
脂肪醇聚氧乙烯硫酸钠1.5-2.9g/L
N-酰基-L-丝氨酸钠2.4-3.5g/L
甘露醇1-1.5g/L
柠檬酸钠 24-35mmol/L
磁化水适量
调节pH7.2。
2.如权利要求1所述的一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于试剂A和试剂B的体积比为4:1。
3.一种根据权利要求1所述的游离脂肪酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
试剂A的制备：
1)取去离子水2000-2500ml，经磁感应强度0.08-0.12T磁处理，得磁化水；
2)取磁化水850-900ml，加入磷酸二氢钠，充分溶解，用磷酸钠调节pH到7.2，依次加入辅酶A、三磷酸腺苷、酰基辅酶A合成酶、MgCl2、Trinder底物，振荡摇匀后，加入磁化水至1000ml，继续振荡均匀，得试剂A；
试剂2的制备：
取磁化水800-850ml，加入磷酸二氢钠和柠檬酸钠，充分溶解，用磷酸钠调节PH到7.2，依次加入黄素腺嘌呤二核苷酸、4氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶、EDTA-2Na、N-椰油酰基谷氨酸钠、脂肪醇聚氧乙烯硫酸钠、N-酰基-L-丝氨酸钠及甘露醇，振荡摇匀后，加入磁化水至1000ml，继续振荡均匀，得试剂B。
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