CN106191206B - 游离脂肪酸检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检测技术领域，特别涉及一种游离脂肪酸检测试剂盒，含有试剂1和试剂2，试剂1中含有磷酸二氢钠、辅酶A、三磷酸腺苷、酰基辅酶A合成酶、MgCl2、Trinder底物，调节pH到7.2；试剂2中含有磷酸二氢钠、黄素腺嘌呤二核苷酸、4氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶、烷基糖苷APG0810、甘露醇、EDTA‑2Na、十二烷基聚氧乙烯醚，调节pH到7.2。通过对试剂中表面活性剂的选择，使得各种酶活性稳定，不易沉淀，保质期延长，降低企业风险成本，提高企业效益。

Description

游离脂肪酸检测试剂盒及制备方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，特别涉及一种游离脂肪酸检测试剂盒，还涉及所述游离脂肪酸检测试剂盒的制备方法。
背景技术
游离脂肪酸，即非酯化脂肪酸(non-estesterfied fatty acid，NEFA)，是人体内脂肪代谢的中间产物，也是细胞膜脂质结构的底物和前列腺素等细胞内信号分子的供体。当肌肉活动所需能源——肝糖耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪成为游离脂肪酸来充当能源使用。虽然游离脂肪酸只占身体脂肪很少的一部分，但却满足了能量需求的很大部分，故而是监控人体脂代谢、糖代谢的重要指标。游离脂肪酸不仅能够反映人体脂肪代谢情况及血脂水平、评价血糖及辅助诊断糖尿病，还能反映人体内多种其他病理、生理情况，如胰岛素抵抗、肥胖、恶性疾病、代谢综合征和心血管疾病等。
即游离脂肪酸在ATP、辅酶A的存在下，经脂酰辅酶A合成酶(Acyl CoASynthetase，ACS)作用，生成脂酰辅酶A；脂酰辅酶A被脂酰辅酶A氧化酶(Acyl CoAOxidase，ACOD)氧化，生成反式-烯酰辅酶A(2,3-trans-Enoyl-CoA)和过氧化氢；而生成的过氧化氢在过氧化物酶(peroxidase，POD)存在下，与Trinder色原及4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-APP)生成红色醌亚胺物(purple dye)，该物质的生成量与样本中的游离脂肪酸含量呈正比，通过测定其吸光度即可得到样品中游离脂肪酸的浓度。
目前市售酶法游离脂肪酸试剂盒均选用单一的稳定剂，由于游离脂肪酸试剂盒成分比较复杂含有多种酶，其试剂盒稳定性直接与酶活性相关，而酶的活性易受各种因素的干扰，比如pH、温度、紫外线、重金属盐、抑制剂、激活剂等，导致试剂盒缺乏稳定性，保存时间短，影响临床使用。单一的稳定剂已越来越不能满足对试剂盒稳定性的要求。并且由于酶的使用量大，试剂容易出现沉淀。因此，配制一种酶活性稳定、不易沉淀、制备简单、成本低廉游离脂肪酸测定试剂盒是游离脂肪酸测定领域亟需解决的一个问题。
发明内容
为了解决以上游离脂肪酸测定试剂盒中酶活性不稳定且易沉淀从而影响检测准确性的问题，本申请公开了一种试剂盒中酶活性稳定、不易沉淀、检测准确性高的游离脂肪酸检测试剂盒。
本申请还公开了所述游离脂肪酸检测试剂盒的制备方法。
本发明是通过以下措施实现的：
一种游离脂肪酸检测试剂盒，含有试剂1和试剂2，
试剂1组成如下：
磷酸二氢钠50mmol/L，
辅酶A 0.05mmol/l，
三磷酸腺苷3mmol/L，
酰基辅酶A合成酶0.4KU/L，
MgCl2 2mmol/l，
Trinder底物0.5g/l，
调节pH到7.2；
试剂2组成如下：
磷酸二氢钠60mmol/L，
黄素腺嘌呤二核苷酸2mmol/l，
4氨基安替比林10mmol/L，
酰基辅酶A氧化酶40KU/L，
过氧化物酶40KU/L，
烷基糖苷APG0810 1-1.5g/L，
甘露醇0.5g/L，
EDTA-2Na 1g/L，
十二烷基聚氧乙烯醚2-3g/L，
调节pH到7.2。
烷基糖苷APG0810是一种烷基碳数为8-10的烷基多糖苷，是一种非离子表面活性剂。
所述的游离脂肪酸检测试剂盒，优选试剂1和试剂2的体积比为4:1。
所述的游离脂肪酸检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
试剂1的制备：取水，加入磷酸二氢钠，充分溶解，用NaOH调节pH到7.2，依次加入辅酶A、三磷酸腺苷、酰基辅酶A合成酶、MgCl2、Trinder底物，搅拌均匀；
试剂2的制备：取水，加入磷酸二氢钠，充分溶解，用NaOH调节PH到7.2，依次加入黄素腺嘌呤二核苷酸、4氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶、烷基糖苷APG0810、甘露醇、EDTA-2Na、十二烷基聚氧乙烯醚，搅拌均匀。
在上述技术方案中，在试剂2中4种表面活性剂的复合使用来达到稳定试剂中的各种酶的效果，其中烷基糖苷APG0810是由可再生资源天然脂肪醇和葡萄糖合成的，是一种性能较全面的新型非离子表面活性剂，兼具普通非离子和阴离子表面活性剂的特性，具有高表面活性、良好的生态安全性和相溶性，是国际公认的首选“绿色”功能性表面活性剂，0810表示碳数为C8-C10。甘露醇是山梨糖醇的同分异构体，两种醇类物质的二号碳原子上羟基朝向不同，分子式是C6H14O6，分子量为182.17。EDTA-2Na乙二胺四乙酸二钠是化学中一种良好的配合剂，它有六个配位原子，形成的配合物叫做鳌合物。十二烷基聚氧乙烯醚为聚氧乙烯型非离子表面活性剂。
本发明的有益效果：
经过技术人员的不断试验和尝试，最终发现烷基糖苷APG0810、甘露醇、EDTA-2Na、十二烷基聚氧乙烯醚4种成分在一定比例配合用于上述试剂2中，对4氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶等的活性具有很好的稳定左右，在37℃保存10天，检测结果偏差只有3.45％，比同类产品具有更好的稳定性，并且对坏血酸、血红蛋白、胆红素具有很好的抗干扰能力；在保存期内不会形成沉淀，延长了保质期，降低企业风险成本，提高企业效益。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
实施例1：
一种游离脂肪酸检测试剂盒，含有试剂1和试剂2，
试剂1组成如下：
磷酸二氢钠50mmol/L，
辅酶A 0.05mmol/l，
三磷酸腺苷3mmol/L，
酰基辅酶A合成酶0.4KU/L，
MgCl2 2mmol/l，
Trinder底物0.5g/l，
调节pH到7.2；
试剂2组成如下：
磷酸二氢钠60mmol/L，
黄素腺嘌呤二核苷酸2mmol/l，
4氨基安替比林10mmol/L，
酰基辅酶A氧化酶40KU/L，
过氧化物酶40KU/L，
烷基糖苷APG0810 1.5g/L，
甘露醇0.5g/L，
EDTA-2Na 1g/L，
十二烷基聚氧乙烯醚2g/L，
调节pH到7.2。
试剂1和试剂2的体积比为4:1。
试剂1的制备：取水，加入磷酸二氢钠，充分溶解，用NaOH调节pH到7.2，依次加入辅酶A、三磷酸腺苷、酰基辅酶A合成酶、MgCl2、Trinder底物，搅拌均匀；
试剂2的制备：取水，加入磷酸二氢钠，充分溶解，用NaOH调节PH到7.2，依次加入黄素腺嘌呤二核苷酸、4氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶、烷基糖苷APG0810、甘露醇、EDTA-2Na、十二烷基聚氧乙烯醚，搅拌均匀。
实施例2：
一种游离脂肪酸检测试剂盒，含有试剂1和试剂2，
试剂1组成如下：
磷酸二氢钠50mmol/L，
辅酶A 0.05mmol/l，
三磷酸腺苷3mmol/L，
酰基辅酶A合成酶0.4KU/L，
MgCl2 2mmol/l，
Trinder底物0.5g/l，
调节pH到7.2；
试剂2组成如下：
磷酸二氢钠60mmol/L，
黄素腺嘌呤二核苷酸2mmol/l，
4氨基安替比林10mmol/L，
酰基辅酶A氧化酶40KU/L，
过氧化物酶40KU/L，
烷基糖苷APG0810 1g/L，
甘露醇0.5g/L，
EDTA-2Na 1g/L，
十二烷基聚氧乙烯醚3g/L，
调节pH到7.2。
试剂1和试剂2的体积比为4:1。
试剂1的制备：取水，加入磷酸二氢钠，充分溶解，用NaOH调节pH到7.2，依次加入辅酶A、三磷酸腺苷、酰基辅酶A合成酶、MgCl2、Trinder底物，搅拌均匀；
试剂2的制备：取水，加入磷酸二氢钠，充分溶解，用NaOH调节PH到7.2，依次加入黄素腺嘌呤二核苷酸、4氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶、烷基糖苷APG0810、甘露醇、EDTA-2Na、十二烷基聚氧乙烯醚，搅拌均匀。
对比例1：
同实施例1相比，将试剂2中的EDTA-2Na去掉，减少的量用水补齐，其余操作同实施例1相同。
对比例2：
同实施例1相比，将试剂2中的EDTA-2Na用量调整为0.5g/L，减少的量用水补齐，其余操作同实施例1相同。
对比例3：
同实施例1相比，将试剂2中的甘露醇去掉，减少的量用水补齐，其余操作同实施例1相同。对比例4：
同实施例1相比，将试剂2中的烷基糖苷APG0810去掉，减少的量用水补齐，其余操作同实施例1相同。
稳定性试验
使用已知游离脂肪酸含量的同一待检品对检测试剂盒的储存稳定性进行试验。试剂盒置于37℃的环境中，分别在1天、3天、4天、6天、10天对待检品进行检测，使用检测结果来表征其稳定性。下表中数据均为3次检测的平均值。
从上述表格可以看出，对比例1试剂2中将EDTA-2Na去掉后，37℃10天偏差增加到16.18％，对比例2、3、4分别将EDTA-2Na减半、甘露醇、烷基糖苷APG0810去掉后，偏差增加到12.81％、14.71％和10.84％。说明试剂2中烷基糖苷APG0810、甘露醇、EDTA-2Na、十二烷基聚氧乙烯醚4种成分在一定比例配合用于上述试剂2中，对4氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶等的活性具有很好的稳定左右，在37℃保存10天，检测结果偏差只有3.45％，而改变添加比例或者添加种类后，偏差增加明显，说明烷基糖苷APG0810、甘露醇、EDTA-2Na、十二烷基聚氧乙烯醚4种成分在特定的比例时对各种酶稳定效果好。
抗干扰试验
在含有其他成分时，实施例1的试剂盒抗干扰检测数据如下
从上表可以看出本申请的试剂盒抗干扰性能也比较优异。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种游离脂肪酸检测试剂盒，其特征在于由试剂1和试剂2组成，试剂1和试剂2的体积比为4:1；
试剂1组成如下：
磷酸二氢钠50mmol/L，
辅酶A 0.05mmol/l，
三磷酸腺苷 3mmol/L，
酰基辅酶A合成酶 0.4KU/L，
MgCl2 2mmol/l，
Trinder底物 0.5g/l ，
调节pH到7.2；
试剂2组成如下：
磷酸二氢钠60mmol/L，
黄素腺嘌呤二核苷酸 2mmol/l，
4氨基安替比林 10mmol/L，
酰基辅酶A氧化酶 40KU/L，
过氧化物酶40 KU/L，
烷基糖苷APG0810 1-1.5g/L，
甘露醇0.5g/L，
EDTA-2Na 1g/L，
十二烷基聚氧乙烯醚2-3g/L，
调节pH到7.2。
2.一种权利要求1所述的游离脂肪酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
试剂1的制备：取水，加入磷酸二氢钠，充分溶解，用NaOH调节pH到7.2，依次加入辅酶A、三磷酸腺苷、酰基辅酶A合成酶、MgCl2 、Trinder底物，搅拌均匀；
试剂2的制备：取水，加入磷酸二氢钠，充分溶解，用NaOH调节PH到7.2，依次加入黄素腺嘌呤二核苷酸、4氨基安替比林、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶、烷基糖苷APG0810 、甘露醇、EDTA-2Na、十二烷基聚氧乙烯醚，搅拌均匀。
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