CN105203777A - 一种活化部分凝血活酶时间测定试剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种活化部分凝血酶时间测定试剂，组分包括：磷脂、活化剂及稳定剂，所述的稳定剂包括丙氨酸和儿茶酸，所述丙氨酸的加入量为质量体积比1-4％，所述儿茶酸的加入量为0.5-5mM。其制备方法为：制备羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，调节缓冲液pH值至中性，并加入氯化钠；向上述缓冲液中加入活化剂，经搅拌混匀后，加入磷脂及其它组分，经混匀搅拌并过滤后，即得到APTT测定试剂。本发明的活化部分凝血酶时间测定试剂，摒弃了毒性较大的稳定剂成分，使生产和使用过程更安全；同时大大提高了APTT测定试剂的稳定性和检测准确度。

Description

一种活化部分凝血活酶时间测定试剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种凝血试剂及其制备方法，特别涉及一种活化部分凝血活酶时间测定试剂及其制备方法。
背景技术
活化部分凝血活酶时间(APTT)可用于判断内源性凝血活性状态，是临床上主要的凝血性能测试指标之一。活化部分凝血活酶时间测定试剂的主要组份为活化剂和磷脂，磷脂是含有磷酸的脂类，属于复合脂。作为血小板替代物，磷脂参与内源性凝血途径。作为活化部分凝血活酶时间测定试剂的主要组份之一，磷脂富含不饱和脂肪酸，易被氧化从而产生一系列过氧化脂质，从而影响了其生理活性。以磷脂酰胆碱为例，其分子中含有甘油、脂肪酸、磷酸及胆碱等基团。同时，其分子中不同碳位上所接的脂肪酸不同：α碳位(R1CO－)上接的几乎都是饱和脂肪酸，而β碳位(R2CO－)上接的一般为油酸、亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等不饱和脂肪酸。在化学性质上，主要表现在脂键、脂肪酸和磷脂的X基(CH2CH2N(CH3)3)上，可发生包括氧化、羟基化等反应。特别地，其中的不饱和脂肪酸易于氧化发生自发的氧化反应，生成过氧化产物，从而影响了磷脂的性能。
为了避免APTT测定试剂中的磷脂氧化，同时也为了制备稳定性较好的APTT测定试剂，包括避免试剂中微生物和细菌的繁衍，丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚和叠氮酸钠成为APTT测定试剂稳定剂的主要选择，这方面可查询到的专利文献很多，包括早期的专利文献US4455377和US5091304。在这些常用的稳定剂当中，丁基羟基甲苯具有一定的毒性，毒性相对较小，而叠氮酸钠的毒性较大，与铜管等接触易于引爆，因此，增添了生产过程中原料的使用和控制难度。另外，除了加入丁基羟基甲苯或丁基羟基茴香醚、叠氮酸钠以外，为了进一步提升活化部分凝血酶测定试剂的稳定性，在试剂中加入多糖或多醇类聚合物(JP2994557B2，JP3330685B2)，这类物质的加入，可提高APTT所含组成尤其是活化剂的分散性和均匀性，或作为一种助悬剂，提高溶液的粘度，使胶体颗粒能够长期悬浮在溶液中不会沉降，然而，这类高分子化合物的加入，在提升混合液粘度的同时，也会降低采用光学法测定的APTT值的准确度。
发明内容
本发明针对现有APTT测定试剂中稳定剂的不足，提出一种新型的APTT测定试剂，生产安全性更高、稳定性效果更强、检测准确度更高。
本发明采用的技术方案如下：
一种APTT测定试剂，组分包括：磷脂、活化剂及稳定剂，所述的稳定剂包括丙氨酸和儿茶酸，所述丙氨酸的加入量为质量体积比1-4％，所述儿茶酸的加入量为0.5-5mM。
进一步地，上述APTT测定试剂中还包括其它稳定剂，包括：氯化钠、丁基羟基甲苯、抗坏血酸、聚乙二醇、甘露醇、麦芽糖中的一种或几种。
进一步地，上述APTT测定试剂中各组分的含量为：磷脂0.002-0.05％、活化剂0.002-0.08％、丙氨酸1-4％、儿茶酸0.5-5mM，其中的百分比均为质量体积百分比。
优选地，上述APTT测定试剂中各组分的含量为：磷脂0.04％，活化剂0.05％，丙氨酸2.5％，儿茶酸1.5mM，其中的百分比均为质量体积百分比。
上述其它稳定剂的加入量为：氯化钠0.5-3％、丁基羟基甲苯0.01-0.1％、抗坏血酸0.05-0.5％、聚乙二醇0.01-0.5％、甘露醇1-4％、麦芽糖1-3％，其中的百分比均为质量体积百分比。
优选地，上述其它稳定剂的加入量为：氯化钠1.5％，丁基羟基甲苯0.04％、抗坏血酸0.2％、聚乙二醇0.05％、甘露醇2％、麦芽糖的加入量为1.5％，其中的百分比均为质量体积百分比。
所述活化剂为纳米二氧化硅。
所述磷脂是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油中的至少两种，并至少包含磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
上述APTT测定试剂中还可加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，加入量为25-75mM。
上述APTT测定试剂中还可加入调节APTT值的二价金属离子的氯化物，包括氯化镁、氯化钙等。
上述APTT测定试剂的制备过程包括：制备羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，调节缓冲液pH值至中性，并加入氯化钠；向上述缓冲液中加入活化剂，经搅拌混匀后，加入磷脂及其它组分，经混匀搅拌并过滤后，即得到APTT测定试剂。氯化钠早于其它组分加入，一方面起到溶液离子强度调节剂的作用，另一方面起到稳定剂的作用。
与现有的APTT测定试剂相比，本发明试剂有如下优点：(1)采用儿茶酸作为抗氧化剂，儿茶酸中含有邻苯二酚结构，邻苯二酚结构具有很强的金属离子蛰合能力，从而降低了金属离子对氧化反应的催化作用；特别地，在中性条件下，儿茶酸中的酚羟基极易与金属离子螯合，从而阻止金属离子对自由基连锁反应的催化作用。儿茶酸中的邻苯二酚结构能够与过氧自由基发生反应，从而终止脂质过氧化链反应，从而进一步提升了试剂的稳定性能。(2)在制备凝血试剂的过程中，所用原料中的少量重金属离子，会导致APTT测定试剂不稳定，儿茶酸与其它抗氧化剂共同使用时可以增强对金属离子的螯合效果，比如儿茶酸可与丙氨酸一起，起到类似EDTA钠盐或钾盐对金属离子的螯合作用。(3)剔除了一般稳定剂中毒性较大的组份，选用儿茶酸替代常用的叠氮酸钠，APTT测定试剂的生产和使用过程更安全。(4)去掉叠氮酸钠后，用以提升试剂稳定性的多糖或多醇类聚合物用量减少甚至完全不用，大大提高了采用光学法测定的APTT值的准确度。(5)在一般稳定剂的基础上，配合丙氨酸和儿茶酸共同作用，APTT测定试剂的稳定性也更高。
附图说明
图137℃条件下儿茶酸的加入量对APTT测定试剂稳定性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
称取1.5g羟乙基哌嗪乙硫磺酸，加入体积为1.5L的玻璃瓶中，加去离子水至500mL，搅拌溶解，用稀氢氧化钠溶液调节至pH为7.3，加入15g氯化钠、0.2g纳米二氧化硅。经搅拌混匀后，加入0.3g混合磷脂(0.1g磷脂酰丝氨酸和0.2g磷脂酰甘油)，经充分混合均匀后，加入0.4g丁基羟基甲苯、0.5g聚乙二醇和0.5g叠氮酸钠，定容至1L。搅拌混匀并过滤后，滤液即为液态APTT测定试剂。
实施例2
称取1.5g羟乙基哌嗪乙硫磺酸，加入体积为1.5L的玻璃瓶中，加去离子水至500mL，搅拌溶解，用稀氢氧化钠溶液调节至pH为7.3，加入15g氯化钠、0.2g纳米二氧化硅。经搅拌混匀后，加入0.3g混合磷脂(0.1g磷脂酰丝氨酸和0.2g磷脂酰甘油)，经充分混合均匀后，加入0.4g丁基羟基甲苯、0.5g聚乙二醇、12g丙氨酸、1.5mM儿茶酸，定容至1L。搅拌混匀并过滤后，滤液即为液态APTT测定试剂。
实施例1和实施例2的配制组成基本相同，只是在实施例2中，取代实施例1中加入的叠氮酸钠，而改为相应的丙氨酸和儿茶酸。
将实施例1和实施例2配制的APTT测定试剂，结合25mM的氯化钙，用CA1500全自动血凝仪对正常人新鲜血浆的活化部分凝血酶时间进行测定。具体地，将实施例1和实施例2制备的两种APTT测定试剂，在37℃条件下保存，每天定时取样一次，连取15天，检测两种试剂的活化部分凝血酶时间，结果见表1。
表1不同组份活化部分凝血酶时间测定试剂的检测结果单位：秒
上述结果表明，用丙氨酸和儿茶酸替代叠氮酸钠，制备的活化部分凝血酶时间测定试剂的稳定性明显增强。
实施例3
丙氨酸加入量对活化部分凝血酶时间试剂的影响
称取1.7g羟乙基哌嗪乙硫磺酸，加入体积为1.5L的玻璃瓶中，加去离子水至500mL，搅拌溶解，用稀氢氧化钠溶液调节至pH为7.3，加入10g氯化钠、0.6g纳米二氧化硅。经搅拌混匀后，加入0.4g混合磷脂(磷脂磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油各0.1g)，经充分混合均匀后，加入1g聚乙二醇、0.4g丁基羟基甲苯、1g抗坏血酸、1.5mM儿茶酸，丙氨酸的加入量不同，将混合液用去离子水定容至1L。搅拌混匀并过滤后，滤液即为液态APTT测定试剂。
将得到的活化部分凝血酶时间试剂，结合25mM的氯化钙，用CA1500全自动血凝仪对正常人新鲜血浆的活化部分凝血酶时间进行测定。具体地，将丙氨酸含量不等的APTT测定试剂，在37℃条件下保存，每3天定时取样一次，连取15天，测定正常质控血浆的活化部分凝血酶时间值。结果见表2。
表237℃条件下丙氨酸的加入量对活化部分凝血酶时间试剂稳定性的影响单位：s
丙氨酸加入量 初期 3天 7天 15天 CV
0g 34.6 34.8 35.4 35.5 1.16％
10g 34.5 34.5 34.7 34.7 0.33％
25g 34.6 34.6 34.7 34.7 0.17％
40g 34.5 34.5 34.5 34.6 0.14％
50g 34.4 34.4 34.5 34.5 0.17％
从表2可以看出，在APPT测定试剂中，当加入丙氨酸后，试剂的稳定性进一步提升，同时，活化部分凝血酶时间测定试剂有随丙氨酸加入量增加而更加稳定的趋势。
实施例4
儿茶酸加入量对活化部分凝血酶时间测定试剂的影响。
称取1.5g羟乙基哌嗪乙硫磺酸，加入体积为1.5L的玻璃瓶中，加去离子水至500mL，搅拌溶解，用稀氢氧化钠溶液调节至pH为7.3，加入18g氯化钠、0.7g纳米二氧化硅。经搅拌混匀后，加入0.5g混合磷脂(磷脂磷脂酰乙醇胺0.2g、磷脂酰丝氨酸0.2g、磷脂酰甘油0.1g)，经充分混合均匀后，加入25g丙氨酸、1g聚乙二醇、0.5g丁基羟基甲苯、1g抗坏血酸、0.5-5mM儿茶酸，将混合液用去离子水定容至1L。搅拌混匀并过滤后，滤液即为液态APTT测定试剂。
将得到的APTT测定试剂，结合25mM的氯化钙，用CA1500全自动血凝仪对正常人新鲜血浆的活化部分凝血酶时间进行测定。具体地，变化儿茶酸的添加量，分别制备儿茶酸添加量不同的APTT测定试剂。将上述制备的APTT测定试剂，在37℃条件下保存，每3天定时取样一次，连取15天，测定正常质控血浆的活化部分凝血酶时间值。结果表明，随儿茶酸加入量的增加，活化部分凝血酶时间测定试剂的稳定性趋于增强，儿茶酸加入量低于1mM时，CV值随儿茶酸的添加量增加而减少幅度明显，在所选择的浓度范围内，总体上浓度与稳定性呈正相关(图1)。
从上述结果得知，在活化部分凝血酶时间试剂中，用丁基羟基甲苯、抗坏血酸、丙氨酸与儿茶酸组成，替代丁基羟基甲苯与叠氮酸钠组合，不仅消除了生产与管理工序中的原料不利因素，同时用本发明制备的活化部分凝血酶时间试剂，具有更好的稳定性能。
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Claims (10)

1.一种APTT测定试剂，其特征在于，组分包括：磷脂、活化剂及稳定剂，所述的稳定剂包括丙氨酸和儿茶酸，所述丙氨酸的加入量为质量体积比1-4％，所述儿茶酸的加入量为0.5-5mM。
2.根据权利要求1所述的APTT测定试剂，其特征在于，组分中还包括其它稳定剂，包括：氯化钠、丁基羟基甲苯、抗坏血酸、聚乙二醇、甘露醇、麦芽糖中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的APTT测定试剂，其特征在于，所述各组分的含量为：磷脂0.002-0.05％、活化剂0.002-0.08％、丙氨酸1-4％、儿茶酸0.5-5mM，其中的百分比均为质量体积百分比。
4.根据权利要求1或2所述的APTT测定试剂，其特征在于，所述各组分的含量为：磷脂0.04％，活化剂0.05％，丙氨酸2.5％，儿茶酸1.5mM，其中的百分比均为质量体积百分比。
5.根据权利要求2所述的APTT测定试剂，其特征在于，所述其它稳定剂的加入量为：氯化钠0.5-3％、丁基羟基甲苯0.01-0.1％、抗坏血酸0.05-0.5％、聚乙二醇0.01-0.5％、甘露醇1-4％、麦芽糖1-3％，其中的百分比均为质量体积百分比。
6.根据权利要求1或2所述的APTT测定试剂，其特征在于，所述活化剂为纳米二氧化硅。
7.根据权利要求1或2所述的APTT测定试剂，其特征在于，所述磷脂是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油中的至少两种，并至少包含磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
8.根据权利要求1或2所述的APTT测定试剂，其特征在于，组分中还含有25-75mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液。
9.根据权利要求1或2所述的APTT测定试剂，其特征在于，组分中还含有二价金属离子的氯化物。
10.根据权利要求1或2或5所述的APTT测定试剂的制备方法，其特征在于，过程如下：制备羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，调节缓冲液pH值至中性，并加入氯化钠；向上述缓冲液中加入活化剂，经搅拌混匀后，加入磷脂及其它组分，经混匀搅拌并过滤后，即得到APTT测定试剂。
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