CN114047150B - 一种脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂、制备方法及其应用。该检测试剂包括第一试剂、第二试剂和第三试剂，第一检测试剂包括破乳剂，第二检测试剂包括底物和乳化剂，第三检测试剂包括酶失活剂和碱金属盐。该检测试剂的制备方法包括乳化步骤。该检测试剂的应用方法包括将第一试剂与第二试剂混合振荡的步骤。本发明通过改变底物在检测试剂中存在状态，避免底物在检测试剂存储过程中发生水解，而在检测时又能迅速溶解于检测体系中参与酶催化反应，减少待测样品中其他酶的影响，能够提供酶催化反应终点，并增加反应产物的可检测性，提高检测脂蛋白相关磷脂酶A2活性的准确性、稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及临床医学参数检测技术领域，具体涉及一种脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂、制备方法及其应用。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高，人们摄入的糖、脂肪等营养物质比重升高，由此引起的心脑血管疾病的发病率逐年上升。研究显示，动脉粥样硬化是导致心脑血管疾病的主要原因。
动脉粥样硬化的形成是由于血管中粘附因子和细胞因子的促进作用，促炎介质能够刺激粘附因子和细胞因子的产生，主要的促炎介质有溶血磷脂酰胆碱、氧化型游离脂肪酸等。医学研究结果表明，脂蛋白相关磷脂酶A2(简称Lp-PLA2)能够将动脉内膜上的低密度脂蛋白的氧化磷脂水解，产生上述促炎物质。因此，通过检测血液中脂蛋白相关磷脂酶A2的活性、浓度等参数能够为临床医生提供有利的预防、诊断、治疗手段。
目前，可临床上检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法主要有基于免疫反应原理的ELISA和免疫比浊法，以及酶学生化法。基于免疫反应原理的方法存在操作时间长、准确性不足，自动化程度低等缺陷，并且无法区分具有活性的酶和已经失活的酶，逐渐不被使用。酶学生化法是利用具有活性的脂蛋白相关磷脂酶A2催化外加的底物类似物，产生能够被检测的物质，通过检测该物质的变化量，计算脂蛋白相关磷脂酶A2的活性。该方法主要是使用带有4-硝基苯酚的底物类似物，在脂蛋白相关磷脂酶A2的作用下，产生带有4-硝基苯酚基团的物质，该物质可马上分解成4-硝基苯酚，使用分光光度计测定吸光度的变化，从而测定出酶活。此方法具有反应灵敏、受外界影响小、易于自动化，操作方便等优点。但存在底物难溶于水，或在助溶剂条件下溶于水但存在自然水解而导致不稳定，试剂不能长时间保存，且增加本底测定值，降低测定灵敏度；待测样品中存在其他酶，也能够水解加入的带有4-硝基苯酚基团的底物类似物，造成测定结果不准确；酶催化反应终点无法确定，只能通过测定的时间点确定；反应产物4-硝基苯酚在反应体系中可检测性不高，易受其他物质干扰的问题。
因此，需要提供一种能够解决上述问题的脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂、制备方法及其应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂、制备方法及其应用，通过改变底物在检测试剂中存在状态，避免底物在检测试剂存储过程中发生水解，而在检测时又能迅速溶解于检测体系中参与酶催化反应，减少待测样品中其他酶的影响，能够提供酶催化反应终点，并增加反应产物的可检测性，提高检测脂蛋白相关磷脂酶A2活性的准确性、稳定性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂，所述检测试剂包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；
所述第一试剂含有破乳剂、助溶剂、缓冲剂、螯合剂、有机酸、无机盐；
所述第二试剂含有底物、乳化剂；
所述第三试剂含有酶失活剂、碱金属盐。
优选地，所述破乳剂包括戊烷磺酸盐、己烷磺酸盐、庚烷磺酸盐、壬烷磺酸盐中的一种或几种。
优选地，所述乳化剂包括聚乙二醇、吐温中的至少一种。
优选地，所述酶失活剂包括奥利司他、尿素、盐酸胍、丙酮中的一种或几种。
优选地，所述碱金属盐包括碱金属碳酸盐，所述碱金属碳酸盐包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾中的一种或几种。
优选地，所述第一试剂、第二试剂和第三试剂为水溶液；
所述第一试剂的各物质的浓度为：破乳剂100mg/L～220mg/L、助溶剂10wt％～20wt％、缓冲剂30mmol/L～100mmol/L、螯合剂10mmol/L～30mmol/L、有机酸5mmol/L～60mmol/L、无机盐80mmol/L～120mmol/L；
所述第二试剂的各物质的浓度为：底物0.5wt％～2.7wt％、乳化剂0.01wt％～0.5wt％；
所述第三试剂的各物质的浓度为：酶失活剂0.5wt％～10wt％、碱金属盐200mmol/L～400mmol/L。
第二方面，本发明提供一种脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
根据需要配制第一试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：破乳剂100mg/L～220mg/L、助溶剂10wt％～20wt％、缓冲剂30mmol/L～100mmol/L、螯合剂10mmol/L～30mmol/L、有机酸5mmol/L～60mmol/L、无机盐80mmol/L～120mmol/L，溶解于相应体积的去离子水中，并用2mol/L～5mol/L的盐酸将pH值调节到4.0～7.6，得到第一试剂；
根据需要配制第二试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：底物0.5wt％～2.7wt％、乳化剂0.01wt％～0.5wt％，然后在一定温度下将底物与乳化剂混合，在搅拌条件下加入去离子水，高速匀质，得到第二试剂；
根据需要配制第三试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：酶失活剂0.5wt％～10wt％、碱金属盐200mmol/L～400mmol/L，溶解于相应体积的去离子水中，并用2mol/L～5mol/L的盐酸将pH值调节到7.0～9.2，得到第三试剂。
优选地，所述底物与乳化剂混合的温度为40℃～70℃。
优选地，所述底物与乳化剂混合的搅拌速度为100转/分钟～300转/分钟。
第三方面，本发明提供一种脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂的应用方法，所述应用方法包括以下步骤：
将待测样品与所述第一试剂混合；
一定时间后加入所述第二试剂，振荡混匀，测定吸光度；
一定时间后加入所述第三试剂，振荡混匀，测定吸光度；
计算吸光度及脂蛋白相关磷脂酶A2的活性。
相对于现有技术，本发明具有以下有益技术效果：①将底物在存储时的检测试剂中存在状态改变为非溶解状态，避免底物在检测试剂存储过程中发生水解，而在检测时又能迅速溶解于检测体系中参与酶催化反应，降低了检测试剂的本底值，提高了检测结果的准确性；②在检测试剂中增加了能够迅速使脂蛋白相关磷脂酶A2失活及变性的组分，从而能够提供酶催化反应实际终点，避免了因检测时间不同而造成的测定结果不稳定的问题；③增加了提高酶解产物可检测性的组分，提高了检测的准确度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合；并且，基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。
需要说明的是，下文描述在所附权利要求书的范围内的实施例的各种方面。应显而易见，本文中所描述的方面可体现于广泛多种形式中，且本文中所描述的任何特定结构及/或功能仅为说明性的。基于本公开，所属领域的技术人员应了解，本文中所描述的一个方面可与任何其它方面独立地实施，且可以各种方式组合这些方面中的两者或两者以上。举例来说，可使用本文中所阐述的任何数目各方面来实施设备及/或实践方法。
需要说明的是，本申请文件中所编序号本身，例如“第一”、“第二”、“第三”等，仅区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
本发明所提供的一种脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂、制备方法及其应用，通过改变底物在检测试剂中存在状态，避免底物在检测试剂存储过程中发生水解，而在检测时又能迅速溶解于检测体系中参与酶催化反应，减少待测样品中其他酶的影响，能够提供酶催化反应终点，并增加反应产物的可检测性，提高检测脂蛋白相关磷脂酶A2活性的准确性、稳定性。
本发明提供一种脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂，该检测试剂包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；
第一试剂含有破乳剂、助溶剂、缓冲剂、螯合剂、有机酸、无机盐；
第二试剂含有底物、乳化剂；
第三试剂含有酶失活剂、碱金属盐。
优选地，破乳剂包括戊烷磺酸盐、己烷磺酸盐、庚烷磺酸盐、壬烷磺酸盐中的一种或几种。
进一步优选地，磺酸盐对应的阳离子包括钠离子、钾离子。例如可以是戊烷磺酸钠、戊烷磺酸钾、己烷磺酸钠、己烷磺酸钾、庚烷磺酸钠、庚烷磺酸钾、壬烷磺酸钠、壬烷磺酸钾等。
需要说明的是，本发明的破乳剂能够使含有底物的乳液破乳，使底物溶解于待测样品、第一试剂和第二试剂形成的溶液中，从而能够被待测样品中脂蛋白相关磷脂酶A2催化水解；此外，本发明的破乳剂还具有抑制待测样本中其他酯酶活性的作用，还可以消除血清中胆红素、乳糜、维生素等杂质的干扰，提高测定结果的准确度。
优选地，助溶剂包括醇类化合物，例如可以是乙醇、丙二醇、甘油等一元醇或者多元醇中一种或者几种。本发明的助溶剂的作用是促进破乳后的底物快速溶解于待测样品、第一试剂和第二试剂形成的溶液体系中。
优选地，缓冲剂包括磷酸类无机盐，可以是磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、磷酸盐。例如可以是磷酸一氢钠、磷酸一氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸钠、磷酸钾中的至少一种。其作用是为脂蛋白相关磷脂酶A2提供相对稳定的溶液渗透压环境和pH值。
优选地，螯合剂包括基三亚甲基膦酸、乙二胺四乙酸钠中的至少一种。
进一步优选地，螯合剂还可以包括1，4-甘露糖醛酸、1，4-古洛糖醛酸、壳寡糖等的至少一种。
螯合剂的作用是螯合待测样品中的金属离子，尤其是钙离子、锌离子等二价金属离子，因为这些金属离子是很多生物酶的活性促进剂或者维持剂，但脂蛋白相关磷脂酶A2的活性并不依赖于金属离子，最大限度降低待测样品中金属离子的浓度，能够抑制其他对测定结果有影响的酶的酶活，甚至使其失活。1，4-甘露糖醛酸、1，4-古洛糖醛酸、壳寡糖对二价金属离子的亲和性更高，可以将其他酶的酶活降低到更低的程度。
优选地，有机酸包括乳酸、丁二酸、苹果酸、柠檬酸中的至少一种。其作用是调节测定溶液体系的pH，使溶液的pH保持在脂蛋白相关磷脂酶A2最适pH范围内。
优选地，无机盐包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠中的至少一种。
优选地，底物选自1-十四酰-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油、1-十四酰-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆酰中的至少一种。
优选地，乳化剂包括聚乙二醇、吐温中的至少一种。
进一步优选地，聚乙二醇包括聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800中的至少一种。聚乙二醇200表示平均分子量为200的聚乙二醇。
进一步优选地，吐温包括吐温20、吐温40中的至少一种。
需要说明的是，本发明的乳化剂的作用是促进较高浓度的底物在水中形成稳定的乳液，阻止底物与溶液中的水长时间接触，减少检测试剂储存期间底物的水解作用，以降低空白检测值，提高检测准确度。
需要说明的是，本发明的第二试剂的配比中，加入了较高浓度的底物，其在选定的乳化剂存在时，在一定搅拌混合条件下，能够形成类似“水包油”的稳定乳化液，也称乳液。该乳液是水相连续，油相分散的状态。油相主体是底物形成的液滴。
需要进一步说明的是，本发明的第一试剂中的破乳剂和助溶剂，第二试剂中的乳化剂和底物的设置方式，实现了检测试剂储存阶段底物与水不接触，防止底物储存过程中水解，也较大程度上降低了底物被氧化破坏的可能性；而在检测过程中，第二试剂中底物与乳化剂形成的稳定液滴在破乳剂的作用下迅速分裂，再在助溶剂的作用下，溶解于测试体系的溶液中，能够实现与脂蛋白相关磷脂酶A2的接触并发生水解反应，使检测得以顺利进行。
本发明的上述设置，使本发明的脂蛋白相关磷脂酶A2的测试试剂在不使用稳定剂、抗氧化剂的情况下，能够维持底物的稳定性。
优选地，酶失活剂包括奥利司他、尿素、盐酸胍、丙酮中的一种或几种。
进一步优选地，加入的酶失活剂为奥利司他和丙酮的混合物。
进一步优选地，酶失活剂中的奥利司他和丙酮的质量比为1:10～4:10之间的任意比值。例如可以是1:10、2:10、3:10、4:10、2.2:10等
需要说明的是，本发明第三试剂中的酶失活剂的作用是在一定时间点将脂蛋白相关磷脂酶A2的活性迅速且最大程度降低，以迅速中止脂蛋白相关磷脂酶A2与底物之间的酶促反应，以避免因反应时间不一致导致的检测结果偏大、偏小等不准确的问题。
需要说明的是，奥利司他，系统命名为(S)-2-甲酰氨-4-甲基-戊酸(S)-1-[[(2S,3S)-3-己基-4-氧-氧杂环丁基]甲基]-十二烷基酯，是一种酯酶抑制剂，可以抑制脂蛋白相关磷脂酶A2与底物之间的酶促反应。丙酮是一种蛋白质变性剂，其作用到脂蛋白相关磷脂酶A2后，使该酶的蛋白质结构发生变化，失去活性。奥利司他和丙酮相互配合和补充，从抑制酶活和使酶蛋白变性两方面入手，迅速中止脂蛋白相关磷脂酶A2与底物之间的酶促反应，以避免因开始酶促反应的时间点与检测时间点之间的间隔时间不一致导致的测定结果不准确的问题。
需要进一步说明的是，丙酮除了具有使酶蛋白变性作用，还具有促进底物水解物4-硝基苯酚溶解于测试体系溶液的作用，有利于提高4-硝基苯酚的测定准确度。
优选地，碱金属盐包括碱金属碳酸盐，所述碱金属碳酸盐包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾中的一种或几种。
需要说明的是，在水溶液中，碱金属碳酸盐能够增加4-硝基苯酚的颜色，提高其在分光光度过程中可检测性。
优选地，第一试剂、第二试剂和第三试剂为水溶液；
第一试剂的各物质的浓度为：破乳剂100mg/L～220mg/L、助溶剂10wt％～20wt％、缓冲剂30mmol/L～100mmol/L、螯合剂10mmol/L～30mmol/L、有机酸5mmol/L～60mmol/L、无机盐80mmol/L～120mmol/L；
第二试剂的各物质的浓度为：底物0.5wt％～2.7wt％、乳化剂0.01wt％～0.5wt％；
第三试剂的各物质的浓度为：酶失活剂0.5wt％～10wt％、碱金属盐200mmol/L～400mmol/L。
在一些实施例中，第一试剂中破乳剂的浓度可以为100mg/L～220mg/L之间的任意数值。例如可以是100mg/L、120mg/L、140mg/L、160mg/L、180mg/L、200mg/L、220mg/L。
在一些实施例中，第一试剂中助溶剂的浓度可以为10wt％～20wt％之间的任意数值。例如可以是10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％。
在一些实施例中，第一试剂中缓冲剂的浓度可以为30mmol/L～100mmol/L之间的任意数值。例如可以是30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L。
在一些实施例中，第一试剂中螯合剂的浓度可以为10mmol/L～30mmol/L之间的任意数值。例如可以是10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L、16mmol/L、18mmol/L、20mmol/L、22mmol/L、24mmol/L、26mmol/L、28mmol/L、30mmol/L。
在一些实施例中，第一试剂中有机酸的浓度可以为5mmol/L～60mmol/L之间的任意数值。例如可以是5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L、60mmol/L。
在一些实施例中，第一试剂中无机盐的浓度可以为80mmol/L～120mmol/L之间的任意数值。例如可以是80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、110mmol/L、120mmol/L。
在一些实施例中，第二试剂中底物的浓度可以为0.5wt％～2.7wt％之间的任意数值。例如可以是0.5wt％、0.7wt％、0.8wt％、1.0wt％、1.1wt％、1.3wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.8wt％、1.9wt％、2.1wt％、2.2wt％、2.3wt％、2.5wt％、2.7wt％、。
在一些实施例中，第二试剂中乳化剂的浓度可以为0.01wt％～0.5wt％之间的任意数值。例如可以是0.01wt％、0.05wt％、0.1wt％、0.15wt％、0.2wt％、0.25wt％、0.3wt％、0.35wt％、0.4wt％、0.45wt％、0.5wt％。
进一步优选地，酶失活剂的浓度随加入的具体物质不同而不同。
在一些实施例中，第三试剂中酶失活剂为奥利司他，其浓度可以为0.5wt％～1.5wt％之间的任意数值。例如可以是0.5wt％、0.6wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.5wt％。
在一些实施例中，第三试剂中酶失活剂为尿素，其浓度可以为5wt％～10wt％之间的任意数值。例如可以是5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％。
在一些实施例中，第三试剂中酶失活剂为盐酸胍，其浓度可以为3wt％～7wt％之间的任意数值。例如可以是3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％。
在一些实施例中，第三试剂中酶失活剂为丙酮，其浓度可以为1.5wt％～6wt％之间的任意数值。例如可以是1.5wt％、2.0wt％、2.5wt％、3.0wt％、3.5wt％、4.0wt％、4.5wt％、5.0wt％、5.5wt％、6.0wt％。
在一些实施例中，第三试剂中碱金属盐的浓度可以为200mmol/L～400mmol/L之间的任意数值。例如可以是220mmol/L、240mmol/L、260mmol/L、280mmol/L、300mmol/L、320mmol/L、340mmol/L、360mmol/L、380mmol/L、400mmol/L。
本发明还提供一种脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
根据需要配制第一试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：破乳剂100mg/L～220mg/L、助溶剂10wt％～20wt％、缓冲剂30mmol/L～100mmol/L、螯合剂10mmol/L～30mmol/L、有机酸5mmol/L～60mmol/L、无机盐80mmol/L～120mmol/L，溶解于相应体积的去离子水中，并用2mol/L～5mol/L的盐酸将pH值调节到4.0～7.6，得到第一试剂；
根据需要配制第二试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：底物0.5wt％～2.7wt％、乳化剂0.01wt％～0.5wt％，然后在一定温度下将底物与乳化剂混合，在搅拌条件下加入去离子水，高速匀质，得到第二试剂；
根据需要配制第三试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：酶失活剂0.5wt％～10wt％、碱金属盐200mmol/L～400mmol/L，溶解于相应体积的去离子水中，并用2mol/L～5mol/L的盐酸将pH值调节到7.0～9.2，得到第三试剂。
在一些具体实施方式中，第一试剂的pH可以是4.0～7.6之间的任意数值。例如可以是4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.6。
在一些具体实施方式中，第三试剂的pH可以是7.0～9.2之间的任意数值。例如可以是7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.2。
优选地，底物与乳化剂混合的温度为40℃～70℃。
在一些具体实施方式中，底物与乳化剂混合的温度可以是40℃～70℃之间的任意数值。例如可以是40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃。
优选地，底物与乳化剂混合的搅拌速度为100转/分钟～300转/分钟。
在一些具体实施方式中，底物与乳化剂混合的搅拌速度可以是100转/分钟～300转/分钟之间的任意数值。例如可以是100转/分钟、120转/分钟、140转/分钟、160转/分钟、180转/分钟、200转/分钟、250转/分钟、280转/分钟、300转/分钟。
在一个具体实施方式中，第二试剂的配制过程如下：根据需要配制第二试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：底物0.5wt％～2.7wt％、乳化剂0.01wt％～0.5wt％，然后在将底物与乳化剂均维持在40℃～70℃下以后混合，然后在搅拌速度为100转/分钟～250转/分钟的速度下搅拌10～30分钟，在搅拌速度为150转/分钟～300转/分钟的速度下加入去离子水，加入速度为匀速20～30分钟内加入完毕，最后高速匀质5～20分钟，得到第二试剂。
需要说明的是，高速匀质为采用现有技术的高速匀质装置进行匀质。
基于相同的发明构思，本发明还提供一种脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂的应用方法，所述应用方法包括以下步骤：
将待测样品与所述第一试剂混合；
一定时间后加入所述第二试剂，振荡混匀，测定吸光度；
一定时间后加入所述第三试剂，振荡混匀，测定吸光度；
计算吸光度及脂蛋白相关磷脂酶A2的活性。
在一个具体实施方式中，脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂的应用过程如下：使用现有技术的生化分析仪进行测定，以加入第一试剂的时间点为零时刻，首先将5～10微升待测样品与150～250微升第一试剂混合，在35～39℃下振荡混合3～6分钟；其次加入5～10微升第二试剂，在1～2分钟内振荡混匀，测定得到第一吸光度；约3～5分钟后加入50～100微升第三试剂，在2分钟内振荡混匀，测定得到第二吸光度；根据第一吸光度和第二吸光度计算脂蛋白相关磷脂酶A2的活性。
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的技术方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限定。
实施例1-6
按照如下步骤和条件制备本发明的脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂。
根据需要配制第一试剂的体积，按照如表1所示的具体组分和配比计算并称取如下组分的配料：破乳剂、助溶剂、缓冲剂、螯合剂、有机酸、无机盐，溶解于相应体积的去离子水中，实施例1使用浓度为2mol/L的盐酸将pH调节到7.6，实施例2使用浓度为4.5mol/L的盐酸将pH调节到4.0，实施例3使用浓度为3mol/L的盐酸将pH调节到5.5，实施例4使用浓度为4mol/L的盐酸将pH调节到6.2，实施例5使用浓度为3.5mol/L的盐酸将pH调节到5，实施例6使用浓度为5mol/L的盐酸将pH调节到7，得到相应实施例的第一试剂；
表1制备本发明的第一试剂的各组分配比
根据需要配制第二试剂的体积，按照如表2所示的具体组分和配比计算并称取如下组分的配料：底物、乳化剂，实施例1、3、5使用的底物为1-十四酰-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油，实施例2、4、6使用的底物为1-十四酰-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆酰，然后在将底物与乳化剂均维持在一定温度下以后混合，然后在搅拌一段时间，在搅拌条件下加入去离子水，在一定时间内加入完毕，最后高速匀质一段时间，底物与乳化剂混合温度、搅拌速度、去离子水的加入速度、高速匀质时间等条件如表3所示，得到第二试剂；
表2制备本发明的第二试剂的各组分配比
表3制备本发明的各操作参数设置
根据需要配制第二试剂的体积，按照如表4所示的具体组分和配比计算并称取如下组分的配料：酶失活剂、碱金属盐，溶解于相应体积的去离子水中，实施例1使用浓度为2.2mol/L的盐酸将pH调节到7.6，实施例2使用浓度为4.4mol/L的盐酸将pH调节到8.9，实施例3使用浓度为2.9mol/L的盐酸将pH调节到8.6，实施例4使用浓度为4.2mol/L的盐酸将pH调节到9.2，实施例5使用浓度为7.3mol/L的盐酸将pH调节到5，实施例6使用浓度为5mol/L的盐酸将pH调节到8.2，得到第三试剂。
表4制备本发明的第三试剂的各组分配比
采用如下检测方法，对实施例1～6得到的脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂进行测试：使用现有技术的生化分析仪进行测定，以加入第一试剂的时间点为零时刻，首先将5微升待测样品与200微升第一试剂混合，在38℃下振荡混合至第5分钟；加入6微升第二试剂，振荡混匀至第7分钟，405纳米下测定得到第一吸光度；在第11分钟加入80微升第三试剂，振荡混匀至第13分钟，405纳米下测定得到第二吸光度；根据第一吸光度和第二吸光度计算脂蛋白相关磷脂酶A2的活性。使用每个实施例对应的检测试剂对用一批待测样品进行多次检测，计算得到的检测限、精密度、准确性结果如表5所示。测定结果的检测限、精密度、稳定性计算方法采用现有技术的方法进行，稳定性是指在检测试剂开封后的前3天，每隔6小时检测同一待测样品的测定结果偏离平均值的程度。
表5制备本发明的第三试剂的各组分配比
本发明的脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂的储存稳定测试采用如下方法进行：将同一批次制备的检测试剂避光储存在2～4℃冰箱中，分别在第0、4、8、12、16、20、24个月取出一份并开封测定其空白吸光度，空白吸光度的测定步骤与测定待测样品的步骤相同，使用去离子水代替相同体积的样品，检测结果如表6所示。从表6的测定结果可以看出本发明的检测试剂在合适条件下的储存期超过20个月。
表6本发明的检测试剂的储存稳定性测试(405纳米下的吸光值)
对比例1
按照实施例3中制备检测试剂的各种组分及配比，但第一试剂的破乳剂加入量减少为100mg/L，其仅作为抑制剂使用，将第一试剂的助溶剂改为加入第二试剂；第二试剂不制备成乳液的形式，不加入乳化剂，将相同质量底物溶解于去离子水中，其在本对比例的第二试剂中的浓度为0.27wt％，加入与实施例3的第一试剂相同浓度的助溶剂，再加入稳定剂葡聚糖40，加入量为0.1wt％。本对比例1得到的检测试剂测试结果如下：检测限2.0U/L，精密度4.9％，稳定性7.4％；在于实施例3相同的储存条件下储存0、4、8、12、16、20、24个月对应的空白吸光度分别为880、948、1032、1127、1439、1647、1873。可知采用本对比例1的检测试剂的检测结果检测限、精密度均升高，稳定性变差；储存稳定性仅为12个月左右，并且初始的空白吸光度较实施例3大幅升高。
对比例2
按照实施例3中制备检测试剂的各种组分、配比及方法制备第一试剂和第二试剂，但不制备和使用第三试剂。参照实施例3的检测方法，省去加入第三试剂的步骤。本对比例2得到的检测试剂测试结果如下：检测限0.6U/L，精密度3.8％，稳定性6.1％；存储期与实施例3基本没有差异。由此可知，在不使用第三试剂的情况下，检测结果的精密度和稳定性均有一定程度的降低，其原因主要在于没有及时终止酶促反应，导致第一吸光度与第二吸光度测定间隔不同，测定值偏差大，从而导致精密度和稳定性变差。
Claims (5)
1.一种脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括第一试剂、第二试剂和第三试剂，所述第一试剂、第二试剂和第三试剂为水溶液；
所述第一试剂含有破乳剂100mg/L~220mg/L、助溶剂10wt%~20wt%、缓冲剂30mmol/L~100 mmol/L、螯合剂10mmol/L~30 mmol/L、有机酸5mmol/L~60 mmol/L、无机盐80mmol/L~120 mmol/L；
所述破乳剂包括戊烷磺酸盐、己烷磺酸盐、庚烷磺酸盐、壬烷磺酸盐中的一种或几种；
所述助溶剂包括乙醇、丙二醇、甘油中一种或者几种；
所述螯合剂包括1，4-甘露糖醛酸、1，4-古洛糖醛酸、壳寡糖中的至少一种；
所述第二试剂含有底物0.5wt%~2.7wt%、乳化剂0.01wt%~0.5wt%；
所述底物选自1-十四酰-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油、1-十四酰-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆酰中的至少一种；
所述乳化剂包括聚乙二醇、吐温中的至少一种；
所述第三试剂含有酶失活剂0.5wt%~10wt%、碱金属盐200mmol/L~400 mmol/L；
所述酶失活剂为奥利司他和丙酮的混合物；
所述碱金属盐包括碱金属碳酸盐。
2.根据权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂，其特征在于，所述碱金属碳酸盐包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾中的一种或几种。
3.一种如权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
根据需要配制第一试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：破乳剂100mg/L~220mg/L、助溶剂10wt%~20wt%、缓冲剂30mmol/L~100 mmol/L、螯合剂10mmol/L~30 mmol/L、有机酸5mmol/L~60 mmol/L、无机盐80mmol/L~120 mmol/L，溶解于相应体积的去离子水中，并用2mol/L~5 mol/L的盐酸将pH值调节到4.0~7.6，得到第一试剂；
根据需要配制第二试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：底物0.5wt%~2.7wt%、乳化剂0.01wt%~0.5wt%，然后在一定温度下将底物与乳化剂混合，在搅拌条件下加入去离子水，加入速度为匀速20~30分钟内加入完毕，高速匀质5~20分钟，得到第二试剂；
根据需要配制第三试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：酶失活剂0.5wt%~10wt%、碱金属盐200mmol/L~400 mmol/L，溶解于相应体积的去离子水中，并用2mol/L~5mol/L的盐酸将pH值调节到7.0~9.2，得到第三试剂。
4.根据权利要求3所述的脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂的制备方法，其特征在于，所述底物与乳化剂混合的温度为40℃~70℃。
5.根据权利要求3所述的脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂的制备方法，其特征在于，所述底物与乳化剂混合的搅拌速度为100转/分钟~300转/分钟。
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Denomination of invention: A detection reagent, preparation method, and application of lipoprotein associated phospholipase A2 Effective date of registration: 20231229 Granted publication date: 20220726 Pledgee: Zhejiang Juzhou Commercial Bank Co.,Ltd. Wenzhou Ouhai Branch Pledgor: ZHEJIANG ERKN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023980074162 |
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