CN108562749A - 一种脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂 - Google Patents

一种脂蛋白相关磷脂酶a2检测试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂，包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂的组成成分为：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）100mmol/L、乙二胺四乙酸（EDTA）15mmol/L、3‑[3‑（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）10mmol/L、正壬烷磺酸钠10mmol/L、氯化钠100mmol/L、氯化镁10mmol/L、防腐剂0.1％；所述R2试剂的组成成分为：柠檬酸18mmol/L、正壬烷磺酸钠10mmol/L、乙醇或甘油20％、底物5mmol/L、防腐剂0.1％、稳定剂0.1％。本发明反应灵敏，受外界的影响较小，使用乙醇或甘油可以促进疏水性底物形成水相，使检测更快速灵敏，检测结果准确可靠，能真实反应血清中Lp‑PLA2的生物活性，解决了现有检测方法容易受到干扰而导致结果不准确，或无法反映脂蛋白相关磷脂酶A2的生物活性的技术问题。

Description

一种脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂。
背景技术
心血管疾病是危害人类健康的严重疾病，是造成死亡的主要原因之一。预防、检测和治疗心血管疾病一直是全世界医学工作者努力不懈的目标。经研究发现，心脑血管疾病的病理基础就是动脉粥样硬化。
近来的研究也不断证实：除血脂异常外，炎症和氧化应激也是动脉粥样硬化病理生理发生和发展的重要机制。而促成血管炎症和氧化应激的就是脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）。Lp-PLA2也称血小板活化因子（PAF）乙酰水解酶，血液循环中的Lp-PLA2由血管内膜中的巨噬细胞、T细胞和肥大细胞分泌，大多以结合脂蛋白颗粒的形式存在，主要与低密度脂蛋白（LDL）结合，少量结合高密度脂蛋白和极低密度脂蛋白。Lp-PLA2通过水解动脉内膜上的LDL上的氧化卵磷脂，从而生成溶血卵磷脂和游离的氧化脂肪酸，后二者是促炎介质，能刺激粘附因子和细胞因子的产生，从而导致单核细胞由管腔向内膜聚集。单核细胞在内膜聚集后衍生为巨噬细胞，巨噬细胞吞噬oxLDL变成凋亡的泡沫细胞。而这些活化的巨噬细胞和泡沫细胞会产生更多的Lp-PLA2重返至循环中。凋亡的泡沫细胞聚集成动脉粥样硬化性斑块，斑块能释放细胞因子和蛋白酶，降解纤维帽的平滑肌细胞和胶原基质，使斑块变得脆弱、破裂，导致血栓形成和心血管事件的发生。因此Lp-PLA2在血液中的浓度是判断心脑血管疾病严重程度和预后的重要指标。
在检测方法学方面，主要分活性的测定和质量的测定。前者相关的方法有滴定分析法，放射性核素法，分光光度计测量法和荧光计法。不过这些方法都用于实验研究，并没有标准化。后者是基于免疫反应的原理而测定LP-PLA2的质量，包括ELISA和免疫比浊法。早前，FDA批准了Lp-PLA2的ELISA测定法，用该方法评估动脉粥样硬化相关的冠心病和缺血中风患者发生心血管事件的风险，但是近来由于其定量准确性差，操作时间长，自动化程度低，逐渐不被临床医生所接受；而免疫比浊法具有高特异性但无法区别失活的酶及代谢产物，从而无法反映具有生物活性的Lp-PLA2真实含量。因此研究出适用于全自动生化分析仪的准确测定Lp-LPA2的试剂将具有非常重要的意义。目前，研究人员更倾向于酶学生化测定的方法，该方法是基于Lp-PLA2酶活性催化底物而建立的，具有简单方便，能即时反应血清中Lp-PLA2活性的优点。
目前使用酶学生化法测定Lp-PLA2活性的原理有两种：一是使用PAF硫脂类为底物。漆原理是酶水解PAF硫酯类似物上sn-2位的硫酯基团，释放出游离硫醇，然后加入可以检测硫醇的二硝苯甲酸，在405nm处检测吸收光的改变。此法优点是可以方便及大量的获得底物，缺点是易受硫基基团的影响，测定准确度不高。二是使用带有4-硝基苯酚基团的PAF类似物。该类似物与PAF硫脂类结构相似，只是把sn-2位的硫酯集团换成4-硝基苯酚基团。其原理是酶水解底物后，释放带有4-硝基苯酚集团的物质，该物质不稳定，马上分解成4-硝基苯酚，在405nm处可以测得吸光度的变化，因此可以测定酶的活性。此方法的优点是反应灵敏，受外界的影响较小，并且操作方便可以上全自动生化分析仪。但是也存在一些问题，带有4-硝基苯酚的PAF底物在水中几乎没有溶解度，而Lp-PLA2是膜结合的非界面酶，须在水相中与底物作用。因此底物在水中的溶解度直接影响其水解效率及吸光度变化。此外，人血清中存在的血清酶，卵磷脂胆固醇转乙酰化酶和对氧磷酶对PAF类底物也有一定的水解活性。
综上所述，现有检测方法容易受到干扰而导致结果不准确，或无法反映脂蛋白相关磷脂酶A2的生物活性的技术问题，为此，我们提出一种脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂，包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂的组成成分为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）100mmol/L、乙二胺四乙酸（EDTA）15mmol/L、3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）10mmol/L、正壬烷磺酸钠10mmol/L、氯化钠100mmol/L、氯化镁10mmol/L、防腐剂0.1％；
所述R2试剂的组成成分为：柠檬酸18mmol/L、正壬烷磺酸钠10mmol/L、乙醇或甘油20％、底物5mmol/L、防腐剂0.1％、稳定剂0.1％。
优选的，所述R1试剂的PH为8.0，所述R2试剂的PH为4.5。
优选的，所述R2试剂中的底物采用1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰乙醇胺、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆酰中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明反应灵敏，受外界的影响较小，并且操作方便可以上全自动生化分析仪，使用3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）和正壬烷磺酸钠配制的缓冲液能抑制血清中酯酶样活性；乙醇或甘油可以促进疏水性底物形成水相，使检测更快速灵敏，检测结果准确可靠，能真实反应血清中Lp-PLA2的生物活性，解决了现有检测方法容易受到干扰而导致结果不准确，或无法反映脂蛋白相关磷脂酶A2的生物活性的技术问题。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：
一种脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂，包括R1试剂和R2试剂，R1试剂的组成成分为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）100mmol/L、乙二胺四乙酸（EDTA）15mmol/L、3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）10mmol/L、正壬烷磺酸钠10mmol/L、氯化钠100mmol/L、氯化镁10mmol/L、防腐剂0.1％；
R2试剂的组成成分为：柠檬酸18mmol/L、正壬烷磺酸钠10mmol/L、乙醇或甘油20％、底物5mmol/L、防腐剂0.1％、稳定剂0.1％，R1试剂的PH为8.0，R2试剂的PH为4.5，R2试剂中的底物采用1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰乙醇胺、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆酰中的一种或几种。
通过AU480全自动生化分析仪对试剂性能研究的结果：
检测参数：
AU480 参数设置
Assay Code RATE
Wavelength（2nd/Primary） 520/410
Assay Point 14-21
ABS Limit 32000/INC
VOL（Normal） 2.0
Reagent T1/T3 120/40
Calibration Type Y=AX+B
校准结果：
精密度检测：
准确度检测：
线性：
本发明反应灵敏，受外界的影响较小，并且操作方便可以上全自动生化分析仪，使用3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）和正壬烷磺酸钠配制的缓冲液能抑制血清中酯酶样活性；乙醇或甘油可以促进疏水性底物形成水相，使检测更快速灵敏，检测结果准确可靠，能真实反应血清中Lp-PLA2的生物活性，解决了现有检测方法容易受到干扰而导致结果不准确，或无法反映脂蛋白相关磷脂酶A2的生物活性的技术问题。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂，包括R1试剂和R2试剂，其特征在于：所述R1试剂的组成成分为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）100mmol/L、乙二胺四乙酸（EDTA）15mmol/L、3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）10mmol/L、正壬烷磺酸钠10mmol/L、氯化钠100mmol/L、氯化镁10mmol/L、防腐剂0.1％；
所述R2试剂的组成成分为：柠檬酸18mmol/L、正壬烷磺酸钠10mmol/L、乙醇或甘油20％、底物5mmol/L、防腐剂0.1％、稳定剂0.1％。
2.根据权利要求1所述的一种脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂，其特征在于：所述R1试剂的PH为8.0，所述R2试剂的PH为4.5。
3.根据权利要求1所述的一种脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂，其特征在于：所述R2试剂中的底物采用1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰乙醇胺、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆酰中的一种或几种。
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