CN107290415A - 电化学传感器及其试剂组合物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于电化学传感器及其试剂组合物，该试剂组合物包括电子媒介体、镁离子、能有效阻止电子媒介体和Mg2+产生沉淀的中等强度的络合剂，确保配制好的试剂长久放置仍无沉淀析出。利用本发明所述的试剂组合物制备得到的电化学传感器其检测结果准确，精度高，可以在血糖测定、甘油三酯测定等领域应用。
Description
技术领域
本发明属于样本分析领域，特别涉及一种用于电化学传感器的试剂组合物及其应用。
背景技术
生物分子的分析检测对获取生命过程中的化学与生物信息以及对疾病的有效诊断与治疗都具有十分重要的意义。电化学传感器就是其中的一种分析检测技术。电化学传感器采用固体电极，并将生物敏感分子固定在电极表面，如酶、电子传递体等。然后通过生物分子间的特异性识别作用，选择性地识别目标分子并将目标分子捕获到电极表面，电极作为信号传导器将电极表面发生的识别反应信号导出，变成可以测量的电学信号，从而实现对分析物进行定量和定性分析的目的。
已知的所有酶中大约有三分之一的酶需要金属离子的存在才能充分发挥其催化活性。金属离子能以多种方式参与酶的催化作用：(1)可接受或供出电子，激活亲电剂或亲核剂，即使在中性溶液中也能进行；(2)金属离子本身就可作为亲电剂或亲核剂；(3)可掩蔽亲核剂，以防止不需要的副反应产生；(4)通过配位键，将酶和底物组合在一起，在此过程中，可能引起底物分子变形；(5)可保持反应基团处于所需的三维取向；(6)可使酶稳定于催化活性构象。而金属酶和金属激活酶两者之间并不能做出明确的区分，金属酶与金属原子结合较为紧密，在酶纯化过程中，金属原子仍被保留。金属激活酶与金属原子结合不很紧密，纯化的酶需加入金属离子，才能被激活，例如利用碱土金属阳离子激活(Ca2+，Mg2+)。
例如，采用电化学传感器检测血液中的甘油三酯含量时，通常利用脂蛋白脂肪酶(LPL)与样品中的甘油三酯(TG)作用生成甘油和脂肪酸：
反应过程中产生的甘油被甘油激酶(GYK)催化与ATP和镁离子作用生成3-磷酸甘油和ADP：
新生成的3-磷酸甘油与氧化态的电子媒介体(mediator(ox))在甘油磷酸氧化酶(G3O)或甘油磷酸脱氢酶(G3D)的作用下生成磷酸二羟丙酮和还原态的电子媒介体(mediator(red))。
在给定电压的条件下，产生还原态电子媒介体的多少和电流大小呈正相关，而电流大小和甘油三酯浓度呈正相关。通过上述几步反应就能准确测定甘油三酯含量。
因此甘油三酯检测的试剂组合物包括脂蛋白脂肪酶、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶、ATP、表面活性剂、镁离子和电子媒介体。其中电子媒介体选自铁氰化钾(Potassium ferricyanide)、三氯化六铵合钌(Hexaammineruthenium chloride)和吩噻嗪衍生物、吩噁嗪衍生物等。Mg2+是甘油三酯测量过程中甘油激酶的辅因子。但是制备电化学传感器的过程中，在pH大于5的条件下，带有亚磷酸基团的电子媒介体(例如吩噻嗪衍生物、吩噁嗪衍生物)遇到Mg2+时常会出现沉淀现象。
在制备电化学传感器的过程中，将预先配制好的试剂组合物以点液等方式添加在传感器的电极上。虽然带有亚磷酸基团的电子媒介体和Mg2+之间产生沉淀的速度并不快，但这仍可能会因为试剂的沉淀反应造成添加在同一批次电化学传感器电极上的反应试剂浓度发生变化。无法确保电化学传感器之间的一致性，造成分析物的检测结果不准确。因此需要寻找能有效阻止电子媒介体和Mg2+产生沉淀但又不影响电子媒介体活性或整体反应性能的方法。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明的一个目的是提供了一种用于电化学传感器的试剂组合物，该试剂组合物包括电子媒介体、镁离子(Mg2+)、能有效阻止电子媒介体和Mg2+产生沉淀的中等强度的络合剂，确保配制好的试剂长久放置仍无沉淀析出。
本发明的第二个目的是提供了用于甘油三酯测定的电化学传感器的试剂组合物，包括脂蛋白脂肪酶、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶、ATP、表面活性剂、镁离子、电子媒介体和能有效阻止电子媒介体和Mg2+产生沉淀的中等强度的络合剂。
本发明的第三个目的是提供一种电化学传感器，包括绝缘性底板，覆盖层，样品入口和位于绝缘性底板上的电极系统，其中所述电极系统至少包括一个工作电极和一个对电极，在电极系统上包括有试剂组合物，该组合物包括电子媒介体、Mg2+和能有效阻止电子媒介体和Mg2+产生沉淀的中等强度的络合剂。
本发明的第四个目的是所述电化学传感器在测定甘油三酯含量上的应用。
其中所述中等强度络合剂选自带有羧基(-COOH)的非还原性有机酸或其盐。所述有机酸选自一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸或多元羧酸。更进一步的，非还原性有机酸选自醋酸、苯甲酸、丁二酸或柠檬酸。非还原性有机酸盐选自无水醋酸钠或苯甲酸钠、丁二酸二钠或柠檬酸三钠二水。
其中所述电子媒介体选自通式I所述的吩噻嗪衍生物或通式II所述的吩噁嗪的衍生物：
其中R1至R9选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳氧基、杂芳香基、杂环胺基、醛基、酮基、羧基、烃羧基、烷氧羰基、酯基、卤素、卤代烷基、亚硝基、硝基、环基、氨基、亚磷酸基团及其盐或磺酸基团及其盐，所述R1至R9基团可以相同或不同，其中R1-R9中至少包括一个亚磷酸基团(即基团)。更进一步地，作为电子媒介体的吩噻嗪衍生物选自通式III：
其中用于甘油三酯测定的电化学传感器的试剂组合物中各组分的含量选自：100ku/L-1000ku/L的脂蛋白脂肪酶，100ku/L-1000ku/L的甘油激酶，100ku/L-1000ku/L的甘油磷酸氧化酶，2g/L-16g/L的ATP，1g/L-25g/L的电子媒介体，0.5g-40g的Mg2+，1g/L-100g/L的表面活性剂和1g-50g的有机羧酸。
其中表面活性剂选自聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚乙二醇辛基苯基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯失水山梨醇三硬脂酸酯或聚氧乙烯单油酸酯等。
本发明所述的镁离子来自于镁盐中的镁离子，所述的镁盐可以选自氯化镁、硫酸镁、醋酸镁、铬酸镁、硝酸镁等合适的镁盐或它们的任一组合。所述的镁离子还可以来自于非镁盐中的镁离子。
本发明的有益效果是：本发明在试剂组合物中添加了带有羧基的非还原性有机酸或其盐，所述有机酸能和试剂中的Mg2+产生络合物，络合后的Mg2+仍能作为甘油激酶的辅因子，确保甘油激酶活性的充分发挥，且电子媒介体和Mg2+稳定存在，也不影响组合物的整体活性。能使甘油三酯含量测定的每一步反应很好地进行。能使这类氧化态电子媒介体吩噻嗪衍生物或吩噁嗪衍生物和3-磷酸甘油与甘油磷酸氧化酶反应，产生还原态的电子媒介体吩噻嗪或吩噁嗪的衍生物，在一定的电压条件下测试产生较好的电流梯度，准确地测定出甘油三酯的含量。并且利用所述试剂组合物制备的电化学传感器，其检测结果准确，精度高，生产的批内差符合质量标准。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。
实施例1是否含有柠檬酸三钠二水(Sodium citrate,trisodium salt,dehydrate)的组合物用于检测血样中甘油三酯的含量
在配制溶液I时，在不加入酶之前先用NaOH调整其pH为6.5后加入酶备用。将配制好的溶液I点液在丝网印刷电极上，在65℃烘箱中烘20分钟后取出，制备得到用于测定甘油三酯的电化学传感器。溶液I以每1000ml溶液计算，包括以下成分：
实验结果显示，不含柠檬酸三钠二水的试剂组合物在放置约半小时后会有沉淀析出，沉淀的析出导致点液时点液针容易堵塞不能点液。因此在使用不含柠檬酸三钠二水的溶液制备电化学传感器时，需要在配置完毕后立即点液至电化学传感器的电极上。而含有柠檬酸三钠二水的试剂组合物长久放置仍不会有沉淀析出，例如放置如16小时后依然没有沉淀析出。
将以上不含或含有柠檬酸三钠二水的组合物在溶液没有产生沉淀的情况下，分别点液到电化学传感器的电极上，制备成测定甘油三酯的电化学传感器，所述电化学传感器的尺寸为35mm*6mm。将本发明所述电化学传感器与测试仪连接，并分别加入甘油三酯含量为45-60mg/dL、300-330mg/dL或625-685mg/dL，红细胞比容调整到42％的全血标本。全血标本的真实值参考生化分析仪测试(HITACHI 7100 Automatic Analyzer)，在250mV的测试电压室温下进行测试。每个浓度的全血标本分别进行50次重复实验，测得的电流值的CV(变异系数)均在1％到3％范围内，每个浓度的测定平均值如下表1所示。
表1
实施例1的测定结果表明，在产生沉淀之前制备的电化学传感器，无论是不含或含有柠檬酸三钠二水的组合物制作的电化学传感器测定甘油三酯时均有明显的电流梯度，可以准确测定甘油三酯浓度从45mg/dL-650mg/dL范围内的含量。
实施例2是否含有Mg2+的组合物用于检测血样中甘油三酯的含量
在配制溶液II时，在不加入酶之前用NaOH调整其pH为6.5后加入酶备用。将配置好的溶液II点液至电化学传感器的电极上，在65℃烘箱中烘20分钟后取出。制备得到用于测定甘油三酯的电化学传感器。溶液II以每1000ml溶液计算，包括以下成分：
在不含或含有无水氯化镁的溶液长久放置后均不会有沉淀析出。如放置16小时后均不会有沉淀析出。
将以上不含和含有无水氯化镁的组合物分别点液到电化学传感器的电极上，制备成测定甘油三酯的电化学传感器，所述电化学传感器的尺寸为35mm*6mm。将电化学传感器与测试仪连接，并分别加入甘油三酯含量为45-60mg/dL、300-330mg/dL或625-685mg/dL，红细胞比容调整到42％的全血标本。全血标本的真实值参考生化分析仪测试(HITACHI 7100 Automatic Analyzer)，在250mV的测试电压室温下进行测试。每个浓度的全血标本分别进行50次重复实验，测得的电流值的CV(变异系数)均在1％到3％范围内，每个浓度的测定平均值如下表2所示。
表2
实施例2的测定结果表明，是否含有Mg2+的组合物均有电流梯度，但不含Mg2+的组合物测试的电流梯度明显低于含有Mg2+的组合物，无法实现准确测定甘油三酯浓度从45mg/dL-650mg/dL范围内的含量。经分析不含Mg2+的组合物有电流梯度是由于酶的原料中本身使用Mg2+作为酶的稳定剂，作为稳定剂的少量Mg2+并不会引起电子媒介体产生沉淀，而能被甘油激酶利用产生电流梯度。试剂组合物中包含无水氯化镁组合物有明显的电流梯度，可以准确测定甘油三酯浓度从45mg/dL-650mg/dL范围内的含量。
实施例3不同种类的有机酸用于检测血样中甘油三酯的含量
在配制溶液III时，在不加入酶之前用NaOH调整其pH为6.5后加入酶备用。将配置好的溶液III点液在电化学传感器的电极上，在65℃烘箱中烘20分钟后取出。制备得到用于测定甘油三酯的电化学传感器。溶液III以每1000ml溶液计算，包括以下成分：
其中，所述有机酸分别选自无水醋酸钠、苯甲酸钠、丁二酸二钠或柠檬酸三钠二水。所述无水醋酸钠或苯甲酸钠为一元羧酸，丁二酸二钠为二元羧酸，柠檬酸三钠二水为三元羧酸或多元羧酸。
实验表明含有无水醋酸钠、苯甲酸钠、丁二酸二钠或柠檬酸三钠二水的组合物长久放置均不会有沉淀析出，例如放置16小时均不会有沉淀析出。
将以上含有无水醋酸钠、苯甲酸钠、丁二酸二钠或柠檬酸三钠二水的试剂组合物分别点液到电化学传感器的电极上，制备成测定甘油三酯的电化学传感器，所述电化学传感器的尺寸为35mm*6mm。将电化学传感器与测试仪连接，并分别加入甘油三酯含量为45-60mg/dL、300-330mg/dL或625-685mg/dL，红细胞比容调整到42％的全血标本。全血标本的真实值参考生化分析仪测试(HITACHI7100Automatic Analyzer)，在250mV的测试电压室温下进行测试。每个浓度的全血标本分别进行50次重复实验，测得的电流值的CV(变异系数)均在1％到3％范围内，每个浓度的测定平均值如下表3所示。
表3
实施例3的测定结果表明，含有无水醋酸钠、苯甲酸钠、丁二酸二钠或柠檬酸三钠二水的组合物均能有效阻止沉淀的析出，且在甘油三酯的测试过程中均有明显的电流梯度可以准确测定甘油三酯浓度从45mg/dL-650mg/dL范围内的含量。
实施例4溶液稳定性试验
配制溶液IV时，在不加入酶之前用NaOH调整其pH为6.5后加入酶备用。将配置好的溶液IV分别在配置完毕后的0小时、4小时、8小时和16小时分别点液在电化学生物传感器的电极上，在65℃烘箱中烘20分钟后取出。制备得到用于测定甘油三酯的电化学传感器。溶液IV以每1000ml溶液计算，包括以下成分：
将电化学传感器与测试仪连接，并分别加入甘油三酯含量为45-60mg/dL、300-330mg/dL或625-685mg/dL，红细胞比容调整到42％的全血标本。全血标本的真实值参考生化分析仪测试(HITACHI 7100 Automatic Analyzer)，在250mV的测试电压室温下进行测试。每个浓度的全血标本分别进行50次重复实验，测得的电流值的CV(变异系数)均在1％到3％范围内，每个浓度的测定平均值如下表4所示。
表4
实施例4的测定结果表明，含有柠檬酸三钠二水的组合物在放置一段时间后如4小时，8小时和16小时进行点液测试，其在相同甘油三酯浓度的情况下对测试结果无影响，说明含有柠檬酸三钠二水的试剂组合物放置一段时间后溶液仍然稳定，且在甘油三酯的测试过程中均有明显的电流梯度，可以准确测定甘油三酯浓度从45mg/dL-650mg/dL范围内的含量。
Claims (10)
1.一种用于电化学传感器的试剂组合物，包括电子媒介体和镁离子，其特征在于，还包括能有效阻止电子媒介体和镁离子产生沉淀的中等强度的络合剂。
2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，中等强度络合剂选自带有羧基的非还原性有机酸或其盐。
3.根据权利要求2所述的试剂组合物，其特征在于，非还原性有机酸选自醋酸、苯甲酸、丁二酸或柠檬酸，非还原性有机酸盐选自无水醋酸钠、苯甲酸钠、丁二酸二钠或柠檬酸三钠二水。
4.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，电子媒介体选自通式I或通式II：
其中R1至R9选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳氧基、杂芳香基、杂环胺基、醛基、酮基、羧基、烃羧基、烷氧羰基、酯基、卤素、卤代烷基、亚硝基、硝基、环基、氨基、亚磷酸基团及其盐或磺酸基团及其盐。所述R1至R9基团可以相同或不同，且R1-R9中至少包括一个亚磷酸基团。
5.根据权利要求4所述的试剂组合物，其特征在于，所述电子媒介体为通式III，
6.一种电化学传感器，包括绝缘性底板，覆盖层，样品入口和位于绝缘性底板上的电极系统，其中所述电极系统至少包括一个工作电极和一个对电极，在电极系统上包括有试剂组合物，该组合物包括电子媒介体和镁离子，其特征在于，包括能有效阻止电子媒介体和镁离子产生沉淀的中等强度的络合剂。
7.根据权利要求6所述的电化学传感器，其特征在于，中等强度络合剂选自带有羧基的非还原性有机酸或其盐。
8.根据权利要求7所述的电化学传感器，其特征在于，非还原性有机酸选自醋酸、苯甲酸、丁二酸或柠檬酸，非还原性有机酸盐选自无水醋酸钠或苯甲酸钠、丁二酸二钠或柠檬酸三钠二水。
9.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，电子媒介体选自通式I或通式II：
其中R1至R9选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳氧基、杂芳香基、杂环胺基、醛基、酮基、羧基、烃羧基、烷氧羰基、酯基、卤素、卤代烷基、亚硝基、硝基、环基、氨基、亚磷酸基团及其盐或磺酸基团及其盐，所述R1至R9基团可以相同或不同，且R1-R9中至少有一个亚磷酸基团。
10.权利要求6至9之一所述电化学传感器在测定甘油三酯含量上的应用。
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