CN116606837B - 用于甘油三酯电化学检测的复合酶液、检测试纸和传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医疗检测仪器技术领域，具体而言，涉及用于甘油三酯电化学检测的复合酶液、检测试纸和传感器。用于甘油三酯电化学检测的复合酶液的反应原料包括脂蛋白脂酶、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化物酶、腺苷三磷酸盐、亚铁氰化钾和Mg2+。采用该复合酶液能够利用电化学对甘油三酯进行检测，检测速度快，灵敏度高、准确度高、稳定性好，且不受维生素C等物质的影响。

Description

用于甘油三酯电化学检测的复合酶液、检测试纸和传感器
技术领域
本发明涉及医疗检测仪器技术领域，具体而言，涉及用于甘油三酯电化学检测的复合酶液、检测试纸和传感器。
背景技术
随着生活方式和生活水平的改善，人们饮食结构发生了变化，富含脂肪类的饮食比例大大提高，同时，由于工作压力增大，人们对于预防保健的关注度不高，这些原因导致脂肪肝的发病率逐年提升。脂肪肝是一种较为常见的慢性肝脏病症，而甘油三酯含量过高会引起脂肪肝，正常情况下，肝脏合成的甘油三酯和磷脂、胆固醇、载脂蛋白一起形成极低密度脂蛋白，若磷脂合成障碍或载脂蛋白合成障碍就会影响甘油三酯转运出肝，继而导致甘油三酯含量过高，引起脂肪肝。另外，若进入肝脏的脂肪酸过多，合成甘油三酯的量超过了合成载脂蛋白的能力，也可引起脂肪肝。
人体在多种病因的情况下，可能引起胰酶激活，在胰腺局部产生炎症反应，是引起急性胰腺炎（AP)，病情严重者甚至导致全身炎症反应综合征（SIRS），进而可能引发某些器官功能性障碍，具有高死亡率。其中，高脂血症容易导致患者AP的发病，近年来，高脂血症性急性胰腺炎（hypertriglyceridemia acute pancreatitis，HLAP）已经超越酒精性胰腺炎成为AP的第二大病因。有研究表明HLAP发病与甘油三酯（triglycerides，TG）升高紧密相关，故又称为高脂血症性胰腺炎（HTG-induced pancreatitis，HTGP）。当血液中甘油三酯（TG）水平升高后，TG分解会产生的大量游离脂肪酸，会引发胰腺自身细胞毒性作用，促进炎性递质释放并影响胰腺微循环，诱导AP的发生。
目前，血液TG测定及其临床应用尚存在很多问题如生物学变异、游离甘油对测定的影响、测定的标准化系统不完善等等。特别是随着对其致动脉粥样硬化（AS）作用研究的深入TG作为冠心病的一项独立危险因素日益受到重视，最近较多研究已肯定血浆TG升高是冠心病发病的独立危险因子。因此急需实现对血液甘油三酯检测的方法和仪器的建立。
随着大型全自动生化分析仪的推广使用以及生化分析仪的更新换代，从传统大型生化仪过渡转化成小型便捷仪器是生物医疗器械的发展大方向。因此，设计开发出操作简便、小型便携、用血量少，适用于指尖血，价格低廉，稳定性好，能够准确测定甘油三酯浓度的试纸条具有重要意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供用于甘油三酯电化学检测的复合酶液、检测试纸和传感器。本发明实施例提供的复合酶液能够利用电化学对甘油三酯进行检测，检测速度快，灵敏度高、准确度高、稳定性好，且不受维生素C等物质的影响。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种用于甘油三酯电化学检测的复合酶液，所述复合酶液的反应原料包括脂蛋白脂酶、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化物酶、腺苷三磷酸盐、亚铁氰化钾和Mg2+。
其中，所述复合酶液中所述脂蛋白脂酶的质量浓度为0.1-2%，所述复合酶液中所述脂蛋白脂酶、所述甘油激酶、所述甘油磷酸氧化酶、所述过氧化物酶的质量比为1：（0.05-1）：（0.01-0.8）：（0.1-1.2）。
所述复合酶液中所述Mg2+的质量浓度为0.01-0.8%，所述复合酶液中所述Mg2+、所述腺苷三磷酸盐和所述亚铁氰化钾的质量比为1:(1-4):(2-6)。
特别的，所述复合酶液中所述脂蛋白脂酶的质量浓度为0.3-1.5%，所述复合酶液中所述脂蛋白脂酶、所述甘油激酶、所述甘油磷酸氧化酶、所述过氧化物酶的质量比为1：（0.05-0.2）：（0.03-0.5）：（0.5-1.2）；
所述复合酶液中所述Mg2+的质量浓度为0.1-0.5%，所述复合酶液中所述Mg2+、所述腺苷三磷酸盐和所述亚铁氰化钾的质量比为1:(1-3.5):(2-6)。所述Mg2+的来源包括在水溶液中可电离出Mg2+的镁盐，所述镁盐选自氯化镁、硫酸镁和硝酸镁的任意一种或至少两种的组合。
在可选的实施方式中，所述复合酶液还包括缓冲溶液、增稠剂、保护剂、表面活性剂，所述脂蛋白脂酶、所述增稠剂、所述保护剂和所述表面活性剂的质量比为1:(0.5-5):(0.1-4):(0.1-2)。
所述复合酶液还包括缓冲溶液、增稠剂、保护剂、表面活性剂，所述脂蛋白脂酶、所述增稠剂、所述保护剂和所述表面活性剂的质量比为1:(0.5-2):(0.1-0.6):(0.1-1.2)。
在可选的实施方式中，所述缓冲溶液选自Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、ACES缓冲液、醋酸钠缓冲液、MES缓冲液、Good’s缓冲液或甘氨酸缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；所述缓冲溶液的pH为5-9。
在可选的实施方式中，所述增稠剂包括甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基纤维素、淀粉磷酸钠、丙二醇藻蛋白酸酯或羧甲基纤维素中的任意一种或至少两种的组合。
在可选的实施方式中，所述保护剂包括蔗糖、乳糖、甘露醇、牛血清白蛋白、明胶或海藻糖中的任意一种或至少两种的组合。
在可选的实施方式中，所述表面活性剂包括TritonX-100、甜菜碱、溴化铵、吐温或十二烷基硫酸钠中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种用于甘油三酯电化学检测的检测试纸，其包括前述实施方式任一项所述的用于甘油三酯电化学检测的复合酶液；所述复合酶液负载于所述检测试纸的电极层，且负载量为1-5mg。
第三方面，本发明提供一种用于甘油三酯电化学检测的传感器，其包括前述实施方式所述的用于甘油三酯电化学检测的检测试纸。与所述甘油三酯电化学检测的试纸相连接并测定所述电化学反应电流值的测定部件；以及依据甘油三酯浓度-电流值标准曲线计算并显示待测样本中甘油三酯含量的计算显示部件；所述甘油三酯电化学检测的试纸用于接收待测样品并在激励电位作用下于反应区发生电化学反应形成电信号。
本发明具有以下有益效果：本发明的复合酶液通过选择特定的物质以配比，能够利用电化学对甘油三酯进行检测，且检测试剂成本低，灵敏度高。同时，该复合酶液制备的检测甘油三酯的电化学传感器采血量小、检测速度快、灵敏度高、准确度高及稳定性好等优点，仅需非常短的检测时间即可获得测试结果，达到即时检测的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明应用例1提供的结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供一种用于甘油三酯电化学检测的复合酶液，所述复合酶液的反应原料包括脂蛋白脂酶、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化物酶、腺苷三磷酸盐、亚铁氰化钾和Mg2+，其中Mg2+可以由在水溶液中可电离出Mg2+的镁盐提供，例如氯化镁，硫酸镁和硝酸镁等，由于反应原料的重点在于Mg2+，镁盐的种类、是否单一等影响要素并不影响实验方案，为控制变量，故镁盐选取氯化镁，同理，腺苷三磷酸盐选取腺苷-5'-三磷酸二钠盐。
本发明实施例基于电子的转移速率正比于甘油三酯浓度，可以得到待测样本中甘油三酯浓度，实现利用电化学电流型的原理对甘油三酯进行检测的目标，有利于工业化推广应用。
具体地，复合酶液能够使待测样本，例如血样，在检测时使其中的甘油三酯在脂蛋白脂肪酶(LPL)作用下生成甘油和脂肪酸；反应过程中产生的甘油被甘油激酶（GK）催化，并与腺苷三磷酸盐（ATP）和Mg2+作用生成3-磷酸甘油和二磷酸腺苷（ADP）；生成的3-磷酸甘油与氧气在甘油磷酸氧化酶(G3PO)的作用下生成磷酸二羟丙酮酸和过氧化氢。过氧化氢与亚铁氰化钾在过氧化物酶(POD)的作用下生成铁氰化钾，在合适的电压条件下，产生还原态电子媒介体的多少和电流大小呈正相关，而电流大小和甘油三脂浓度呈正相关，继而通过电化学能够快速且准确检测甘油三酯。
其中，所述复合酶液中所述脂蛋白脂酶的质量浓度为0.1-2%，例如，质量浓度为0.1%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%和2%等0.1-2%之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值，优选的，所述复合酶液中所述脂蛋白脂酶的质量浓度为0.3-1.5%。
所述复合酶液中所述脂蛋白脂酶、所述甘油激酶、所述甘油磷酸氧化酶、所述过氧化物酶的质量比为1：（0.05-1）：（0.01-0.8）：（0.1-1.2）；例如，质量比中甘油激酶GK的数值可是0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1等0.05-1之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值。甘油磷酸氧化酶G3PO的数值可是0.01、0.03、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75和0.8等0.01-0.8之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值。过氧化物酶POD的数值可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1和1.2等0.1-1.2之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值，优选的，所述脂蛋白脂酶、所述甘油激酶、所述甘油磷酸氧化酶、所述过氧化物酶的质量比为1：（0.05-0.2）：（0.03-0.5）：（0.5-1.2）。
所述复合酶液中所述Mg2+的质量浓度为0.01-0.8%，例如，浓度可以是0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%和0.8%等0.01-0.8%之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值，优选的，所述复合酶液中所述Mg2+的质量浓度为0.1-0.5%。
复合酶液中所述Mg2+、腺苷三磷酸盐，例如腺苷-5'-三磷酸二钠盐(Na2ATP)和所述亚铁氰化钾的质量比为1:(1-4):(2-6)。例如，上述质量比中 腺苷三磷酸盐，例如Na2ATP的数值可以为1、1.5、2、2.5、3、3.5以及4等1-4之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值。亚铁氰化钾的数值可以为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5以及6等2-6之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值，优选的，所述Mg2+、腺苷三磷酸盐，例如腺苷-5'-三磷酸二钠盐(Na2ATP)和所述亚铁氰化钾的质量比为1:(1-3.5):(2-6)。
通过控制复合酶液中脂蛋白脂酶和Mg2+的浓度，能够使得复合酶液更均匀反应，更灵敏且检测更准确。需要说明的是，本发明实施例记载的复合酶液中所述Mg2+的质量浓度为0.01-0.8%，所述Mg2+、所述腺苷-5'-三磷酸二钠盐和所述亚铁氰化钾的质量比为1:(1-4):(2-6)，优选的，所述Mg2+的质量浓度为0.1-0.5%，所述Mg2+、腺苷三磷酸盐，例如腺苷-5'-三磷酸二钠盐(Na2ATP)和所述亚铁氰化钾的质量比为1:(1-3.5):(2-6)。
进一步地，复合酶液还包括缓冲溶液；其中，所述缓冲溶液选自Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、ACES缓冲液、醋酸钠缓冲液、MES缓冲液、Good’s缓冲液或甘氨酸缓冲液中的任意一种或至少两种的组合，且缓冲溶液的pH为5-9，例如可以是5、5.5、6、6.5、7、7.5、8和9等5-9之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值。
由于复合酶液中的溶剂除了缓冲溶液，其他物料基本都是中性的物料，溶解后也不会对混合体系的pH造成太大影响，因此，复合酶液的pH也为5-9，例如可以是5、5.5、6、6.5、7、7.5、8和9等5-9之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值。
进一步地，复合酶液还包括增稠剂、保护剂与表面活性剂。其中，复合酶液中所述脂蛋白脂酶、所述增稠剂、所述保护剂和所述表面活性剂的质量比为1:(0.5-5):(0.1-4):(0.1-2)，例如可以是1:0.6:0.15:0.1、1:0.8:0.5:0.2、1:1.7:1.4:0.6、1:2:2.5:1、1:3.1:3.4:1.3、1:4.2:3.6:1.9和1:5:4:2等1:(0.5-5):(0.1-4):(0.1-2)之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值，优选的，所述脂蛋白脂酶、所述增稠剂、所述保护剂和所述表面活性剂的质量比为1:(0.5-2):(0.1-0.6):(0.1-1.2)。
具体地，增稠剂甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉磷酸钠、丙二醇藻蛋白酸酯或羧甲基纤维素中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合为甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素的组合，羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素的组合，淀粉磷酸钠和羟丙基甲基纤维素的组合，甲基纤维素和淀粉磷酸钠的组合。
所述保护剂包括蔗糖、乳糖、甘露醇、牛血清白蛋白、明胶或海藻糖中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合为蔗糖和乳糖的组合，蔗糖和甘露醇的组合，甘露醇和乳糖的组合，牛血清白蛋白和乳糖的组合，海藻糖和乳糖的组合。
所述表面活性剂包括TritonX-100、吐温或十二烷基硫酸钠中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合为TritonX-100和吐温的组合，TritonX-100和十二烷基硫酸钠的组合，十二烷基硫酸钠和吐温的组合。表面活性剂可以将脂蛋白分解以释放甘油三酯，在众多表面活性剂中发现TritonX-100作为表面活性剂时能够更好的使脂蛋白中的甘油三脂释放，让待测物与酶液充分反应。
需要说明的是，本发明实施例采用的增稠剂、保护剂与表面活性剂统称为非反应原料。即使未曾参与反应，但均有其不同的作用。具体如下：增稠剂可以使得复合酶液中各成分分布均匀一致，尤其是在制备用于甘油三酯电化学检测的检测试纸的烘干过程中，增稠剂可以使得复合酶液形成的酶层在覆盖与干燥过程中更加均匀。保护剂的能够保护复合酶液中各种酶的活性，增强复合酶液的稳定性，尤其是在制备用于甘油三酯电化学检测的检测试纸的烘干过程中，保护剂可以保护酶在干燥条件下保持更长时间的活性，进而增强检测试纸能够长期储存的稳定性。表面活性剂的作用是降低固体—液体之间的界面张力，增加固体—液体之间吸附，使复合酶液形成的酶层均匀的分散在电极表面；同时当血样和试纸上酶液反应时，表面活性剂有助于脂蛋白上的甘油三酯脱落，让血样中待测物和酶液充分发生反应。
第二方面，本发明提供一种用于甘油三酯电化学检测的检测试纸，其通过前述实施方式任一项所述的用于甘油三酯电化学检测的复合酶液制备得到。其中，该检测试纸的反应区通过加入本发明实施例提供的复合酶液并经干燥形成。根据本发明实施例提供的复合酶液的工作原理和过程可见，本发明实施例提供的电化学甘油三酯检测用检测试纸所述属于电流型传感器，具有采血量小、检测速度快、灵敏度高、准确度高和稳定性好等优点。
具体地，检测试纸在检测是发生的反应如下所示：
第三方面，本发明提供一种用于甘油三酯电化学检测的传感器，其包括前述实施方式所述的用于甘油三酯电化学检测的检测试纸；与所述甘油三酯电化学检测的试纸相连接并测定所述电化学反应电流值的测定部件；以及依据甘油三酯浓度-电流值标准曲线计算并显示待测样本中甘油三酯含量的计算显示部件；所述甘油三酯电化学检测的试纸用于接收待测样品并在激励电位作用下于反应区发生电化学反应形成电信号。
全血样本不仅包括水、葡萄糖、蛋白质、酮以及其它生物分子，还包含脂蛋白，在全血样本中测定甘油三酯时，一方面需要避免全血样本中其他物质的干扰，另一方面脂蛋白包裹的甘油三酯若不能完全释放，则其测定的数值存在偏差。
同时，背景电流会影响测试结果的稳定性和准确性以及测试系统的稳定性。背景电流可以由试剂组分中的杂质或组分本身产生，进一步降低背景电流可以减少或消除校准过程中涉及的至少一个参数（即干扰值）。
本发明最终采用三磷酸甘油的氧化反应生成过氧化氢，再通过过氧化氢与亚铁氰化钾的氧化反应生成铁氰化钾，在合适的电压条件下，产生还原态电子媒介体的多少和电流大小呈正相关，若采用还原反应进行电化学测量时会产生背景电流，从而造成很大的干扰，导致灵敏度小。
表面活性剂有助于脂蛋白释放甘油三酯让待测物与酶液充分反应。本发明实施例提供的检测传感器为电流型传感器，能高效的实现甘油三酯的检测，具有采血量小、检测速度快、灵敏度高、准确度高及稳定性好等优点。
本发明实施例还提供一种用于甘油三酯电化学检测的传感器的制备方法，包括以下步骤：
（a）取绝缘基底，后采用网版掩膜溅镀/电镀或者激光刻蚀等方式，在绝缘基底上附着金属薄层或者印刷碳浆作为电极层，不同的电极材料在附着金属薄层或者印刷碳浆上形成不同的电极，即形成传感器的电极组，其包括工作电极、参比电极、流液到位电极与接通电极。
需要说明的是，传感器的电极组包括工作电极、参比电极、流液到位电极与接通电极；本发明对于各个电极的位置不做具体的要求，本领域技术人员在满足电化学甘油三酯检测方法的反应原理基础上，可以根据实际情况进行选择。
（b）在所述工作电极的电极层上通过点液方式覆盖一层酶液，控制负载量为1-5mg，在37-65℃下烘干20-120min。
（c）待上述烘干操作完成后，利用双面胶或胶水将一端开有试剂窗口的亲水膜层覆盖在所述电极层上，使得所述试剂窗口处以及两者之间的亲水膜层一起形成能够吸入待测样本的虹吸池，最后经过压合、裁切后，将所得电化学甘油三酯试纸存在于带有分子筛干燥剂的密闭塑料筒内。
本发明实施例还提供一种上述用于甘油三酯电化学检测的传感器的使用方法包括如下内容：
将上述用于甘油三酯电化学检测的检测试纸裸露的部分电极插入与之配套的检测设备的接插口处，待测样本，例如血样，从检测试纸的虹吸池入口处滴入，通过虹吸作用流进反应区，待测样本中在检测过程中在脂蛋白脂肪酶(LPL)作用下生成甘油和脂肪酸；反应过程中产生的甘油被甘油激酶催化，并与ATP和镁离子作用生成3-磷酸甘油和ADP；生成的3-磷酸甘油与氧气在甘油磷酸氧化酶的作用下生成磷酸二羟丙酮酸和过氧化氢。过氧化氢与亚铁氰化钾在过氧化物酶的作用下生成铁氰化钾，在合适的电压条件下，产生还原态电子媒介体的多少和电流大小呈正相关，而电流大小和甘油三脂浓度呈正相关。此时与之配套的检测设备会施加一个激励电位，激励电压与复合酶液发生电化学反应产生电流值，通过与之配套的检测设备中软件的换算，即可得到待测样本中甘油三酯含量。
其中，待测样本和复合酶液的体积比为1：（1-3），例如可以是1:1、1:1.2、1:1.3、1:1.5、1:1.8、1:2.0、1:2.2、1:2.5、1:2.8和1:3.0等1：（1-3）之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值。
激励电位为-100至-500mV，例如可以是-100mV、-105mV、-110mV、-150mV、-180mV、-200mV、-250mV、-300mV、-350mV、-400mV和-500mV等-100至-500mV之间的任意数值或者任意两个数值形成的范围值。优选的，所述激励电位为-100至-300mV。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1：甘油三酯电化学检测的复合酶液的制备
先配制浓度为0.05mol/L且pH为7的ACES缓冲液作为溶剂；然后按照质量百分比称取海藻糖0.2%，TritonX-100 0.5%，K4[Fe(CN)6] 0.8%，羟乙基纤维素0.8%，Na2ATP 0.5%，Mg2+0.3%（氯化镁），混合至完全溶解；按照质量百分比再称取LPL 1%、GK 0.07%、G3PO0.04%，POD 1.1%，混合至完全溶解，将上述两者混合搅拌30min至完全溶解，得到酶液。
实施例2：甘油三酯电化学检测的复合酶液的制备
先配制浓度为0.1mol/L且pH为7.5的Tris缓冲液作为溶剂；然后按照质量百分比称取蔗糖0.15%，TritonX-100 0.15%，K4[Fe(CN)6] 1%，聚乙烯吡咯烷酮0.75%，Na2ATP0.5%，Mg2+0.5%（氯化镁），混合至完全溶解；按照质量百分比再称取LPL 1.5%、GK 0.075%、G3PO 0.045%，POD 0.75%，混合至完全溶解，将上述两者混合搅拌30min至完全溶解，得到酶液。
实施例3：甘油三酯电化学检测的复合酶液的制备
先配制浓度为0.15mol/L且pH为6.5的醋酸缓冲液作为溶剂；然后按照质量百分比称取甘露醇0.15%，TritonX-100 0.45%，K4[Fe(CN)6] 0.95%，羧甲基纤维素0.86%，Na2ATP0.65%，Mg2+0.4%（硫酸镁），混合至完全溶解；按照质量百分比再称取LPL 1.2%、GK 0.15%、G3PO 0.6%，POD 1.2%，混合至完全溶解，将上述两者混合搅拌30min至完全溶解，得到酶液。
实施例4：甘油三酯电化学检测的复合酶液的制备
先配制浓度为0.2mol/L且pH为7.5的MES缓冲液作为溶剂；然后按照质量百分比称取牛血清白蛋白0.18%，TritonX-100 0.36%，K4[Fe(CN)6] 0.6%，羟丙基甲基纤维素0.6%，Na2ATP 0.35%，Mg2+0.1%（硫酸镁），混合至完全溶解；按照质量百分比再称取LPL 0.3%、GK0.06%、G3PO 0.15%，POD 0.36%，混合至完全溶解，将上述两者混合搅拌30min至完全溶解，得到酶液。
实施例5：甘油三酯电化学检测的复合酶液的制备
先配制浓度为0.2mol/L且pH为8的Good’s缓冲液作为溶剂；然后按照质量百分比称取乳糖0.25%，TritonX-100 0.3%，K4[Fe(CN)6] 0.8%，甲基纤维素0.6%，Na2ATP 0.5%，Mg2+0.15%（氯化镁），混合至完全溶解；按照质量百分比再称取LPL 0.87%、GK 0.10%、G3PO0.1%，POD 1%，混合至完全溶解，将上述两者混合搅拌30min至完全溶解，得到酶液。
对比例1-对比例10：甘油三酯电化学检测的复合酶液的制备
对比例1-对比例10提供的制备方法与实施例1相同，区别在于物料配比不同，具体如下：
对比例1：除了复合酶液中LPL的质量浓度调整为0.02%外，并保持其他物质与LPL的质量比不变外，其余均与实施例1相同。
对比例2：除了复合酶液中LPL的质量浓度调整为0.06%外，并保持其他物质与LPL的质量比不变外，其余均与实施例1相同。
对比例3：除了复合酶液中Mg2+的质量浓度调整为0.005%外，并保持其他物质与Mg2 +的质量比不变外，其余均与实施例1相同。
对比例4：除了复合酶液中Mg2+的质量浓度调整为0.9%外，并保持其他物质与Mg2+的质量比不变外，其余均与实施例1相同。
对比例5：除了复合酶液中POD的质量浓度调整为0.05%外，其余均与实施例1相同。
对比例6：除了复合酶液中POD的质量浓度调整为1.5%外，其余均与实施例1相同。
对比例7：除了复合酶液中GK的质量浓度调整为0.03%外，其余均与实施例1相同。
对比例8：除了复合酶液中GK的质量浓度调整为1.2%外，其余均与实施例1相同。
对比例9：除了复合酶液中G3PO的质量浓度调整为0.005%外，其余均与实施例1相同。
对比例10：除了复合酶液中G3PO的质量浓度调整为1%外，其余均与实施例1相同。
对比例11：参照实施例1的复合酶液的制备方法，区别在于，除了复合酶液中K4[Fe(CN)6]调整为氯化六氨合钌外，并保持其他物质的选择以及质量比不变外，其余均与实施例1相同。
对比例12：参照实施例1的复合酶液的制备方法，区别在于，除了复合酶液中K4[Fe(CN)6]调整为蒽醌-1-磺酸钠外，并保持其他物质的选择以及质量比不变外，其余均与实施例1相同。
对比例13：参照实施例1的复合酶液的制备方法，区别在于，除了复合酶液中TritonX-100调整为吐温外，并保持其他物质的选择以及质量比不变外，其余均与实施例1相同。
对比例14：参照实施例1的复合酶液的制备方法，区别在于，除了复合酶液中TritonX-100调整为甜菜碱外，并保持其他物质的选择以及质量比不变外，其余均与实施例1相同。
应用例1：甘油三酯电化学检测的传感器制备
具体如下：
（a）取绝缘基底，后采用网版掩膜溅镀方式，在绝缘基底上附着金属薄层或者印刷碳浆作为电极层。
（b）在所述工作电极的电极层上通过点液方式覆盖一层实施例1的复合酶液，控制负载量为3mg，在50℃下烘干60min。
（c）待上述烘干操作完成后，利用双面胶将一端开有试剂窗口的亲水膜层覆盖在所述电极层上，使得所述试剂窗口处以及两者之间的亲水膜层一起形成能够吸入待测样本的虹吸池，最后经过压合、裁切后，将所得电化学甘油三酯试纸存在于带有分子筛干燥剂的密闭塑料筒内。
应用例2-5： 甘油三酯电化学检测的传感器制备
应用例2-5除复合酶液分别替换为实施例2-5外，其余均与应用例1相同。制备方法参照应用例1。
应用对比例1-14： 甘油三酯电化学检测的传感器制备
应用对比例1-14除复合酶液分别替换为对比例1-14外，其余均与应用例1相同。制备方法参照应用例1。
上述用于甘油三酯电化学检测的传感器的使用方法包括如下内容：
将电化学甘油三酯试纸裸露的部分电极插入与之配套的检测设备的接插口处，待测样本从试纸的虹吸池入口处滴入，通过虹吸作用流进反应区，在激励电位-150mV~-300mV作用下，通过传感器的测定部位检测电流值后，依据甘油三酯浓度-电流值标准曲线计算并显示待测样本中甘油三酯含量的计算显示部件的数值即为待测样本中甘油三酯含量。
现在按照上述甘油三酯电化学试纸的使用方法，对上述应用例和应用对比例进行如下性能测试：
（一）获得甘油三酯浓度-电流值标准曲线
使用正常人的静脉全血，加入不同量的甘油三酯母液，配制成10种不同浓度的甘油三酯全血样本，理论浓度分别为：0.5 mmol/L、1.1 mmol/L、1.78 mmol/L、2.53 mmol/L、3.44 mmol/L、4.57 mmol/L、5.56 mmol/L、6.87 mmol/L、8.39 mmol/L、8.75 mmol/L；然后按照前述电化学甘油三酯试纸的使用方法，控制激励电位为-200mV，分别对10种不同浓度的甘油三酯全血样本测试电流响应，取反应时间为5s时的电流值，每个全血样本平行测试8次并取平均值，以此判断重复性、相对灵敏度以及线性范围。应用例1的相关测试的原始数据列于表1中，并将甘油三酯浓度作为横坐标且电流值作为纵坐标，通过拟合趋势线得到图1。
表1
对本申请的传感器的检测结果和方法得到的检测结果进行相关性分析，结果参见图1，根据图1和表1可知，甘油三酯理论浓度和测试所得电流值的平均值建立校准曲线，线性拟合的相关系数平方（R2）为0.9996，具有良好的拟合度，可以作为甘油三酯浓度-电流值标准曲线，且所得电流值的CV在3.6%以下，检测响应时间仅需5s。
（二）具体测试18例不同浓度的甘油三酯样本
随机选取不同浓度的18例血液样本进行测试，然后与医院生化分析仪的检测结果相比进行评价，其中应用例1的检测结果和线性相关性如表2所示。
表2
为了便于简洁，应用例2-5及应用对比例1-12仅给出计算后的结果，如表3所示。
表3
电流平均值的差值 R2 各浓度下CV最大值 18个样本中的最大偏差绝对值
应用例2 -753.2 0.9997 5.2% 5.4%
应用例3 -769.3 0.9995 6.2% 5.1%
应用例4 -786.2 0.9991 4.6% 6.2%
应用例5 -729.8 0.999 5.1% 4.9%
应用对比例1 -456.2 0.9987 6.9% 7.3%
应用对比例2 -492.4 0.9951 7.7% 6.7%
应用对比例3 -421.9 0.913 7.5% 8.4%
应用对比例4 -398.2 0.8921 8% 9.2%
应用对比例5 -321.4 0.7837 9.3% 12.2%
应用对比例6 -562.1 0.8993 5% 8.2%
应用对比例7 -422.3 0.9235 6.6% 8.1%
应用对比例8 -398.1 0.789 7.3% 9.2%
应用对比例9 -512.4 0.8145 7.9% 10.5%
应用对比例10 -492.1 0.8091 9.1% 9.6%
应用对比例11 -389.2 0.6524 14.2% 28.1%
应用对比例12 -409.1 0.5991 12.9% 27.8%
从表1~表3可以得出如下几点：
（1）综合应用例1~5可以看出，本发明提供的甘油三酯电化学检测的反应酶液应用在电化学检测过程中具有良好的线性关系，其中线性拟合的相关系数平方均大于0.999，且电流值重复8次的CV均在6.2%以内，样本中的最大偏差绝对值在6.2%以内；
（2）综合应用例1和应用对比例1~2可以看出，相较于应用例1中LPL的质量浓度为1%，应用对比例1~2中分别为0.02%和0.06%而言，应用对比例1~2的电流响应效果明显由应用例1的790.9下降至电流平均值的差值仅为-456.2和-492.4，且线性相关系数均下降，表明测试的准确性下降，其中主要原因为应用对比例1~2中LPL的浓度偏低导致灵敏度降低，而LPL是疏水性酶，浓度过高会使酶液产生沉淀，由此表明，本发明通过将LPL的质量浓度控制在特定范围，显著提高了检测的灵敏性和准确性；
（3）综合应用例1和应用对比例3~4可以看出，应用例1中Mg2+的质量浓度为0.3%，相较于应用对比例3~4中该质量浓度分别为0.005%和0.9%而言，应用例1中电流值的CV在3.6%以下，线性拟合的相关系数平方（R2）为0.9996，而应用对比例3~4中线性拟合的相关系数平方分别仅为0.913和0.8921，且电流响应的灵敏度也下降，主要是由于应用对比例3中Mg2+的浓度偏低，Mg2+充当的是激活剂，Mg2+浓度降低，被激活的甘油激酶较少，导致灵敏度及线性降低，应用对比例4中Mg2+的浓度偏高，由于该离子属于金属离子，过多会对反应造成干扰，导致电流响应降低，由此表明，本发明通过将Mg2+的浓度控制在特定范围，显著提高了检测的灵敏度和准确性；同样的，综合应用例1和应用对比例5~10可以看出，POD、GK以及G3PO的添加量对于最终检测结果均十分关键，酶添加量较少导致甘油三酯反应不充分，导致灵敏度降低；酶添加量过多，会导致扩散速率减缓，影响测试结果。本发明通过各组分的协同组合，实现了电化学甘油三酯的高效检测。
（4）综合应用例1和应用对比例11和12可以看出，替换电子介体后，应用对比例11中浓度到高值部分（浓度＞5 mmol/L以上）测试浓度值整体偏低，线性相关系数下降至0.6524，且与医院生化分析仪的检测结果偏差最大为28.1%，由此表明，本发明通过选择亚铁氰化钾作为电子介体与其他酶相组合，提高了检测的准确性和灵敏度。
（三）抗坏血酸对复合酶液的影响试验数据
利用应用例1、应用对比例11和应用对比例12的复合酶液分别制备得到的传感器对同一血样（血样中加入相同量的维生素C，维生素C的浓度为2mg/dL）进行检测，检测结果如下表4。
表4
根据表4可知，应用例1浓度值与医院检测浓度较为一致，且加入维生素C后，偏差在-3.5%以下，满足试纸的技术要求；应用对比例11和应用对比例12高值部分与生化仪偏差较大，高值部分测不上去，加入维生素C后，测试值均偏大，这是由于维生素C参与反应，增加电流信号值，从而浓度测试偏大。
（四）表面活性剂对复合酶液的影响
利用应用例1、应用对比例13和应用对比例14的复合酶液分别制备得到的传感器对同一血样进行检测，检测结果如下表5。
表5
根据表5可知，综合应用例1和应用对比例13和14可以看出，替换表面活性剂后，与医院生化分析仪的检测结果偏差最大为35.71%，由此表明，本发明通过选择作为TritonX-100与其他酶相组合，使血样中甘油三酯全部释放，与酶液充分反应。
综上所述，本申请的方案具有采血量小、检测速度快、灵敏度高、准确度高及稳定性好等优点，仅需5s的检测时间即可获得测试结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种用于甘油三酯电化学检测的复合酶液，其特征在于，所述复合酶液的反应原料包括脂蛋白脂酶、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化物酶、腺苷三磷酸盐、亚铁氰化钾和Mg2+;所述复合酶液中所述脂蛋白脂酶的质量浓度为0.3-1.5%，所述复合酶液中所述脂蛋白脂酶、所述甘油激酶、所述甘油磷酸氧化酶、所述过氧化物酶的质量比为1：（0.05-0.2）：（0.03-0.5）：（0.5-1.2）；
所述复合酶液中所述Mg2+的质量浓度为0.1-0.5%，所述复合酶液中所述Mg2+、所述腺苷三磷酸盐和所述亚铁氰化钾的质量比为1:(1-3.5):(2-6)；
所述复合酶液还包括缓冲溶液、增稠剂、保护剂和表面活性剂，所述表面活性剂为TritonX-100。
2.根据权利要求1所述的用于甘油三酯电化学检测的复合酶液，其特征在于，所述腺苷三磷酸盐包括腺苷-5'-三磷酸二钠盐和腺苷-5'-三磷酸二钾盐的任意一种或两种的组合。
3.根据权利要求1所述的用于甘油三酯电化学检测的复合酶液，其特征在于，所述Mg2+的来源包括在水溶液中可电离出Mg2+的镁盐，所述镁盐选自氯化镁、硫酸镁和硝酸镁的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1所述的用于甘油三酯电化学检测的复合酶液，其特征在于，所述脂蛋白脂酶、所述增稠剂、所述保护剂和所述表面活性剂的质量比为1:(0.5-5):(0.1-4):(0.1-2)。
5.根据权利要求4所述的用于甘油三酯电化学检测的复合酶液，其特征在于，所述脂蛋白脂酶、所述增稠剂、所述保护剂和所述表面活性剂的质量比为1:(0.5-2):(0.1-0.6):(0.1-1.2)。
6.根据权利要求 5所述的用于甘油三酯电化学检测的复合酶液，其特征在于，所述缓冲溶液选自Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、ACES缓冲液、醋酸钠缓冲液、MES缓冲液、Good’s缓冲液或甘氨酸缓冲液中的任意一种或至少两种的组合，所述缓冲溶液的pH为5-9。
7.根据权利要求5所述的用于甘油三酯电化学检测的复合酶液，其特征在于，所述增稠剂包括甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基纤维素、淀粉磷酸钠、丙二醇藻蛋白酸酯或羧甲基纤维素中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求5所述的用于甘油三酯电化学检测的复合酶液，其特征在于，所述保护剂包括蔗糖、乳糖、甘露醇、牛血清白蛋白、明胶或海藻糖中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种用于甘油三酯电化学检测的检测试纸，其特征在于，包括权利要求1-8任一项所述的用于甘油三酯电化学检测的复合酶液，所述复合酶液负载于所述检测试纸的电极层，且负载量为1-5mg。
10.一种用于甘油三酯电化学检测的传感器，其特征在于，其包括权利要求9所述的用于甘油三酯电化学检测的检测试纸。
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GR01 Patent grant
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Denomination of invention: Composite enzyme solution, detection test strip, and sensor for electrochemical detection of triglycerides

Granted publication date: 20231020

Pledgee: Bank of Nanjing Jiangbei District branch of Limited by Share Ltd.

Pledgor: Nanjing Jingjie Biotechnology Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980009019

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