CN108467882A - 一种甘油三脂检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种甘油三脂检测试剂盒，一种甘油三脂检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂R1和试剂R2，试剂R1包含甘油激酶、脂蛋白酯酶、过氧化物酶、复合色原、镁盐；所述试剂R2包含甘油磷酸氧化酶、4‑氨基安替比林、三磷酸腺苷；复合色原为3‑甲基‑N,N‑二丙磺酸钠苯胺、N‑乙基‑N‑(3‑磺丙基)‑3‑甲基苯胺钠盐、N,N‑双(4‑磺丁基)‑3‑甲基苯胺二钠盐、N‑乙基‑N‑(2‑羟基‑3‑磺丙基)‑3‑甲基苯胺钠盐、2,4,6‑三溴‑3‑羟基苯甲酸中的多种。本发明中试剂盒在检测甘油三脂时具有较高的灵敏度，检测时间短，抗干扰能力强。

Description

一种甘油三脂检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种甘油三脂检测试剂盒。
背景技术
甘油三酯(TG)是脂质的组成成分，是甘油和3个脂肪酸所形成的脂。是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人体内含量最多的脂类。甘油三酯的主要功能是供给与储存能源，还可固定和保护内脏。甘油三酯也是血脂中的主要组成成分，是机体重要的功能物质。正常情况下，从食物中摄取的脂肪于肠道内，在胆汁酸、脂酶的作用下被肠黏膜吸收，在肠黏膜上皮细胞内合成甘油三酯。在病理条件下，各种组织细胞合成和贮存甘油三脂明显增多，血清甘油三酯是所有脂蛋白中的甘油三酯总和。临床上作为一项重要的血脂常规测定指标。甘油三酯的升高常见于糖尿病、肥胖症、肾病综合征、肝病、家族性高甘油三酯血病、甲状腺功能不足、脑血管疾病等。甘油三脂降低可见于甲亢、重症肝损害、垂体机能减退、吸收不良等。
目前，甘油三脂的测定方法血清TG测定方法有化学法、酶法和色谱法三大类，化学法操作繁琐，技术要求高。色谱法费用贵，样品处理复杂。酶法作为检测血清TG的常规方法，具有简便、快速、微量、精密度高、特异性强、易达到终点、线性范围广等优点。酶法的主要原理：脂蛋白酯酶水解TG生成甘油和脂肪酸(FFA)；接着是甘油与三磷酸腺苷(三磷酸腺苷)在甘油激酶(甘油激酶)和磷酸甘油氧化酶(甘油磷酸氧化酶),催化下生成H2O2；H2O2偶联Trinder反应呈色，即H2O2与4-氨基安替比林(4-AAP)在过氧化物酶的催化作用下生成醌亚胺，其生成量与样本中甘油三脂含量成正比。
已有文献报道，不同色原对Trinder的反应中在呈色灵敏度、稳定性及抗干扰的能力有差别，例如，参见李妍等“Trinder’s反应中四种色原物质的比较”《中国医学检验杂志》，2004年第5期，因此色原自身的呈色灵敏度及稳定性影响试剂的灵敏度。现如今，市场上存在酶法甘油三酯检测试剂盒，但是市售的试剂盒普遍存在灵敏度偏低的问题，这可能使得检测结果不准确，影响医生的判断，最终延误治疗或造成误诊。因此，研制一种灵敏度更高的甘油三酯检测试剂盒显得十分必要。
发明内容
本发明的目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种灵敏度更高的甘油三酯检测试剂盒，该检测盒检测时间短、抗干扰能力强、稳定性好、重复性好、精确度高、检测灵敏度高。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种甘油三脂检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂R1和试剂R2，其特征在于：所述试剂R1包含甘油激酶、脂蛋白酯酶、过氧化物酶、复合色原、镁盐；所述试剂R2包含甘油磷酸氧化酶、4-氨基安替比林、三磷酸腺苷；
所述复合色原为3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺(TODP)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸(TBHBA)中的多种。
作为一种优选的技术方案，所述复合色原为3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐组成的混合物。
作为一种改进的技术方案，所述试剂R1包含甘油激酶0.2～10KU/L、脂蛋白酯酶0.1～15KU/L、过氧化物酶0.05～5KU/L、复合色原中3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺的浓度为0.2～10mmol/L，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐的浓度为1.0～30mmol/L、镁盐0.5～30mmol/L；所述试剂R2包含甘油磷酸氧化酶0.2～20KU/L、4-氨基安替比林0.1～20mmol/L、三磷酸腺苷0.1～6mmol/L。
作为一种改进的技术方案，所述试剂R1还包含缓冲液30～300mmol/L、稳定剂1-20g/L、表面活性剂5～70mmol/L和防腐剂0.1～2g/L；所述试剂R2还包含缓冲液25～100mmol/L、稳定剂1-20g/L、表面活性剂5～70mmol/L和防腐剂0.1～2g/L。
作为一种优选的技术方案，所述复合色原中3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺的浓度为0.3-5mmol/L，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐的浓度为3-25mmol/L。
作为一种改进的技术方案，所述试剂R1和所述试剂R2中缓冲液分别为3-[N,N-二(羟乙基氨基)]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、GOOD’S缓冲液中的一种或多种。
作为一种优选的技术方案，所述试剂R1和所述试剂R2中缓冲液分别为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、GOOD’S缓冲液中的一种或多种，且所述缓冲液的浓度为30～80mmol/L。
作为一种改进的技术方案，所述试剂R1和所述试剂R2中稳定剂分别为聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、EDTA钠、甘露醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇和牛乳血清蛋白(BSA)中的一种或多种。
作为一种改进的技术方案，所述试剂R1和试剂R2的pH为7-9。
作为一种优选的技术方案，所述试剂R1和所述试剂R2中表面活性剂分别为TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列的一种或多种。
作为一种优选的方案，所述试剂R1和所述试剂R2中防腐剂分别为山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、2-甲基异噻唑酮盐酸、叠氮钠、硫柳汞、procl in系列、尼泊金酯中的一种或多种。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)该发明涉及的检测试剂盒包括试剂R1、R2，色原选择3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺(TODP)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)的复合色原，与使用单一色原的现有技术相比，可以有效缩短反应曲线到终点的时间，灵敏度高、检测时间短；
(2)本发明中的检测试剂盒通过稳定性试验、重复性试验、干扰试验考察，采用复合色原试剂盒相对于采用单一色原的试剂盒具有更好的稳定性、重复性、抗干扰能力强；
(3)该试剂的pH范围为7-9，所用pH的可以是7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.4、8.8、9.0。在该试剂盒优选的pH下，色原呈现良好的显色稳定性，两者相辅相成，从而提高试剂盒检测的稳定性和灵敏性；
(4)ATP是呈酸性的物质，会影响POD的稳定性，从而影响试剂的稳定性，所以将这两种试剂放置在不同组份里。将ATP放置在R2里，可降低试剂的空白吸光度值。
综上所述，本发明的试剂盒采用复合色原，通过K值测定、稳定性试验、干扰试验以及重复性试验考察，证明该试剂盒符合本行业内试剂盒的性能指标，并且相比现有技术中的单一色原具有更好的灵敏度、稳定性、抗干扰性和重复性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种甘油三酯的检测试剂盒包括以下组分：
试剂R1(pH7.0)
试剂R2(pH7.0)
实施例2
一种甘油三酯的检测试剂盒包括以下组分：
试剂R1(pH7.5)
试剂R2(pH7.5)
实施例3
一种甘油三酯的检测试剂盒包括以下组分：
试剂R1(pH8.0)
试剂R2(pH8.0)
实施例4
一种甘油三酯的检测试剂盒包括以下组分：
试剂R1(pH8.5)
试剂R2(pH8.5)
实施例5
一种甘油三酯的检测试剂盒包括以下组分
试剂R1(pH8.8)
试剂R2(pH8.8)
实施例6
一种甘油三酯的检测试剂盒包括以下组分：
试剂R1(pH7.5)
试剂R2(pH7.5)
实施例7
一种甘油三酯的检测试剂盒包括以下组分：
试剂R1(pH7.5)
试剂R2(pH7.5)
实施例8一种甘油三酯的检测试剂盒的检测方法及实验参数
分析方法：终点法
反应方向：上升方向
校准方式：LOGIT-LOG(4P)或SPLINE
测定波长：主波长546nm，辅波长660nm
测定温度：37℃
样本：试剂R1：试剂R2：校准品＝160:40:2(单位：ul)
操作方法：将160ul试剂R1加入2ul样本，37℃孵育5分钟后加入400ul试剂R2，1分钟后读取吸光度A1，3分钟后读取吸光度A2，采用2点定标法，用日立7180全自动生化分析仪进行检测，各实施例试剂性能测试结果见表1。
表1
由表1可以看出，复合色原在空白、灵敏度、线性反应到终点的时间等性能上要优于单一色原，而且两色原的比例不同对试剂性能也有影响，总的来说实施例4效果最好。
实施例9稳定性试验考察
将实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中试剂盒在37℃下进行加速破坏，间隔相同破坏时间后对空白吸光度、灵敏度K值以及线性反应到终点时间进行测定，具体测定结果见表2。
表2
从上述表2实验结果来看，复合色原在破坏后，线性反应到终点的时间只往后移动1个点，破坏实验对试剂灵敏度影响不大，说明采用复合色原的试剂盒具有更好的稳定性。
实施例10干扰样本考察
选择无溶血、黄疸和脂血的新鲜血清作为基础样本，用基础样本分别以1:10的比例稀释胆红素、血红蛋白等干扰物的贮存液和空白液作为高胆红素样本、溶血样本和对照样本，稀释后测试样本中胆红素和血红蛋白的浓度分别是0.488g/L和5g/L。以正常样本、溶血样本以及高胆红素样本为检测样本，采用实施例1、2、3和4中试剂盒分别对上述样本进行测定，各样本测定结果见表3。
表3
通过表3数据分析可以得出：溶血样本与正常样本测定的数据对比可以发现，各色原抗血红蛋白干扰能力普遍较差，且血红蛋白对反应的干扰均呈正干扰，溶血样本中血红蛋白干扰吸光度对检测结果的影响最严重，并且通过与对照样本比较，得出各实施例对溶血样本测值偏高，但是复合色原的试剂盒检测值相对单一色原来说更接近正常值。
胆红素具有还原性，也可通过消耗主反应中间产物，导致有色终反应产物减少，而使测定结果偏低，通过将高胆红素样本与正常样本测定的数据对比可以看出，相对来说复合色原检测结果更接近正常样本，较为准确。
通过上述结果可以得出，溶血、高胆红素会对试剂造成正干扰，但是复合色原的试剂盒检测值偏差变化较小，因此本发明的试剂盒在测定一些特殊样本时，具有较好的抗干扰能力。
实施例11重复性实验
以朗道质控品低值1178靶值1.11(1.02-1.20)作为待测样品，用本发明实施例1-4试剂盒重复测定10次，计算变异系数CV％值，测试结果见表4。
表4
测定次数 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
1 1.15 1.15 1.11 1.11
2 1.13 1.13 1.12 1.12
3 1.12 1.05 1.14 1.14
4 1.13 1.13 1.03 1.13
5 1.14 1.14 1.15 1.15
6 1.13 1.03 1.12 1.12
7 1.17 1.17 1.08 1.11
8 1.11 1.11 1.13 1.13
9 1.12 1.12 1.13 1.13
10 1.18 1.18 1.15 1.15
平均值 1.14 1.12 1.12 1.13
CV％ 1.98％ 4.28％ 3.28％ 1.28％
由以上结果可见，实施例1、2、3和4的CV％值分别为1.98％、4.28％、3.28％、1.28％均符合《甘油三酯测定试剂盒(酶法)行业标准》标准要求，复合色原比单一色原重复性好。
实施例11准确度实验
以GBW09147靶值0.85作为待测样品，用本发明实施例1-4试剂盒重复测定10次，计算均值(M)与相对偏差B％值结果如表5。
表5
测定次数 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
1 0.88 0.96 0.91 0.83
2 0.82 0.95 0.93 0.89
3 0.78 0.96 0.89 0.82
4 0.85 0.97 0.87 0.80
5 0.81 0.98 0.81 0.81
6 0.89 0.97 0.96 0.80
7 0.85 0.97 0.94 0.87
8 0.77 0.97 0.85 0.83
9 0.80 0.97 0.99 0.84
10 0.83 0.96 0.93 0.81
均值(M) 0.83 0.97 0.91 0.83
B％ 2.59％ 13.65％ 6.82％ 2.35％
由以上结果可见，实施例1、2、3和4的B％值分别为2.59％、13.65％、6.82％和2.35％，采用复合色原的实施例1、实施例4其B％均小于3％，相比而言采用复合色原的试剂盒准确度更符合技术要求，相对偏差<10％。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甘油三脂检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂R1和试剂R2，其特征在于：所述试剂R1包含甘油激酶、脂蛋白酯酶、过氧化物酶、复合色原、镁盐；所述试剂R2包含甘油磷酸氧化酶、4-氨基安替比林、三磷酸腺苷；
所述复合色原为3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸中的多种。
2.根据权利要求1所述的一种甘油三脂检测试剂盒，其特征在于：所述复合色原为3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐组成的混合物。
3.根据权利要求2所述的一种甘油三脂检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1包含甘油激酶0.2～10KU/L、脂蛋白酯酶0.1～15KU/L、过氧化物酶0.05～5KU/L、复合色原中3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺的浓度为0.2～10mmol/L，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐的浓度为1.0～30mmol/L、镁盐0.5～30mmol/L；所述试剂R2包含甘油磷酸氧化酶0.2～20KU/L、4-氨基安替比林0.1～20mmol/L、三磷酸腺苷0.1～6mmol/L。
4.根据权利要求3所述的一种甘油三脂检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1还包含缓冲液30～300mmol/L、稳定剂1-20g/L、表面活性剂5～70mmol/L和防腐剂0.1～2g/L；所述试剂R2还包含缓冲液25～100mmol/L、稳定剂1-20g/L、表面活性剂5～70mmol/L和防腐剂0.1～2g/L。
5.根据权利要求3或4所述的一种甘油三脂检测试剂盒，其特征在于：所述复合色原中3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺的浓度为0.3-5mmol/L，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐的浓度为3-25mmol/L。
6.根据权利要求4所述的一种甘油三脂检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1和所述试剂R2中缓冲液分别为3-[N,N-二(羟乙基氨基)]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、GOOD’S缓冲液中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的一种甘油三脂检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1和所述试剂R2中缓冲液分别为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、GOOD’S缓冲液中的一种或多种，且所述缓冲液的浓度为30～80mmol/L。
8.根据权利要求4所述的一种甘油三脂检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1和所述试剂R2中稳定剂分别为聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、EDTA钠、甘露醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇和牛乳血清蛋白(BSA)中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的一种甘油三脂检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1和试剂R2的pH为7-9。
10.根据权利要求4所述的一种甘油三脂检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1和所述试剂R2中表面活性剂分别为TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列的一种或多种。
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