CN106086161A - 一种脂蛋白磷脂酶a2检测试剂及其制备与使用方法 - Google Patents

一种脂蛋白磷脂酶a2检测试剂及其制备与使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备与使用方法，该检测试剂由以下成分及其含量组成：20‑200mmol/L HEPES缓冲液、20‑100mmol/L柠檬酸盐缓冲液、50mmol/L 1‑豆蔻酰基‑2‑(4‑对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液、20‑100U/L脂蛋白磷脂酶A2校准品以及20‑100U/L脂蛋白磷脂酶A2质控品。该检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对脂蛋白磷脂酶A2的测定，可以高通量、快速化、精确地确定生物样品中的脂蛋白磷脂酶A2含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点。

Description

一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备与使用方法
技术领域
本发明涉及生物医学检验技术领域，更具体地说，涉及一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备与使用方法。
背景技术
脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)是一项用于动脉粥样硬化、冠心病的临床评价和风险预测的重要评价指标。脂蛋白磷脂酶A2是一种非钙依赖性的丝氨酸脂酶，与cPLA2和sPLA2等磷脂酶不同的是，脂蛋白磷脂酶A2与低密度脂蛋白相关，与高密度脂蛋白相关性微弱。脂蛋白磷脂酶A2由巨噬细胞和其他炎症细胞产生，在动脉粥样硬化的病变晚期比前期浓度高。低密度脂蛋白氧化是动脉粥样硬化的过程中的一个关键步骤。脂蛋白磷脂酶A2通过水解过氧化物酶参与被氧化的低密度脂蛋白在血管壁中的降解，生成有效的促炎介质：溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸，导致动脉粥样硬化斑块的形成。脂蛋白磷脂酶A2与其他的心血管脂质标志物一样存在一定的个体差异，但与高敏C反应蛋白相比可变性大大减少。除此之外，脂蛋白磷脂酶A2在系统性炎症条件下不会升高，因此可能作为血管炎症反应的特异性标志物。由于脂蛋白磷脂酶A2在个体之间相对小的生物差异性和血管特异性的特点，因此脂蛋白磷脂酶A2的检测在心血管风险的监控中有重要意义。
目前国内外关于脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的检测已申请及获得授权的专利较多，所使用的检测方法基本都是免疫学方法，如胶乳增强免疫比浊、ELISA、免疫荧光、化学发光、磁微粒化学发光、时间分辨荧光免疫分析、免疫胶体金、免疫层析等。这些免疫学方法所使用的检测试剂灵敏度低、特异性弱，配制过程复杂，尤其是检测结果以底物转换速度：nm/min/ml计算，换算复杂，因此难以满足行业发展需要，对Lp-PLA2检测试剂进行改进十分必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种操作简便、灵敏度高、特异性强的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备和使用方法。应用该检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对脂蛋白磷脂酶A2的测定，可以高通量、快速化、精确地确定生物样品中的脂蛋白磷脂酶A2含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低脂蛋白磷脂酶A2检测成本，有利于临床广泛推广使用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，由以下成分及其含量组成：20-200mmol/L HEPES缓冲液、20-100mmol/L柠檬酸盐缓冲液、50mmol/L 1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液、20-100U/L脂蛋白磷脂酶A2校准品以及20-100U/L脂蛋白磷脂酶A2质控品。
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其中，所述HEPES缓冲液由如下浓度的组分配制而成：200mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10mmol/L 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、10mmol/L正壬烷磺酸钠、5mmol/L乙二胺四乙酸、200mmol/L氯化钠以及余量的纯化水,使用6M HCl调节pH至7.60±0.05；
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其中，所述柠檬酸盐缓冲液由如下浓度的组分配制而成：20mmol/L一水合柠檬酸、10mmol/L正壬烷磺酸钠以及余量的纯化水,使用6M HCl调节pH至4.50±0.05；
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其中，所述1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液由如下浓度的组分配制而成：35mmol/L 1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱以及余量的二甲基甲酰胺；
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其中，所述脂蛋白磷脂酶A2校准品和脂蛋白磷脂酶A2质控品均由如下浓度的组分配制而成：20-100U/L的活力为100-400U/mg的脂蛋白磷脂酶A2以及余量的基质溶液。
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其中，所述脂蛋白磷脂酶A2校准品与脂蛋白磷脂酶A2质控品采用的基质溶液由如下浓度的组分配制而成：150mmol/L Na2HPO4、质量浓度15％NaCl、质量浓度1％BSA牛血清白蛋白、体积浓度0.1％叠氮钠防腐剂以及余量的纯化水,使用6M HCl调节pH至7.40±0.05。
本发明还提供一种如上所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的制备方法，分别配制HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液、脂蛋白磷脂酶A2校准品以及脂蛋白磷脂酶A2质控品；
所述HEPES缓冲液的配制方法如下：称取配方量的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、正壬烷磺酸钠、乙二胺四乙酸、氯化钠，分别加入纯化水中，搅拌，溶解，定容，调节pH，即得；
所述柠檬酸盐缓冲液的配制方法如下：称取配方量的一水合柠檬酸、正壬烷磺酸钠，分别加入纯化水中，搅拌，溶解，定容，调节pH，即得；
所述1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液的配制方法如下：称取配方量的1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱，加入二甲基甲酰胺中，搅拌，溶解，定容，即得；
所述脂蛋白磷脂酶A2校准品的配制方法如下：称取配方量的活力为100-400U/mg的脂蛋白磷脂酶A2，加入基质溶液中，搅拌，溶解，定容，即得；
所述脂蛋白磷脂酶A2质控品的配制方法如下：称取配方量的活力为100-400U/mg的脂蛋白磷脂酶A2，加入基质溶液中，搅拌，溶解，定容，即得。
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的制备方法，其中，所述基质溶液的配制方法如下：称取配方量的Na2HPO4、NaCl、BSA牛血清白蛋白、叠氮钠防腐剂，加入纯化水中，搅拌，溶解，定容，调节pH，即得。
本发明还提供一种如上所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的使用方法，包括如下步骤：
(1)试剂处理
HEPES缓冲液：稳定液体，配制后储存于2-8℃备用；
柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液：将柠檬酸盐缓冲液与1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液以体积比为19:1比例混匀，混合液可在2-8℃下稳定两周；
(2)准备样本
样本为新鲜的离体血清或血浆，采血后立即离心分离血清，离心后样本在2-8℃保存可稳定7天，-20℃保存可稳定2个月；
(3)校准程序
在全自动生化分析仪中加入脂蛋白磷脂酶A2校准品、HEPES缓冲液，混匀，37℃温育4.5分钟；然后加入柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液，混匀，410nm波长进行检测，37℃恒温2分钟后，读取初始吸光度，连续监测3.5min的吸光度变化率，由生化分析仪自动制作校准曲线；
使用脂蛋白磷脂酶A2校准品，每7天一次重新制作标准曲线；当发生如下情形时，需要重新校准：试剂批号更换时；仪器更换零部件或者保养时；质控品或样本结果异常时；
(4)质控程序
在全自动生化分析仪中加入脂蛋白磷脂酶A2质控品、HEPES缓冲液，混匀，37℃温育4.5分钟；然后加入柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液，混匀，410nm波长进行检测，37℃恒温2分钟后，读取初始吸光度，连续监测3.5min的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算质控品浓度数值；
使用脂蛋白磷脂酶A2质控品，每天进行质控实验；每个浓度质控品重复测量10次，计算精密度CV；
(5)检测过程
在全自动生化分析仪中加入待检样品、HEPES缓冲液，混匀，37℃温育4.5分钟；然后加入柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液，混匀，410nm波长进行检测，37℃恒温2分钟后，读取初始吸光度，连续监测3.5min的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算待测样品浓度数值。
实施本发明的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备和使用方法，具有以下有益效果：
(1)本发明为了克服现有技术存在的缺陷，提供了一种操作简便、灵敏度高、特异性强的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，应用该检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对脂蛋白磷脂酶A2的测定，可以高通量、快速化、精确地确定生物样品中的脂蛋白磷脂酶A2含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低脂蛋白磷脂酶A2检测成本，有利于临床广泛推广使用。
(2)该检测试剂具有如下优势：所有试剂组分配方均为自主研发，质量可靠；采用国际领先的酶法，检验方法更先进，性能优于免疫法；经临床验证，检测数据准确、可靠、重复性好、灵敏度高；性价比高，性能达到美国同类产品水平，价格更低；
(3)该检测试剂的配制方法简单，使用方便，灵敏度高、特异性强、结果准确，适宜广泛推广；
(4)本发明的校准品、质控品配制完成后可制成冻干粉长期保存，使用时加入相应量的纯化水复溶；使用本发明的校准品定标后，检测血清或血浆样本得到的结果单位即为U/L，无需换算。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是脂蛋白磷脂酶A2的标定曲线；
图2是脂蛋白磷脂酶A2检测中相关性的检测结果；
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。
实施例1一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂
该检测试剂由以下成分及其含量组成，见表1：
表1 脂蛋白磷脂酶A2检测试剂组成成分
其中，所述HEPES缓冲液(R1)由如下浓度的组分配制而成：200mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10mmol/L 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、10mmol/L正壬烷磺酸钠、5mmol/L乙二胺四乙酸、200mmol/L氯化钠以及余量的纯化水，使用6M HCl调节pH至7.60±0.05；
所述柠檬酸盐缓冲液(R2a)由如下浓度的组分配制而成：20mmol/L一水合柠檬酸、10mmol/L正壬烷磺酸钠以及余量的纯化水，使用6M HCl调节pH至4.50±0.05；
所述1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液(R2b)由如下浓度的组分配制而成：35mmol/L 1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱以及余量的二甲基甲酰胺；
所述校准品和质控品：所述脂蛋白磷脂酶A2校准品和脂蛋白磷脂酶A2质控品均由如下浓度的组分配制而成：20-100U/L的活力为100-400U/mg的脂蛋白磷脂酶A2以及余量的基质溶液；其中，基质溶液由如下浓度的组分配制而成：150mmol/L Na2HPO4、质量浓度15％NaCl、质量浓度1％BSA牛血清白蛋白、体积浓度0.1％叠氮钠防腐剂以及余量的纯化水，使用6M HCl调节pH至7.40±0.05。
实施例2一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的制备方法
分别配制HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液、脂蛋白磷脂酶A2校准品以及脂蛋白磷脂酶A2质控品；
所述HEPES缓冲液的配制方法如下：称取配方量的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、正壬烷磺酸钠、乙二胺四乙酸、氯化钠，分别加入纯化水中，搅拌，溶解，定容，调节pH，即得；
所述柠檬酸盐缓冲液的配制方法如下：称取配方量的一水合柠檬酸、正壬烷磺酸钠，分别加入纯化水中，搅拌，溶解，定容，调节pH，即得；
所述1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液的配制方法如下：称取配方量的1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱，加入二甲基甲酰胺中，搅拌，溶解，定容，即得；
所述脂蛋白磷脂酶A2校准品的配制方法如下：称取配方量的活力为200U/mg的脂蛋白磷脂酶A2，加入基质溶液中，搅拌，溶解，定容，即得；
所述脂蛋白磷脂酶A2质控品的配制方法如下：称取配方量的活力为200U/mg的脂蛋白磷脂酶A2，加入基质溶液中，搅拌，溶解，定容，即得。
所述基质溶液的配制方法如下：称取配方量的Na2HPO4、NaCl、BSA牛血清白蛋白、叠氮钠防腐剂，加入纯化水中，搅拌，溶解，定容，调节pH，即得。
如配制100U/L的校准品或质控品，则称取活力为200U/mg的脂蛋白磷脂酶A20.5mg溶解于上述方法配制的基质1L中。本发明的校准品、质控品配制完成后可制成冻干粉长期保存，使用时加入相应量的纯化水复溶。
实施例3一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的使用方法，包括如下步骤：
(1)试剂处理
HEPES缓冲液(R1)：稳定液体，配制后储存于2-8℃备用；
柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液(R2ab)：将柠檬酸盐缓冲液(R2a)与1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液(R2b)以体积比为19:1比例混匀，混合液可在2-8℃下稳定两周；
(2)准备样本
样本为新鲜的离体血清或血浆，采血后立即离心分离血清，离心后样本在2-8℃保存可稳定7天，-20℃保存可稳定2个月；
(3)校准程序
在全自动生化分析仪中加入脂蛋白磷脂酶A2校准品、HEPES缓冲液，混匀，37℃温育4.5分钟；然后加入柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液，混匀，410nm波长进行检测，37℃恒温2分钟后，读取初始吸光度，连续监测3.5min的吸光度变化率，由生化分析仪自动制作校准曲线；
使用脂蛋白磷脂酶A2校准品，每7天一次重新制作标准曲线；当发生如下情形时，需要重新校准：试剂批号更换时；仪器更换零部件或者保养时；质控品或样本结果异常时；
(4)质控程序
在全自动生化分析仪中加入脂蛋白磷脂酶A2质控品、HEPES缓冲液，混匀，37℃温育4.5分钟；然后加入柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液，混匀，410nm波长进行检测，37℃恒温2分钟后，读取初始吸光度，连续监测3.5min的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算质控品浓度数值；
使用脂蛋白磷脂酶A2质控品，每天进行质控实验；每个浓度质控品重复测量10次，计算精密度CV；
(5)检测过程
在奥林巴斯AU480机型中加入待检样品、HEPES缓冲液，混匀，37℃温育4.5分钟；然后加入柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液，混匀，410nm波长进行检测，37℃恒温2分钟后，读取初始吸光度，连续监测3.5min的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算待测样品浓度数值。
奥林巴斯AU480机型的参数设置条件如表2，测试过程如表3；
表2 奥林巴斯AU480机型的参数设置
测定方法 速率法 样本量 2μL
R1 200μL R2ab 50μL
反应时间 10分钟 主波长 410nm
温度 37℃ 副波长 520nm
反应方向 上升
表3测试过程
本发明使用脂蛋白磷脂酶A2检测试剂检测脂蛋白磷脂酶A2含量的检验原理如下：
酶法直接测定脂蛋白磷脂酶A2活性，脂蛋白磷脂酶A2水解底物1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱sn-2位置，生成一种有颜色的产物，4-对硝基苯酚；根据吸光度的变化速率计算Lp-PLA2的活性，用两个校准品作出一条吸光度与酶活(U/L)相对应的定标图，从而推导出脂蛋白磷脂酶A2的活性。
奥林巴斯AU480测试结果如下(本发明测试结果中的准确度、精密度、线性范围、相关性、稳定性均采用本领域常规测试方法测得)：
1.准确度：相对偏差B≤10.0％；
2.精密度：重复性CV≤2.0％、批间差R≤3.0％，
测试低值和高值质控品，批内精密度CV<2.0％；
表4 精密度测试结果
测试次数 浓度1(U/L) 浓度2(U/L)
1 35.02 93.10
2 35.28 93.58
3 35.42 94.02
4 34.67 92.87
5 35.18 94.00
6 35.20 94.10
7 35.17 93.56
8 34.98 94.03
9 34.11 93.38
10 35.29 92.92
Mean 35.03 93.56
SD 0.38 0.48
CV 1.10％ 0.51％
3.线性范围：3U/L-680U/L，标定曲线见图1；
4、相关性：与Diadexus测定结果相比，相关系数r＞0.990，相关性结果见表5与图2；
表5 相关性结果
5、稳定性：2-8℃稳定＞15天，日间CV＜5.0％。
表6 稳定性结果
本专利通过研发全新校准品系统即本发明的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，以酶法进行检测，直接使用U/L为检测结果单位，判读结果更简便，更符合临床检验要求。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其特征在于，由以下成分及其含量组成：20-200mmol/L HEPES缓冲液、20-100mmol/L柠檬酸盐缓冲液、50mmol/L 1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液、20-100U/L脂蛋白磷脂酶A2校准品以及20-100U/L脂蛋白磷脂酶A2质控品。
2.根据权利要求1所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其特征在于，所述HEPES缓冲液由如下浓度的组分配制而成：200mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10mmol/L 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、10mmol/L正壬烷磺酸钠、5mmol/L乙二胺四乙酸、200mmol/L氯化钠以及余量的纯化水,使用6M HCl调节pH至7.60±0.05。
3.根据权利要求2所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其特征在于，所述柠檬酸盐缓冲液由如下浓度的组分配制而成：20mmol/L一水合柠檬酸、10mmol/L正壬烷磺酸钠以及余量的纯化水,使用6M HCl调节pH至4.50±0.05。
4.根据权利要求3所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其特征在于，所述1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液由如下浓度的组分配制而成：35mmol/L 1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱以及余量的二甲基甲酰胺。
5.根据权利要求4所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其特征在于，所述脂蛋白磷脂酶A2校准品和脂蛋白磷脂酶A2质控品均由如下浓度的组分配制而成：20-100U/L的活力为100-400U/mg的脂蛋白磷脂酶A2以及余量的基质溶液。
6.根据权利要求5所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其特征在于，所述脂蛋白磷脂酶A2校准品与脂蛋白磷脂酶A2质控品采用的基质溶液由如下浓度的组分配制而成：150mmol/LNa2HPO4、质量浓度15％NaCl、质量浓度1％BSA牛血清白蛋白、体积浓度0.1％叠氮钠防腐剂以及余量的纯化水,使用6M HCl调节pH至7.40±0.05。
7.一种如权利要求6所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的制备方法，其特征在于，分别配制HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液、脂蛋白磷脂酶A2校准品以及脂蛋白磷脂酶A2质控品；
所述HEPES缓冲液的配制方法如下：称取配方量的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、正壬烷磺酸钠、乙二胺四乙酸、氯化钠，分别加入纯化水中，搅拌，溶解，定容，调节pH，即得；
所述柠檬酸盐缓冲液的配制方法如下：称取配方量的一水合柠檬酸、正壬烷磺酸钠，分别加入纯化水中，搅拌，溶解，定容，调节pH，即得；
所述1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液的配制方法如下：称取配方量的1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱，加入二甲基甲酰胺中，搅拌，溶解，定容，即得；
所述脂蛋白磷脂酶A2校准品的配制方法如下：称取配方量的活力为100-400U/mg的脂蛋白磷脂酶A2，加入基质溶液中，搅拌，溶解，定容，即得；
所述脂蛋白磷脂酶A2质控品的配制方法如下：称取配方量的活力为100-400U/mg的脂蛋白磷脂酶A2，加入基质溶液中，搅拌，溶解，定容，即得。
8.根据权利要求7所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的制备方法，其特征在于，所述基质溶液的配制方法如下：称取配方量的Na2HPO4、NaCl、BSA牛血清白蛋白、叠氮钠防腐剂，加入纯化水中，搅拌，溶解，定容，调节pH，即得。
9.一种如权利要求1所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)试剂处理
HEPES缓冲液：稳定液体，配制后储存于2-8℃备用；
柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液：将柠檬酸盐缓冲液与1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液以体积比为19:1比例混匀，混合液可在2-8℃下稳定两周；
(2)准备样本
样本为新鲜的离体血清或血浆，采血后立即离心分离血清，离心后样本在2-8℃保存可稳定7天，-20℃保存可稳定2个月；
(3)校准程序
在全自动生化分析仪中加入脂蛋白磷脂酶A2校准品、HEPES缓冲液，混匀，37℃温育4.5分钟；然后加入柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液，混匀，410nm波长进行检测，37℃恒温2分钟后，读取初始吸光度，连续监测3.5min的吸光度变化率，由生化分析仪自动制作校准曲线；
使用脂蛋白磷脂酶A2校准品，每7天一次重新制作标准曲线；当发生如下情形时，需要重新校准：试剂批号更换时；仪器更换零部件或者保养时；质控品或样本结果异常时；
(4)质控程序
在全自动生化分析仪中加入脂蛋白磷脂酶A2质控品、HEPES缓冲液，混匀，37℃温育4.5分钟；然后加入柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液，混匀，410nm波长进行检测，37℃恒温2分钟后，读取初始吸光度，连续监测3.5min的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算质控品浓度数值；
使用脂蛋白磷脂酶A2质控品，每天进行质控实验；每个浓度质控品重复测量10次，计算精密度CV；
(5)检测过程
在全自动生化分析仪中加入待检样品、HEPES缓冲液，混匀，37℃温育4.5分钟；然后加入柠檬酸盐缓冲液+1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液混合液，混匀，410nm波长进行检测，37℃恒温2分钟后，读取初始吸光度，连续监测3.5min的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算待测样品浓度数值。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109374878A (zh) * 2018-11-13 2019-02-22 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶a2的方法
CN109917131A (zh) * 2019-03-26 2019-06-21 苏州博源医疗科技有限公司 一种脂蛋白磷脂酶a2检测试剂及其制备和使用方法
CN110530809A (zh) * 2019-09-19 2019-12-03 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 一种高性能磷脂酶a2检测试剂盒
CN111175242A (zh) * 2020-03-17 2020-05-19 湖南新大陆生物技术有限公司 一种脂蛋白磷脂酶a2检测试剂盒及其应用
CN112575057A (zh) * 2020-12-11 2021-03-30 深圳上泰生物工程有限公司 一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶a2活性中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘芸辉: ""分光光度法测定脂蛋白相关磷脂酶A2活性的研究"", 《中国学位论文全文数据库》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109374878A (zh) * 2018-11-13 2019-02-22 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶a2的方法
CN109917131A (zh) * 2019-03-26 2019-06-21 苏州博源医疗科技有限公司 一种脂蛋白磷脂酶a2检测试剂及其制备和使用方法
CN109917131B (zh) * 2019-03-26 2021-12-17 苏州博源医疗科技有限公司 一种脂蛋白磷脂酶a2检测试剂及其制备和使用方法
CN110530809A (zh) * 2019-09-19 2019-12-03 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 一种高性能磷脂酶a2检测试剂盒
CN111175242A (zh) * 2020-03-17 2020-05-19 湖南新大陆生物技术有限公司 一种脂蛋白磷脂酶a2检测试剂盒及其应用
CN112575057A (zh) * 2020-12-11 2021-03-30 深圳上泰生物工程有限公司 一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶a2活性中的应用
CN112575057B (zh) * 2020-12-11 2021-07-30 深圳上泰生物工程有限公司 一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶a2活性中的应用

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