CN109917131A - 一种脂蛋白磷脂酶a2检测试剂及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备和使用方法。应用该检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对脂蛋白磷脂酶A2含量的自动化测定，可以高通量、快速化、精确地测定生物样本中脂蛋白磷脂酶A2的含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低脂蛋白磷脂酶A2检测成本，有利于临床广泛推广使用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备和使用方法。
背景技术
脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PLA2）是一项用于动脉粥样硬化、冠心病的临床评价和风险预测的重要评价指标。脂蛋白磷脂酶A2是一种非钙依赖性的丝氨酸脂酶，与cPLA2和sPLA2等磷脂酶不同的是，脂蛋白磷脂酶A2与低密度脂蛋白相关，与高密度脂蛋白相关性微弱。脂蛋白磷脂酶A2由巨噬细胞和其他炎症细胞产生，在动脉粥样硬化的病变晚期比前期浓度高。低密度脂蛋白氧化是动脉粥样硬化的过程中的一个关键步骤。脂蛋白磷脂酶A2通过水解过氧化物酶参与被氧化的低密度脂蛋白在血管壁中的降解，生成有效的促炎介质：溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸，导致动脉粥样硬化斑块的形成。脂蛋白磷脂酶A2与其他的心血管脂质标志物一样存在一定的个体差异，但与高敏C反应蛋白相比可变性大大减少。除此之外，脂蛋白磷脂酶A2在系统性炎症条件下不会升高，因此可能作为血管炎症反应的特异性标志物。由于脂蛋白磷脂酶A2在个体之间相对小的生物差异性和血管特异性的特点，因此脂蛋白磷脂酶A2的检测在心血管风险的监控中有重要意义。
目前国内外关于脂蛋白磷脂酶A2的检测已申请及获得授权的专利较多，所使用的检测方法基本都是免疫学方法，如胶乳增强免疫比浊、ELISA、免疫荧光、化学发光、磁微粒化学发光、时间分辨荧光免疫分析、免疫胶体金、免疫层析等。这些免疫学方法所使用的检测试剂灵敏度低、特异性弱，配制过程复杂，尤其是检测结果以底物转换速度：nm/min/ml计算，换算复杂，难以满足行业发展需要。因此，研发一种灵敏度高、结果精确，且高通量、快速化，操作简便、成本低廉的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备和使用方法对相关疾病的临床诊断具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：针对现有技术的上述缺陷，提供一种操作简便、灵敏度高、特异性强的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备和使用方法。应用该检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对脂蛋白磷脂酶A2含量的自动化测定，可以高通量、快速化、精确地测定生物样本中脂蛋白磷脂酶A2的含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低脂蛋白磷脂酶A2检测成本，有利于临床广泛推广使用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1中包含抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体和均相酶底物溶液；所述试剂R2包含脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物和R2缓冲液。
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，制备方法包括以下步骤：
A.试剂R1的制备：将质量分数5.0%的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、5.0%的葡萄糖-6-磷酸、0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的NaN3的用55 mmol/L、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中混匀，得到试剂R1，所述抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:300。
B.试剂R2的制备：将质量分数0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的NaN3用120 mmol/L、pH=8.2的Tris缓冲液溶解制成R2缓冲液，再将脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物加入所述R2缓冲液中混匀，得到试剂R2，所述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:900。
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂，所述的抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体，由脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原免疫实验动物后产生，所述抗体为完整抗体分子，或者为保留与脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种，优选为兔。
所述抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
a.用PBS缓冲液将脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原稀释至3.0 mg/ml，得到免疫原溶液，然后用3.0 ml所述免疫原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
b.2周后，再用3.0 ml相同的免疫原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔2～5周注射一次，共计注射3～8次；
c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化得到抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体。
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂，其中，所述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原由脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物与载体连接而成，其结构式如下述式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）；
所述载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种，优选为血清蛋白，更优选为牛血清白蛋白。
所述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原的制备方法，包括以下步骤：
（1）将质量分数1.0%的载体蛋白溶解于0.2 mmol/L，pH=8.5的磷酸缓冲液中，得到载体蛋白溶液；
（2）将质量分数0.5%的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物、5.0%的二甲基甲酰胺、5.0%的乙醇溶解于10 mmol/L，pH=5.0的磷酸钾缓冲液中，再加入质量分数0.5%的1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，将上述化学物质在25～35℃下搅拌反应30～60 分钟；
（3）将步骤（2）中溶解好的溶液缓慢滴加至步骤（1）中的载体蛋白溶液中，并在-4～0℃下搅拌12～24小时，得到偶联物溶液，将反应后的偶联物溶液进行透析纯化，纯化后所得溶液即为脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原溶液，在脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原溶液中加入质量分数0.10%的NaN3，于-20℃下储存。
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂，其中，所述的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物由脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式（Ⅱ）所示：
式（Ⅱ）。
所述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物的制备方法，包括以下步骤：
①葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将质量分数2.5%的规格为200KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下溶解于含有0.05 mol/L Tris、3.6 mmol/L MgCl2和1.8 mmol/L NaCl，pH=8.5～9.0的溶液中；在此溶液中加入质量分数10.0%的还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、7.5%的葡萄糖-6-磷酸以及1.5%的卡必醇；加热到30～35℃，再缓慢加入质量分数0.5%的二甲基亚砜，摇匀后静置15～25秒；
②脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的激活：在无水状态下将质量分数0.5%的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物，溶解于5.0%的二甲基甲酰胺中；将此溶液温度降到-10～-15℃；然后加入1.5%的三丁胺、2.5%的氯甲酸异丁酯、1.5%的碳二亚胺；0.5%的N-羟基硫代琥珀酰亚胺；-10～-15℃搅拌30～60分钟；
③葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的连接：将步骤②中激活的温度为-10～-15℃的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物溶液逐滴加入到步骤①中溶解的温度为30～35℃的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2～8℃搅拌12～24小时；
④纯化产物：将反应后的连接产物通过G-25葡聚糖凝胶层析柱进行纯化，纯化后所得溶液即为脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物溶液，在脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物溶液中加入质量分数0.65%的BSA和质量分数0.10%的NaN3，于2～8℃下储存。
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂，其中，所述的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物，其结构式如下述式（Ⅲ）所示：
式（Ⅲ）；
上述式（Ⅲ）所示的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的合成路线如下：
。
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂，其中，所述的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的合成路线，具体制备步骤如下：
（Ⅰ）合成化合物3：将41 g化合物1溶解于200 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，加入64 g四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU），然后将混合物在常温下搅拌20分钟，搅拌结束后再加入17 g化合物2与45 ml N-甲基吗啡啉（NMM），将混合物在0℃下搅拌2小时，然后将上述混合物倒入500ml的纯化水中，再用500ml乙酸乙酯萃取，用500 ml卤水冲洗有机层，重复3次，再用无水硫酸钠干燥，减压蒸发得到粗产物，最后经硅胶层析纯化得到化合物3；
（Ⅱ）合成化合物4：在200 ml 二氯甲烷（DCM）中加入44 g化合物3，在0℃下加入25 ml的HCl/MeOH（2 mol/L），将此混合物在室温下搅拌12小时，然后减压蒸发，得到化合物4；
（Ⅲ）合成化合物6：将23 g化合物4和17 ml三乙胺在400 ml二氯甲烷（DCM）中搅拌混合，然后加入25 g N,N'-二环己基卡二亚胺和52 g化合物5，将反应混合物在室温条件下搅拌2.5小时，然后用饱和碳酸氢钠水溶液冲洗，使用无水硫酸镁进行干燥，过滤后在真空中浓缩，所得粗产物经硅胶层析纯化，洗脱得到化合物6；
（Ⅳ）合成化合物7：将64 g化合物6溶解于500 mL乙酸乙酯（EtOAc）中，然后加入20 mL哌啶，将反应混合物在室温下搅拌3小时，除去溶剂后用500 mL正己烷稀释，沉淀产物经过滤后，用200 mL正己烷洗涤2次，真空干燥得到化合物7；
（Ⅴ）合成化合物9：将21 g化合物7溶解于100 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，加入26 ml二异丙基乙胺（DIEA），然后在室温下搅拌15 分钟，将反应混合物冷却到0°C，随后添加23 g四甲基脲六氟磷酸酯并搅拌30分钟，将15g化合物8添加到上述反应混合物中，然后在室温下搅拌2小时，将搅拌后的反应混合物用250 ml乙酸乙酯（EtOAc）稀释，然后用250 ml纯化水和250 ml卤水冲洗，将有机层分离，通过Na2SO4进行干燥，在真空中除去溶剂，得到化合物9；
（Ⅵ）合成脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物：将16g化合物9溶解于250ml HCl（6mol/L）中，在25℃下搅拌5小时，然后进行减压浓缩，浓缩产物在室温下用乙腈研磨12小时，所得浆料经过滤后减压干燥过夜，得到脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物；
。
本发明还提供一种如上所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的使用方法，包括以下步骤：
（一）在全自动生化分析仪中加入待测样本、R1试剂，混匀，37℃温育3-5分钟；
（二）加入R2试剂，混匀，37℃恒温5-10分钟后，340 nm波长进行检测，连续监测3分钟内的吸光度变化率，由全自动生化分析仪自动计算待测样本中脂蛋白磷脂酶A2的含量；
所述试剂R1与试剂R2按1:1～4:1的体积比使用，优选按4∶1的体积比使用。
本发明所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的使用方法，其中，所述的待测样本为生理样本；优选地，所述的生理样本为血清、血浆、尿液、唾液；更优选地，所述的生理样本为血清或血浆。
本发明的有益效果是：通过反复的试验获得了一种全新的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物，并使用该脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物制备得到高免疫原性的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原，进而免疫实验动物得到高效价的抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体；同时，使用该脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物制备得到脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物。含有上述抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体与脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对脂蛋白磷脂酶A2高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低脂蛋白磷脂酶A2检测成本，有利于临床推广使用。
附图说明
图1是本发明的脂蛋白磷脂酶A2的均相酶免疫检测反应曲线。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂、仪器、设备、耗材均可从正规渠道商购买获得。
实施例1.脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的合成
脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的化学结构式如式（Ⅲ）所示：
式（Ⅲ）。
上述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的合成路线及制备步骤如下：
。
具体的合成步骤如下：
（Ⅰ）合成化合物3：将41 g化合物1溶解于200 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，加入64 g四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU），然后将混合物在常温下搅拌20分钟，搅拌结束后再加入17 g化合物2与45 ml N-甲基吗啡啉（NMM），将混合物在0℃下搅拌2小时，然后将上述混合物倒入500ml的纯化水中，再用500ml乙酸乙酯萃取，用500 ml卤水冲洗有机层，重复3次，再用无水硫酸钠干燥，减压蒸发得到粗产物，最后经硅胶层析纯化得到51 g化合物3，收率68%。
（Ⅱ）合成化合物4：在200 ml 二氯甲烷（DCM）中加入44 g化合物3，在0℃下加入25ml的HCl/MeOH（2 mol/L），将此混合物在室温下搅拌12小时，然后减压蒸发，得到25 g化合物4，收率89%。
（Ⅲ）合成化合物6：将23 g化合物4和17 ml三乙胺在400 ml二氯甲烷（DCM）中搅拌混合，然后加入25 g N,N'-二环己基卡二亚胺和52 g化合物5，将反应混合物在室温条件下搅拌2.5小时，然后用饱和碳酸氢钠水溶液冲洗，使用无水硫酸镁进行干燥，过滤后在真空中浓缩，所得粗产物经硅胶层析纯化，洗脱得到66 g化合物6，为黄色固体，收率86%。
（Ⅳ）合成化合物7：将64 g化合物6溶解于500 mL乙酸乙酯（EtOAc）中，然后加入20mL哌啶，将反应混合物在室温下搅拌3小时，除去溶剂后用500 mL正己烷稀释，沉淀产物经过滤后，用200 mL正己烷洗涤2次，真空干燥得到42 g化合物7，呈淡黄色固体，收率100%。
（Ⅴ）合成化合物9：将21 g化合物7溶解于100 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，加入26ml二异丙基乙胺（DIEA），然后在室温下搅拌15 分钟，将反应混合物冷却到0°C，随后添加23g四甲基脲六氟磷酸酯并搅拌30分钟，将15g化合物8添加到上述反应混合物中，然后在室温下搅拌2小时，将搅拌后的反应混合物用250 ml乙酸乙酯（EtOAc）稀释，然后用250 ml纯化水和250 ml卤水冲洗，将有机层分离，通过Na2SO4进行干燥，在真空中除去溶剂，得到27 g化合物9，为黄色固体，收率83%。
（Ⅵ）合成脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物：将16 g化合物9溶解于250ml HCl（6mol/L）中，在25℃下搅拌5小时，然后进行减压浓缩，浓缩产物在室温下用乙腈研磨12小时，所得浆料经过滤后减压干燥过夜，得到5.7 g脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物，呈灰色固体，收率52%。
对上述合成步骤得到的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物进行结构鉴定，方法如下：
利用VARIAN MERCURY plus 400MHz对上述灰色固体化合物进行1H核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ4.58-4.63 (m, 2H), 3.98-4.03 (m, 2H), 3.40-3.51 (m, 3H), 2.44-2.53 (m, 6H), 1.99-2.07 (m, 5H), 1.71-1.82 (m, 2H), 1.58-1.63 (m, 2H), 1.31-1.35 (m, 2H)。
LC-MS检测方法：Agilent 1200A, column : C18; column size: 4.6 * 50mm;mobile phase: B(ACN), A(0.05%FA in water); gradient(B%):as Acq.Method above；LC-MS检测条件：mobile phase: from 30% water (0.05% FA) and 70% CH3CN (0.05%FA) to 5% water (0.05% FA) and 95% CH3CN (0.05% FA) in 6.0 min, finally underthese conditions for 0.5 min；LC-MS检测结果：purity is 95.1%, Rt = 0.661 min;MS Calcd.:435; MS Found:436 ([M+1]+)。
实施例2.脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原的制备
本实施例中的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原由式（Ⅲ）所示的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物与牛血清白蛋白（BSA）连接而成，其结构式如下述式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）。
该脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原的合成方法具体步骤如下：
（1）将质量分数1.0%的载体蛋白溶解于0.2 mmol/L，pH=8.5的磷酸缓冲液中，得到载体蛋白溶液；
（2）将质量分数0.5%的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物、5.0%的二甲基甲酰胺、5.0%的乙醇溶解于10 mmol/L，pH=5.0的磷酸钾缓冲液中，再加入质量分数0.5%的1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，将上述化学物质在30℃下搅拌反应45分钟；
（3）将步骤（2）中溶解好的溶液缓慢滴加至步骤（1）中的载体蛋白溶液中，并在-4℃下搅拌18小时，得到偶联物溶液，将反应后的偶联物溶液进行透析纯化，纯化后所得溶液即为脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原溶液，在脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原溶液中加入质量分数0.10%的NaN3，于-20℃下储存。
实施例3.抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体的制备
将实施例2制备得到的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
a.用PBS缓冲液将脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原稀释至3.0 mg/ml，得到免疫原溶液，然后用3.0 ml所述免疫原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射；
b. 2周后，再用3.0 ml相同的免疫原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物兔注射一次，之后每隔3周注射一次，共计注射5次；
c.对免疫后的实验动物兔取血，分离纯化得到抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体，测定其效价为1∶10000。
实施例4.脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物的制备
本实施例中的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物由式（Ⅲ）所示的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）连接而成，其结构式如下述式（Ⅱ）所示：
式（Ⅱ）；
该脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物的合成方法具体步骤如下：
①葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将质量分数2.5%的规格为200KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下溶解于含有0.05 mol/L Tris、3.6 mmol/L MgCl2和1.8 mmol/L NaCl，pH=8.8的溶液中；在此溶液中加入质量分数10.0%的还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、7.5%的葡萄糖-6-磷酸以及1.5%的卡必醇；加热到33℃，再缓慢加入质量分数0.5%的二甲基亚砜，摇匀后静置20秒；
②脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的激活：在无水状态下将质量分数0.5%的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物，溶解于5.0%的二甲基甲酰胺中；将此溶液温度降到-12℃；然后加入1.5%的三丁胺、2.5%的氯甲酸异丁酯、1.5%的碳二亚胺；0.5%的N-羟基硫代琥珀酰亚胺；-12℃搅拌45分钟；
③葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的连接：将步骤②中激活的温度为-12℃的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物溶液逐滴加入到步骤①中溶解的温度为33℃的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；4℃搅拌18小时；
④纯化产物：将反应后的连接产物通过G-25葡聚糖凝胶层析柱进行纯化，纯化后所得溶液即为脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物溶液，在脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物溶液中加入质量分数0.65%的BSA和质量分数0.10%的NaN3，于4℃下储存。
实施例5.脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂的制备
A.试剂R1的制备：将质量分数5.0%的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、5.0%的葡萄糖-6-磷酸、0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的 NaN3的用55 mmol/L、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中混匀，得到试剂R1，所述抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1: 300；
B.试剂R2的制备：将质量分数0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的NaN3用120 mmol/L、pH=8.2的Tris缓冲液溶解制成R2缓冲液，再将脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物加入所述R2缓冲液中混匀，得到试剂R2，所述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1: 900。
实施例6. 脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检验及结果
1. 获得标准曲线：
（1）设置迈瑞 BS480全自动生化分析仪反应参数（表1）。
（2）操作步骤为：先加试剂R1，再加入标准品，最后加入试剂R2。加入试剂R2后，测定不同时间点的OD340吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调整试剂R1和试剂R2的体积比例，同时调整测光点，最后得出较理想的反应标准曲线图，如图1所示。
表1 迈瑞BS480全自动生化分析仪反应参数
2. 样本检测：通过本发明的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高浓度质控样本10次，上述质控样本为：将脂蛋白磷脂酶A2标准品溶解于空白人造血浆中，至浓度分别为30.00，150.00，300.00 ng/ml。检测结果及数据分析见表2。
表2 样本测定值及精密度和回收率评估
| 血液样本 | 低 | 中 | 高 |
| 样本浓度(ng/ml) | 30.00 | 150.00 | 300.00 |
| 1 | 31.45 | 154.76 | 311.92 |
| 2 | 32.67 | 150.38 | 303.14 |
| 3 | 29.88 | 155.49 | 300.66 |
| 4 | 31.50 | 152.80 | 298.75 |
| 5 | 30.93 | 146.71 | 299.80 |
| 6 | 31.52 | 151.99 | 309.92 |
| 7 | 29.76 | 153.20 | 294.55 |
| 8 | 30.24 | 147.58 | 306.15 |
| 9 | 30.87 | 157.76 | 305.30 |
| 10 | 32.14 | 155.00 | 302.41 |
| 平均值(ng/ml) | 31.10 | 152.57 | 303.26 |
| 标准差（SD） | 0.95 | 3.51 | 5.24 |
| 精密度（CV%） | 3.05 | 2.30 | 1.73 |
| 回收率（%） | 103.67 | 101.71 | 101.09 |
检测结果：本发明的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，回收率均在95%-105%之间；精密度高，CV均低于5%。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关技术人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (9)
1.一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1中包含抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体和均相酶底物溶液；所述试剂R2包含脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物和R2缓冲液。
2.根据权利要求1所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
A.试剂R1的制备：将质量分数5.0%的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、5.0%的葡萄糖-6-磷酸、0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的NaN3的用55 mmol/L、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中混匀，得到试剂R1，所述抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:300；
B.试剂R2的制备：将质量分数0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的NaN3用120 mmol/L、pH=8.2的Tris缓冲液溶解制成R2缓冲液，再将脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物加入所述R2缓冲液中混匀，得到试剂R2，所述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:900。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体，由脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原免疫实验动物后产生，所述抗体为完整抗体分子，或者为保留与脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种，优选为兔；
所述抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
a.用PBS缓冲液将脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原稀释至3.0 mg/ml，得到免疫原溶液，然后用3.0 ml所述免疫原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
b.2周后，再用3.0 ml相同的免疫原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔2～5周注射一次，共计注射3～8次；
c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化得到抗脂蛋白磷脂酶A2特异性抗体。
4.根据权利要求3所述的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原由脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物与载体连接而成，其结构式如下述式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）；
所述载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种，优选为血清蛋白，更优选为牛血清白蛋白；
所述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原的制备方法，包括以下步骤：
（1）将质量分数1.0%的载体蛋白溶解于0.2 mmol/L，pH=8.5的磷酸缓冲液中，得到载体蛋白溶液；
（2）将质量分数0.5%的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物、5.0%的二甲基甲酰胺、5.0%的乙醇溶解于10 mmol/L，pH=5.0的磷酸钾缓冲液中，再加入质量分数0.5%的1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，将上述化学物质在25～35℃下搅拌反应30～60分钟；
（3）将步骤（2）中溶解好的溶液缓慢滴加至步骤（1）中的载体蛋白溶液中，并在-4～0℃下搅拌12～24小时，得到偶联物溶液，将反应后的偶联物溶液进行透析纯化，纯化后所得溶液即为脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原溶液，在脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽免疫原溶液中加入质量分数0.10%的NaN3，于-20℃下储存。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物由脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式（Ⅱ）所示：
式（Ⅱ）；
所述脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物的制备方法，包括以下步骤：
①葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将质量分数2.5%的规格为200KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下溶解于含有0.05 mol/L Tris、3.6 mmol/L MgCl2和1.8 mmol/L NaCl，pH=8.5～9.0的溶液中；在此溶液中加入质量分数10.0%的还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、7.5%的葡萄糖-6-磷酸以及1.5%的卡必醇；加热到30～35℃，再缓慢加入质量分数0.5%的二甲基亚砜，摇匀后静置15～25秒；
②脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的激活：在无水状态下将质量分数0.5%的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物，溶解于5.0%的二甲基甲酰胺中；将此溶液温度降到-10～-15℃；然后加入1.5%的三丁胺、2.5%的氯甲酸异丁酯、1.5%的碳二亚胺；0.5%的N-羟基硫代琥珀酰亚胺；-10～-15℃搅拌30～60分钟；
③葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的连接：将步骤②中激活的温度为-10～-15℃的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物溶液逐滴加入到步骤①中溶解的温度为30-35℃的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2～8℃搅拌12～24小时；
④纯化产物：将反应后的连接产物通过G-25葡聚糖凝胶层析柱进行纯化，纯化后所得溶液即为脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物溶液，在脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽酶标偶联物溶液中加入质量分数0.65%的BSA和质量分数0.10%的NaN3，于2～8℃下储存。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物，其结构式如下述式（Ⅲ）所示：
式（Ⅲ）；
上述式（Ⅲ）所示的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的合成路线如下：
。
7.根据权利要求6所述的脂蛋白磷脂酶A2均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物的合成路线，具体制备步骤如下：
（Ⅰ）合成化合物3：将41 g化合物1溶解于200 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，加入64 g四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU），然后将混合物在常温下搅拌20分钟，搅拌结束后再加入17 g化合物2与45 ml N-甲基吗啡啉（NMM），将混合物在0℃下搅拌2小时，然后将上述混合物倒入500ml的纯化水中，再用500ml乙酸乙酯萃取，用500 ml卤水冲洗有机层，重复3次，再用无水硫酸钠干燥，减压蒸发得到粗产物，最后经硅胶层析纯化得到化合物3；
（Ⅱ）合成化合物4：在200 ml 二氯甲烷（DCM）中加入44 g化合物3，在0℃下加入25 ml的HCl/MeOH（2 mol/L），将此混合物在室温下搅拌12小时，然后减压蒸发，得到化合物4；
（Ⅲ）合成化合物6：将23 g化合物4和17 ml三乙胺在400 ml二氯甲烷（DCM）中搅拌混合，然后加入25 g N,N'-二环己基卡二亚胺和52 g化合物5，将反应混合物在室温条件下搅拌2.5小时，然后用饱和碳酸氢钠水溶液冲洗，使用无水硫酸镁进行干燥，过滤后在真空中浓缩，所得粗产物经硅胶层析纯化，洗脱得到化合物6；
（Ⅳ）合成化合物7：将64 g化合物6溶解于500 mL乙酸乙酯（EtOAc）中，然后加入20 mL哌啶，将反应混合物在室温下搅拌3小时，除去溶剂后用500 mL正己烷稀释，沉淀产物经过滤后，用200 mL正己烷洗涤2次，真空干燥得到化合物7；
（Ⅴ）合成化合物9：将21 g化合物7溶解于100 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，加入26 ml二异丙基乙胺（DIEA），然后在室温下搅拌15 分钟，将反应混合物冷却到0°C，随后添加23 g四甲基脲六氟磷酸酯并搅拌30分钟，将15g化合物8添加到上述反应混合物中，然后在室温下搅拌2小时，将搅拌后的反应混合物用250 ml乙酸乙酯（EtOAc）稀释，然后用250 ml纯化水和250 ml卤水冲洗，将有机层分离，通过Na2SO4进行干燥，在真空中除去溶剂，得到化合物9；
（Ⅵ）合成脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物：将16g化合物9溶解于250ml HCl（6mol/L）中，在25℃下搅拌5小时，然后进行减压浓缩，浓缩产物在室温下用乙腈研磨12小时，所得浆料经过滤后减压干燥过夜，得到脂蛋白磷脂酶A2氨基末端三肽衍生物；
。
8.一种如权利要求1所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（一）在全自动生化分析仪中加入待测样本、R1试剂，混匀，37℃温育3-5分钟；
（二）加入R2试剂，混匀，37℃恒温5-10分钟后，340 nm波长进行检测，连续监测3分钟内的吸光度变化率，由全自动生化分析仪自动计算待测样本中脂蛋白磷脂酶A2的含量；
所述试剂R1与试剂R2按1:1～4:1的体积比使用，优选按4∶1的体积比使用。
9.根据权利要求8所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂的使用方法，其特征在于，所述的待测样本为生理样本；优选地，所述的生理样本为血清、血浆、尿液、唾液；更优选地，所述的生理样本为血清或血浆。
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