CN111157739A - Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒及其制备方法及其专用组合型偶联剂 - Google Patents

Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒及其制备方法及其专用组合型偶联剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒及其制备方法及其专用组合型偶联剂，所述的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒为通过组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒；所述的组合型偶联剂包括有以下组分:碳二亚胺、O‑苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲四氟硼酸和O‑苯并三氮唑‑四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕1.2﹕1。本发明优点在于：显著提高了抗体与胶乳微球间偶联的合成反应活性、偶联效率、和偶联的稳定性，提高了抗体利用率。

Description

Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒及其制备方法及其专用组合型偶 联剂
技术领域
本发明属于医学检测及体外诊断领域，具体是指一种Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒及其制备方法及其专用组合型偶联剂。
背景技术
IV型胶原蛋白(IVC)属于非原纤维胶原蛋白，是基底膜网状结构的主要成分之一，不但在BMs骨架形成过程中起重要作用，而且还具有参与细胞黏附、迁移、生长、增殖和分化等重要生理过程的功能，因此，IV型胶原蛋白(IVC) 的生物学特性与肿瘤、肾病等多种重大疾病密切相关。
作为肝细胞基底膜的核心结构，在肝纤维化形成过程中起主要作用。Ⅳ型胶原蛋白在肝纤维化时有显著变化，在轻度肝损伤合并肝纤维化内胶原总量增加尚不明显时，血清Ⅳ型胶原蛋白含量即可明显增加，其含量的变化能较好的反应肝纤维化、肝细胞损伤及程度。
目前市场上IV型胶原蛋白(IVC)检测技术常用的方法有如下几种：酶联免疫检测法(ELISA)、放射免疫分析法、时间分辨荧光免疫分析方法、胶乳免疫比浊法、化学发光法等。其中酶联免疫检测法(ELISA)需要特定设备，耗时；放射免疫分析技术法需要搭配昂贵的设备，存在放射线辐射和污染等问题；时间分辨荧光免疫分析方法需要用稀有金属进行标记；化学发光法需要特定设备，且仅能一次发光且易受环境干扰。胶乳免疫比浊法属于普通免疫比浊技术的衍生技术，克服了普通免疫比浊技术信号量非常有限的缺点，使抗体体积有了数量级上的增长，大幅提升了可检测性，但该方法也存在技术难点，即抗体与胶乳微球的偶联效率无法保证，易出现偶联不上、偶联速度慢及后期脱落等情况，使得其活性及稳定性不能保证。
大部分的抗体与胶乳微球偶联所使用的偶联剂以碳二亚胺(EDC)为主，合成反应活性、偶联效率、和偶联的稳定性不能得到保证，因此，找到一种抗体与胶乳微球间高效偶联的偶联剂，是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
为解决现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒及其制备方法及其专用组合型偶联剂。本发明技术方案运用组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒，实现抗体与胶乳微球的高效偶联。
为实现上述目的，本发明的第一个方面是提供一种Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒制备方法，其技术方案是所述的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒为通过组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒；
所述的组合型偶联剂包括有以下组分:
碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕1.2﹕1。
进一步设置是包括以下步骤：
(1.1)用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液悬浮10％(w/v)且粒径 100-200nm羧基胶乳微球，室温搅拌30min混合均匀，10000rpm转速下离心 15min，去除上清液后用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌 30min混合均匀，使其质量体积浓度为2％；
(1.2)取上述悬浮微球，边室温搅拌，边加入组合偶联剂；该组合偶联剂的成分为碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑- 四甲基脲六氟磷酸盐；
其对应质量比例为微球溶液﹕碳二亚胺﹕O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸﹕O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐＝10﹕1.2﹕1.2﹕1；
O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐在加入前分别用1％醋酸溶液37℃超声10min溶解完全；
加入顺序为先加入碳二亚胺室温搅拌20min，再同时加入含O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸的醋酸溶液与含O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐的醋酸溶液，室温搅拌30min；
(1.3)用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液溶解鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体，使其浓度为5mg/ml；
(1.4)边搅拌边快速将上述溶解后的抗体按照体积比抗体﹕胶乳微球＝1﹕5 加入到经过处理的胶乳微球中，室温持续搅拌30min后，调pH至6.5，室温孵育3h；
(1.5)孵育完成后在10000rpm转速下离心10min，去除上清液，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次10000rpm转速下离心10min，重复6次，完成最后一次离心，去上清液后用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，使其质量体积浓度为1％；
(1.6)加入3％质量体积浓度的牛血清白蛋白室温持续搅拌30min，静置封闭24h；
(1.7)时间到后，将封闭好的胶乳微球在10000rpm转速下离心10min，去除上清液，用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次在10000rpm转速下离心10min，重复2次，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，得到质量体积浓度为1％的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒。
本发明还提供一种利用上述方法所制备的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒。
本发明的第二个目的是提供一种Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒制备专用组合型偶联剂，包括有以下组分:
碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕1.2﹕1。
采用上述方案，本发明的优势在于：利用组合型偶联剂，有效地促进有空间位阻的酰胺键的形成，减少副反应及反应后副产物的产生，显著提高了抗体与胶乳微球间偶联的合成反应活性、偶联效率、和偶联的稳定性，提高了抗体利用率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1为本发明具体实施例3所制得的IV型胶原检测试剂与市售试剂盒的线性相关图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本实施例将本发明的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒应用到检测试剂盒以测试并说明优点和效果。
制备实施例：
本发明具体步骤操作如下：
1.用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液悬浮10％(w/v)羧基胶乳微球(粒径100-200nm)，室温搅拌30min混合均匀，离心(10000rpm，15min)，去除上清液后用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌 30min混合均匀，使其浓度为2％(w/v)。
2.取上述悬浮微球，边室温搅拌，边加入组合偶联剂。组合偶联剂的成分为碳二亚胺(EDC)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU) 和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，三者比例为1.2﹕1.2﹕ 1。其对应质量比例为微球溶液﹕EDC﹕TBTU﹕HBTU＝10﹕1.2﹕1.2﹕ 1。TBTU与HBTU在加入前分别用1％醋酸溶液37℃超声10min溶解完全。加入顺序为先加入EDC室温搅拌20min，再同时加入含TBTU的醋酸溶液与含HBTU的醋酸溶液，室温搅拌30min。
3.用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液溶解鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体，使其浓度为5mg/ml。
4.边搅拌边快速将上述溶解后的抗体按照抗体﹕胶乳微球＝1﹕5(体积比) 加入到经过处理的胶乳微球中，室温持续搅拌30min后，调PH至6.5，室温孵育3h。
5.孵育完成后离心(10000rpm，10min)，去除上清液，用50mmol/L，PH6.0-6.5 醋酸盐缓冲液洗涤，再次离心(10000rpm，10min)，重复6次。完成最后一次离心，去上清液后用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，使其浓度为1％(w/v)。
6.加入3％(w/v)BSA室温持续搅拌30min，静置封闭24h。
7.时间到后，将封闭好的胶乳微球离心(10000rpm，10min)，去除上清液，用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次离心(10000rpm， 10min)，重复2次。用50mmol/L，PH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，得到浓度为1％(w/v)Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒， 2-8℃密封保存。
8.试剂盒的制备：试剂1与试剂2的体积比为3:1。具体成分如下
试剂1：
醋酸盐缓冲液(PH6.0-6.5) 50mmol/L
牛血清白蛋白 0.9g/L
叠氮钠 0.01％
试剂2：
Figure BDA0002343137190000051
试验例
以下实施例描述的IV型胶原(IVC)测定试剂盒可配套适用于雅培C16000、贝克曼AU(480/5800)全自动生化分析仪等机型上。
待测血清：不溶血血清。
具体检测程序：
Figure BDA0002343137190000061
校准程序：多点定标，采用非线性校准模式。
结果计算：以测定管ΔA，根据校准曲线可求得IVC含量。
实施例1按照上述试剂盒的配制程序对组合型偶联剂的成分比例进行筛选，检测结果见表1，通过低值，高值的实际浓度与理论浓度比较结果表明，五种不同的比例相比较以EDC﹕TBTU﹕HBTU＝1.2﹕1.2﹕1差异较小。
上述EDC系碳二亚胺简称；TBTU系O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸的简称；HBTU系O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐简称。
表1组合型偶联剂的成分不同比例检测结果
Figure BDA0002343137190000062
实施例2精密度测定：
批内精密度：对同一样品连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数、标准差和变异系数，
Figure BDA0002343137190000071
表2中CV值为1.65％，差异较小。
表2批内精密度检测结果
Figure BDA0002343137190000072
批间精密度：分别配制3批试剂盒，标记为①、②、③，每个批号对同一样品测试3次，分别计算每批3次检测的均值
Figure BDA0002343137190000073
按以下公式计算相对偏差R。
Figure BDA0002343137190000074
式中：
Figure BDA0002343137190000075
中的最大值；
Figure BDA0002343137190000076
中的最小值；
Figure BDA0002343137190000077
批试剂检测均值。
表3批间精密度检测结果
Figure BDA0002343137190000081
本试剂盒3个批号经检测批间差为5.3％，差异较小。
实施例3本发明试剂盒与市售试剂盒的性能指标比较：
对照的市售试剂盒，其信息如下：
产品名称：IV型胶原蛋白测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(安徽伊普诺康生物技术股份有限公司)
线性相关：分别采用本发明试剂盒与市售试剂盒，采用AU5800全自动生化分析仪，对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析(结果见图1，X轴表示的是本发明试剂盒的测定值，Y轴表示的是市售试剂盒的测定值)。相关系数：r2＝0.9921，线性方程为： y＝0.976x+0.214，结果表明本发明试剂盒与市售试剂盒相关性良好。
表4线性相关检测结果
Figure BDA0002343137190000082
Figure BDA0002343137190000091
Figure 1
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (4)

1.一种Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒制备方法，其特征在于：所述的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒为通过组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒；
所述的组合型偶联剂包括有以下组分:
碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕1.2﹕1。
2.根据权利要求1所述的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1.1)用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液悬浮10％(w/v)且粒径100-200nm羧基胶乳微球，室温搅拌30min混合均匀，10000rpm转速下离心15min，去除上清液后用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌30min混合均匀，使其质量体积浓度为2％；
(1.2)取上述悬浮微球，边室温搅拌，边加入组合偶联剂；该组合偶联剂的成分为碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐；
其对应质量比例为微球溶液﹕碳二亚胺﹕O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸﹕O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐＝10﹕1.2﹕1.2﹕1；O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐在加入前分别用1％醋酸溶液37℃超声10min溶解完全；
加入顺序为先加入碳二亚胺室温搅拌20min，再同时加入含O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸的醋酸溶液与含O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐的醋酸溶液，室温搅拌30min；
(1.3)用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液溶解鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体，使其浓度为5mg/ml；
(1.4)边搅拌边快速将上述溶解后的抗体按照体积比抗体﹕胶乳微球＝1﹕5加入到经过处理的胶乳微球中，室温持续搅拌30min后，调pH至6.5，室温孵育3h；
(1.5)孵育完成后在10000rpm转速下离心10min，去除上清液，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次10000rpm转速下离心10min，重复6次，完成最后一次离心，去上清液后用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，使其质量体积浓度为1％；
(1.6)加入3％质量体积浓度的牛血清白蛋白室温持续搅拌30min，静置封闭24h；
(1.7)时间到后，将封闭好的胶乳微球在10000rpm转速下离心10min，去除上清液，用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次在10000rpm转速下离心10min，重复2次，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，得到质量体积浓度为1％的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒。
3.一种如权利要求1或2所示的制备方法所制备的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒。
4.一种Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒制备专用组合型偶联剂，其特征在于：包括有以下组分:
碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕1.2﹕1。
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