CN104215778B

CN104215778B - 一种c肽单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法和包括其的检测试剂盒

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Publication number: CN104215778B
Application number: CN201410504841.6A
Authority: CN
Inventors: 陈超; 李基�; 彭波; 孙小禁
Original assignee: SHANGHAI KEHUA BIOENGINEERING CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI KEHUA BIOENGINEERING CO Ltd
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2034-09-26
Also published as: CN104215778A

Abstract

本发明公开了一种C肽单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法和包括所述C肽单克隆抗体交联磁微粒的C肽检测试剂盒。本发明的C肽单克隆抗体在与磁微粒交联后，先利用非离子表面活性剂进行了预处理。本发明还公开了包含海藻糖的C肽酶结合物的稀释剂，提高了酶结合物的稳定性。本发明的C肽检测试剂盒具有检测灵敏度高、特异性强、药物干扰小、结果稳定性好等优点；从而可以大规模适用于糖尿病临床辅助诊断筛查。

Description

一种C肽单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法和包括其的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断医学检验领域。具体地说，本发明涉及一种C肽单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法和包括其的C肽检测试剂盒。

背景技术

C肽是胰脏中β胰岛细胞合成的胰岛素原的一部分，在从胰岛细胞分泌之前，胰岛素原大多以一个86分子氨基酸的多肽形式存在，其中包括由两个胱氨酸连接的多肽，一个是51个氨基酸分子的胰岛素，分别是21个氨基酸的A链和30个氨基酸的B链，另一个是30个氨基酸分子的C肽以及两外两个2肽。

C肽和胰岛素是等量分泌的，但是C肽在血液中的浓度却远远高于胰岛素。主要原因有以下几点：(1)C肽不同于胰岛素，它不经过肝脏代谢而是经过肾脏被排出体外并且C肽在体内能发生的交叉反应非常少；(2)C肽的半衰期为大于30分钟而胰岛素的半衰期只有5～7分钟；(3)胰岛素易受溶血影响使得测量结果会降低，但是从至今报到来看并未发现C肽也受到溶血的影响。

C肽的正常水平在每个个体中都是不一样的，甚至存在很大差异。C肽水平因个体的性别、BMI、腰围与臀围的比率、血清甘油三酯、总胆固醇量、尿酸等呈正相关；与年龄、吸烟情况及高密度脂蛋白胆固醇呈负相关。

C肽的测量有着很多的用途及意义，包括：(1)作为一种精确的指标去评估糖尿病人的剩余胰岛β细胞的功能以及胰岛素分泌的水平；(2)用来诊断胰岛素瘤或者内源性高胰岛素血症；(3)区分非天然低血糖症和由于胰岛素功能亢进引起的低血糖；(4)在某些情况下可以用来区分I型糖尿病和II型糖尿病；(5)为糖尿病病人治疗方案的确定提供指导。

目前临床上C肽的检测方法主要有放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫分析法(ELISA)、时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)等。RIA方法由于试剂具有放射性，对操作者具有一定危害性，且操作复杂，试剂有效期短等缺点，早已不推荐作为C肽临床诊断；ELISA法的缺点在于无法准确进行定量，且批间差异较大，线性范围有限，无法持续监控患者C肽水平；TRFIA虽然测值较为准确，但依然存在反应时间较长，对环境要求较高，容易受空气尘埃影响，且多为96人份/盒，使用稀土标记物等缺点也使得此免疫方法无法大规模使用；CLIA法是一种较为先进的免疫学方法，具有反应时间短、灵敏度高、特异性好、线性范围宽、重复性好等优点，标记物稳定性好，在保证检测速度的前提下，也能达到检测高通量。根据目前C肽临床的应用情况，市场应用前景最好且诊断最可靠的方法学为CLIA法。

虽然目前中国市场上已有注册批准的C肽化学发光免疫分析法测定试剂盒，但多为进口试剂，成本较高，且试剂盒的制备方法和相关材料均作为保密资料，未被公开，不利于C肽检测在社区基层医院的推广。国产C肽试剂盒重复性较差，批间差异难控，且灵敏度较低，交叉反应率较高，临床应用前景较差。

目前的使用的C肽检测试剂盒中利用C肽单克隆抗体交联磁微粒，在制得C肽单克隆抗体交联磁微粒后，往往需要对该交联磁微粒作封闭处理，以便封闭磁微粒上未与C肽单克隆抗体交联的活性位点，从而降低检测过程中的非特异性结合。在现有技术中，通常采用牛血清白蛋白(BSA)对C肽单克隆抗体交联磁微粒作封闭处理。此外，目前使用的C肽检测试剂盒中需要对C肽酶试剂进行稀释的稀释液，但稀释液对于C肽酶试剂的稳定性也存在影响。目前，现有技术中的C肽检测试剂盒存在非特异性结合、灵敏度不够高、抗干扰性不强、以及检测结果稳定性不好等等缺点。现有的磁微粒在交联后直接用一些无关蛋白(如BSA)进行洗涤、封闭，但BSA存在批间差异，不同的BSA的特异性也各不相同，通过BSA直接封闭往往不能完全达到理想的封闭效果。

因此，本领域急需一种具有检测灵敏度高、特异性好、非特异性结合低、重复性高等优点的C肽检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种C肽单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法和包括所述C肽单克隆抗体交联磁微粒的C肽检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供包含海藻糖的C肽酶结合物的稀释剂，该稀释剂能够提高酶结合物的稳定性。

在第一方面，本发明提供一种C肽单克隆抗体交联磁微粒，所述C肽单克隆抗体在与磁微粒交联后，利用非离子表面活性剂进行了预处理。

在优选的实施方式中，所述C肽单克隆抗体交联磁微粒在经非离子表面活性剂预处理后再进行封闭处理；优选地，利用BSA作封闭处理。

在具体的实施方式中，所述非离子表面活性剂是PE6400(BASF公司)、或PE6200(BASF公司)、或二者的组合；优选地，所述非离子表面活性剂是PE6400(BASF公司)和PE6200(BASF公司)的组合。

在另一实施方式中，所述C肽单克隆抗体交联磁微粒的最低检测限为0.01ng/mL。

在优选的实施方式中，所述C肽单克隆抗体为Dako公司生产，克隆号为PEP001。

在另一优选的实施方式中，所述预处理是将非离子表面活性剂与C肽单克隆抗体磁微粒交联物充分混匀一定时间；用生理盐水洗涤后，用10mMpH7.4含有1％BSA的磷酸缓冲液继续封闭；优选地，预处理的温度在15-30℃，时间为60-120分钟。

在另一优选的实施方式中，进行预封闭处理时，所述C肽单克隆抗体磁微粒交联物溶液与非离子表面活性剂PE6400(BASF公司)和PE6200(BASF公司)溶液的浓度分别为5-15mg/ml、0.1-1.0wt％、0.1-1.0wt％，优选10mg/ml、0.5wt％、0.5wt％。

在另一优选的实施方式中，进行预封闭处理时，所述非离子表面活性剂PE6400溶液和PE6200溶液组成的封闭液中的体积比为(0.5-1.5):(0.5-1.5)；优选1:1。

在另一优选的实施方式中，所述磁微粒的主要成分是超顺磁性微粒，粒径为800nm～3μm，主要的活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基。

在第二方面，本发明提供一种C肽单克隆抗体交联磁微粒的制备方法，所述方法包括：

a)将C肽单克隆抗体与磁微粒交联；和

b)用非离子表面活性剂对步骤a)得到的C肽单克隆抗体交联磁微粒进行预处理。

在优选的实施方式中，所述方法还包括对步骤b)得到的经预处理的C肽单克隆抗体交联磁微粒作封闭处理；优选地，利用BSA作封闭处理。

在具体的实施方式中，步骤b)中的所述非离子表面活性剂是PE6400(BASF公司)、PE6200(BASF公司)、或二者的组合；优选地，所述非离子表面活性剂是PE6400(BASF公司)和PE6200(BASF公司)的组合。

在优选的实施方式中，所述预处理是将非离子表面活性剂与C肽单克隆抗体磁微粒交联物充分混匀一定时间，用生理盐水洗涤后，用10mMpH7.4含有1％BSA的磷酸缓冲液继续封闭；优选地，预处理的温度在15-30℃，时间为60-120分钟。

在另一优选的实施方式中，进行预处理时，所述C肽单克隆抗体磁微粒交联物溶液与非离子表面活性剂PE6400(BASF公司)和PE6200(BASF公司)溶液的浓度分别为5-15mg/ml、0.1-1.0wt％、0.1-1.0wt％，优选10mg/ml、0.5wt％、0.5wt％。

在另一优选的实施方式中，进行预处理时，所述非离子表面活性剂PE6400溶液和PE6200溶液组成的封闭液中的体积比为(0.5-1.5):(0.5-1.5)；优选1:1。

在第三方面，本发明提供一种C肽酶交联物稀释液，所述C肽酶交联物稀释液中含有海藻糖。

在具体的实施方式中7.如权利要求6所述的C肽酶交联物稀释液，其特征在于，海藻糖的浓度为1％-10％wt％，优选5％wt％。

在优选的实施方式中，C肽酶交联物中的C肽单克隆抗体为Dako公司生产，克隆号为CPT-3F11。

在优选的实施方式中，C肽酶交联物中的酶为碱性磷酸酶。

在优选的实施方式中，C肽酶交联物稀释液的配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl、50～300mMNaCl、0.5～2％BSA、海藻糖1～10％，0.05～0.5％吐温-20、0.05～0.2％ProClin-300；优选地，C肽酶交联物稀释液的配方为：50mMpH7.4Tris-HCl、150mMNaCl、1％BSA、海藻糖5％，0.1％吐温-20、0.1％ProClin-300。

在第四方面，本发明提供本发明第一方面的C肽单克隆抗体交联磁微粒，或采用本发明第二方面所述的方法制备的C肽单克隆抗体交联磁微粒，或本发明第三方面所述的C肽酶交联物稀释液的用途，其用于检测C肽或制备C肽检测试剂盒。

在第五方面，本发明提供一种C肽检测试剂盒，所述试剂盒装有：本发明第一方面所述的C肽单克隆抗体交联磁微粒，或采用本发明第二方面所述的方法制备的C肽单克隆抗体交联磁微粒，或本发明第三方面所述的C肽酶交联物稀释液。

在另一优选的实施方式中，所述人胰岛素检测试剂盒还装有：酶标记的C肽单克隆抗体；C肽定标品；化学发光底物；和，洗涤液。

在另一优选的实施方式中，所述酶标记的C肽单克隆抗体中的酶是碱性磷酸酶。

在另一优选的实施方式中，所述化学发光底物的主要成分为1,2-二氧杂环丁烷衍生物，为酶促化学发光底物。

在另一优选的实施方式中，所述1,2-二氧杂环丁烷衍生物为AMPPD(3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷)、CDP-star。

在另一优选的实施方式中，所述的磁微粒试剂的主要成分是超顺磁性微粒，其粒径为800nm～3μm，主要的活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基。

在第五方面，本发明提供一种检测C肽的方法，所述方法包括利用本发明第一方面所述的C肽单克隆抗体交联磁微粒，或本发明第二方面所述的方法制备的C肽单克隆抗体交联磁微粒，或本发明第三方面所述的C肽酶结合物稀释液，或本发明第五方面所述的C肽检测试剂盒检测样品中的C肽。

在第六方面，本发明提供一种制备C肽检测试剂盒的方法，所述的方法包括：

将本发明第一方面所述的C肽单克隆抗体交联磁微粒，或本发明第二方面所述的方法制备的C肽单克隆抗体交联磁微粒、或本发明第三方面的C肽酶结合物稀释液与酶标记的C肽单克隆抗体、C肽定标品、化学发光底物和洗涤液制成C肽检测试剂盒。

在另一优选的实施方式中，所述的C肽单克隆抗体交联磁微粒的制备，是将活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基的磁微粒通过共价交联的方式与C肽单克隆抗体中的裸露氨基交联反应，并通过含有0.5～2％的BSA溶液洗涤和封闭，最终贮存于含有0.1～1％的BSA溶液中，2～8℃保存备用。

在另一优选的实施方式中，所述的磁微粒试剂稀释液的配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl、50～300mMNaCl、0.5～2％BSA、0.05～0.2％ProClin-300。

在另一优选的实施方式中，碱性磷酸酶标记C肽单克隆抗体的制备方法为戊二醛偶联法，具体操作为：将碱性磷酸酶溶于终浓度5％戊二醛溶液中，室温静置过夜，生理盐水透析后，加入C肽单克隆抗体，50mMpH9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析过夜，加入甘氨酸，室温反应2小时，等体积加入饱和硫酸铵，2～8℃2小时，4000rpm离心去上清，沉淀溶于50mMpH7.40磷酸缓冲液中，对其透析过夜，加入等体积甘油，置于-20℃保存。

在另一优选的实施方式中，所述的C肽定标品的浓度分别为0.5～2ng/mL和10～20ng/mL。

在另一优选的实施方式中，所述的C肽定标品的稀释液配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mMNaCl，0.5～2％BSA，0.05～0.2％ProClin-300。

在另一优选的实施方式中，所述的洗涤液配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mMNaCl，0.1～1％曲拉通X-100，0.05～0.2％ProClin-300。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了用或不用非离子表面活性剂预封闭处理人胰岛素抗体，对于检测人胰岛素的灵敏度的影响。

图2显示了用或不用海藻糖的C肽酶稀释液，对于C肽酶试剂稳定性的影响。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在C肽单克隆抗体与磁微粒交联之后，先利用非离子表面活性剂对C肽单克隆抗体磁微粒交联物作预处理，再进行常规封闭处理能够显著降低反应的非特异性吸附，最终提高了所得C肽单克隆抗体交联磁微粒在检测C肽时的灵敏度。同时，发明人进一步发现，在C肽的酶稀释液中加入海藻糖，能够大大提高C肽酶结合物的稳定性，减少由于低浓度保存而造成的活性下降。在此基础上完成了本发明。

本发明的C肽单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法

基于以上出乎意料的发现，本发明首先提供一种C肽单克隆抗体交联磁微粒，所述C肽单克隆抗体，例如Dako公司的单克隆抗体(克隆号为PEP001)在与磁微粒交联之后，利用非离子表面活性剂进行预处理。

相应地，本发明还提供了上文所述C肽单克隆抗体交联磁微粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a)将C肽单克隆抗体与磁微粒交联；和

本发明的C肽单克隆抗体交联磁微粒可以用于检测C肽或制备C肽检测试剂盒，从而显著提高检测C肽时的灵敏度。

本文所用的术语“非离子表面活性剂”具有与本领域普通技术人员通常理解的含义，即，在水溶液中不产生离子的表面活性剂。非离子表面活性剂溶于水时不发生解离，其分子中的亲油基团与离子型表面活性剂的亲油基团大致相同，其亲水基团主要是由具有一定数量的含氧基团(如羟基和聚氧乙烯链)构成。

在具体的实施方式中，本发明所用的非离子表面活性剂是PE6400(BASF)、PE6200(BASF)、或二者的组合。在优选的实施方式中，本发明所用的非离子表面活性剂是PE6400(BASF)和PE6200(BASF)的组合。

在本发明中，所述预处理是C肽单克隆抗体与磁微粒交联后，形成磁微粒交联物，在进行封闭之前，先用非离子表面活性剂对磁微粒交联物反应一定时间，再用无关蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)进行常规封闭。在优选的实施方式中，在15-30℃，将已交联好的C肽磁微粒交联物加入至一定浓度的非离子表面活性剂溶液，反应90分钟。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员可以合理确定上述预处理中，C肽单克隆抗体磁微粒交联物与非离子表面活性剂溶液各自合适的浓度以及相互的比例。

例如，在具体的实施方式中，预处理中所述C肽单克隆抗体磁微粒交联物溶液与非离子表面活性剂PE6400溶液和PE6200溶液的浓度分别为5-15mg/ml、0.1-1.0wt％、0.1-1.0wt％。在优选的实施方式中，所述C肽单克隆抗体磁微粒交联物溶液与非离子表面活性剂PE6400溶液和PE6200溶液的浓度分别为10mg/ml、0.5wt％、0.5wt％。

在另一具体的实施方式中，预处理中所述非离子表面活性剂PE6400溶液和PE6200溶液组成的封闭液中的体积比为(0.5-1.5):(0.5-1.5)。在优选的实施方式中，所述非离子表面活性剂PE6400溶液和PE6200溶液的体积比为1:1。

同样，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员可以合理确定所用的磁微粒。例如，在具体的实施方式中，磁微粒的主要成分是超顺磁性微粒，粒径为800nm～3μm，主要的活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基。

在具体的实施方式中，所述的C肽单克隆抗体交联磁微粒的制备，是将活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基的磁微粒通过共价交联的方式与C肽单克隆抗体中的裸露氨基交联反应，并通过含有0.5～2％的BSA溶液洗涤和封闭，最终贮存于含有0.1～1％的BSA溶液中，2～8℃保存备用。

本发明的C肽单克隆抗体交联磁微粒可用任何上述制备方法或类似的方法制备。

本发明的C肽检测试剂盒

基于本发明的C肽单克隆抗体交联磁微粒，本发明进一步提供了一种C肽检测试剂盒，所述试剂盒装有本发明的C肽单克隆抗体交联磁微粒。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员可以确定所述C肽检测试剂盒中的其它组分，例如，在具体的实施方式中，本发明的C肽检测试剂盒还可装有：酶标记的C肽单克隆抗体；C肽定标品；化学发光底物；和洗涤液。

本领域普通技术人员可以根据具体的要求选择酶标记的C肽单克隆抗体中的酶。在优选的实施方式中，所述酶标记的C肽单克隆抗体中的酶是碱性磷酸酶。

相应地，本发明的C肽检测试剂盒中的所述化学发光底物的主要成分可以为1,2-二氧杂环丁烷衍生物，为酶促化学发光底物。在优选的实施方式中，所述1,2-二氧杂环丁烷衍生物为AMPPD(3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷)、CDP-star。而本发明的C肽检测试剂盒中的磁微粒试剂的主要成分可以是超顺磁性微粒，其粒径为800nm～3μm，主要的活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基。

本发明的C肽检测试剂盒可如下所示进行制备，包括：

将本发明的C肽单克隆抗体交联磁微粒；酶标记的C肽单克隆抗体；C肽定标品；化学发光底物；和洗涤液制成C肽检测试剂盒。

在具体的实施方式中，所述的磁微粒试剂稀释液的配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl、50～300mMNaCl、0.5～2％BSA、0.05～0.2％ProClin-300。

在具体的实施方式中，碱性磷酸酶标记C肽单克隆抗体的制备方法为戊二醛偶联法，具体为：将碱性磷酸酶溶于终浓度5％戊二醛溶液中，室温静置过夜，生理盐水透析后，加入C肽单克隆抗体，50mMpH9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析过夜，加入甘氨酸，室温反应2小时，等体积加入饱和硫酸铵，2～8℃2小时，4000rpm离心去上清，沉淀溶于50mMpH7.40磷酸缓冲液中，对其透析过夜，加入等体积甘油，置于-20℃保存。

C肽酶交联物稀释液

在本发明中，C肽酶交联物与C肽酶结合物具有相同的含义，其表示利用酶，例如碱性磷酸酶标记的C肽单克隆抗体。发明人注意到经稀释的C肽酶交联物或C肽酶结合物，即，低浓度的C肽酶交联物或C肽酶结合物经长期保存会造成的活性降低。

有鉴于此，发明人进一步研究了C肽酶交联物的稀释液，发现在C肽的酶稀释液中加入海藻糖能够大大提高C肽酶结合物的稳定性，减少由于低浓度保存而导致的酶活性降低。在具体的实施方式中，C肽的酶稀释液中海藻糖的浓度为1％-10％wt％，优选5％wt％。

在优选的实施方式中，碱性磷酸酶标记C肽单克隆抗体的稀释液的配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl、50～300mMNaCl、0.5～2％BSA、海藻糖1～10％，0.05～0.5％吐温-20、0.05～0.2％ProClin-300；优选地，50mMpH7.4Tris-HCl、150mMNaCl、1％BSA、海藻糖5％，0.1％吐温-20、0.1％ProClin-300。所述的C肽定标品的浓度分别为0.5～2ng/mL和10～20ng/mL。所述的C肽定标品的稀释液配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mMNaCl，0.5～2％BSA，0.05～0.2％ProClin-300。所述的洗涤液配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mMNaCl，0.1～1％曲拉通X-100，0.05～0.2％ProClin-300。

本发明的C肽的检测方法

在本发明的C肽单克隆抗体交联磁微粒以及包含其的C肽检测试剂盒的基础上，本发明还提供一种检测C肽的方法，所述方法利用本发明的C肽单克隆抗体交联磁微粒，或本发明的C肽检测试剂盒检测样品中的C肽。

本发明的优点

1)包含本发明C肽单克隆抗体交联磁微粒的试剂盒的检测灵敏度高，目前市场上的C肽试剂盒的最低检测限一般高于0.1ng/mL，相比之下，包含本发明C肽单克隆抗体交联磁微粒的试剂盒的最低检测限能达到0.01ng/mL；

2)本发明的试剂盒特异性强；胆红素、血红蛋白、乳糜颗粒、类风湿因子(RF)、抗核抗体(ANA)、人抗鼠抗体(HAMA)对C肽测定结果均无明显干扰；而人胰岛素(HumanInsulin)、类胰岛素生长因子I(IGF-I)、人生长激素(hGH)和胰高血糖素对C肽测定结果均无明显干扰；

3)本发明的试剂盒药物干扰小；对于目前市面上最常见的且临床使用最普遍的4种类胰岛素药物，即，诺和锐、优泌乐、来得时、诺和平，本发明的试剂盒检测1000mIU/L浓度以下的诺和锐、优泌乐、来得时、诺和平无干扰。

4)本发明的试剂盒测定结果稳定性好；碱性磷酸酶更稳定、测定结果的重复性更好，1,2-二氧杂环丁烷衍生物具有较长的发光时间，发光信号可稳定超过20分钟以上；信号强度高，便于光电倍增管检测；抗干扰能力强，不易污染。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例

材料

本发明实施例中所用的材料和试剂，包括C肽单克隆抗体均是市售可得的。

例如，C肽单克隆抗体购自Dako公司；磁微粒购自Lifetechnologies：本发明实施例中用作校准品的C肽由生工生物(上海)有限公司合成，并由科华公司自行稀释到相应浓度；血清样品来自上海长征医院临床检验科。

方法

1.C肽磁微粒试剂的制备

C肽磁微粒试剂稀释液配方：

将C肽磁微粒单克隆抗体交联物用磁微粒稀释液稀释至0.2～0.6mg/mL，室温充分混匀至少30分钟，制得C肽磁微粒试剂。

2.碱性磷酸酶标记C肽单克隆抗体的制备

1)将碱性磷酸酶溶于终浓度5％戊二醛溶液中，使得碱性磷酸酶的浓度为10mg/mL；

2)室温静置过夜；

3)用生理盐水(体积比大于1:200)透析至少4小时；

4)取出透析后的碱性磷酸酶，按照质量1:1的比例加入C肽单克隆抗体，充分混匀；

5)50mMpH9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析过夜；

6)取出透析液，按照体积比1:1000加入1M甘氨酸溶液，混匀，终止反应2小时；

7)等体积加入饱和硫酸铵，2～8℃保存2小时；

8)4000rpm离心去上清，沉淀溶于50mMpH7.40磷酸缓冲液中；

9)50mMpH7.40磷酸缓冲液中透析过夜；

10)取出透析液加入等体积的甘油，制得碱性磷酸酶标记C肽单克隆抗体，置于-20℃保存。

3.C肽酶试剂的制备

C肽酶试剂稀释液配方：

将碱性磷酸酶标记C肽单克隆抗体用酶稀释液稀释至1:1000～1:5000，室温充分混匀至少30分钟，制得C肽酶试剂。

4.C肽定标品的制备

C肽定标品稀释液配方：

将合成C肽用C肽定标品稀释液分别稀释至1ng/mL和15ng/mL，室温充分混匀至少30分钟，制得C肽定标品。通过多次对校准品和定标品同时测定，建立C肽试剂盒主曲线，并对C肽定标品进行赋值，即为C肽定标品的制备。

5.洗涤液的制备

洗涤液配方：

按配方配制洗涤液，室温充分混匀至少30分钟，制得洗涤液。

6.C肽的检测方法

1)加入30μl血清样本、50μl磁微粒试剂、50μl酶试剂；

2)37℃反应15分钟；

3)磁吸后去上清液，加入300μl洗涤液；

4)重复步骤3)2次；

5)磁吸后去上清液，加入300μl化学发光底物；

6)37℃下反应10分钟；

7)光电倍增管(PMT)读取相对发光单位(RLU)，自动计算浓度值。

实施例1.C肽单克隆抗体交联磁微粒的制备

1)取10mg活性功能基团为羧基的1.0μm磁微粒，用50mMpH6.0的MES缓冲液洗涤2次；

2)磁吸后去上清液，加入0.5mL的50mMpH6.0的MES缓冲液混匀，再加入0.5mL25mg/mL碳二亚胺(EDC)溶液，充分混匀；

3)室温反应30分钟；

4)磁吸后去上清液，用50mMpH6.0的MES缓冲液洗涤2次；

5)加入实施例1所得的0.05mgC肽单克隆抗体，再用50mMpH6.0的MES缓冲液定容至1mL，充分混匀；

6)37℃反应过夜；

7)用含有50mMpH7.8Tris-HCl，150mMNaCl，1％BSA溶液洗涤2次。

8)加入2mL含有50mMpH7.8Tris-HCl，150mMNaCl，1％BSA溶液，充分混匀。

9)37℃封闭过夜；

10)用含有50mMpH7.8Tris-HCl，150mMNaCl，0.5％BSA溶液洗涤2次；

11)加入2mL含有50mMpH7.8Tris-HCl，150mMNaCl，0.5％BSA溶液，充分混匀；

12)2～8℃保存，制得C肽单克隆抗体交联磁微粒。

实施例2.C肽磁微粒交联物的预处理

1)将非离子表面活性剂PE6400和PE6200，用纯化水分别稀释至0.1％(质量百分比浓度)

2)实施例1.6)工序后，磁吸，去上清液。

3)将C肽磁微粒交联物添加至0.1％PE6400溶液或0.1％PE6200溶液中，磁微粒交联物的终浓度为10mg/mL；或将C肽磁微粒交联物添加至0.1％PE6400溶液和0.1％PE6200溶液的混合溶液(体积比为1:1)中，磁微粒交联物的终浓度为10mg/mL，15-30℃下混匀90分钟；

4)继续实施例1.7)及以后的工序。

实施例3.C肽单克隆抗体交联磁微粒的灵敏度检测

利用实施例2所得的C肽单克隆抗体交联磁微粒(Dako公司，克隆号为PEP001)，如材料与方法所述进行灵敏度检测(Dako公司，克隆号为CPT-3F11，碱性磷酸酶标记抗体)，结果如下表所示：

从上表可以看出，使用0.1％PE6400或者0.1％PE6200单独预封闭处理C肽磁微粒交联物，灵敏度(S/N值)分别提高2.8倍和2.8倍，而同时使用0.1％PE6400和0.1％PE6200处理C肽磁微粒交联物，灵敏度(S/N值)提高3.0倍。综上所述，以下实施例中选择0.1％PE6400和0.1％PE6200共同对C肽磁微粒交联物作预封闭处理。

实施例4.含海藻糖的C肽酶稀释液对C肽酶稳定性的影响

如“材料与方法”中C肽酶试剂稀释液配方所述，本发明人制备了含海藻糖的C肽酶稀释液，以及不含海藻糖的C肽酶稀释液。

利用上述稀释液稀释与碱性磷酸酶偶联的C肽单克隆抗体后，将稀释的C肽酶试剂置于2-8℃下存放，并测试其对C肽酶稳定性的影响，测试结果如图2所示。

结果发现，在2-8℃下存放0-6个月，利用含海藻糖的C肽酶稀释液稀释的C肽酶试剂的活性几乎没有损失，而利用不含海藻糖的C肽酶稀释液稀释的C肽酶试剂的活性有明显降低；继续存放，利用含海藻糖的C肽酶稀释液稀释的C肽酶试剂的活性降低速度也明显低于利用不含海藻糖的C肽酶稀释液稀释的C肽酶试剂的。

实施例5.本发明所述的试剂盒分析性能

1)最低检测限：本试剂盒的最低检测限不高于0.01ng/mL。

测定空白样本20次，计算20次测定结果均值(M)和标准差(SD)，M+2SD对应的浓度即为试剂盒的最低检测限。

2)准确度：本试剂盒的回收率在85％～115％之间。

3)重复性：本试剂盒的相对变异系数(CV)≤8％。

4)线性范围：本试剂盒的线性范围为0.01～30ng/mL。

将接近线性范围上限的高值样本进行系列稀释，计算实测值与理论稀释度之间的线性相关系数r，结果应大于或等于0.99。

5)批间差：本试剂盒批间的相对变异系数(CV)≤15％。

6)分析特异性：

测定以下一定浓度的干扰物质，测定结果基本无交叉反应。

7)药物干扰：

测定4种临床中常用的类胰岛素药物，不同浓度下的药物干扰结果见下表。

8)稳定性：本试剂盒2～8℃保存12个月，试剂盒分析性能仍稳定。

实施例6.本发明所述的试剂盒与现有进口试剂盒的临床比对结果

委托上海中医药大学附属龙华医院和上海长征医院从门诊和住院病人中收集共218例临床血清样本，同时对本发明所述的试剂盒与现有的进口C肽检测试剂盒(Roche公司，货号03184897190)进行检测，通过Medcalc统计软件进行相关性及一致性分析。

1)相关性分析

以现有进口试剂A的临床测定结果为X轴，本发明所述的试剂盒的临床测定结果为Y轴，绘制散点图，进行相关性分析，其相关性方程为：y＝0.9816x+0.0687(P<0.001)；相关性系数：r＝0.9898，两者的测定结果相关性良好。

2)一致性分析

采用Bland-Altman统计学方法对两组测定结果进行分析，以每个样本的测定结果的比值作为纵坐标，两者的测定结果的均值作为横坐标作图。计算所有比值的平均值(A)及标准差(SD)，并根据公式A±1.96SD得到95％的一致性界限范围。本次临床试验中A＝0.99，SD＝0.121，因此95％的一致性界限范围为：0.75-1.22。上述结果显示，96.33％(210/218)的测定结果在上述范围内，两者测定结果在统计学上有着一致性。

3)总结：

现有的Roche公司的C肽检测试剂盒是目前临床上用于C肽检测市场份额最高的产品，其试剂盒的临床性能已被临床广泛接受。本发明所述的试剂盒在临床试验比对中，与进口试剂A的结果相关性及一致性高度吻合，能满足目前市场上对C肽检测的需求，且生产成本远低于该试剂盒。

对比例1.阳离子型表面活性剂预处理C肽单克隆抗体交联磁微粒

发明人利用411(Stepan公司)或T-77(Rhodia公司)重复实施例1-3，发现利用阳离子型表面活性剂对C肽作预封闭处理使得灵敏度降低25％左右。

结论：利用阳离子型表面活性剂未取得与利用非离子型表面活性剂相当的效果。

对比例2.阴离子型表面活性剂预处理C肽单克隆抗体交联磁微粒

发明人利用Triton^TMH-66(Dow公司)重复实施例1-3，发现利用以上阴离子型表面活性剂对C肽作预封闭处理使得灵敏度降低15％左右。

结论：利用阴离子型表面活性剂也未取得与利用非离子型表面活性剂相当的效果。

对比例3.两性离子表面活性剂预处理C肽单克隆抗体交联磁微粒

发明人利用两性离子表面活性剂1307(BASF公司)重复实施例1-3，发现利用两性离子表面活性剂对人胰岛素作预处理对灵敏度并未产生显著影响。

结论：利用两性离子表面活性剂并未取得与利用非离子型表面活性剂相当的效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种C肽单克隆抗体交联磁微粒，所述C肽单克隆抗体在与磁微粒交联后，利用非离子表面活性剂进行预处理；其特征在于，所述非离子表面活性剂是BASF公司的PE6400、或BASF公司的PE6200、或二者的组合。

2.如权利要求1所述的C肽单克隆抗体交联磁微粒，其特征在于，所述非离子表面活性剂是BASF公司的PE6400和BASF公司的PE6200的组合。

3.如权利要求1或2所述的C肽单克隆抗体交联磁微粒，其特征在于，所述C肽单克隆抗体交联磁微粒的最低检测限为0.01ng/mL。

4.一种C肽单克隆抗体交联磁微粒的制备方法，所述方法包括：

a)将C肽单克隆抗体与磁微粒交联；和

b)用非离子表面活性剂对步骤a)得到的C肽单克隆抗体交联磁微粒进行预处理；

其特征在于，步骤b)中的所述非离子表面活性剂是BASF公司的PE6400、BASF公司的PE6200、或二者的组合。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂是BASF公司的PE6400和BASF公司的PE6200的组合。

6.权利要求1-3中任一项所述的C肽单克隆抗体交联磁微粒的用途，用于制备C肽检测试剂盒。

7.权利要求4或5所述的方法制备的C肽单克隆抗体交联磁微粒的用途，用于制备C肽检测试剂盒。

8.一种C肽检测试剂盒，所述试剂盒装有：权利要求1-3中任一项所述的C肽单克隆抗体交联磁微粒，或权利要求4或5所述的方法制备的C肽单克隆抗体交联磁微粒。

9.一种制备C肽检测试剂盒的方法，所述的方法包括将以下物质制成C肽检测试剂盒：

a.权利要求1-3中任一项所述的C肽单克隆抗体交联磁微粒或权利要求4或5所述的方法制备的C肽单克隆抗体交联磁微粒；

b.酶标记的C肽单克隆抗体；

c.C肽定标品；

d.化学发光底物；和

e.洗涤液。