CN109917138A - 一种肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒 - Google Patents
一种肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,包括检测卡以及荧光微球工作液;所述检测卡包括用于检测肌红蛋白的检测卡;荧光微球工作液中含有标记相应抗体的时间分辨荧光微球。检测过程中,结合在检测区和质控区的荧光微球复合物,在激发光的作用下,发射出的荧光,由荧光免疫分析仪采集处理,即可计算出检测结果。本发明具有操作简便、测量准确、灵敏度高和特异性强的优点。
Description
技术领域
本发明属于心肌标志物蛋白免疫分析技术领域,尤其是涉及一种肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
肌红蛋白(MYO)是与血红蛋白相似的血红素蛋白质。存在于肌肉细胞内,主要功能是储存氧,在心肌内含量非常丰富。分子量16700,由一条含有153个氨基酸残基的多肽链和一个血红素辅基构成,呈紧密球形。多肽链中氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部,亲水侧链多位于分子表面,因此其水溶性较好。
由于MYO分子量小,所以在肌肉细胞损伤后较早释放入血循环,1-2h升高,12h达高峰,24h后逐渐下降,是早期诊断急性心肌梗死(AMI)的主要指标,能为AMI的诊断和抢救赢得宝贵时间。
骨骼肌疾病和肾功能障碍时血清MYO浓度也可升高,故MYO不是心肌损伤的特异性标志物。但由于其灵敏度高,一般可用于阴性诊断。如果胸痛发作后8h而MYO仍在正常范围内,则可排除AMI。
由于在AMI后患者血中MYO很快从肾脏清除,故MYO测定有助于在AMI病程中观察有无再梗死或梗死再扩展。MYO频繁增高,提示原有心肌梗死仍在延续。
MYO还是溶栓治疗中判断有无再灌注的敏感而准确的指标。
临床领域应用的MYO免疫检测方法主要有胶体金免疫层析法(Goldimmnnochromatography GICA)、酶联免疫测定法(Enzyme Immunoassay,EIA)和化学发光免疫测定(CLIA)等。
胶体金免疫层析法具备操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点,但由于灵敏度不高、难以实现定量等缺点限制了这种方法的使用。
酶联免疫测定法由于具备操作简单、试剂有效期长、无污染、高于胶体金的敏感性、特异性好、结果可用仪器测定等特点得以推广,但由于敏感性相对较低,所用标记酶与底物可定量测定范围窄,及仪器测定范围窄等缺点,限制了其在微量免疫定量测定中的应用。
化学发光免疫测定其研究起步于80年代初,快速发展应用于90年代,为当今最为敏感的微量免疫测定法。主要特点是高敏感性、可测定浓度范围宽、样品无需稀释即可检测、试剂有效期长、操作简单、检测自动化成度高、数据自动生成处理能力强、测定仪器兼容性好、无环境污染等,因而得到了迅速发展与应用。但是检测灵敏度、测值准确度仍然不高。
发明内容
本发明旨在提出一种肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒;该试剂盒能快速反应,灵敏度高、特异性强的检测人体内肌红蛋白的试剂盒,以实现肌红蛋白检测过程中,便捷、快速的出具准确的检测结果。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,包括检测卡以及荧光微球工作液;
所述检测卡包括用于检测肌红蛋白的检测卡;
所述的用于检测肌红蛋白的检测卡,包括硝酸纤维素膜,其上分别包被肌红蛋白抗体和链霉亲和素在检测区和质控区;
所述荧光微球工作液,包括生物素标记的时间分辩荧光微球与抗体标记的时间分辨微球形成的混储液;抗体标记的时间分辨微球为具有与检测区单抗不同位点的肌红蛋白抗体标记的时间分辨荧光微球。
所述的肌红蛋白(MYO)时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,其特征在于:以相应的抗体或生物素标记物浓度计,肌红蛋白抗体标记的时间分辨荧光微球的浓度为600~1000ng/mL,生物素标记的时间分辩荧光微球的浓度以生物素标记物浓度计为40~180ng/mL;优选的,肌红蛋白抗体标记的时间分辨荧光微球的浓度为800ng/mL;生物素标记的时间分辩荧光微球的浓度以生物素标记物浓度计为110ng/mL。
所述的肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,其特征在于:所述时间分辨荧光微球的粒径为50~150nm;且微球内包裹的镧系元素为铕,活性官能团为羧基。
所述的肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,其特征在于:所述的荧光微球工作液的制备方法,包括如下步骤,
a)荧光微球的活化:
用5-50mM的pH6.0-8.0缓冲液,将荧光微球的质量-体积浓度调整为0.05%-0.2%,优选的浓度为0.1%;向体系中加入10-100μL浓度为10-50mg/mL的碳二亚胺溶液,超声混匀后加入10-100μL浓度为10-50mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺,超声混匀后,常温混匀30-60分钟;离心处理反应后的荧光微球,弃上清后用5-100mM的pH5.0-6.5的MES缓冲液复溶至原体积;2-8℃环境下储存备用。
b)荧光微球与抗体蛋白的偶联:
向活化好的荧光微球溶液中加入终浓度为50-300μg/mL的抗体或生物素,优选的,抗体的终浓度为80-120ng/mL;生物素终浓度为180-220μg/mL;室温混匀2-4小时后,向其中加入封闭剂,室温混匀0.5-2小时;离心处理,弃上清,沉淀物用至少包含质量浓度0.1%-8%的蔗糖和体积分数0.01%-0.3%的proclin300的PBS或MES作为稀释液重悬至原标记体积,配制成抗体或生物素标记的荧光微球浓储液;优选的,所述的稀释液为含蔗糖质量浓度为8%,海藻糖质量浓度为2%以及体积浓度为0.05%的Procline的pH为6.0的20mM MES;用于稀释浓储配制工作液时,优选的,应包含BSA的质量浓度为0.5%、蔗糖的质量浓度为0.3%、海藻糖的质量浓度为0.2%、Procline的体积浓度为0.05%、tween-20体积浓度为0.05%的pH为7.4的PBS缓冲液。
所述的肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,其特征在于:步骤b)中,封闭剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸或脱脂乳粉中的一种或几种,其质量浓度为0.5-1.5%;优选的,抗体或生物素与荧光微球偶联后,将偶联抗体的荧光微球与偶联生物素的荧光微球按照体积比为1:1-4:1的比例配制成混合浓储液,优选的1:1.5;将混合浓储液与上述稀释液按体积比1:150—1:750的比例配制成荧光微球工作液;优选的,1:300。
所述的肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,所述的检测区对应包被的肌红蛋白抗体,肌红蛋白抗体浓度为600~1000ng/mL;质控区包被的链霉亲和素浓度在1-3mg/mL。
一种制备肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒的方法,其特征在于:包括检测卡的制备以及荧光微球工作液的制备;
所述检测卡的制备包括以下步骤,
1)检测区和质控区的制备;
将对应的抗体和链霉亲和素以1000ng/mL的终浓度均匀分散于含质量浓度为0.5%-1%海藻糖的缓冲液中,均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区,并在35-50℃条件下烘干固化。
2)检测卡组装
将吸水纸、含检测区和质控区的硝酸纤维素膜、滤血膜、样品垫依次搭接(1-2mm)的粘贴于底板,裁切成3-4mm的卡条,装入卡壳中,制成肌红蛋白检测卡。
所述的制备方法,其特征在于:
将对应的抗体和链霉亲和素以1000ng/mL和2mg/mL的终浓度均匀分散于含质量浓度为1%海藻糖的缓冲液中,均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区,并在35-50℃条件下烘干固化。
所述的试剂盒或所述的制备方法得到的检测盒在定量检测肌红蛋白的含量的试剂中的应用。
本发明还提供了一种制备如上所述的肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒的方法,包括检测卡的制备以及荧光微球工作液的制备;
所述检测卡的制备包括以下步骤,
1)检测区和质控区的制备;
将对应的抗体和链霉亲和素(SA)以0.5~2ng/mL的终浓度均匀分散于含质量浓度为0.5%-1%海藻糖的缓冲液中,均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区,并在35-50℃条件下烘干固化。
2)检测卡组装
将吸水纸、含检测区和质控区的硝酸纤维素膜、滤血膜、样品垫依次搭接(1-2mm)的粘贴于底板,裁切成3-4mm的卡条,装入卡壳中,制成肌红蛋白检测卡。
优选的,将对应的抗体和链霉亲和素以0.8ng/mL的终浓度均匀分散于含质量浓度为1%海藻糖的缓冲液中,均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区,并在35~50℃条件下烘干固化。
本发明中,检测卡由依次粘贴在底板上的吸水纸、硝酸纤维素膜、滤血膜、样品垫和卡壳组成,硝酸纤维素膜上包被有检测区和质控区;荧光微球工作液中含有标记相应抗体的时间分辨荧光微球。检测过程中,结合在检测区和质控区的荧光微球复合物,在激发光的作用下,发射出的荧光,由荧光免疫分析仪采集处理,即可计算出检测结果。
本发明同时提供如上所述的试剂盒或如上所述的制备方法得到的检测试剂盒在定量检测肌红蛋白的含量的试剂中的应用。
相对于现有技术,本发明所述的试剂盒,具有以下优势:
(1)本发明所述的试剂盒,采用了时间分辨荧光免疫层析,特异性和灵敏度均达到98%以上。
(2)本发明所述的试剂盒,采用了侧向层析的方法,操作便捷快速。兼具了时间分辨的高灵敏度和侧向层析的便捷快速的优点。
附图说明
图1磁微粒化学发光法与本方法试剂盒检测肌红蛋白结果相关性。
具体实施方式
除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
所有的数字标识,例如pH、温度、时间、浓度,包括范围,都是近似值。要了解,虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。同时也要了解,虽然不总是明确的叙述,本文中描述的试剂仅仅是示例,其等价物是本领域已知的。
下面结合实施例来详细说明本发明。
一、检测卡的制备
1)检测区和质控区的制备;
将对应的抗体和链霉亲和素(SA)1000ng/mL和2mg/mL的终浓度均匀分散于含质量浓度为0.5%-1%海藻糖的缓冲液中,均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区,并在35-50℃条件下烘干固化。
2)检测卡组装
将吸水纸、含检测区和质控区的硝酸纤维素膜、滤血膜、样品垫依次搭接(1-2mm)的粘贴于底板,裁切成3-4mm的卡条,装入卡壳中,制成肌红蛋白检测卡。
二、荧光微球标记抗体的制备
(1)荧光微球的活化
取50μL初始浓度(固含量即质量-体积浓度)为1%的荧光微球(采购于BangsLaboratories,Inc.FCEU003),加入至950μL pH为6.0的20mMMES缓冲液中,混匀,12000g离心15min。弃上清,上述MES缓冲液重悬至1mL。
分别依次加入10mg/mL的EDC和NHS各50μL,室温混匀20min后,12000g离心15min,弃上清,用上述MES缓冲液复溶至1mL,置于2-8℃储存备用。
(2)荧光微球与抗体(或生物素)偶联
向上述溶液中加入一定量的抗体(或生物素),使抗体的终浓度为100ng/mL,生物素的终浓度为200μg/mL。室温混匀2小时。
(3)终止偶联
向偶联体系中加入终止液BSA,使其终浓度(质量浓度)为1%,室温连续混匀1小后,12000g离心15min,弃上清,用含蔗糖质量浓度为8%,海藻糖质量浓度为2%以及体积浓度为0.05%的Procline的pH为6.0的20mMMES缓冲液,将沉淀物重悬至1mL,得到荧光微球标记抗体(或生物素)的浓储液。
(4)工作液的配制
配制含BSA的质量浓度为0.5%、蔗糖的质量浓度为0.3%、海藻糖的质量浓度为0.2%、Procline的体积浓度为0.05%、tween-20体积浓度为0.05%的pH为7.4的PBS缓冲液。
抗体标记得到的荧光微球浓储与生物素标记的荧光微球浓储按体积比1:1混合,并用上述BSA的质量浓度为0.5%、蔗糖的质量浓度为0.3%、海藻糖的质量浓度为0.2%、Procline的体积浓度为0.05%、tween-20体积浓度为0.05%的pH为7.4的PBS缓冲液作为稀释液,将得到的含抗体标记荧光微球与生物素标记荧光微球体积比为1:1的混合浓储液,按照混合浓储液与稀释液体积比为1:200进行稀释,得到微球工作液,按100μL/支分装,或置于一个试剂瓶中储存,待使用前分装成100μL/支用于检测。
本发明试剂盒的使用方法
所有检测组份与待检样本置于室温下,平衡至室温。
使用时,取上述制备好的检测卡与荧光微球工作液,将25μL待检样本加入到上述配制并分装为100μL的工作液中,混匀后向检测卡加样孔中加入混合样本100μL。15min后,将检测卡插入荧光免疫分析仪,进行检测。读取检测结果。检测150例标本结果与已经取得注册证的博奥赛斯(天津)生物科技有限公司生产的肌红蛋白的磁微粒化学发光试剂盒检测结果进行比对。直线方程为y=0.965x-0.121,相关系数R=0.999。可见本方法制备的试剂盒与磁微粒化学发光法测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对相关系数进行t检验(检验水准α=0.05),P<0.001,两种方法测定的肌红蛋白值的相关密切程度是显著性的,可见两种方法测定的肌红蛋白值密切相关,说明试剂盒的诊断能力较强,可推广临床应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,其特征在于:包括检测卡以及荧光微球工作液;
所述检测卡包括用于检测肌红蛋白的检测卡;
所述的用于检测肌红蛋白的检测卡,包括硝酸纤维素膜,其上分别包被肌红蛋白抗体和链霉亲和素在检测区和质控区;
所述荧光微球工作液,包括生物素标记的时间分辩荧光微球与抗体标记的时间分辨微球形成的混储液;抗体标记的时间分辨微球为具有与检测区单抗不同位点的肌红蛋白抗体标记的时间分辨荧光微球。
2.根据权利要求1所述的肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,其特征在于:以相应的抗体或生物素标记物浓度计,肌红蛋白抗体标记的时间分辨荧光微球的浓度为600~1000ng/mL,生物素标记的时间分辩荧光微球的浓度为40~180ng/mL;优选的,肌红蛋白抗体标记的时间分辨荧光微球的浓度为800ng/mL;生物素标记的时间分辩荧光微球的浓度为110ng/mL。
3.根据权利要求1所述的肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,其特征在于:所述时间分辨荧光微球的粒径为50~150nm;且微球内包裹的镧系元素为铕,活性官能团为羧基。
4.根据权利要求1所述的肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,其特征在于:所述的荧光微球工作液的制备方法,包括如下步骤,
a)荧光微球的活化:
用5-50mM的pH6.0-8.0缓冲液,将荧光微球的质量-体积浓度调整为0.05%-0.2%,优选的浓度为0.1%;向体系中加入10-100μL浓度为10-50mg/mL的碳二亚胺溶液,超声混匀后加入10-100μL浓度为10-50mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺,超声混匀后,常温混匀30-60分钟;离心处理反应后的荧光微球,弃上清后用5-100mM的pH5.0-6.5的MES缓冲液复溶至原体积;2-8℃环境下储存备用;
b)荧光微球与抗体蛋白的偶联:
向活化好的荧光微球溶液中加入终浓度为50-300μg/mL的抗体或生物素,优选的,抗体的终浓度为80-120ng/mL;生物素终浓度为180-220μg/mL;室温混匀2-4小时后,向其中加入封闭剂,室温混匀0.5-2小时;离心处理,弃上清,沉淀物用至少包含质量浓度0.1%-8%的蔗糖和体积分数0.01%-0.3%的proclin300的PBS或MES作为稀释液重悬至原标记体积,配制成抗体或生物素标记的荧光微球浓储液;优选的,所述的稀释液为含蔗糖质量浓度为8%,海藻糖质量浓度为2%以及体积浓度为0.05%的Procline的pH为6.0的20mM MES;用于稀释浓储配制工作液时,优选的,应包含BSA的质量浓度为0.5%、蔗糖的质量浓度为0.3%、海藻糖的质量浓度为0.2%、Procline的体积浓度为0.05%、tween-20体积浓度为0.05%的pH为7.4的PBS缓冲液。
5.根据权利要求4所述的肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,其特征在于:步骤b)中,封闭剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸或脱脂乳粉中的一种或几种,其质量浓度为0.5-1.5%;优选的,抗体或生物素与荧光微球偶联后,将偶联抗体的荧光微球与偶联生物素的荧光微球按照体积比为1:1-4:1的比例配制成混合浓储液,优选的2:1;将混合浓储液与上述稀释液按体积比1:150~1:750的比例配制成荧光微球工作液;优选的,1:300。
6.根据权利要求1所述的肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒,其特征在于,所述的检测区对应包被的肌红蛋白抗体,肌红蛋白抗体浓度为600-1000ng/mL;质控区包被的链霉亲和素浓度在1-3mg/mL。
7.一种制备如权利要求1~6任一项所述的肌红蛋白时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒的方法,其特征在于:包括检测卡的制备以及荧光微球工作液的制备;
所述检测卡的制备包括以下步骤,
1)检测区和质控区的制备;
将对应的抗体和链霉亲和素均匀分散于含质量浓度为0.5%-1%海藻糖的缓冲液中,均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区,并在35-50℃条件下烘干固化。
2)检测卡组装
将吸水纸、含检测区和质控区的硝酸纤维素膜、滤血膜、样品垫依次搭接(1-2mm)的粘贴于底板,裁切成3-4mm的卡条,装入卡壳中,制成肌红蛋白检测卡。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于:
将对应的抗体和链霉亲和素分别以1000ng/mL和2mg/mL终浓度均匀分散于含质量浓度为1%海藻糖的缓冲液中,均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区,并在35-50℃条件下烘干固化。
9.如权利要求所述的试剂盒或所述的制备方法得到的检测盒在定量检测肌红蛋白的含量的试剂中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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