CN104634980B - 心肌肌钙蛋白i超敏检测试剂盒及超敏检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种cTnI超敏检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括标记有示踪标记物的至少一株第一抗cTnI抗体和包被磁性微球的至少一株第二抗cTnI抗体，并且所述第一抗cTnI抗体与cTnI的结合位点相异于第二抗cTnI抗体与cTnI的结合位点。上述试剂盒可优选地进一步包括一种稀释液，所述稀释液能够显著地降低检测过程中的非特异性结合，进一步提高检测准确性和灵敏度。本发明还提供了采用上述试剂盒检测cTnI的方法，该方法具有很高的灵敏性，能够灵敏、准确地检测出样本中的cTnI含量，为AMI的早期诊断和治疗提供更及时、可靠的信息。

Description

心肌肌钙蛋白I超敏检测试剂盒及超敏检测方法

技术领域

本发明涉及生化物质的检测领域，具体涉及一种心肌肌钙蛋白I超敏检测试剂盒及其制备方法，还涉及一种心肌肌钙蛋白I超敏检测方法。

背景技术

肌钙蛋白是横纹肌收缩的调节蛋白，存在于心肌和骨骼肌中，由三种亚基组成，分别为TnI、TnC和TnT。三种亚基形成复合物，在肌肉收缩和舒张过程中起着重要调节作用。TnI为肌动蛋白的抑制亚基，有三种亚型：快骨骼肌亚型(fTnI)、慢骨骼肌亚型(sTnI)和心肌亚型(心肌肌钙蛋白I，cTnI)。其中心cTnI分子质量23.9kD，包含有210个氨基酸残基。cTnI含量升高可作为诊断急性心肌梗死(AMI)的重要血清学指标。发生急性心肌梗塞时，cTnI由于心肌受到障碍在4-8小时内被释放到血液中，因此其浓度脱离健康人的浓度范围。通常，AMI发病后12-18小时后，cTnI浓度达到最高，并且维持5-10日。

急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，靠休息以及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，甚至危及生命，是心内科的常见疾病之一，严重危害人类健康。此病在欧美最常见，美国每年约有150万人发生心肌梗死。中国近年来呈明显上升趋势，每年新发病人数至少50万，现患至少200万。近年来AMI在治疗上取得很大发展，从消极的保守治疗转为积极的消除血栓或经皮冠状动脉扩张术乃至进行冠状动脉搭桥术治疗。这就对早期准确诊断出AMI提出了很高的要求，但AMI发作时敏感性只有50％左右，随着时间的延长，敏感性逐步提高，至6h敏感性可达90％以上，表现出随着时间推移敏感性逐渐升高的趋势，意味着早期准确诊断出AMI的关键问题是提高检测方法的灵敏度。

目前，AMI的检测方法主要有特征性心电图衍变以及血清生物标志物的动态变化。但是，约有25％的心肌梗死患者发病早期没有典型的临床症状，约50％左右的AMI患者缺乏心电图的特异改变，若单独依靠心电图改变和临床症状，AMI的诊断符合率仅为75％。在这种情况下，心肌损伤标志物的检测在诊断AMI时尤为重要。心肌损伤标志物主要为肌酸激酶同工酶(CK-MB)及cTnI。其中，由于cTnI具有心肌损伤后动态释放迅速、曲线完整、峰值明显、组织特异性强、窗口诊断期长、测定方法快、血中出现早等优点，基于cTnI对AMI的诊断方式优于基于CK-MB对AMI的诊断方式，因此已被临床广泛接受。cTnI不仅成为诊断急性心肌梗死的“金标准”，而且已成为心肌疾病病情监测、疗效观察、危险分级及预后评估的最合适标志物。

cTnI的测定方法很多，主要有放射性同位素免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验法(ELISA)、以及胶体金免疫层析法(ICA)等。近年来，随着对cTnI研究的发展，一些新的更加准确的检测方法在临床检验科中得以开展，如化学发光法(CLIA)。

放射性同位素免疫分析法法因其存在着操作繁琐、检测时间长、不适合大批量检测、结果重复性差、核素污染等问题，已基本不使用。

酶联免疫吸附试验法的测定原理是以包被固相载体的特异性抗体为第一抗体，加入待测血清后，再加入生物素标记的第二抗体，形成双夹心，孵育后冲洗分离，加入发光基质底物，测得的光强度与标准曲线相比可得cTnI的浓度值。然而，酶联免疫吸附试验法存在着操作繁琐、测定周期偏长、灵敏度相对较低、线型范围偏窄等诸多不足；尤其是，由于cTnI血清含量偏低，采用ELISA法检测cTnL表现出明显的灵敏度较差的问题，使临床无法在早期快速准确的诊断出AMI发作，因而限制了ELISA法在cTnI临床检测方面的进一步应用。

胶体金免疫层析法标本用量少，简便快速，适合于cTnI的床旁检测。其基本原理均是利用两个抗cTnI单克隆抗体的结合来检测cTnI，当血清样本滴到吸收孔内，第一个被胶体金标记的抗体与cTnI结合形成一个抗体抗原复合物，第二个固定化的cTnI单抗捕捉到这个结合体，产生一个粉色的条带，对于无结合体的存在，反应圈内则没有色带。但胶体金免疫层析法仅能进行定性测定，对于定量测定则灵敏度很差。基于胶体金免疫层析法开发的检测卡，虽然可快速完成cTnI定性检测，但同样由于灵敏度较低的问题，在AMI早期，血清中仅含有少量cTnI的情况下，胶体金免疫层析法无法准确诊断出AMI的发作，所以在临床应用上还是有很大的局限性。

化学发光法是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质，经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将标记物质直接标记在抗原或抗体上，经过特异性反应后形成抗原-抗体复合物，然后进行相应标记物的检测方法检测。CLIA的主要优点是灵敏度高、线性范围宽、标记物的有效期长、无放射性危害、可实现全自动化等。

Siemens公司提供的cTnI检测试剂盒包含主试剂包，含ADVIA超敏TnI^TM二元标记试剂、固相试剂和辅助试剂。二元标记试剂包括吖啶酯标记的山羊多克隆抗cTnI抗体(～0.15μg/mL)，2个生物素标记的鼠单克隆抗cTnI抗体(～2.0μg/mL)；固相试剂为乳胶磁性颗粒悬浮液；辅助试剂为非磁性乳胶颗粒。该公司的ADVIACentaur超敏TnI检测法是采用直接化学发光技术的3位点夹心免疫测试法。在检测过程中，二元标记试剂中的抗体与样品中的肌钙蛋白I结合，产生免疫复合物。免疫复合物中所含的生物素随机与磁性颗粒上标记的链霉亲和素结合。

Roche公司提供的cTnI检测试剂盒，可将其中的生物素化的抗cTnI的单克隆抗体和钌(Ru)络合物标记的抗cTnI单克隆抗体与抗原形成三明治夹心法结构，通过电化学发光免疫分析法(ECLIA)测定cTnI。

化学发光法虽具有准确、特异性强、精密度好的优点，其灵敏度也远高于酶联免疫吸附试验法和胶体金免疫层析法。但是，现有的cTnI商业检测试剂盒灵敏度对于临床应用依然不够高，分析灵敏度都在5pg/mL以上，因而不能够准确地检测超低浓度的cTnI，故不能满足AMI早期诊断的高要求。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种cTnI检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒具有超高灵敏度，可以为AMI的早期诊断提供准确的检测结果，从而提高AMI早期诊断的敏感性。

本发明还提供一种cTnI检测方法，具有超高灵敏度，为AMI的早期诊断提供了更为先进的方法。

根据本发明，提供了一种cTnI检测试剂盒，所述试剂盒包括标记有示踪标记物的至少一株第一抗cTnI抗体和包被磁性微球的至少一株第二抗cTnI抗体，并且所述第一抗cTnI抗体与cTnI的结合位点相异于第二抗cTnI抗体与cTnI的结合位点。所述第一抗cTnI抗体和第二抗cTnI抗体可以是抗cTnI单克隆抗体和/或抗cTnI多克隆抗体。该试剂盒是超敏检测试剂盒，在用于检测cTnI时，具有很高的灵敏度。

在本发明中，所述第一抗cTnI抗体和第二抗cTnI抗体的区别在于它们与cTnI的位点结合不同。因此，在本发明的等同技术方案中，试剂盒也可以包括标记有示踪标记物的至少一株第二抗cTnI抗体和包被磁性微球的至少一株第一抗cTnI抗体。就本发明而言，超敏是指检测灵敏度在5pg/mL以下，尤其是3pg/mL以下。

本发明采用双抗体夹心法检测cTnI，这种方法采用两株或多株针对cTnI的单克隆或多克隆抗体，其中被标记的一株或多株抗cTnI的单抗或多抗用于捕获cTnI氨基酸区段，连接在载体上的其他株抗cTnI的单抗或多抗用于结合cTnI上不同于前者所结合的氨基酸区段。

优选地，所述第一抗cTnI抗体与cTnI的结合位点为cTnI的10-100氨基酸区段；所述第二抗cTnI抗体与cTnI的结合位点为cTnI的40-200氨基酸区段。选择这些结合区段的cTnI抗体有利于对其进行更好地标记或包被磁球，同时有利于在检测过程中cTnI抗体与cTnI的结合，提高检测特异性、准确性。

在一个优选实施方案中，所述试剂盒包括两种第一抗cTnI抗体，与cTnI的结合位点分别为cTnI的10-50和60-100氨基酸区段；所述试剂盒包括两种第二抗cTnI抗体，与cTnI的结合位点分别为cTnI的40-80和120-200氨基酸区段。

根据本发明，所述示踪标记物可以选自本领域中常用于标记抗原或抗体的示踪标记物，例如金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，尤其优选为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。

适用于本发明的磁性微球也称为磁珠，可以是本领域中常用的磁性微球。优选的是，本发明使用的磁性微球，是将纳米级的Fe₂O₃或Fe₃O₄磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有特别限制，可根据需要进行选择。

本发明所使用的磁性微球应能满足直径为0.1-5μm，磁性微球还可以通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH₂。

在一个具体实施例中，所述磁性微球为Fe₂O₃或Fe₃O₄磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，并具有0.1-5μm的粒径；并且，所述磁性微球任选地通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。

根据本发明，在所述试剂盒中，第一抗cTnI抗体和第二抗cTnI抗体的浓度分别为1-20μg/mL，示踪标记物的浓度为5-500ng/mL，磁性微球的浓度为0.1-2mg/mL。上述各成分的浓度基于包含该成分的各试剂盒组分的量计。

根据本发明，所述示踪标记物直接或间接地标记第一抗cTnI抗体。间接标记的方式包括但不限于通过异硫氰酸荧光素(FITC)与抗FITC抗体体系或通过链霉亲和素(SA)与生物素(Biotin)体系进行间接标记。直接标记是指ABEI直接与第一抗cTnI抗体连接进行标记；间接标记是指通过中间媒介链接体系使得ABEI标记第一抗cTnI抗体，所述中间媒介链接体系包括但不限于FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系。本发明人发现，间接标记有利于减弱空间效应，有利于信号的放大，使得检测更加灵敏。

根据本发明，所述第二抗cTnI抗体直接或间接地包被磁性微球。间接包被磁性微球的方式包括但不限于通过FITC与抗FITC抗体体系或通过链霉亲和素与生物素体系进行间接包被。直接包被是指利用第二抗cTnI抗体直接对磁性微球进行包被；间接包被是指通过中间媒介链接体系，使得第二抗cTnI抗体对磁性微球进行包被，所述中间媒介链接体系包括但不限于FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系。间接包被的优点在于，有利于减弱空间效应，有利于信号的放大，使得检测更加灵敏。

根据本发明的一些实施方案，所述试剂盒包括选自A1-A3中的任意一种组分和选自B1-B3中的任意一种组分，其中，A1为标记(指直接标记)有示踪标记物的第一抗cTnI抗体溶液；A2为标记(指直接标记)有示踪标记物的链霉亲和素溶液和生物素化的第一抗cTnI抗体溶液；A3为标记(指直接标记)有示踪标记物的抗异硫氰酸荧光素抗体溶液和标记有的异硫氰酸荧光素的第一抗cTnI抗体溶液。B1为包被(指直接包被)磁性微球的第二抗cTnI抗体溶液；B2为包被(指直接包被)磁性微球的链霉亲和素溶液和生物素化的第二抗cTnI抗体溶液；B3为包被(指直接包被)磁性微球的抗异硫氰酸荧光素抗体溶液和标记有异硫氰酸荧光素的第二抗cTnI抗体溶液；并且，组分A1-A3和组分B1-B3的各溶液分别任选地含有牛血清白蛋白(BSA)和/或防腐剂。BSA的浓度优选为0.01-5g/mL。

本发明还提供了一种稀释液，所述稀释液包括以下组分：牛血清白蛋白、新生牛血清、羊血清、马血清、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、水合2-吗啉乙磺酸(如一水合2-吗啉乙磺酸)、乙二醇、丙三醇、吐温-80、酪蛋白和乙二胺四乙酸二钠。

在本发明的优选实施方案中，所述稀释液各组分的浓度如下：1～10g/L的BSA、1～50体积％的新生牛血清、0.1～10体积％的羊血清、0.1～10体积％的马血清、1～100mmol/L的二硫苏糖醇、1～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、1～100mmol/L的水合2-吗啉乙磺酸、0.1～10体积％的乙二醇、0.1～10体积％的丙三醇、0.01～2体积％的吐温-80、0.1～10g/L的酪蛋白和0.1～10g/L的乙二胺四乙酸二钠。该稀释液优选以水为溶剂。该稀释液还优选地进一步包含0.01～1g/L的防腐剂。

适用于本发明的防腐剂可以选自本领域常用的防腐剂，例如为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin 300(免疫诊断常用防腐剂之一，主要活性成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)和抗生素中的任一种或两种以上混合物。

在本发明的优选实施方案中，本发明提供的试剂盒还包括如上所述的稀释液。在检测过程中添加所述稀释液，所述稀释液能够消除类风湿因子(RF)、人抗鼠抗体(HAMA)、嗜异性抗体、抗核抗体(ANA)等多种干扰免疫反应因子，从而提供一个更利于抗体和抗原反应的条件。因此，加入所述稀释剂能够显著地降低样本检测的非特异性结合，从而进一步提高反应灵敏度和检测准确度。

根据本发明，所述试剂盒还包括cTnI的低点校准品和高点校准品，并任选地包括缓冲液。本发明所述低点校准品与高点校准品是两者相对而言，其中“低点校准品”，是指将cTnI用50％牛血清制品稀释成浓度为0.01-2206ng/mL得到的校准品；而“高点校准品”是指将cTnI用50％牛血清制品稀释成浓度为17668-50000ng/mL得到的校准品。低点校准品和高点校准品分别任选地含有浓度为0.01-5g/mL的BSA和/或防腐剂。

在本发明的一个具体实施方案中，所述试剂盒包括下列组分：a)cTnI抗体标记的ABEI，cTnI抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，ABEI浓度为5ng/mL-500ng/mL；b)包被有cTnI抗体的磁性微球，cTnI抗体浓度1-20μg/mL，磁性微球浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；c)低点校准品，浓度0.01-2206pg/mL；d)高点校准品，浓度17668-50000pg/mL；e)浓度为0.01-5g/mL的BSA；f)防腐剂；g)如上所述稀释液。

在本发明的一个具体实施方案中，所述试剂盒包括下列组分：a)标记cTnI抗体的ABEI，cTnI抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，ABEI浓度为5ng/mL-500ng/mL；b)标记FITC的cTnI抗体，cTnI抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，FITC浓度为5ng/mL-500ng/mL；c)包被有FITC单抗或多抗的磁性微球，FITC单抗或多抗浓度1-20μg/mL，磁性微球浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；d)低点校准品，浓度0.01-2206pg/mL；e)高点校准品，浓度17668-50000pg/mL；f)浓度为0.01-5g/mL的BSA；g)防腐剂；h)如上所述稀释液。

在本发明的一个具体实施方案中，所述试剂盒包括下列组分：a)标记cTnI抗体的ABEI，cTnI抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，ABEI浓度为5ng/mL-500ng/mL；b)生物素化的cTnI抗体，cTnI抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，生物素浓度为5ng/mL-500ng/mL；c)包被有链霉亲和素的磁性微球，链霉亲和素浓度为1-20μg/mL，磁性微球浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；d)低点校准品，浓度为0.01-2206pg/mL；e)高点校准品，浓度为17668-50000pg/mL；f)浓度为0.01-5g/mL的BSA；g)防腐剂；h)如上所述稀释液。

在本发明的一个具体实施方案中，所述试剂盒包括下列组分：a)标记有链霉亲和素的cTnI抗体，cTnI抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，链霉亲和素浓度为1-20μg/mL，b)生物素标记的ABEI，生物素浓度为5ng/mL-500ng/mL，ABEI浓度为5ng/mL-500ng/mL；c)包被有cTnI抗体的磁性微球，cTnI抗体浓度为1-20μg/mL，磁性微球浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；d)低点校准品，浓度为0.01-2206pg/mL；e)高点校准品，浓度17668-50000pg/mL；f)浓度为0.01-5g/mL的BSA；g)防腐剂；h)如上所述稀释液。

在本发明的一个具体实施方案中，所述试剂盒包括下列组分：a)FITC单抗或多抗标记的cTnI抗体，cTnI抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，FITC单抗或多抗浓度为1-20μg/mL，b)FITC标记的ABEI，FITC浓度为5ng/mL-500ng/mL，ABEI浓度为5ng/mL-500ng/mL；c)包被有cTnI抗体的磁性微球，cTnI抗体浓度为1-20μg/mL，磁性微球浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；d)低点校准品，浓度0.01-2206pg/mL；e)高点校准品，浓度17668-50000pg/mL；f)浓度为0.01-5g/mL的BSA；g)防腐剂；h)如上所述稀释液。

在本发明的一个具体实施方案中，所述试剂盒包括下列组分：a)链霉亲和素标记的cTnI抗体，cTnI抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，链霉亲和素浓度为1-20μg/mL；b)生物素标记的ABEI，生物素浓度为5ng/mL-500ng/mL，ABEI浓度为5ng/mL-500ng/mL；c)标记FITC的cTnI抗体，cTnI抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，FITC浓度为5ng/mL-500ng/mL；d)包被有FITC单抗或多抗的磁性微球，FITC单抗或多抗浓度为1-20μg/mL，磁性微球浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；e)低点校准品，浓度为0.01-2206pg/mL；f)高点校准品，浓度为17668-50000pg/mL；g)浓度为0.01-5g/mL的BSA；h)防腐剂；i)如上所述稀释液。

在本发明的一个具体实施方案中，所述试剂盒包括下列组分：a)FITC单抗或多抗标记的cTnI抗体，cTnI抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，FITC单抗或多抗浓度为1-20μg/mL；b)FITC标记的ABEI，FITC浓度为5ng/mL-500ng/mL，ABEI浓度为5ng/mL-500ng/mL；c)生物素化的cTnI抗体，cTnI抗体浓度为50ng/mL-5000ng/mL，生物素浓度为5ng/mL-500ng/mL；d)包被有链霉亲和素的磁性微球，链霉亲和素浓度为1-20μg/mL，磁性微球浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；e)低点校准品，浓度为0.01-2206pg/mL；f)高点校准品，浓度为17668-50000pg/mL；g)浓度为0.01-5g/mL的BSA；h)防腐剂；i)如上所述稀释液。

本发明提供了一种用于制备如上所述试剂盒的方法，所述方法包括：所述方法包括：将至少一株第一抗cTnI抗体直接或间接标记示踪标记物；将所述至少一株第二抗cTnI抗体直接或间接包被磁性微球。

根据本发明的方法，所述间接标记包括将示踪标记物通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或通过链霉亲和素与生物素体系标记所述第一抗cTnI抗体。

根据本发明的方法，所述间接包被包括将所述第二抗cTnI抗体通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或通过链霉亲和素与生物素体系间接包被磁性微球。

根据本发明的试剂盒制备方法还可以包括低点校准品和高点校准品的配制，还可以进一步包括试剂盒的组装。

根据本发明，还提供了一种检测cTnI的方法，所述方法包括使用如上所述的试剂盒，利用化学发光免疫法检测待测样本中的cTnI浓度。

根据本发明，待测样本可为直接得到的血清、血浆及全血，也可以是通过抽取人体血样进行分离得到的样本。

具体地，使试剂盒中的第一抗cTnI抗体和第二抗cTnI抗体与待测样本中的cTnI形成第一抗cTnI抗体-cTnI-第二抗cTnI抗体双抗体夹心模式，然后加入发光底物，通过化学发光免疫法测定cTnI的浓度。

使用本发明提供的试剂盒检测的原理示意图可参考图1。

在一个实施方案中，所述检测cTnI浓度的方法包括使用如上所述的试剂盒，通过化学发光免疫分析仪检测cTnI浓度。在本发明的一个优选的实施方案中，所述方法全自动地进行。根据本发明，所述化学发光免疫分析仪优选为Maglumi系列化学发光免疫分析仪(深圳新产业生物医学工程股份有限公司生产)。

采用本发明提供的试剂盒，能够以超高灵敏度测定cTnI浓度；检测灵敏度例如达到1pg/mL，功能灵敏度例如达到2.5pg/mL。配合化学发光免疫分析仪使用，可实现全自动、快速、灵敏、定量地检测样本中cTnI浓度结果。本发明所能实现的检测灵敏度高于现有技术5至200倍，因而能够更加灵敏地检测出样本中的cTnI含量，进而为AMI的早期诊断提供更加准确的检测结果，提高AMI早期诊断的敏感性，从而能够及早准确诊断出AMI，为AMI的治疗提供更充足的时间。

附图说明

图1是使用本发明提供的cTnI检测试剂盒检测样本中的cTnI含量的原理示意图；其中，图中各标记意义如下：

—cTnI抗原；—磁性微球；—样本中的其他成分；—针对cTnI的抗体；—标记有ABEI的cTnI抗体；—包被磁性微球的cTnI抗体；—光信号。

图2显示了实施例8和实施例9的线性测试结果对比。

图3显示了实施例10和实施例11的线性测试结果对比。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明做进一步地说明，应理解，本发明的范围并不限于此。

制备1：包被cTnI的单抗或多抗的磁性微球悬浮液的制备

此制备步骤使用的免疫磁性微球选择Merck公司生产的浓度为100mg/mL，羟基为95mg KOH/g的纳米磁性微球悬浮液。

A溶液的配制(pH3.6醋酸缓冲液)：称取2.55g三水合乙酸钠，用4500mL纯化水溶解，再加入14mL乙酸，混匀后，用纯化水定容至5000mL(pH3.6)。

将磁性微球中悬浮于5倍于包被体积的上述pH3.6醋酸缓冲液，使磁球浓度为20mg/mL；再加入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC)，使其浓度为10mg/mL；按所得溶液与cTnI单抗或多抗的重量比为1mg：12μg的比例加入纯化的cTnI单抗或多抗，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时。

以0.1mol/l的PBS缓冲液:纯化水＝1:9的体积比配制pH为7.4的PBS缓冲液500mL，加入2.5g BSA混匀溶解，即为磁珠清洗液。将温浴好的磁性微球倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入5倍体积的磁性微球清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液，重复该清洗步骤四次。

磁性微球的悬浮：将清洗后的磁性微球加入包被体积的BSA水溶液(5g/L，含1g/L叠氮钠)，得到磁性微球悬浮液中，悬浮浓度为20mg/mL，此悬浮液体积即为此制备步骤所述的包被体积。

制备2：包被有链霉亲和素的磁性微球悬浮液的制备

此制备步骤使用的免疫磁性微球选择Merck公司生产的浓度为100mg/mL，羟基为95mg KOH/g的纳米磁性微球悬浮液。

A溶液的配制(pH3.6醋酸缓冲液)：称取2.55g三水合乙酸钠，用4500mL纯化水溶解，再加入14mL乙酸，混匀后，用纯化水定容至5000mL(pH3.6)。

将磁性微球加入与包被体积等量的上述pH3.6醋酸缓冲液悬浮，使磁性微球浓度为20mg/mL，再加入CMC(使其浓度为10mg/mL)，按所得溶液与链霉亲和素的重量比为1mg：12μg的比例加入链霉亲和素，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时

磁性微球清洗液的配制：以0.1mol/l的PBS缓冲液:纯化水＝1:9的体积比配制pH为7.4的PBS缓冲液500mL，加入2.5g BSA混匀溶解，即为磁珠清洗液。

将温浴好的磁性微球倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入5倍体积的磁性微球清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液，重复该清洗步骤四次。

磁性微球的悬浮：将清洗后的磁性微球加入包被体积的BSA水溶液(5g/L，含1g/L叠氮钠)，得到磁性微球悬浮液中，悬浮浓度为20mg/mL，即为包被有链霉亲和素的磁球的悬溶液。

制备3：包被有FITC单抗或多抗的磁性微球悬浮液的制备

此制备步骤使用的免疫磁性微球选择Merck公司生产的浓度为100mg/mL，羟基数为95mg KOH/g的纳米磁性微球悬浮液。

A溶液的配制(pH3.6醋酸缓冲液)：称取2.55g三水合乙酸钠，用4500mL纯化水溶解，再加入14mL乙酸，混匀后，用纯化水定容至5000mL(pH3.6)。

将磁性微球加入与包被体积等量的pH3.6醋酸缓冲液悬浮，使磁性微球浓度为20mg/mL，再加入CMC，使其浓度为10mg/mL，按所得溶液与FITC单抗或多抗的重量比为1mg：12μg的比例加入FITC单抗或多抗，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时

磁性微球清洗液的配制：以0.1mol/l的PBS缓冲液:纯化水＝1:9的体积比配制pH为7.4的PBS缓冲液500mL，加入2.5g BSA混匀溶解，即为磁珠清洗液。

将温浴好的磁性微球倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入5倍体积的磁性微球清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液，重复该清洗步骤四次。

磁性微球的悬浮：将清洗后的磁性微球加入包被体积的BSA水溶液(5g/L，含1g/L叠氮钠)，得到磁性微球悬浮液，悬浮浓度为20mg/mL，即为包被有FITC单抗或多抗的磁球的悬溶液。

制备4：标记有ABEI的cTnI单抗或多抗溶液的制备

透析液(F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na₂CO₃14.31g，NaHCO₃26.46g，加水定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸，取1mg cTnI单抗或多抗用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，放入透析液中，透析2小时，搅拌速度400rpm。将透析好的溶液装入小白瓶中(每瓶1mL)，加入300μg ABEI-半琥珀酰胺酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，37℃反应2小时，得到标记ABEI的cTnI抗体溶液。

安装好G-25凝胶柱，用纯化水洗脱干净后，再用pH值7.4的PBS缓冲液对反应溶液进行平衡洗脱。

凝胶柱平衡洗脱完毕后，将标记好ABEI的cTnI抗体溶液过柱纯化，然后收集出现峰值的溶液。

将收集好的蛋白溶液，加入等体积的含0.5g/mL的BSA的保护液，既得。

制备5：cTnI单抗或多抗标记的生物素溶液的制备

透析液(F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na₂CO₃14.31g，NaHCO₃26.46g，加水定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸，取1mgcTnI单抗或多抗用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，倒入透析袋中，扎紧透析袋另一端，放入透析液中，透析2小时，搅拌速度400rpm。

将活化的生物素溶于DMF中，按照生物素与cTnI单抗或多抗的摩尔比为20:1的比例将二者混合反应2h。

将反应后的液体用0.1mol/L PBS于4℃透析24小时，即制成cTnI单抗或多抗的生物素溶液。

制备6：标记cTnI单抗或多抗的FITC溶液的制备

透析液(F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na₂CO₃14.31g，NaHCO₃26.46g，加水定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸，取1mg的cTnI单抗或多抗用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，倒入透析袋中，扎紧透析袋另一端，放入透析液中，透析2小时(搅拌速度400rpm)。

透析好的溶液装入小白瓶中(每瓶1mL)，加入100μg FITC，室温反应2.5小时，得到标记cTnI单抗或多抗的FITC溶液。

配制pH7.4PBS缓冲液作为层析柱的平衡液；层析柱用纯化水冲洗24小时后，连接平衡液与层析柱平衡30分钟；放干上表面液体，加入上述标记cTnI单抗或多抗的FITC溶液，再次放干表面液体。加入适量平衡液，连通上下管道，下方连接核酸蛋白检测仪(纯化前预热2小时)调整光亮和精确度。调零，收集峰值时间段的液体，即为所需要的标记cTnI单抗或多抗的FITC溶液。

制备7：cTnI单抗或多抗标记的链霉亲和素溶液的制备

透析液(F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na₂CO₃14.31g，NaHCO₃26.46g，加水定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸备用。取1mg cTnI单抗或多抗用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，倒入透析袋中，扎紧透析袋另一端，放入透析液中，透析2小时(搅拌速度400rpm)

透析好的溶液装入小白瓶中(每瓶1mL)，加入50μg链霉亲和素，37℃反应2小时，得到标记cTnI抗体的链霉亲和素溶液。

安装好G-25凝胶柱，用纯化水洗脱干净后，在用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱。

凝胶柱平衡洗脱完毕后，将标记好cTnI抗体的链霉亲和素过柱纯化，然后收集出现峰值的溶液。

将收集好的蛋白溶液，加入等体积的含0.5g/mL的BSA保护液，即得。

制备8：cTnI单抗或多抗标记的FITC单抗或多抗溶液的制备

透析液(F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na₂CO₃14.31g，NaHCO₃26.46g，加水定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸备用。取1mg cTnI单抗或多抗用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，倒入透析袋中，扎紧另一端，放入透析液中，透析2小时(搅拌速度400rpm)。

透析好的溶液装入小白瓶中(每瓶1mL)，加入50μgFITC单抗或多抗，37℃反应2小时，得到标记cTnI抗体的FITC单抗或多抗溶液。

安装好G-25凝胶柱，用纯化水洗脱干净后，在用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱。

凝胶柱平衡洗脱完毕后，将标记好cTnI抗体的FITC单抗或多抗溶液过柱纯化，然后收集出现峰值的溶液。

将收集好的蛋白溶液，加入等体积的含0.5g/mL的BSA保护液，即得。

制备9：生物素化的ABEI溶液的制备

透析液(F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na₂CO₃14.31g，NaHCO₃26.46g，加水定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸备用。取1mg生物素用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，倒入透析袋中，扎紧透析袋另一端，放入透析液中，透析2小时(搅拌速度400rpm)。

透析好的溶液装入小白瓶中(每瓶1mL)，加入300μg ABEI-半琥珀酰胺酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，37℃反应2小时，得到生物素化的ABEI溶液。

安装好G-25凝胶柱，用纯化水洗脱干净后，在用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱。

凝胶柱平衡洗脱完毕后，将生物素化的ABEI溶液过柱纯化，然后收集出现峰值的溶液。

将收集好的蛋白溶液，加入等体积的含0.5mg/mL的BSA保护液，即得。

制备10：FITC标记的ABEI溶液的制备

透析液(F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na₂CO₃14.31g，NaHCO₃26.46g，加水定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸备用。取1mg FITC用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL。扎紧另一端放入透析液中，透析2小时(搅拌速度400rpm)。

透析好的溶液装入小白瓶中(每瓶1mL)，加入300μg ABEI-半琥珀酰胺酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，37℃反应2小时。

安装好G-25凝胶柱，用纯化水洗脱干净后，在用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱。

凝胶柱平衡洗脱完毕后，将FITC标记的ABEI过柱纯化，然后收集出现峰值的溶液。

将收集好的蛋白溶液，加入等体积的含0.5g/mL的BSA保护液，即得。

制备11：稀释液的制备

在200mL纯化水中加入5g BSA、300mL的新生牛血清、50mL的羊血清、10mL的马血清、3.08g的二硫苏糖醇、6.05g的三羟甲基氨基甲烷、2.31g一水合2-吗啉乙磺酸、10mL乙二醇、50mL的丙三醇、0.5mL吐温-80、2g的酪蛋白、1g乙二胺四乙酸二钠、1g叠氮钠，加入纯化水至总体积为1000mL，充分搅拌后采用0.4μm滤膜过滤，备用。若配制量不同，按比例增加。

制备12：高、低点校准品溶液的制备

取cTnI标准品，用50％牛血清制品配制成浓度为17668.000pg/mL和34.000pg/mL的高、低点校准品溶液。

以下实施例中：

以下所使用的第一抗cTnI抗体、第二抗cTnI抗体：均由Hytest公司生产。

羊抗FITC多克隆抗体：美国Jackson公司生产。

ABEI：深圳新产业生物医学股份有限公司生产。

FITC：美国Sigma公司生产。

cTnI标准品：Meridian Life Science,Inc.生产。

磁性微球由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产，80％粒径分布为1-5μm，磁化强度为4000高斯时沉淀时间为10-15秒，BSA为30mg时蛋白吸附浓度为0.8mg-1.2mg。

生物素、链霉亲和素：均为美国Biosources公司生产。

Maglumi 2000化学发光分析仪由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供。

实施例1

通过以下步骤制备试剂盒1：

采用能够分别结合cTnI的氨基酸区段为18～28和83～93的两株cTnI抗体作为第一抗cTnI抗体，按照上述制备4步骤用ABEI标记，得到标记有ABEI的第一抗cTnI抗体溶液。其中，第一抗cTnI抗体的总浓度为300ng/mL，ABEI浓度为30pg/mL。

采用分别结合cTnI的氨基酸区段为41～49和190～196的两株cTnI抗体作为第二抗cTnI抗体，按照上述制备1的步骤包被磁性微球，得到包被磁性微球的第二抗cTnI抗体溶液。其中，第二抗cTnI抗体的总浓度为5μg/mL，磁性微球浓度为1mg/mL。

按照制备11制备稀释液。

按照步骤12制备低点校准品溶液和高点校准品溶液，浓度分别为34.000pg/mL、17668.000pg/m。

上述各溶液还包含BSA 1g/mL，NaN₃2mg/mL。

实施例2

通过以下步骤制备试剂盒2：

采用能够分别结合cTnI的氨基酸区段为26～35和83～93的两株cTnI抗体作为第一抗cTnI抗体，按照上述制备4步骤用ABEI标记，得到标记有ABEI的第一抗cTnI抗体溶液。其中，使第一抗cTnI抗体的总浓度为300ng/mL，ABEI浓度为30pg/mL。

采用分别结合cTnI的氨基酸区段为41～49和169～178的两株cTnI抗体作为第二抗cTnI抗体，按照上述制备5的步骤，制备生物素化的第二抗cTnI抗体溶液。其中，使第二抗cTnI抗体的总浓度为300ng/mL，生物素浓度为30pg/mL。

按照上述制备2制备包被磁性微球的链霉亲和素溶液。其中，使链霉亲和素浓度为10μg/mL，磁性微球浓度为1mg/mL。

按照制备11制备稀释液。

按照步骤12制备低点校准品溶液和高点校准品溶液，浓度分别为34.000pg/mL、17668.000pg/m。

上述各溶液还包含BSA 1g/mL，NaN₃2mg/mL。

实施例3

按照上述制备3制备得到包被有羊抗FITC多克隆抗体的磁性微球悬浮液。

使用实施例1中的第一抗cTnI抗体，按照上述制备4制备得到标记有ABEI的第一抗cTnI抗体溶液。

使用实施例1中的第二抗cTnI抗体，按照上述制备6制备得到第二抗cTnI抗体标记的FITC溶液。

按照上述制备11制备得到稀释液。

按照上述制备12制备得到高低点校准品溶液。

上述制备的各个溶液分别构成本实施例提供的试剂盒3的组分。

实施例4

使用实施例1中的第二抗cTnI抗体，按照上述制备1制备得到包被有第二抗cTnI抗体的磁性微球悬浮液。

使用实施例1中的第一抗cTnI抗体，按照上述制备7制备得到第一抗cTnI抗体标记的链霉亲和素溶液。

按照上述制备9制备得到生物素化的ABEI溶液。

按照上述制备11制备得到稀释液。

按照上述制备12制备得到高低点校准品溶液。

上述制备的各个溶液分别构成本实施例提供的试剂盒4的组分。

实施例5

使用实施例1中的第二抗cTnI抗体，按照上述制备1制备得到包被有第二抗cTnI抗体的磁性微球悬浮液。

使用实施例1中的第一抗cTnI抗体，按照上述制备8制备得到第一抗cTnI抗体标记的羊抗FITC多克隆抗体溶液。

按照上述制备10制备得到FITC标记的ABEI溶液。

按照上述制备11制备得到稀释液。

按照上述制备12制备得到高低点校准品溶液。

上述制备的各个溶液分别构成本实施例提供的试剂盒5的组分。

实施例6

按照上述制备3制备得到包被有羊抗FITC多克隆抗体的磁性微球溶液。

使用实施例2中的第二抗cTnI抗体，按照上述制备6制备得到标记第二抗cTnI抗体的FITC溶液。

使用实施例2中的第一抗cTnI抗体，按照上述制备7制备得到第一抗cTnI抗体标记的链霉亲和素溶液。

按照以上制备9制备得到生物素化的ABEI溶液。

按照上述制备11制备得到稀释液。

按照上述制备12制备得到高低点校准品溶液。

上述制备的各个溶液分别构成本实施例提供的试剂盒6的组分。

实施例7

按照上述制备2制备得到包被有链霉亲和素的磁性微球溶液。

使用实施例2中的第二抗cTnI抗体，按照上述制备5制备得到第二抗cTnI抗体标记的生物素溶液。

使用实施例2中的第一抗cTnI抗体，按照上述制备8制备得到第二抗cTnI抗体标记的羊抗FITC多克隆抗体溶液。

按照以上制备10制备得到FITC标记的ABEI溶液。

按照上述制备11制备得到稀释液。

按照上述制备12制备得到高低点校准品溶液。

上述制备的各个溶液分别构成本实施例提供的试剂盒6的组分。

实施例8

使用上述实施例1制备的试剂盒1和Maglumi 2000化学发光免疫分析仪检测样本中的cTnI浓度。

具体地，按照以下步骤测量样本中的cTnI浓度：

a.将100μL待测样本、高低点校准品加入到反应杯中；

b.加入100μL降低反应非特异性结合的稀释液；

c.加入20μL包被磁性微球的cTnI抗体溶液；

d.加入100μL标记有ABEI的cTnI抗体溶液；

e.37℃温浴35min，置于磁环境下清洗3次；

f.加入200μL系统洗液(深圳市新产业生物医学工程股份有限公司，货号：130299005M)；

g.37℃温浴5min，置于磁环境下清洗3次；

h.加入化学发光激发物(深圳市新产业生物医学工程股份有限公司，货号：130299004M)，检测光信号强度；

i.根据样本检测光强度，参照标准品修正后的十点标准曲线自动计算出待测样本的cTnI浓度。

其中，试剂盒十点标准曲线的绘制：将cTnI标准品，用所配制的稀释液稀释成下列十个浓度：0.000pg/mL、12.000pg/mL、34.000pg/mL、97.000pg/mL、275.000pg/mL、780.000pg/mL、2206.000pg/mL、6243.000pg/mL、17668.000pg/mL、50000.000pg/mL。使用分析仪测定上述十个浓度的标准品溶液的光强度，仪器自动拟合生成试剂盒十点标准曲线。

在试剂盒使用过程中采用十点标准曲线中的第9点(17668.000pg/mL)、第3点(34.000pg/mL)作为试剂盒的高点、低点校准品。试剂盒使用时通过高点、低点校准品校准，仪器自动修正十点标准曲线。

分析灵敏度的检验：

分析灵敏度的测定方法参考美国临床实验室标准化协会(CLSI)颁发的《EP17-A2—检测能力评估指导原则》，以所配制的稀释液(空白样本)作为待测样本，重复测定20次，根据测量结果的均值和标准差计算分析灵敏度(M+2SD)。结果见表1。

功能灵敏度的检验：

功能灵敏度的测定方法也参考美国临床实验室标准化协会(CLSI)颁发的《EP17-A2—检测能力评估指导原则》，取cTnI标准品，以稀释液为溶剂配制5个低浓度样本作为待测样本，在五天之内每天分别重复测量8次，通过每个样本测量平均值和CV％拟合幂函数()；通过幂函数曲线获得CV％＝20％处对应的分析物浓度即为功能灵敏度(FS)。结果见表2。

线性范围的检测：

线性范围的测定方法参考美国临床实验室标准化协会(CLSI)颁发的《EP6-A：定量测量方法的线性评价：一种统计学方法，批准指南》，取cTnI标准品，用稀释液溶解并配制高浓度溶液样本(H)，将稀释液(即空白样本，L)和高浓度溶液样本(H)以不同体积比配制一系列线性溶液，采用实施例1试剂盒对所配制的系列cTnI线性溶液进行检测。检测数据结果见表7。将线性数据与以下实施例9的线性数据做拟合曲线图，结果见图2。

实施例9

检测方法与实施例8大致相同，不同之处仅在于，省去实施例8中的步骤b。

分析灵敏度、功能灵敏度和线性范围测定结果分别见表1、3、6。线性数据与实施例8线性数据的拟合曲线图见图2。

实施例10

使用上述实施例2制备的试剂盒2和Maglumi 2000化学发光免疫分析仪检测样本中的cTnI浓度。

具体地，按照以下步骤测量样本中的cTnI浓度：

a.将100μL待测样本、高低点校准品加入到反应杯中；

b.加入100μL降低反应非特异性结合的稀释液；

c.加入20μL包被磁性微球的链霉亲和素溶液；

d.加入100μL生物素化的cTnI抗体溶液；

e.加入100μL的cTnI单抗或多抗标记的ABEI；

f.37℃温浴35min，置于磁环境下清洗3次；

g.加入200μl系统洗液；

h.37℃温浴5min，置于磁环境下清洗3次；

i.加入发光底物，检测光信号强度；

j.根据样本检测光强度，参照标准品修正后的十点标准曲线自动计算得出待测样本的cTnI浓度。

按照上述步骤测定分析灵敏度、功能灵敏度和线性范围，测定样本与实施例8相同，结果分别见表1、4、7。将线性数据与以下实施例11的线性数据做拟合曲线图，结果见图3。

实施例11

检测方法与实施例10大致相同，不同之处仅在于，省去实施例10中的步骤b。

分析灵敏度、功能灵敏度和线性范围测定结果分别见表1、5、7。线性数据与实施例10线性数据的拟合曲线图见图3。

对比例1

采用南京基蛋生物技术有限公司生产的酶免试剂盒对实施例8中制备的分析灵敏度、功能灵敏度和线性范围的测定样本进行测量，结果见表1、6和9。

表1 分析灵敏度测定结果

分析灵敏度为测试结果的均值加上两倍的标准差，即为M+2SD。

可从检测结果看出，实施例8和10由于加入了降低反应特异性结合的稀释液，其分析灵敏度分别极大地高于未加入稀释液的实施例9、实施例11和对比例1。同时，实施例8的分析灵敏度达到了0.92pg/mL，这对于AMI的临床应用将带来极大的帮助。

表2 实施例8功能灵敏度测定结果

表3 实施例9功能灵敏度测定结果

表4 实施例10功能灵敏度测定结果

表5 实施例11功能灵敏度测定结果

表6 对比例1功能灵敏度测定结果

功能灵敏度是以日间重复CV为20％时对应检测样品具有的浓度。

可从检测结果看出，实施例8和实施例10由于加入降低反应特异性结合的稀释液，其功能灵敏度同样极大地高于相应的未加入稀释液的实施例9、实施例11和对比例1。同时优选的实施例8的功能灵敏度达到了2.28pg/mL，这对临床确诊AMI有极大的帮助。

表7 实施例8和实施例9线性范围测定结果

表8 实施例10和实施例11线性测定结果

表9 对比例1线性测定结果

从表7-9的结果和图2、图3可以看出，0-50000pg/mL的浓度范围内，采用本发明提供的试剂盒对cTnI样本的检测值与理论值之间具有良好的线性关系。加入稀释液对检测线性没有明显影响。但是，综合上述灵敏度检验试验结果可见，稀释液的加入能够在保持良好的线性关系的同时提高检测灵敏度。

综上，根据本发明制备的cTnI化学发光免疫检测试剂盒对线性样本的测量结果均等同于或优于所采用的现有市售酶联免疫试剂盒，但是根据本发明的优选实施方案(例如实施例8和10)，采用本发明制备的cTnI检测试剂盒来测定样本，分析灵敏度和功能灵敏度均显著的优于采用现有市售酶联免疫试剂盒，因而在AMI患者诊断过程中，利用本发明提供的cTnI检测试剂盒能够提供更为准确有效的诊断相关信息。

虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。

Claims (13)

1.一种心肌肌钙蛋白I超敏检测试剂盒，所述试剂盒包括标记有示踪标记物的至少一株第一抗心肌肌钙蛋白I抗体和包被磁性微球的至少一株第二抗心肌肌钙蛋白I抗体，并且所述第一抗心肌肌钙蛋白I抗体与心肌肌钙蛋白I的结合位点相异于第二抗心肌肌钙蛋白I抗体与心肌肌钙蛋白I的结合位点；

所述试剂盒还包括稀释液，所述稀释液包括以下组分：

牛血清白蛋白、新生牛血清、羊血清、马血清、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、水合2-吗啉乙磺酸、乙二醇、丙三醇、吐温-80、酪蛋白和乙二胺四乙酸二钠。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述第一抗心肌肌钙蛋白I抗体与心肌肌钙蛋白I的结合位点为心肌肌钙蛋白I的10-100氨基酸区段；所述第二抗心肌肌钙蛋白I抗体与心肌肌钙蛋白I的结合位点为心肌肌钙蛋白I的40-200氨基酸区段。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两种第一抗心肌肌钙蛋白I抗体，与心肌肌钙蛋白I的结合位点分别为心肌肌钙蛋白I的10-50和60-100氨基酸区段；所述试剂盒包括两种第二抗心肌肌钙蛋白I抗体，与心肌肌钙蛋白I的结合位点分别为心肌肌钙蛋白I的40-80和120-200氨基酸区段。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述示踪标记物为金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶中的至少一株。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述示踪标记物为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球为Fe₂O₃或Fe₃O₄磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，并具有0.1-5μm的粒径；并且，所述磁性微球任选地通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，

所述示踪标记物直接或间接地标记第一抗心肌肌钙蛋白I抗体，并且间接标记的方式包括通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或通过链霉亲和素与生物素体系进行间接标记；

所述第二抗心肌肌钙蛋白I抗体直接或间接地包被磁性微球，并且间接包被磁性微球的方式包括通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或通过链霉亲和素与生物素体系进行间接包被。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括选自A1-A3中的任意一种组分和选自B1-B3中的任意一种组分，其中

A1为标记有示踪标记物的第一抗心肌肌钙蛋白I抗体溶液；

A2为标记有示踪标记物的链霉亲和素溶液和生物素化的第一抗心肌肌钙蛋白I抗体溶液；

A3为标记有示踪标记物的抗异硫氰酸荧光素抗体溶液和标记有的异硫氰酸荧光素的第一抗心肌肌钙蛋白I抗体溶液；

B1为包被磁性微球的第二抗心肌肌钙蛋白I抗体溶液；

B2为包被磁性微球的链霉亲和素溶液和生物素化的第二抗心肌肌钙蛋白I抗体溶液；

B3为包被磁性微球的抗异硫氰酸荧光素抗体溶液和标记有异硫氰酸荧光素的第二抗心肌肌钙蛋白I抗体溶液；

并且，组分A1-A3和组分B1-B3的各溶液分别任选地含有牛血清白蛋白和/或防腐剂。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液各组分的含量如下：

1～10g/L的牛血清白蛋白、1～50体积％的新生牛血清、0.1～10体积％的羊血清、0.1～10体积％的马血清、1～100mmol/L的二硫苏糖醇、1～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、1～100mmol/L的水合2-吗啉乙磺酸、0.1～10体积％的乙二醇、0.1～10体积％的丙三醇、0.01～2体积％的吐温-80、0.1～10g/L的酪蛋白和0.1～10g/L的乙二胺四乙酸二钠。

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括心肌肌钙蛋白I的低点校准品和高点校准品，并任选地包括缓冲液。

11.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒中，第一抗心肌肌钙蛋白I抗体和第二抗心肌肌钙蛋白I抗体的浓度均为1-20μg/mL，示踪标记物的浓度为5-500ng/mL，磁性微球的浓度为0.1-2mg/mL。

12.一种用于制备如权利要求1-11中任意一项所述的试剂盒的方法，所述方法包括：将至少一株第一抗心肌肌钙蛋白I抗体直接或间接标记示踪标记物；将所述至少一株第二抗心肌肌钙蛋白I抗体直接或间接包被磁性微球；

制备稀释液，所述稀释液包括以下组分：

牛血清白蛋白、新生牛血清、羊血清、马血清、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、水合2-吗啉乙磺酸、乙二醇、丙三醇、吐温-80、酪蛋白和乙二胺四乙酸二钠。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，

所述间接标记包括将示踪标记物通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或通过链霉亲和素与生物素体系标记所述第一抗心肌肌钙蛋白I抗体；

所述间接包被包括将所述第二抗心肌肌钙蛋白I抗体通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或通过链霉亲和素与生物素体系间接包被磁性微球。