CN102901820A - 一种人肿瘤标志物糖类抗原50(ca50)的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肿瘤标志物糖类抗原50(CA50)的磁微粒化学发光免疫检测方法,属于免疫检测分析技术领域。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CA50单克隆抗体和碱性磷酸酶(AP)标记的单克隆抗体与抗原结合,形成FITC标记抗体-抗原-AP标记抗体的夹心免疫复合物,类似“三明治”结构。随后加入连有抗FITC抗体的磁性微粒,通过抗FITC抗体与FITC的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁颗粒上,在外加磁场中直接沉淀,不需离心即可将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质分离。本发明试剂盒将化学发光与磁微粒相结合,提供了一种接近均相的反应体系,与现有技术相比,本发明试剂盒具有更高的灵敏度、线性范围宽、快速等诸多优点,并且大大降低了产品成本,在临床检验等方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域,涉及检测血清中肿瘤标志物CA50含量的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其测试方法
背景技术
肿瘤标志物(tumor mark,TM)是指肿瘤细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质,或是宿主对体内寄生物反应而产生并进入到体液或组织中的物质。目前临床上常用的肿瘤标志物大多是非特异性标志物,这些标志物在良性肿瘤和正常组织中也有出现,但在肿瘤发生时,其水平明显提高。由于这类标志物没有肿瘤特异性,因此又称为广谱性肿瘤标志物。
CA50是由Lindbolm等(1983)发现的一种非特异性广谱肿瘤标志物,其在消化道肿瘤和其它系统肿瘤中均有很好的应用价值。CA50是一种以唾液酸脂和唾液酸糖蛋白为主要成分的糖类抗原,广泛存在于胰腺、胆囊、肝、胃、结直肠、膀胱、子宫,正常组织中一般不存在。当细胞恶变时,糖基转化酶的失活或胚胎期才活跃的某些转化酶又被激活,造成细胞表面糖基结构改变从而形成CA50。经研究证实在多种恶性肿瘤患者血中CA50皆有升高,对胰腺癌和胆囊癌的阳性检出率居首位(90%以上),其次为卵巢或子宫颈癌、肝癌、结肠/直肠癌、膀脏癌、胃癌、肺癌。因此,CA50在临床上主要用于对胰腺癌、胆囊癌、肝癌、胃癌及卵巢癌等肿瘤诊断有较高价值,此外还可作为评价肿瘤术后手术效果的指标。
化学发光免疫检测技术于上个世纪80年代,继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术,相对于后两者化学发光免疫技术具有高灵敏度、高特异性,操作简便、快速,标记结合物稳定,同时无放射性同位素损伤和污染等特点,因此近年来在临床检测分析中被广泛推广使用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于提供一种糖类抗原50(CA50)定量测定试剂盒及其检测方法,采用该试剂盒进行CA50检测具有较高的灵敏度和特异性,操作更简便,检测时间更短。
本发明提供了检测CA50化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括:磁微粒试剂;CA50校准品;CA50质控品;CA50抗试剂;清洗浓缩液;发光底物溶液;样本稀释液。
所述的磁微粒试剂为连接羊抗FITC抗体的磁微粒溶液;
所述的校准品及质控品为含有一定量CA50抗原的BSA缓冲液;
所述的抗试剂是由碱性磷酸酶(AP)标记的CA50单克隆抗体及异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CA50单克隆抗体的混合液;
所述的清洗浓缩液是含有Tris、NaCl和表面活性剂等的缓冲液;
所述的发光底物溶液是含Lumigen APS-5发光液的缓冲液;
所述的样本稀释液是含有BSA的溶液。
本发明所提供的检测CA50的样品前处理方法,包括以下步骤:
1、样品前处理
对临床血清,3000rpm离心5分钟,取上层液即可进行分析测定。待测样品2-8℃存放不得超过48小时,若48小时未检测,应于-20℃以下保存,但不应超过30天。
2、实验前准备
实验前需将所有试剂放置至室温;准备好一次性平底试管和磁分离器及温育时用于覆盖磁分离器的塑料膜;调节水浴箱温度为37℃;准备化学发光测定仪,并仔细阅读仪器使用说明书。
3、试剂准备
实验前将试剂盒中各试剂置混匀仪上充分混匀;磁微粒试剂混匀后应为均匀悬浊液,无明显凝集。
4、利用上述检测CA50的化学发光免疫分析试剂盒检测样品。
本发明的检测方法如下:
(1)加样与免疫反应:在每一平底试管中加入30μl CA50校准品(质控品或待测样本);60μl抗试剂,混匀后,37℃温育30分钟;加入30μl 磁微粒试剂,混匀后,37℃温育5分钟;
(2)洗涤:将平底试管在磁分离器上静置2分钟,然后弧线倾倒上清液,将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干;每管中加入300μl清洗液,混匀后,将平底试管在磁分离器上静置2分钟,然后弧线倾倒上清液,将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干;重复两次;
(3)加入发光底物溶液:每个试管加入200μl发光底物;
(4)读取发光值:用化学发光仪测定每管的发光值;
(5)如遇到高值HOOK样本,为了避免出现高值HOOK效应,建议临床医师根据其余指标选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。
本发明具有以下优点:
1、使用磁珠为固相,使免疫反应更接近液相,反应更充分和迅速,而且使结合的免疫复合物更加容易分离,降低了非特异性吸附。
2、使用的抗试剂为单克隆抗体混合物,使免疫反应的亲和力更高,而且单抗的生产批间差异相对小,更容易保证产品的批间稳定。
3、使用化学发光底物溶液,使检测的灵敏度得到了提高,而且线性范围更宽。
4、本方法的建立可以为其他试剂盒的开发提供一种方便、高灵敏度、准确性和稳定性的免疫检测方法。
本发明的主要创新之处在于:
1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合,提供了一种接近均相的反应体系,与现有技术相比,本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性,并达到了较佳的性能参数。
2、试剂盒中的磁微粒试剂、抗试剂、校准品、质控品、清洗浓缩液、发光底物溶液及样本稀释液是该反应体系下的最优配方,给试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
本发明的检测CA50的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒主要采用直接夹心法定量检测人血清等样品中CA50的含量;对样品的前处理要求低,前处理过程简单,能快速、高通量检测大批样品;采用了高特异的单克隆抗体和超顺磁、高分散、比表面积大的磁微粒子,主要试剂以工作液的形式提供,检验方法方便易行,具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒,结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利,与市场上的酶联免疫试剂盒等相比,线性范围宽,有效避免钩状效应,不需样品稀释,适用于大批量样品筛选的定量。
附图说明
图1 为本发明的CA50化学发光免疫检测标准曲线,其中,横坐标为CA50的浓度,纵坐标为相对发光强度(RLU)。
具体实施方式
实施例1
一、磁珠缓冲液配制操作规程:以配制1L为例:
1、根据配制量,选择合适容器,加入700ml的纯水;
2、称取Tris 6.02g,NaN3 0.99g于容器中,混匀,室温搅拌2小时;
3、检测溶液pH,应在10左右;
4、调制pH值为8.0;
5、量取Tween-20 2.76ml ;称取硫酸新霉素 0.99g;四环素 0.03g;BSA 4.97g于容器中,搅拌1小时,调 pH值至 8.0±0.05;
6、定容至1L,调 pH值至8.0±0.05;
7、用0.22um滤器过滤,贮存于4℃。
二、磁微粒试剂的制备过程
将直径为0.1微米的四氧化三铁微球用戊二醛进行活化,室温混匀4小时后,用0.01mol/L PBS pH7.4缓冲液清洗三次,并用该溶液进行悬浮,浓度为50-100mg/ml;然后,每毫升悬液中加入羊抗FITC抗体100μg,于37℃混匀温育3-8小时;用等体积的0.01mol/L PBS 5%BSA pH7.4缓冲液于37℃封闭40分钟;最后,用0.5%BSA 0.02mol/L Tris-HCl pH8.0缓冲液清洗三次,并用上述磁珠缓冲液配制一定浓度的工作液。
实施例2
一、碱性磷酸酶AP与抗CA50单克隆抗体的偶联
抗体为免疫球蛋白,含有氨基(-NH2),使用SMCC活化剂进行活化,生成马来酰亚胺-免疫球蛋白;马来酰亚胺-免疫球蛋白含有可以与-SH基团反应的马来酰亚胺基团,加入含有-SH的碱性磷酸酶,可以将抗体与碱性磷酸酶连接在一起。
二、异硫氰酸荧光素FITC与抗CA50单克隆抗体的偶联
FITC分子与CA50单克隆抗体的偶联物是以常见的碱性液标记法对抗体进行标记。当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时, 蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。一般最多能结合15-20个,一个IgG分子可结合2-8个分子的FITC,其反应式如下FITC-N=C=S + -NH2-蛋白质 → FITC-NS-C-NH2-蛋白质
实施例3
校准品/质控品的配制:
1、最高点:最高浓度点为X,目标点浓度为A,B,C,D,E,F,配制V体积溶液时,需加入原料的体积分别为:表1
浓度 | 加入校准品稀释液体积 | 加入X体积 |
A | V-A*V/X | A*V/X |
B | V-B*V/X | B*V/X |
C | V-C*V/X | C*V/X |
D | V-D*V/X | D*V/X |
E | V-E*V/X | E*V/X |
F | V-F*V/X | F*V/X |
2、糖类抗原50(CA50)测定试剂盒CA50校准品原料(浓度为5000U/ml)用样本稀释液(具体配方见实施例4 )配制成浓度点为0、10、20、40、80、150U/ml;质控品浓度分别为10、80U/ml。
3、完全溶解后,贴好标签于2-8℃保存,有效期为12个月。
实施例4
一、清洗浓缩液配制操作规程:以配制1L为例:
1、根据配制量,选择合适的容器,加入出水700ml,称取Tris 12.11g;NaCl 312.43g;Tween-20 27.74g;Bronidox 1g;Triton X-100 1g;
2、放置18小时,调pH至8.6±0.05;加纯水至1L,过滤。
3、使用时进行15倍稀释。
二、发光底物溶液配制操作规程:以配制1L为例:
1、根据配制量,选择合适的容器,称取Tris 36.36g;Na2SO3 10mg;SDS 1.0g;光泽精 3.27mg;Tween-20 0.31ml调pH至9.35;加纯水至1L,过滤。
2、测试发光值
三、样本稀释液配制操作规程:以配制1L为例:
1、加入500ml纯水于容器中,称取三羟基氨基甲烷6g;NaCl 8.8g;BSA 60g;Proclin 300 1ml,调pH至7.5±0.05。
2、纯水定容至1L,过滤。
实施例5
人肿瘤标志物CA50磁微粒化学发光免疫检测:
操作步骤:
(1)加样与免疫反应:在每一平底试管中加入30μl CA50校准品(质控品或待测样本);60μl抗试剂,混匀后,37℃温育30分钟;加入30μl 磁微粒试剂,混匀后,37℃温育5分钟。
(2)洗涤:将平底试管在磁分离器上静置2分钟,然后弧线倾倒上清液,将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干;每管中加入300μl清洗液,混匀后,将平底试管在磁分离器上静置2分钟,然后弧线倾倒上清液,将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干;重复两次。
(3)加入发光底物溶液:每个试管加入200μl发光底物。
(4)读取发光值:用化学发光仪测定每管的发光值。
检测结果:
检测曲线见图1.
对零标准点进行20次重复测试,取零标准点测定的平均值加上2倍的标准差,即为其灵敏度。本方法的灵敏度为≤1U/ml。
临床试验:
一、检测数据
标本采自1000例正常体检、供血者。样本体检结果均无传染性疾病,半年内无输血和大手术史,妇女不在妊娠期和哺乳期。将测值进行统计学分析,得出正常血清参考范围:<15.0U/ml。与国外知名公司生产的试剂盒相比,本发明试剂盒的检测结果更加精确。
本数据仅供参考,不同地区、不同个体以及采用不同方法进行检测,所测得的CA50水平也会有所不同,建议各实验室建立自己的正常值范围。不可仅凭本方法得出的CA50值作出诊断,仅作为中间数据参考作用,应结合临床其他资料分析结果,包括病人的具体情况和治疗状况。通过其他方法得到的样品中的CA50浓度值与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。超出试剂盒测定范围的样本,系统将无法给出确切的数值。如欲测定其确切的结果,建议稀释后再进行测定。本试剂盒的检测结果仅供临床参考,不能单独作为确诊或排除病例的依据,为达到诊断目的,此检测结果要与临床检查、病史和其它的检查结合使用。本品可用于血清样本的测定,用于其他体液样本中CA50浓度测定的可靠性未得到充分确认。
二、本发明试剂盒性能指标
分析灵敏度定义为:对20次零校准品的测定,取其2倍的平均偏差,其在标准曲线上所对应的浓度即为分析灵敏度;
分析灵敏度:≤1U/ml ;
精密度:批内变异CV%≤10.0%;批间变异CV%≤15.0%;
线性系数:r≥0.9900;
线性范围:0-150 U/ml ;
特异性:测定高浓度的交叉反应物质,结果如下:
潜在交叉反应物 | 检测结果 | 干扰性 |
糖类抗原19-9(CA19-9) 400 U/ml | 0.29U/ml | ≤0.01% |
癌胚抗原(CEA) 1000 ng/ml | 0.4U/ml | ≤0.01% |
糖类抗原15-3(CA15-3)5000 U/ml | 1.47U/ml | ≤0.01% |
甲胎蛋白(AFP)500 ng/ml | 0.01U/ml | ≤0.01% |
糖类抗原125(CA125) 1000 U/ml | 0.25U/ml | ≤0.01% |
Claims (4)
1.一种人肿瘤标志物糖类抗原50即CA50的磁微粒化学发光免疫检测方法,其特征在于:将羊抗FITC抗体与直径为0.1-5微米的磁微粒连接组成固相试剂,经捕捉反应体系中的FITC标记抗体、抗原以及酶标记抗体后形成固相-FITC标记抗体-抗原-酶标记抗体夹心复合物;所述的酶标记抗体中使用的酶是碱性磷酸酶AP;所述的酶标试剂的偶联方法是将N-琥珀酰胺3-(2-吡啶二巯基)丙酸SPDP活化的抗体与Traunt’s试剂活化的碱性磷酸酶以1:0.5-2的比例混合,并用凝胶层析柱分离纯化;所使用的底物溶液为环二氧乙烷类衍生物AMPPD。
2.如权利要求1所述的CA50磁微粒化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括:磁微粒试剂;CA50校准品;CA50质控品;CA50抗试剂;清洗浓缩液;发光底物溶液;样本稀释液;
所述的磁微粒试剂为连接羊抗FITC抗体的磁微粒溶液;
所述的校准品及质控品为含有一定量CA50抗原的BSA缓冲液;
所述的抗试剂是由碱性磷酸酶AP标记的CA50单克隆抗体及异硫氰酸荧光素FITC标记的CA50单克隆抗体的混合液;
所述的清洗浓缩液是含有Tris、NaCl和表面活性剂等的缓冲液;
所述的发光底物溶液是含Lumigen APS-5发光液的缓冲液;
所述的样本稀释液是含有BSA的溶液。
3.如权利要求1-2中任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的使用方法如下:
(1)加样与免疫反应:在每一平底试管中加入30μl CA50校准品、质控品或待测样本;60μl抗试剂,混匀后,37℃温育30分钟;加入30μl 磁微粒试剂,混匀后,37℃温育5分钟;
(2)洗涤:将平底试管在磁分离器上静置2分钟,然后弧线倾倒上清液,将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干;每管中加入300μl清洗液,混匀后,将平底试管在磁分离器上静置2分钟,然后弧线倾倒上清液,将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干;重复两次;
(3)加入发光底物溶液:每个试管加入200μl发光底物;
(4)读取发光值:用化学发光仪测定每管的发光值。
4.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述待测样本为高值HOOK样本时,根据需要使用样本稀释液对样本进行稀释。
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