CN110540961A

CN110540961A - Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法

Info

Publication number: CN110540961A
Application number: CN201910772517.5A
Authority: CN
Inventors: 刘宏民; 郑一超; 范琦琦; 赵丽娟; 李迎迎
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2039-08-21
Also published as: CN110540961B

Abstract

本发明提供一种Annexin V‑FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及提取方法，主要包括以下步骤：(1)表达和纯化Annexin V，制备Annexin V‑FITC，构建Annexin V‑FITC外泌体捕获亲和磁珠；(2)细胞培养上清液分离与浓缩：细胞培养后分离出细胞培养上清液，并经浓缩处理；(3)外泌体提取：将步骤(2)所得细胞培养上清液与外泌体捕获亲和磁珠共孵育，得到亲和磁珠‑外泌体复合物；(4)外泌体洗脱，将得到的亲和磁珠‑外泌体复合物与洗脱液共孵育，收集洗脱液，即为所提取分离的外泌体产物。本发明所述外泌体捕获亲和磁珠可重复使用，提取方便，且提取得到的外泌体纯度高。

Description

Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法

技术领域

本发明属于外泌体提取技术领域，具体涉及Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法。

背景技术

外泌体(Exosomes)是通过细胞内多泡体与细胞膜融合产生的纳米级细胞外膜泡，其直径在30～150nm，密度为1.13～1.19g/mL，含有脂质、蛋白质、mRNA和miRNA等多种生物活性分子，广泛分布在血清、尿液、唾液和其他生物液体中。外泌体作为细胞间通信和遗传物质的重要转移载体，可通过传递其内容物给受体细胞，从而参与多种生理病理过程。

目前细胞外泌体提取方法主要有超速离心法，蔗糖密度梯度离心法，超滤法，高聚物沉淀法以及免疫磁珠捕获法等，然而这些方法各有利弊。超速离心法是目前文献报道中使用最多且有效的提取的外泌体提取的方法，虽然该方法能够得到纯度较高的外泌体，但是其离心步骤繁琐，费时费力，且需要昂贵的设备。蔗糖密度梯度离心法，高聚物沉淀等方法虽然操作简便，耗时短，但是其纯度无法保障，往往含有大量杂蛋白，对细胞外泌体的后续应用及研究造成很大影响。免疫磁珠法虽然提取的外泌体较纯，但这种基于抗体结合的方法会难洗脱，对外泌体造成损伤。

发明内容

本发明针对现有技术中外泌体提取存在的诸多不足之处，提供一种Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法，所述外泌体捕获亲和磁珠可重复使用，提取方便，且提取得到的外泌体纯度高。

本发明采用如下技术方案：

制备Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠的方法，包括以下步骤：

步骤1-1：Annexin V原核表达：将已构建好的带有His标签的pET-28b-Annexin V质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到BL21(DE3)-pET-28b-Annexin V菌株，35-39℃且100-220rpm培养至OD值0.6-0.9，加入IPTG使体系中IPTG的终浓度为0.5-1mM，18-25℃过夜诱导表达；

步骤1-2：蛋白提取：收集诱导表达后的菌体，加入PBS重悬菌体，冰浴条件下超声破碎 0.5-2h，然后进行4℃，12000g离心20-60min，收集上清液，并使用0.45μm水系滤膜进行抽滤，收集滤液备用；

步骤1-3：蛋白纯化：将步骤1-2收集的滤液与Ni-NTA亲和层析柱共孵育，再用不同浓度的咪唑缓冲液洗脱，收集并检测得到含有目的蛋白的洗脱液，使用10KDa超滤管进行浓缩，即得Annexin V浓缩液；

步骤1-4：将Annexin V浓缩液加入3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，在50-120mM 的NaHCO₃溶液或50-120mM的Na₂HPO₃溶液中搅拌，2-15℃过夜透析，得到Annexin V透析液；

步骤1-5：将步骤1-4得到的Annexin V透析液稀释为0.5-5mg/mL，并将稀释后的Annexin V透析液与0.5-5mg/mL的FITC溶液按照100-150：1的体积比混匀，2-15℃且30-100rpm 旋转孵育2-10h得到混合液；

步骤1-6：将步骤1-5得到的混合液加入到3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，并在PBS 缓冲液中2-15℃过夜搅拌透析；

步骤1-7：收集步骤1-6透析后得到的Annexin V-FITC溶液，使用AKTA蛋白纯化仪，连接Mono Q离子交换柱进行纯化，首先使用Binding buffer(30-100mM HEPES，pH＝9.0)平衡柱子，在上样后，使用Elution buffer(30-100mM HEPES，200-1000mM NaCl，pH＝9.0)进行梯度洗脱，并对洗脱液进行收集，得到Annexin V-FITC复合物；

步骤1-8：亲和磁珠制备：将抗FITC抗体磁珠与步骤1-7得到的Annexin V-FITC复合物混合，2-15℃且30-100rpm旋转孵育2-10h，即得到外泌体捕获亲和磁珠。

进一步地，所述抗FITC抗体磁珠为超顺磁四氧化三铁磁珠。

采用上述方法制备得到的Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠。

利用所述Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠提取外泌体的方法，包括以下步骤：

步骤3-1：外泌体提取：于生物体液中加入外泌体结合增强剂和所述外泌体捕获亲和磁珠，混合均匀后，旋转孵育2-10h；

步骤3-2：清洗：将步骤3-1旋转孵育后的混合液通过磁力吸附其中的亲和磁珠，弃上清液，然后再将亲和磁珠分散于洗涤缓冲液内混匀，再次通过磁力吸附其中的亲和磁珠，弃上清液，由此得到清洗后的亲和磁珠-外泌体复合物；

步骤3-3：外泌体洗脱：于步骤3-2所得亲和磁珠-外泌体复合物中加入洗脱缓冲液，孵育 5-25min后，通过磁力吸附其中的亲和磁珠，收集上清液，该上清液即为所提取分离的外泌体产物。

进一步地，当所述生物体液采用细胞培养上清液时，所述细胞培养上清液通过以下方法处理得到：

步骤2-1：细胞培养：细胞培养48h后换成无血清培养基，继续培养36h后收集上清液，记为细胞培养液；

步骤2-2：低速离心：将步骤2-1中收集的细胞培养液进行4℃，4000g离心20-60min，收集上清液，记为一次上清液；

步骤2-3：高速离心：将步骤2-2中收集的一次上清液进行4℃，10000g离心20-60min，收集上清液，记为二次上清液；

步骤2-4：超滤液制备：将步骤2-3中收集的二次上清液采用100KDa超滤管进行超滤处理，超滤后得到所述细胞培养上清液，用于外泌体提取；其中，二次上清液进行超滤浓缩，例如10-50倍，能够提高步骤3-1中外泌体的提取效率。

优选地，步骤3-1中，所述外泌体结合增强剂为CaSO₄浓度为2mM-150mM的CaSO₄水溶液。

优选地，步骤3-2中，所述洗涤缓冲液为含有如下浓度的组分的水溶液：2mM-150mMCaSO₄，10-100mM NaH₂PO₄和50-500mM NaCl，且所述洗涤缓冲液中还含有重量百分比为0.01-0.1％的吐温20。

优选地，步骤3-3中，所述洗脱缓冲液为含有如下浓度的组分的水溶液：2mM-150mMEDTA，10-100mM NaH₂PO₄和50-500mM NaCl；其中，所用洗脱缓冲液的体积可根据细胞培养上清液的体积进行调整。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的外泌体捕获亲和磁珠及外泌体提取方法适用于细胞培养上清液，血浆等生物体液。本发明的原理在于利用外泌体的PS(磷脂酰丝氨酸)与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS，由此获得的外泌体形态完整，纯度高。而且，由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，有利于外泌体的后续应用。此外，本发明在提取分离外泌体时不需要使用昂贵的设备，所制备的外泌体捕获亲和磁珠也可重复使用，省时省力，经济方便。

附图说明

图1为Annexin V蛋白纯化SDS-PAGE凝胶电泳图；

图2为Annexin V-FITC纯化图；

图3为Annexin V-FITC纯化结果对应的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图4为细胞外泌体的NTA检测图；

图5为细胞外泌体的电镜检测图；

图6为细胞外泌体的western blot结果。

具体实施方式

为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明。

实施例1

Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠的制备方法如下：

步骤1-1：Annexin V原核表达：将已构建好的带有His标签的pET-28b-Annexin V质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到BL21(DE3)-pET-28b-Annexin V菌株(此处采用常规技术手段即可，不是本发明的重点，不再赘述)，37℃200rpm培养至OD值0.6-0.9，加入IPTG(即异丙基硫代半乳糖苷)至上述培养后的体系中IPTG的终浓度为0.5-1mM，20℃过夜诱导表达；

步骤1-2：蛋白提取：收集诱导表达后的菌体，加入PBS重悬菌体；冰浴条件下超声破碎0.5-2h，使用低温离心机进行4℃，12000g离心30min，收集上清液，并使用0.45μm水系滤膜进行抽滤，收集滤液备用；

步骤1-3：蛋白纯化：将步骤1-2收集的滤液与Ni-NTA亲和层析柱共孵育，收集流穿，再分别用2.5mM(1-3管)，10mM(4-8管)，100mM(9-12，14-18管)，250mM(19-22 管)的咪唑缓冲液洗脱，收集每一管洗脱液，并从各管中取少量进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，收集含有目的蛋白的对应管的洗脱液(9-12，14-19管)，并使用10KDa超滤管进行浓缩，即得AnnexinV浓缩液；

根据SDS-PAGE凝胶电泳检测，Annexin V蛋白纯化结果如图1所示，Annexin V蛋白分子量大约为35～36KDa，目的蛋白在9～12，14～19泳道对应的样品中。

步骤1-4：将Annexin V浓缩液加入到5kDa分子量截留的透析袋中，在60mM NaHCO₃溶液(pH＝9.0)中温和搅拌，4℃过夜透析；

步骤1-5：将步骤1-4透析后得到的Annexin V溶液稀释为2mg/mL，并与浓度为4mg/mL 的FITC溶液按100：1的比例混匀，4℃，50rpm旋转孵育10h；得到混合液；

步骤1-6：将步骤1-5得到的混合液注射到5KDa分子量截留的透析袋中，并在1LPBS 溶液(pH＝7.4)中温和搅拌，4℃过夜透析；

步骤1-7：收集步骤1-6透析后的溶液，使用AKTA蛋白纯化仪，连接Mono Q离子交换柱进行纯化，首先使用结合缓冲液Binding buffer(50mM HEPES，pH＝9.0)平衡柱子，在上样后，使用洗脱缓冲液Elution buffer(50mM HEPES，500mM NaCl，pH＝9.0)进行梯度洗脱(梯度为Elution buffer％：0-50，0-15min；50-85，15-35min；85-100，35-40min)，并对洗脱液进行收集，得到Annexin V-FITC复合物；

Annexin V-FITC复合物的纯化结果如图2和3所示，图2为蛋白纯化图，横坐标为洗脱液的体积，纵坐标为紫外值，横坐标上面的红色字体为收集洗脱液对应的EP管号码。图3为SDS-PAGE凝胶电泳图，泳道2为未纯化前的Annexin V-FITC，泳道3-7分别对应图2中纯化时第10，11，12，13，15管的收集液，即为得到的Annexin V-FITC复合物。

步骤1-8：亲和磁珠制备：将抗FITC抗体磁珠(FITC为异硫氰酸荧光素，抗FITC抗体磁珠购买自百迈格生物科技有限公司)与步骤1-7纯化后的Annexin V-FITC复合物混合，置于旋转仪上孵育3h，Annexin V-FITC复合物可与抗FITC抗体磁珠上的抗FITC抗体结合，从而得到Annexin V-FITC亲和磁珠，即为外泌体捕获亲和磁珠；

本实施例中，所述抗FITC抗体磁珠为超顺磁四氧化三铁磁珠，可通过磁力架将其吸附在EP管壁上，以实现溶液与磁珠分离。

实施例2

一种细胞外泌体提取分离的方法，包括以下操作步骤：

步骤(1)：表达和纯化Annexin V，制备Annexin V-FITC，构建Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠，本实施例中，步骤(1)采用实施例1的操作得到外泌体捕获亲和磁珠；

步骤(2)：细胞培养上清液分离与浓缩，优选采用以下方式：

步骤2-1：细胞培养：胃癌细胞MGC 803培养48h后换成无血清培养基，继续培养36h后收集上清液，记为细胞培养液；

步骤2-2：低速离心：将步骤2-1中收获的细胞培养液使用低温离心机进行4℃，4000g 离心30min，离心完毕后将离心管内上清液(记为一次上清液)转移至新管备用，沉淀丢弃，此处产生的沉淀包括细胞培养基内的死细胞以及大的细胞碎片成分；

步骤2-3：高速离心：将步骤2-2中收获的一次上清液使用低温离心机进行4℃，10000g 离心30min，离心完毕后将离心管内上清液(记为二次上清液)转移至新管备用，沉淀丢弃，此处产生的沉淀包括大的细胞外囊泡；

步骤2-4：超滤液制备：将步骤2-3中收获的二次上清液用100KDa超滤管超滤浓缩至原体积的二十分之一到三十分之一，超滤后得到所述细胞培养上清液，用于外泌体提取；

步骤(3)：外泌体提取，将步骤(2)所得细胞培养上清液浓缩液与外泌体捕获亲和磁珠共孵育，得到亲和磁珠-外泌体复合物，具体操作过程如下：

步骤3-1：外泌体提取：将步骤2-4得到的所述细胞培养上清浓缩液中加入CaSO₄溶液(50 ×)使体系中CaSO₄的终浓度为100mM，并与步骤1-8制备的外泌体捕获亲和磁珠混合均匀后，置于旋转仪上4℃，50rpm旋转孵育2h；

外泌体提取的原理为：所述外泌体捕获亲和磁珠上的Annexin V可与外泌体上的PS以 Ca²⁺依赖的方式特异性结合，本实施例中，通过加入CaSO₄外泌体结合增强剂，使外泌体与亲和磁珠的结合效率更高；

步骤3-2：清洗：将步骤3-1旋转孵育后的混合液置于磁力架上1min，弃上清，在剩余的亲和磁珠-外泌体复合物中加入洗涤缓冲液混匀得到混合液，再将该混合液置于磁力架上 1min，弃上清，得到洗涤后的亲和磁珠-外泌体复合物；

本实施例中，所述洗涤缓冲液为含有如下浓度的组分的水溶液：100mM CaSO₄，50mM NaH₂PO₄和150mM NaCl，且所述洗涤缓冲液中还含有重量百分比为0.05％的吐温20，配制时用0.22μm滤膜过滤，使其不含有不溶颗粒；该洗涤缓冲液既可以发挥洗涤去除杂质的作用，又能同时保证在洗涤时外泌体不被洗脱下来；

步骤(4)：外泌体洗脱，在步骤3-2洗涤后得到的亲和磁珠-外泌体复合物中加入50-500μL 洗脱缓冲液，室温孵育5min后，置于磁力架上1min，吸取上清，即为所提取分离的外泌体产物，所得外泌体放置于-80℃冰箱内长期保存。

本实施例中，所述洗脱缓冲液为含有如下浓度的组分的水溶液：2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM NaH₂PO₄和150mM NaCl，配制时用0.22μm滤膜过滤，使其不含有不溶颗粒，EDTA能与Ca²⁺结合，使外泌体从Annexin V上解离下来，所得洗脱液即为所提取分离的外泌体产物。

细胞外泌体的鉴定：

(1)细胞外泌体的NTA检测：

图4为细胞外泌体的NTA检测图。由图中检测结果所示，实施例2所提取的外泌体的平均粒径为132.5nm，符合外泌体的粒径范围(30～150nm)。

(2)细胞外泌体的电镜检测：

图5为细胞外泌体的电镜检测图，由图中检测结果所示，外泌体形态为纳米级囊泡，符合外泌体的形态要求。

(3)细胞外泌体的western blot检测：

图6为细胞外泌体的western blot结果，据文献报道，CD9，CD63为外泌体的标志蛋白， Alix在外泌体中高度富集，由图中检测结果所示，本发明所提取的外泌体中，这三种蛋白均高表达。

因此，本发明所制备的外泌体捕获亲和磁珠能够有效提取外泌体，纯度高，且所采用的提取方法不会对外泌体造成损伤，所提取的外泌体形态完整，活性高，有利于外泌体的后续应用。

最后所应说明的是：上述实施例仅用于说明而非限制本发明的技术方案，任何对本发明进行的等同替换及不脱离本发明精神和范围的修改或局部替换，其均应涵盖在本发明权利要求保护的范围之内。

Claims

1.制备Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1-2：蛋白提取：收集诱导表达后的菌体，加入PBS重悬菌体，冰浴条件下超声破碎0.5-2h，然后进行4℃，12000g离心20-60min，收集上清液，并使用0.45μm水系滤膜进行抽滤，收集滤液备用；

步骤1-4：将Annexin V浓缩液加入3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，在50-120mM的NaHCO₃溶液或50-120mM的Na₂HPO₃溶液中搅拌，2-15℃过夜透析，得到Annexin V透析液；

步骤1-5：将步骤1-4得到的Annexin V透析液稀释为0.5-5mg/mL，并将稀释后的Annexin V透析液与0.5-5mg/mL的FITC溶液按照100-150：1的体积比混匀，2-15℃且30-100rpm旋转孵育2-10h得到混合液；

步骤1-6：将步骤1-5得到的混合液加入到3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，并在PBS缓冲液中2-15℃过夜搅拌透析；

步骤1-7：收集步骤1-6透析后得到的Annexin V-FITC溶液，使用Mono Q离子交换柱进行纯化得到Annexin V-FITC复合物；

2.根据权利要求1所述的制备Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠的方法，其特征在于，所述抗FITC抗体磁珠为超顺磁四氧化三铁磁珠。

3.采用权利要求1或2的方法制备得到的Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠。

4.利用权利要求3所述Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠提取外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤3-3：外泌体洗脱：于步骤3-2所得亲和磁珠-外泌体复合物中加入洗脱缓冲液，孵育5-25min后，通过磁力吸附其中的亲和磁珠，收集上清液，该上清液即为所提取分离的外泌体产物。

5.根据权利要求4所述利用所述Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠提取外泌体的方法，其特征在于，当所述生物体液采用细胞培养上清液时，所述细胞培养上清液通过以下方法处理得到：

步骤2-4：超滤液制备：将步骤2-3中收集的二次上清液采用100KDa超滤管进行超滤处理，超滤后得到所述细胞培养上清液，用于外泌体提取。

6.根据权利要求4或5所述利用所述Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠提取外泌体的方法，其特征在于，步骤3-1中，所述外泌体结合增强剂为CaSO₄浓度为2mM-150mM的CaSO₄水溶液。

7.根据权利要求4或5所述利用所述Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠提取外泌体的方法，其特征在于，步骤3-2中，所述洗涤缓冲液为含有如下浓度的组分的水溶液：

2mM-150mM CaSO₄，10-100mM NaH₂PO₄和50-500mM NaCl，且所述洗涤缓冲液中还含有重量百分比为0.01-0.1％的吐温20。

8.根据权利要求4或5所述利用所述Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠提取外泌体的方法，其特征在于，步骤3-3中，所述洗脱缓冲液为含有如下浓度的组分的水溶液：

2mM-150mM EDTA，10-100mM NaH₂PO₄和50-500mM NaCl。