CN113388575A - 一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：S1：将间充质干细胞接种到扩增培养基进行培养；S2：收集间充质干细胞培养基，离心去除细胞碎片，过滤去除大颗粒，得到间充质干细胞培养上清；S3：用切向流超滤膜浓缩间充质干细胞培养上清，得到外泌体浓缩液；S4：对外泌体浓缩液进行过柱处理，去除杂蛋白，得到外泌体悬液；S5：将所得外泌体悬液中加入透明质酸钠制成间充质干细胞外泌体制剂。该皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体的制备方法，本发明优选人胚胎干细胞源间充质干细胞作为外泌体的来源，来源更稳定，功能更强大，能够有效控制损伤皮肤真皮层的炎性浸润。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法。
背景技术
外泌体是细胞分泌的纳米级微小囊泡，直径约为30-150nm，具有脂质双层膜结构，作为一种活细胞分泌的亚细胞成分，外泌体广泛参与细胞之间的交流，并可以作为干细胞的旁分泌因子来发挥生物学效应。外泌体包含丰富的蛋白质、RNA及DNA等生物活性物质。干细胞外泌体与干细胞具有相似的生物学性能，但更加安全稳定高效，具有更强而复杂的信号分子转运和调控能力，为无细胞移植治疗的情况下实现组织再生、组织修复提供了新策略、新方法。
皮肤是人体第一大器官，作为人体的保护屏障，具有防护外来机械损伤、防止病原微生物和化学性物质入侵机体的重要作用。皮肤损伤有外力导致的机械损伤和病理损伤，例如：日常生活中皮肤损伤，糖尿病患者并发症导致的慢性难愈合病理损伤。研究表明，在皮肤损伤修复过程中抑制炎症是促进皮肤损伤修复愈合的关键。炎症是指先天免疫系统被激活，入侵的病原体攻击皮肤组织产生的反应。
目前相关研究报道表明，在治疗皮肤损伤修复中的外泌体，主要来源于脐带、骨髓、脂肪间充质干细胞，在细胞培养过程中质量不易控制，而胚胎干细胞来源的间充质干细胞外泌体拥有更高的生物活性和批次一致性，质量稳定，更适合大规模生产。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体的制备方法，解决了上述背景技术中提出的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：将间充质干细胞接种到扩增培养基进行培养；
S2：收集间充质干细胞培养基，离心去除细胞碎片，过滤去除大颗粒，得到间充质干细胞培养上清；
S3：用切向流超滤膜浓缩间充质干细胞培养上清，得到外泌体浓缩液；
S4：对外泌体浓缩液进行过柱处理，去除杂蛋白，得到外泌体悬液；
S5：将所得外泌体悬液中加入透明质酸钠制成间充质干细胞外泌体制剂。
优选的，所述S1对间充质干细胞进行培养时，采用无血清培养基。
优选的，所述S2步骤中在细胞培养上清浓缩过程中，先后使用0.45μm 和0.22μm滤膜过滤，得到浓缩液。
优选的，所述S3步骤中超滤膜截留物质分子量大于5KD，上清液浓缩倍数为20倍。
优选的，所述S4步骤中使用的外泌体分离柱为35nm+色谱柱，能过滤35 nm以下的杂蛋白。
优选的，所述S5步骤中透明质酸钠的浓度为1％-5％。
本发明提供了一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体的制备方法，具备以下优点：
1、该皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，本发明优选人胚胎干细胞源间充质干细胞作为外泌体的来源，相比成体组织干细胞外泌体来源更稳定，功能更强大，能够显著促进皮肤损伤修复；
2、该皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，本发明采用无血清培养基培养间充质干细胞，安全可靠，不会像传统的血清培养法可能会引起免疫排斥反应；
3、该皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，本发明采用沉淀法分离纯化间充质干细胞外泌体，纯化效率高，适合大规模生产；
4、本发明所制备得到的间充质干细胞外泌体的整个过程均在洁净实验室进行，可以作为皮下使用，用于水光针，滚针等。
附图说明
图1为间充质干细胞外泌体的透射电镜图；
图2为间充质干细胞外泌体的粒径分布图；
图3为间充质干细胞外泌体的特异性标记蛋白表达情况；
图4为间充质干细胞外泌体制剂对八马小香猪皮肤损伤的对照图；
图5为间充质干细胞外泌体制剂对八马小香猪皮肤损伤的治疗效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
本发明提供一种技术方案：一种皮肤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.间充质干细胞的培养：用无血清培养基重悬细胞，根据活细胞数目按 10^4cells/cm2细胞密度接种到细胞培养瓶中，补加无血清培养基至 0.15-0.2ml/cm2，混匀后放入细胞培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养，待细胞融合至80％时，收集细胞上清,冻于-80℃备用。
2.细胞培养上清预处理：取间充质干细胞培养上清(新鲜或者－80℃复温)，3000g离心15min去除死细胞和碎片。
3.过滤除大颗粒：先后使用0.45μm和0.22μm水系膜过滤第2步上清，收集过滤后的细胞上清。
4.切向流超滤浓缩细胞上清：将离心后的上清液用vivaflow 200切向流膜包超滤浓缩20倍，使用截留分子量大于5KD的超滤膜。
1)将进液/回流管路放入第3步准备的细胞上清中，滤出管路放入1L废液瓶中，开启蠕动泵并调速至压力指示2.5bar，持续循环与浓缩至浓缩液剩约10～15ml；
2)降低循环速度至20-40ml/min并持续循环系统1-2min以增加样品回收率。
3)取出进液管，将系统中剩余的样品泵到样品瓶，进液管加约10ml DPBS 清洗并泵入样品瓶。
5. 0.22μm膜过滤：使用millipore 0.22μm过滤器过滤外泌体浓缩液。
6.过柱除杂蛋白：先用70ml DPBS冲洗qEV分离柱，待冲洗液流完，立即加入10ml外泌体悬液，至下部不再滴液体时立即加10ml DPBS至下部不再滴液体，滴出的20ml液体弃置；下部放外泌体收集瓶，上部加入20mlDPBS，收取20ml外泌体至不再流出。换废液收集瓶，加入120ml的DPBS冲洗柱子，再次上样第5步的外泌体浓缩液，相同方法收集。
7.合并收集的外泌体悬液，加入1/20体积DPBS，用0.22μm的滤膜再过滤一遍,得到外泌体悬液，分装保存至-80℃。
8.向外泌体悬液中加入1％-5％透明质酸钠，即制成人间充质干细胞外泌体制剂。
实施例二
根据所得到的一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体，设置了鉴定的方案，包括以下步骤：
1.透射电镜(TEM)观察外泌体形态：将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上，将20μL样本滴加到铜网上，室温静置3分钟后，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加3％磷钨酸溶液30μL对样本进行负染(室温，5分钟)。用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态，见图1。
2.纳米粒子分析系统(iZon qNano,New Zealand)检测外泌体的粒径和浓度：按照操作说明书调节仪器各项参数，将Nanopore(NP100)安装到加样孔下方，调节Stretch至43cm，向加样孔内加入40μL PBS，使电流稳定在100-120nA 范围内。吸去PBS，加入40μL 1：100稀释的CPC100标准品(粒径70nm)，测量粒子数和浓度，通过软件得到标准曲线。吸去标准品，PBS洗3次，加入 40μL 1:1000稀释的待测样品，测定粒子数和浓度，重复测量3次。通过软件进行数据分析，得出分析报告。结果显示粒径范围为50-150nm，见图2。
3.western blot检测外泌体特异性表面标志物CD9、CD63和HSP70的表达：提取外泌体总蛋白，通过BCA蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度，制胶配制10％的分离胶，电泳，转膜，封闭及抗体孵育，化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物CD9、CD63 和HSP70。见图3。
按照实施例1制备的干细胞外泌体制剂，在实施例2完成观测鉴定并标注合格后，进行间充质干细胞外泌体制剂对猪皮肤损伤治疗对照试验，其具体步骤如下：
1)猪皮肤损伤模型的建立
取品种、年龄、及生长状况相同的健康巴马小香猪6只，随机分成两组，每组3个重复。猪麻醉后进行局部脱毛、消毒、铺巾，无菌操作下在猪背部做40mm*2mm的表皮全层缺损模型，同时在创面内进行防挛缩固定。
2)间充质干细胞外泌体制剂的局部外敷治疗
伤口模型建立后，随即在伤口外敷治疗制剂，治疗组外敷间充质干细胞制剂混合止血材料护固莱士，对照组仅外敷护固莱士，将实验猪移出手术室，观察是否出现异常，直至其完全清醒。
3)伤口评估及治疗效果评价
治疗后每天观察伤口情况，于第14天取下皮肤创面组织固定后制作组织切片，观察伤口愈合情况。
结果显示：如图4所示，2周后对照组组织修复不明显，真皮层的炎性浸润明显，正常角质层形成水平较差。实验两组的炎性浸润均有效控制，真皮层结构完整，同时角质层均有一定水平修复。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种用于皮肤损伤修复的含间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将间充质干细胞接种到扩增培养基进行培养；
S2：收集间充质干细胞培养基，离心去除细胞碎片，过滤去除大颗粒，得到间充质干细胞培养上清；
S3：用切向流超滤浓缩间充质干细胞培养上清，得到外泌体浓缩液；
S4：对外泌体浓缩液进行过柱处理，去除杂蛋白，得到外泌体悬液；
S5：将所得外泌体悬液中加入透明质酸钠制成间充质干细胞外泌体制剂。
2.根据权利要求1所述的一种皮肤损伤修复用的间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述S1对间充质干细胞进行培养时，采用无血清细胞培养基。
3.根据权利要求1所述的一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述S2步骤中在细胞培养上清浓缩过程中，先后使用0.45μm和0.22μm滤膜过滤；
4.根据权利要求1所述的一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述S3步骤中超滤膜截留物质分子量大于5KD，上清液浓缩倍数为20倍；
5.根据权利要求1所述的一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述S4步骤中使用的外泌体分离柱为35nm+色谱柱，能过滤35nm以下的杂蛋白；
6.根据权利要求1所述的一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述S5步骤中透明质酸钠的浓度为1％-5％。
7.一种鉴定权利要求1的方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)透射电镜观察外泌体形态：将载样铜网固定在支架上，将样本滴加到铜网上室温静置，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加磷钨酸溶液对样本进行负染，用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态。
(2)纳米粒子分析系统检测外泌体的粒径和浓度；
(3)western blot检测外泌体特异性表面标志物CD9、CD63和HSP70的表达：提取外泌体总蛋白，经化学发光成像分析仪观察条带显影情况。
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