CN113403261A - 一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，涉及生物技术领域，包括以下步骤：S1：将胚胎干细胞接种到扩增培养基进行培养；S2：收集胚胎干细胞培养基，离心去除细胞碎片，过滤去除大颗粒，得到胚胎干细胞培养上清；S3：用切向流超滤膜浓缩胚胎干细胞培养上清，得到外泌体浓缩液；S4：对外泌体浓缩液进行过柱处理，去除杂蛋白，得到外泌体悬液。该皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，本发明优选人胚胎干细胞作为外泌体的来源。胚胎干细胞的外泌体比成体组织干细胞外泌体来源更稳定，功能更强大，能够调控体内干细胞的生长和增殖，促进皮肤内的成纤维细胞等分泌更多的胶原蛋白，这些生物效应具有传统化妆品不可比拟的优势。

Description

一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法。
背景技术
外泌体是细胞分泌的纳米级微小囊泡，直径约为30-150nm，具有脂质双层膜结构，负责细胞间的物质运输和信息传递。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs)具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，可分化成三胚层的任意细胞，具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成。ESCs的外泌体内含与多能性相关的因子、转录因子、mRNA、microRNA等，表现出比成体组织干细胞外泌体更强大的功能，可以抑制细胞衰老过程，改变靶细胞表观遗传特征，使效应细胞逆转至低分化状态，起到与组织干细胞类似的作用，如修复血管、抑制炎症、促进组织干细胞增殖分化等功能，在损伤修复以及组织再生中发挥着重要作用。
市场上大多数美容制剂的活性成分单一，个体针对性不强，产品效果不佳，且产品同质化严重等问题。而胚胎干细胞外泌体可提供细胞生长和分化所需要的各种营养和物质信息，可快速激活人体的修护系统，根据不同肌肤问题进行智能修护。目前在针对皮肤修复的外泌体，主要来源于脐带、骨髓、脂肪间充质干细胞，在细胞培养过程中质量不易控制，而胚胎干细胞外泌体拥有更高的生物活性和批次一致性，质量稳定，更适合大规模生产。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，解决了上述背景技术中提出的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
S1：将胚胎干细胞接种到扩增培养基进行培养；
S2：收集胚胎干细胞培养基，离心去除细胞碎片，过滤去除大颗粒，得到胚胎干细胞培养上清；
S3：用切向流超滤膜浓缩胚胎干细胞培养上清，得到外泌体浓缩液；
S4：对外泌体浓缩液进行过柱处理，去除杂蛋白，得到外泌体悬液。
优选的，所述S1对胚胎干细胞进行培养时，采用基质胶包被细胞培养板。
优选的，所述S2步骤中收集稳定培养2天的干细胞培养上清进行提取，在细胞培养上清浓缩过程中，先后使用0.45μm和0.22μm滤膜过滤，得到浓缩液。
优选的，所述S3步骤中超滤膜截留物质分子量大于5KD，上清液浓缩倍数为10-20倍。
优选的，所述S4步骤中使用的外泌体分离柱为35nm以上的色谱柱，能过滤35nm以下的杂蛋白。
一种上述皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的应用方法，包括以下步骤：
S01：对受试者的皮肤进行皮肤检测，得到受试者的皮肤数据报告；
S02：受试者使用胚胎干细胞外泌体配合基础水光针进行皮肤真皮层注射；
S03：14天后进行皮肤测试，得到受试者的皮肤数据报告，比较使用前后皮肤状态。
本发明提供了一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，具备以下优点：
1、该皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，本发明优选人胚胎干细胞作为外泌体的来源，相比成体组织干细胞外泌体来源更稳定，功能更强大，能够显著缓解的皮肤的老化；
2、该皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，本发明采用无血清培养基培养胚胎干细胞，安全可靠，不会像传统的血清培养法可能会引起免疫排斥反应；
3、该皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，本发明采用沉淀法分离纯化胚胎干细胞外泌体，纯化效率高，适合大规模生产；
4、本发明所制备得到的胚胎干细胞外泌体可用于化妆品原料，根据不同化妆品的需求，与其进行配伍后生产精华液、润肤膏等各种化妆品；
5、本发明所制备得到的胚胎干细胞外泌体的整个过程均在洁净实验室进行，可以作为皮下使用，用于水光针，滚针等。
附图说明
图1为胚胎干细胞外泌体的透射电镜图；
图2为胚胎干细胞外泌体的粒径分布图；
图3为胚胎干细胞外泌体的特异性标记蛋白表达情况；
图4为本发明10人次使用胚胎干细胞外泌体前后的面部皮肤改善情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
本发明提供一种技术方案：一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
1.胚胎干细胞的培养：在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶，将胚胎干细胞移入该培养皿，加入无血清培养基，在温箱内(37℃，5％CO 2，饱和湿度)培养，收集每天更换的培养基上清。
2.细胞培养上清预处理：取胚胎干细胞培养上清(新鲜或者－20℃复温)，3000g离心15min去除死细胞和碎片。
3.过滤除大颗粒：先后使用0.45μm和0.22μm水系膜过滤第3步上清，收集过滤后的细胞上清。
4.切向流超滤浓缩细胞上清：
1)将进液/回流管路放入第3步准备的细胞上清中，滤出管路放入1L废液瓶中，开启蠕动泵并调速至压力指示2.5bar，持续循环与浓缩至浓缩液剩约10～15ml；
2)降低循环速度至20-40ml/min并持续循环系统1-2min以增加样品回收率。
3)取出进液管，将系统中剩余的样品泵到样品瓶，进液管加约10ml DPBS清洗并泵入样品瓶。
5.0.22μm膜过滤：使用millipore 0.22μm过滤器过滤外泌体浓缩液。
6.过柱除杂蛋白：先用70ml DPBS冲洗qEV分离柱，待冲洗液流完，立即加入10ml外泌体悬液，至下部不再滴液体时立即加10ml DPBS至下部不再滴液体，滴出的20ml液体弃置；下部放外泌体收集瓶，上部加入20mlDPBS，收取20ml外泌体至不再流出。换废液收集瓶，加入120ml的DPBS冲洗柱子，再次上样第5步的外泌体浓缩液，相同方法收集。
7.合并收集的外泌体悬液，加入1/20体积DPBS，用0.22μm的滤膜再过滤一遍,得到外泌体悬液，分装保存至-80℃。
实施例二
本发明提供一种技术方案：一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的鉴定方法，包括以下步骤：
1.透射电镜(TEM)观察外泌体形态：将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上，将20μL样本滴加到铜网上，室温静置3分钟后，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加3％磷钨酸溶液30μL对样本进行负染(室温，5分钟)。用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态，见图1。
2.纳米粒子分析系统(iZon qNano,New Zealand)检测外泌体的粒径和浓度：按照操作说明书调节仪器各项参数，将Nanopore(NP100)安装到加样孔下方，调节Stretch至43cm，向加样孔内加入40μL PBS，使电流稳定在100-120nA范围内。吸去PBS，加入40μL 1：100稀释的CPC100标准品(粒径70nm)，测量粒子数和浓度，通过软件得到标准曲线。吸去标准品，PBS洗3次，加入40μL 1:1000稀释的待测样品，测定粒子数和浓度，重复测量3次。通过软件进行数据分析，得出分析报告。结果显示粒径范围为50-150nm，见图2。
3.western blot检测外泌体特异性表面标志物CD9、CD63和HSP70的表达：提取外泌体总蛋白，通过BCA蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度，制胶配制10％的分离胶，电泳，转膜，封闭及抗体孵育，化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物CD9、CD63和HSP70。见图3。
实施例三
请参阅图4，一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的应用方法，包括以下步骤：
S01：对受试者的皮肤进行皮肤检测，得到受试者的皮肤数据报告；
S02：受试者使用胚胎干细胞外泌体配合基础水光针进行皮肤真皮层注射；
S03：注射14天后再次进行皮肤测试，得到受试者的皮肤数据报告，比较使用前后皮肤状态。
本领域技术人员可以理解为：
挑选10位受试者，先对受试者的皮肤进行检测(CBS-807皮肤分析系统)检测皮肤的弹性、毛孔大小、水分、皱纹和肤色，得到受试者的皮肤报告，受试者试用所得胚胎干细胞外泌体，采用水光针注射方式将胚胎干细胞外泌体与基础水光1:1比例混合，注入皮肤真皮层，14天后再次进行皮肤检测。结果见图4。
由图4可知，本发明提供的胚胎干细胞外泌体具有良好的抗衰美容效果，可以有效改善面部皮肤弹性、水分、皱纹、斑点和毛孔粗大等问题，对面部皮肤具有修复作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将胚胎干细胞接种到扩增培养基进行培养；
S2：收集胚胎干细胞培养基，离心去除细胞碎片，过滤去除大颗粒，得到胚胎干细胞培养上清；
S3：用切向流超滤膜浓缩胚胎干细胞培养上清，得到外泌体浓缩液；
S4：对外泌体浓缩液进行过柱处理，去除杂蛋白，得到外泌体悬液。
2.根据权利要求1所述的一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞培养提取物的制备方法，其特征在于：所述S1对胚胎干细胞进行培养时，采用基质胶包被细胞培养板。
3.根据权利要求1所述的一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述S2步骤中收集稳定培养2天的干细胞培养上清进行提取，在细胞培养上清浓缩过程中，先后使用0.45μm和0.22μm滤膜过滤。
4.根据权利要求1所述的一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述S3步骤中超滤膜截留物质分子量大于5KD，上清液浓缩倍数为10-20倍。
5.根据权利要求1所述的一种皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述S4步骤中使用的外泌体分离柱为35nm以上的色谱柱。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的皮肤抗衰老用胚胎干细胞外泌体的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01：对受试者的皮肤进行皮肤检测，得到受试者的皮肤数据报告；
S02：受试者使用胚胎干细胞外泌体配合基础水光针进行皮肤真皮层注射；
S03：14天后再次进行皮肤测试，得到受试者的皮肤数据报告，比较使用前后皮肤状态。
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