CN116004512A - 一种利用外泌体制备诱导性多能干细胞的方法及其试剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用外泌体制备诱导性多能干细胞的方法及其试剂和应用，涉及生物领域。本发明利用外泌体装载miR‑302/367簇递送到外周血单个核细胞中，从而将外周血单个核细胞重编程为诱导性多能干细胞，具有递送效率高、诱导活性强和细胞重编程效率高等优势，减少了诱导性多能干细胞的生产周期和制备成本，为建立儿童期早发精神分裂症患或儿童孤独症的的多能干细胞模型提供一种可靠的方案。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体而言，涉及一种利用外泌体制备诱导性多能干细胞的方法及其试剂和应用。
背景技术
儿童期神经发育障碍主要包括早发性精神分裂症(early-onset schizophrenia,EOS/COS)是一组起源于儿童早期的以幻觉、妄想及认知损害为主要特征的神经精神发育性障碍疾病。
儿童孤独症又称自闭症，是一组神经发育障碍类疾病，以社会交往障碍、沟通障碍和局限性、刻板性、重复性行为是主要症状的神经发育障碍性疾病的统称，包括典型孤独症、阿斯伯格综合征以及未分型的广泛性发育障碍等。
儿童期神经发育障碍的病因未明及发病机制尚不完全明确，尚需进一步研究，确立合适的体外疾病模型是科学研究的基础。目前,利用诱导性多能干细胞作为儿童孤独症和早发精神分裂症的体外模型已经成为研究热点。
当前的iPSC(诱导多能干细胞)生成标准策略依赖于“鸡尾酒”转录因子Oct4、Sox2、Klf4和Myc(OSKM)的过表达。但是，利用病毒导入OSKM进行细胞重编程不但效率很低(＜0.1％)，且逆转录病毒会随机整合到宿主基因组，存在致瘤风险。尽管其中一些因子有多种替代方案，包括使用其他转录因子、小分子药物，但至少需要一种多能干细胞转录因子，但仍然需要至少一种转录因子(通常是Oct4)才能有效地进行iPSC重编程。
且人的iPSC建系的主要供体细胞来源于皮肤的成纤维细胞。然而从皮肤上取样有一定痛苦，并存在取样后的感染风险。且皮肤细胞体外扩增到成纤维细胞培养条件要求较高，时间较长。
因此，寻找简单的供体细胞进行iPSC重编程非常重要。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用外泌体制备诱导性多能干细胞的方法及其试剂和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种诱导性多能干细胞的制备方法，其包括以下步骤：获取装载有目标miRNA的外泌体，其中，所述目标miRNA选自miR302/367簇：在外周血单个核细胞的培养基中添加所述外泌体，进行诱导培养，以获得诱导性多能干细胞；所述外周血单个核细胞来源于儿童早发精神分裂症和/或儿童孤独症患者。
第二方面，本发明实施例提供了一种诱导性多能干细胞，其由前述实施例所述的制备方法制备获得。
第三方面，本发明实施例提供了一种用于制备诱导性多能干细胞的试剂或试剂盒，其包括：用于实施前述实施例所述的制备方法的试剂。
第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的用于制备诱导性多能干细胞的试剂在制备诱导性多能干细胞的试剂盒中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用外泌体装载miR-302/367簇递送到外周血单个核细胞中，从而将外周血单个核细胞重编程为诱导性多能干细胞，具有递送效率高、诱导活性强和细胞重编程效率高等优势，减少了诱导性多能干细胞的生产周期和制备成本，为建立儿童期早发精神分裂症患或儿童孤独症的多能干细胞模型提供一种可靠的方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的技术路线图；
图2为儿童早发精神分裂症患儿来源的红细胞外泌体的鉴定：A)外泌体的纳米粒径测定，B)外泌体的ZETA电位测定，C)外泌体电镜照片，D)外泌体westerblot鉴定；
图3为红细胞外泌体递送Cy3红色荧光标记has-mir-302a/has-mir-367的能被外周血单个核细胞摄取；
图4为荧光标记的miR-302/367簇加载到红细胞外泌体的相对定量；
图5为利用Oct4-GFP荧光的表达鉴定用红细胞递送miR-302a，miR-302b，miR-302c，miR-302d，miR-367转导8天后的荧光表达水平；
图6为qRT-PCR检测iPSC克隆在D4、D6、D8所表达多能性基因Oct4、Sox2、Nanog、Klf4的结果；
图7为培养8天后的细胞进行OCT4-GFP荧光强度鉴定结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明实施例提供了一种诱导性多能干细胞的制备方法，其包括以下步骤：获取装载有目标miRNA的外泌体，其中，所述目标miRNA选自miR302/367簇：在外周血单个核细胞的培养基中添加所述外泌体，进行诱导培养，以获得诱导性多能干细胞；所述外周血单个核细胞来源于儿童早发精神分裂症和/或儿童孤独症患者。
本申请的发明人发现，过表达miR302/367簇可以有效促进iPSC重编程。而miR302/367簇同时导入细胞需要高效的递送载体，外泌体能够有效将miR302/367簇递送至外周血单个核细胞(PBMC)中，诱导PBMC重编程为多能干细胞。该方法克服了需要依赖于利用病毒导入OSKM进行细胞重编程的技术障碍，开拓了以外泌体作为miRNA的载体，诱导成体细胞重编程为诱导性多功能干细胞的提供安全高效方案，具有简单易行，重编程效率高，生产周期短，成本低等优势。
在一些实施例中，所述外泌体包括红细胞来源的外泌体和血清外泌体中的至少一种。
红细胞来源的外泌体作为miRNA的递送载体，具有靶向性高，递送效率高等优势，且该递送体系在细胞重编程的整个过程中释放miR-302/367，并随着时间丢失，使得获得的iPSCs不含外源性整合基因片段。
在一些实施例中，所述外泌体来源于儿童早发精神分裂症和/或儿童孤独症患者。
在一些实施例中，所述miR302/367簇包括has-mir-302a，has-mir-302b，has-mir-302c，has-mir-302d和has-mir-367。
在一些实施例中，所述miR302/367簇中，任意两个miRNA之间的摩尔比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。该摩尔比具体可以为(0.5、0.7、0.9、1.1、1.3和1.5中的任意一种)：(0.5、0.7、0.9、1.1、1.3和1.5中的任意一种)。可选地，该摩尔比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。
在一些实施例中，每1～20μg的所述外泌体中，各miRNA的装载量独立地为0.1～5μmol。该装载量具体可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5μmol中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，每1～20μg的所述外泌体中，各miRNA的装载量独立地为0.1～1μmol。
在一些实施例中，所述制备方法还包括装载有目标miRNA的外泌体的制备，步骤包括：将目标miRNA转染入所述外泌体中。
在一些实施例中，所述转染的方法选自电穿孔法和脂质体转染法中的任意一种。
在一些实施例中，每1～20μg的所述外泌体，所述目标miRNA中的各miRNA所采用的转染用量独立地为0.1～5μmol。该转染用量具体可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5μmol中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，在培养基中添加所述外泌体的时间为培养外周血单个核细胞的第20～28小时后。该时间具体可以为培养外周血单个核细胞的第20、22、24、26和28小时中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，添加所述外泌体的时间为培养外周血单个核细胞的第22～26小时。
在一些实施例中，所述外泌体的添加量为：每(1～10)×105个外周血单个核细胞，添加50～150ng的所述外泌体。具体地，每(1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任意一种)×105个外周血单个核细胞，外泌体的添加量具体可以为50ng、60ng、80ng、100ng、120ng、140ng和150ng中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述外周血单个核细胞的培养条件包括：温度为30～45℃；培养时间为8～10天，CO2浓度为4％～6％。培养的时间具体可以为8天、9天和10天中的任意一种或任意两种之间的范围。培养温度为30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、45℃中的任意一种或任意两种之间的范围。CO2浓度可以为4％、4.5％、5％、5.5％、6％中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述培养基为在RPMI 1640培养基的基础上，添加FBS、以及100×P/S混合液体(其中，青霉素浓度为10,000U/mL，链霉素浓度10mg/ml)后获得；在所述培养基中，FBS的体积分数为10％，P/S的体积分数为1％。记为RPMI 1640+10％ FBS+1％ P/S。在其他实施例中，所述培养基也可以为α-MEM+10％(体积分数)FBS+1％(体积分数)P/S。
另一方面，本发明实施例还提供了一种用于制备诱导性多能干细胞的试剂或试剂盒，其包括：用于实施前述实施例所述的制备方法的试剂。
在一些实施例中，所述试剂包括：所述目标miRNA、用于培养PBMC的培养基、分离或纯化所述外泌体的试剂、分离或纯化所述外周血单个核细胞的试剂中的至少一种。
在一些实施例中，所述试剂包括：将目标miRNA先加载到外泌体中的试剂。
另一方面，本发明实施例还提供了一种诱导性多能干细胞，其由前述任意实施例所述的制备方法制备获得。
此外，本发明实施例还提供了如前述实施例所述的用于制备诱导性多能干细胞的试剂在制备诱导性多能干细胞的试剂盒中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种诱导性多能干细胞的制备方法，技术路线参照图1，包括以下步骤。
(1)外周血单个核细胞分离培养
首先签订知情同意书，抽取儿童早发精神分裂症或儿童孤独症患者的外周血5mL置于紫色的抗凝管中。由于单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，从而分离出PBMC。具体分离步骤如下：
①将5mL全血转入50mL离心管中，加入5ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
②加入5mL Ficoll溶液于15mL离心管底。然后将稀释的血液沿管壁缓缓加入到15mL离心管的ficoll上层；
③于常温下2,000rpm，离心30min，降速设置值为0模式。离心完毕将得到分层，其中的中间白色层为PBMC所在层；
④用吸管把灰白色层以上液体去掉，然后将吸管轻轻插入中灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，转移到另一干净的15mL离心管中；
⑤往离心管中加入5倍体积的Hanks液，然后以1500rpm，10min离心后去掉上清，再加入Hanks液洗涤2次，之后加入细胞培养基(RPMI1640+10％ FBS+1％ P/S)，再度2,000rpm，10min；
⑥加入5mL培养基重悬细胞，进行细胞计数后接种到T25培养瓶中培养。
(2)红细胞外泌体提取
抽取患者来源的外周血，按步骤(1)中所采用Ficoll密度梯度离心法分离获得下层的红细胞，用15mL PBS重悬红细胞后接种至T75培养瓶中，于37℃培养箱培养过夜，收集培养液，依次按600g离心15min、2000g离心15min、3000g离心15min、10000g离心30min去除细胞及杂质，转移上清到新的离心管中，经0.22μm过滤器过滤到超高速离心管，再经120000g超高速冷冻离心70min，收集细胞外囊泡(外泌体)沉淀，用PBS重悬。
(3)红细胞外泌体的鉴定：
将红细胞外泌体重新悬浮在PBS中，并放置在铜网格上，孵育30分钟后。用PBS清洗网格并通过将网格放置在2％多聚甲醛中固定10分钟。固定后用去离子水洗涤3次，然后加入2％醋酸铀酰处理样本15分钟。再添加一滴0.13％甲基纤维素和0.4％乙酸双氧铀处理10分钟来嵌入样品。在JEM-2000EX透射电子显微镜中检查网格，并捕获图像。纳米粒子跟踪分析(nanoparticletrackinganalysis，NTA)用来测定粒径是否符合外泌体纳米级别的定义，电镜可以观察外泌体的经典结构；蛋白质印迹法(Western-blot，WB)可用来对外泌体膜上特异性表达的标记蛋白(CD63，CD9，TSG101，Alix，Flotillin等)进行检测，其次外泌体流式鉴定外泌体的CD63标志性蛋白。多维度的外泌体指标鉴定结果见图2，结果表明提取的外泌体符合标准。
(4)红细胞外泌体装载miR-302/367簇：
①将重悬的红细胞外泌体(10ug)加入等体积的电转缓冲液(1.15mM磷酸钾，pH＝7.2，25mM钾氯化物，21％ Optiprep)中以1:1的比例稀释。
②将miR-302/367簇(miR-302a，miR-302b，miR-302c，miR-302d，miR-367)各取0.5μmol加入到红细胞外泌体电转稀释液中，将混合物转移到0.4cm电穿孔比色皿中；
表1：本发明所使用的miR-302/367簇序列及荧光标记
| miR-302/367簇 | 序列(5'-3') | 5'端修饰 |
| has-mir-302a | UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA | cy3红色荧光分子 |
| has-mir-302b | UAAGUGCUUCCAUGUUUUUAGUAG | cy3红色荧光分子 |
| has-mir-302c | UAAGUGCUUCCAUGUUUCAGUGG | cy3红色荧光分子 |
| has-mir-302d | UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU | cy3红色荧光分子 |
| has-mir-367 | GAAUUGCACUUUAGCAAUGGUGA | cy3红色荧光分子 |
③使用Bio-Rad公司的Gene Pulser II电穿孔系统，在350V/150μF电容下进行电击三次，然后将混合物在37℃下共孵育30min以确保外泌体膜的修复。
④4℃条件下，120000g超速离心70分钟去除未进入红细胞外泌体的miR-302/367簇。
⑤超离后的沉淀(外泌体)重悬于PBS中，分装成100μl体积以避免冻融循环，并在-80℃下储存。
⑥为了计算miRNA在红细胞外泌体中的载药率，将cy3标记的反义miR-302/367簇各0.5μmol加到红细胞外泌体(20μg)电穿孔，120000g超高速冷冻离心70min，分别收集上清液和重新悬浮的外泌体进行荧光测量。用以下公式计算miRNA的载药量：红细胞外泌体载药率＝包裹在红细胞里的miRNA的荧光值/miRNA初始投入量的荧光值×100％。
(5)红细胞外泌体递送miR-302/367簇进入PBMC外周血单个核细胞：
PBMC外周血单个核细胞传代到六孔板，在37℃的二氧化碳培养箱培养24小时后，分别取100ng装载miR-302/367簇的红细胞外泌体加入到PBMC外周血单个核细胞中。连续培养8天后观察荧光。结果见图3表明PBMC外周血单个核细胞能摄取红细胞外泌体所递送的miR-302/367簇。
(6)iPSC进行表型的鉴定：
检测细胞重编程后的多能性，检测iPSCs所表达多能性基因Oct4、Sox2、Nanog、Klf4。PBMC外周血单个核细胞传代到六孔板，细胞培养24小时后，分别取100ng装载miR-302/367簇的红细胞外泌体加入到PBMC外周血单个核细胞中。之后，在37℃的二氧化碳培养箱中连续培养8天后进行OCT4-GFP荧光强度鉴定。图4表示荧光标记的miR-302/367簇加载到红细胞外泌体的相对定量。图5表明红细胞外泌体递送miR-302/367簇诱导OCT4-GFP荧光强度增强。表明iPSC的标志蛋白OCT4表达增强。通过qRT-PCR检测iPSC克隆在D4、D6、D8所表达多能性基因Oct4、Sox2、Nanog、Klf4的表达水平，从图6结果表明细胞过表达多能性基因。细胞间接免疫荧光结果(图7)也表明利用红细胞外泌体递送miRNA302/367簇在8天后诱导出多能干细胞形成。
以上所述仅为本发明的优选实施案例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
获取装载有目标miRNA的外泌体，其中，所述目标miRNA选自miR302/367簇：
在外周血单个核细胞的培养基中添加所述外泌体，进行诱导培养，以获得诱导性多能干细胞；所述外周血单个核细胞来源于儿童早发精神分裂症和/或儿童孤独症患者。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述外泌体包括：红细胞的外泌体和血清外泌体中的至少一种；
优选地，所述外泌体来源于儿童早发精神分裂症和/或儿童孤独症患者。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述miR302/367簇包括has-mir-302a，has-mir-302b，has-mir-302c，has-mir-302d和has-mir-367中的至少一种；
优选地，所述miR302/367簇包括has-mir-302a，has-mir-302b，has-mir-302c，has-mir-302d和has-mir-367；
优选地，所述miR302/367簇中，任意两个miRNA之间的摩尔比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；
优选地，所述miR302/367簇中，任意两个miRNA之间的摩尔比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，更优选为1:1。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，每1～20μg的所述外泌体中，各miRNA的装载量独立地为0.1～5μmol；
优选地，每1～20μg的所述外泌体中，各miRNA的装载量独立地为0.1～1μmol。
5.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括装载有目标miRNA的外泌体的制备，步骤包括：将目标miRNA转染入外泌体中；
优选地，所述转染的方法选自电穿孔法和脂质体转染法中的任意一种；
优选地，每1～20μg的所述外泌体，所述目标miRNA中的各miRNA所采用的转染用量独立地为0.1～5μmol。
6.根据权利要求1～4所述的制备方法，其特征在于，在培养基中添加所述外泌体的时间为培养外周血单个核细胞的第20～28小时后；
优选地，添加所述外泌体的时间为培养外周血单个核细胞的第22～26小时。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述外泌体的添加量为：每(1～10)×105个外周血单个核细胞，添加50～150ng的所述外泌体；
优选地，所述外周血单个核细胞的培养条件包括：温度为36～38℃；时间为8～10天，CO2浓度为4％～6％；
优选地，所述培养基为在RPMI 1640培养基或α-MEM的基础上，添加FBS、以及青霉素与链霉素混合溶液后获得；在所述培养基中，FBS的体积分数为10％，青霉素与链霉素混合溶液的体积分数1％。
8.一种诱导性多能干细胞，其特征在于，其由权利要求1～7任一项所述的制备方法制备获得。
9.一种用于制备诱导性多能干细胞的试剂或试剂盒，其特征在于，其包括：用于实施权利要求1～7任一项所述的制备方法的试剂。
10.如权利要求9所述的用于制备诱导性多能干细胞的试剂在制备诱导性多能干细胞的试剂盒中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN116004548A (zh) * | 2023-03-20 | 2023-04-25 | 天九再生医学(天津)科技有限公司 | 一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法 |
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2022
- 2022-12-30 CN CN202211743600.8A patent/CN116004512A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN116004548A (zh) * | 2023-03-20 | 2023-04-25 | 天九再生医学(天津)科技有限公司 | 一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法 |
| CN116004548B (zh) * | 2023-03-20 | 2023-09-08 | 天九再生医学(天津)科技有限公司 | 一种基于外泌体递送microRNA制备诱导性多能干细胞的方法 |
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