KR20160019475A - 체액으로부터의 산발성 세포를 분리하는 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 장치 - Google Patents

Abstract

흡수재에 긴밀하게 접촉되어 있는 여과 막에 기반을 둔, 혈액과 같은 체액, 악성 삼출액, 기관지 폐포 세척액, 복막 세척액 및 양막액으로부터 생 산발성 세포를 온화하게 분리하는 방법이다. 본 발명을 이용하는 것에 의해 예를 들어 순환 종양 세포 및 파종성 종양 세포, 자궁 내막 세포 및 순환 영양 막 세포를 분리하는 것이 가능하여, 후속적인 검출, 정량, 특성화 및 특히 상기 세포의 배양이 이뤄질 수 있다. 본 방법을 수행하는 장치가 추가로 개시된다.

Description

체액으로부터의 산발성 세포를 분리하는 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 장치{METHOD FOR SEPARATION OF SPORADIC CELLS FROM BODY FLUIDS, AND APPARATUS FOR CARRYING OUT SAID METHOD}

본 발명은 혈액과 같은 체액, 악성 삼출액(복수, 흉막 삼출액), 기관지 폐포 세척액, 복막 세척액 및 양막액으로부터의 생 산발성 세포(희소 세포)를 온화하게 분리하는 방법을 제공한다. 본 방법을 이용하는 것에 의해 예를 들어 순환 종양 세포(CTC, circulating tumor cell) 및 파종성 종양 세포(DTC, disseminated tumor cell), 자궁 내막 세포 및 순환 태아 영양 막 세포(CFTC, circulating fetal trophoblast cell)를 분리하는 것이 가능하여, 후속적인 검출, 정량, 특성화 및 특히 배양이 이루어 질 수 있다.

암(carcinoma)을 가진 환자의 가장 흔한 사망의 원인은 전이성 병변이다 (Birchmeier, 1996). 전이 중인 종양 세포가 원발 종양에서 분리되어 직접 또는 림프계를 통해 혈류에 들어가는 과정에서, 2차 장기로 이동하고 전이성 침착이 발달한다. 전이성 암을 가진 환자에서 CTC의 검출은 부정적인 예후와 관련되어 있다 (Zharo 2011, Zhang 2012, Wang 2011).

임상적으로 중대한 중요성에도 불구하고, CTC의 분자적 특성화는 아직 이뤄지지 않았다. 이는 혈액 세포 수에 비해 극도로 낮은 CTC의 빈도에 기인할 수 있다. CTC는 상피 마커의 감소된 발현 및 간엽 마커의 증가된 발현을 특징으로 하는 상피-간엽 전환(EMT, epithelial-mesenchymal transition) 과정에 의해 생성된다. 이러한 변화는 증가된 운동성, 침윤 및 치료 내성을 촉진한다(Thiery 2002 Shook 2003 Christofori 2006 Jechlinger 2003). CTC/DTC는 미세- 및 거대-전이 병소 생성 가능성을 갖는 원위 장기로 전파된 종양 세포의 집단을 나타낸다. 원발 종양으로부터의 종양 세포 일부 및/또는 CTC 및 DTC는 줄기세포(CSC, 암 줄기세포)의 특성을 보유한다. 암 줄기세포의 집단은 자가재생 능력을 갖고 치료 내성을 갖고 있어 부정적인 예후를 의미한다.

CTC/CSC는 진단, 예후 결정, 질병 치료 효과 및 위험 모니터링에 있어 수많은 가능성을 보유하고 있다(Mani 2008).

종양의 림프절 및 혈액으로의 조기 전파는 순환 종양 세포(CTC) 및 파종성 종양 세포(DTC)에 의해 인식된다. CTC는 원발 종양을 다루는 과정에서 원발 종양 절제로 인해 환자에서 발생하는 것으로도 기술되었다.

CTC의 검출은 의심의 여지 없이 암의 예후 인자이다. CTC 검출은 종양의 전이 진단 또는 종양 전이 조기 검출을 위한 침습성 생검의 대체제로서 및 개별 환자의 치료 효과 세팅 및 모니터링에 잠재적으로 이용될 수 있다. CTC의 양 및 특성은 생존 예후 인자 또는 치료 반응의 예측 인자가 될 수 있다. CTC의 장기간의 특성화는 더욱 우수한 동적 생리 반응 평가 기회를 제공할 수 있다. 또한, CTC 수의 변화는 이미징에 의한 이전의 모니터링된 변화에 비교했을 때, CTC 분석이 이미징 방법보다 생존 평가에 있어 더 중요해 질 수 있다.

일반적으로 전이성 대장직장 암, 전립선암, 난소암, 유방암에서 검출된 CTC 값에 관한 부정적인 예후의 유효한 근거가 존재한다. 또한, 정맥 혈전 색전증의 형성에 있어 CTC의 중요성에 대한 연구들이 존재한다. 말초 혈액에서 CTC가 1개 이상 검출된 전이성 유방암 환자에서 CTC가 검출되지 않은 환자에 비해 최대 4배 높은 혈전증 발생률이 관찰되었다(Mego 2009). CTC는 조직 인자의 발현 및 방출을 통해 응고의 활성화에 관여할 가능성이 있다(Davila 2008). CTC는 100억 개 혈액 세포에 약 1개의 세포의 정도로 혈액에 극소량 존재한다(Pantel 2001, Ziegelschmidt 2005).

현재 사용 가능한 기술은 CTC 검출에 있어 다양한 방법을 사용한다: 밀도 구배 분리, 면역-자기 분리, 구배 면역-자기 분리. 이러한 방법들은 세포특이적이고 가압여과법(pressure filtration methods)에 비해 온화하나, 항체 결합 과정에서 세포막 상의 수용체 및 항원과 상호작용하는 것으로 인해 진정한 생 CTC/DTC를 선택하기 어렵다.

또한, 산발성 세포의 존재는 RT-PCR에 의해 간접적으로 검출될 수 있으나, 이 방법은 종종 종양 특이 마커의 낮은 발현 및 CTC 및 DTC에 전형적인 항원의 비특이성으로 인해 한계가 있다(Andreopoulou 2012). 추가로, 원발 종양과 CTC/DTC 간 표면 항원 발현의 높은 수준의 불일치가 입증된 것은, CTC/DTC 분리에 있어 이러한 마커 사용의 엄청난 비현실성을 암시한다.

대부분의 상피 종양에서 분리된 산발성 CTC 세포의 크기가 혈액 세포 크기 보다 훨씬 더 크다는 것을 고려할 때, CTC 분리의 효과적인 방법 중의 하나는 여과막을 통한 여과 공정에 기반을 둔 것으로 분리된 세포는 막 표면에 잔존하고, 다른 세포는 막을 통과하는 것이다(Paterlini-Brechot et al. 2007, Vona 2000). CTC/DTC의 크기 기반 분리 방법의 이용은 암 질환 동안 발현이 달라지는 표면 항원 및 수용체에 대한 의존 없이 CTC/DTC의 검출 및 분리를 가능하게 한다.

최근 이용되는 여과 방법은 가압- 또는 진공-가속 여과 공정을 포함한다(Mikulova, 2011). 여과 구배는 압력을 변화시킴으로써 생성된다. 통상적인 여과법의 단점은 침전물의 축적으로, 여과 막 상의 침전은 필터의 폐색 현상을 유발하여 혈액 세포의 침전물 내 포획으로 이어진다. 결과적으로, 침전물과 혈액 세포는 현미경하 여과 필터 상의 산발성 세포 존재 평가를 상당히 악화시킨다. 포획된 혈액 세포는 세척에 의해 부분적으로 제거할 수 있으나, 침전물은 여전히 필터 상에 잔존한다. 이런 이유로, (채혈과정에서의 튜브 내 뿐만 아니라) 추가의 항응고제가 여과 장치에 가해져야 한다. 다른 방법들처럼, 근본적인 단점은 세포 생존 능력에 악영향을 주는 것으로, 보통 세포가 추가로 분열하지 않게 되고 후속적인 배양이 불가능해진다.

현재 이용되는 모든 방법들은 또한 다른 단점, 예를 들어, 큰 부피의 혈액 분석 요구, 많은 실험실 내 노동, 시간소모적 평가(샘플가공에 수 시간이 소요) 또는 고가 장비 및 시약의 사용을 갖고/갖거나 방법들이 일상적인 CTC 및 DTC 검출 방법에 필요한 신뢰성, 민감성, 효율성, 특이성 및 표준화가 결여되어 있다.

따라서, 세포 분리, 특히 체액으로부터의 산발성 세포 분리에 있어, 재현 가능하고, 현미경 하에서 필터 상 존재하는 산발성 세포의 우수한 평가를 나타내고, 공정 시간, 장비 및 운영 요원이 요구되지 않고, 적은 수의 샘플 분석에도 고가 비용이 아니고, 제한된 유효기간을 갖는 고가 시약을 요구하지 않는 방법이 바람직할 것이다. 분리 공정에서 수용체 및 항원과의 임의의 상호작용이 일어나지 않아야 한다. 공정은 생존 세포 및 진정 CTC/DTC의 선택을 가능하게 하고 상기 세포가 가능하게는 후속 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 실험에서 사용될 수 있도록 세포에게 온화한 수준으로 이뤄져야 한다.

또한, 분리 공정을 재현 가능하게 수행하고, 대부분의 실험실이 입수 가능하고, 잠재적 병리학적인 물질을 멸균 상태로 다루기에 적합한 쉽게 제조되는 장치가 바람직할 것이다. 상기 장치는 여과 막 상의 분리된 세포의 후속 검출 및/또는 정량 및/또는 배양 가능성을 제공해야 하며, 일회용 또는 재사용의 형태로 사용할 수 있다.

발명의 요약

본 발명에 따른 흡수재에 긴밀하게 접촉되도록 위치한 여과 막을 이용한 사람과 동물의 체액으로부터 산발성 세포를 분리하는 방법은 기존 방법의 단점을 제거하고 전반적인 요구사항을 충족시킨다.

가압/진공 여과와는 대조적으로, 모세관력(모세관 현상)을 이용한 여과 과정에서 혈액 또는 혈장과 같은 체액으로부터의 단백질의 응고가 최소한의 정도로 일어나며, 이로 인해 정상적인 채혈을 위한 항응고제(EDTA)가 첨가된 채혈 튜브에 추가적인 항응고제가 필요하지 않다. 만약 체액에 이미 응고(clot)가 존재한다면 소량의 PBS와 같은 완충제로 희석하는 것만으로 응고를 예방하기에 충분하다. 결과적으로, 여과 막이 폐색되지 않고 (보통 가압/진공 여과에서, 특히 여과 초기에 발생함), 분리가 더욱 순조롭고, 빠르며 완전하게 이루어진다.

소량의 침전은 침전 내 적혈구와 같은 혈액 세포가 침전물 내 소량 함유됨을 야기하고, 원칙적으로 상기와 같은 침전 및 혈액 세포 모두가 필터 상의 산발성 세포 존재 검출을 파괴한다. 명백히 산발성 세포 존재의 정확한 평가는 중대하다; 여과 시간은 이용되는 여과 면적, 예를 들어 여과 막과 흡수재 면적에 따라 꽤 쉽게 조정할 수 있다.

또한, 막 상에 포획된 산발성 세포는 물리적으로 및 화학적으로 변하지 않은 상태로 유지되어, 생존 가능하다는 것을 발견하였고, 이는 현재 결과 면에서 다른 방법에 의해 실현 가능하지 않았던 그의 효과적인 후속 배양을 가능하게 한다.

또한, 체액의 희석 또는 필터 상 산발성 세포의 세정을 위해, 여과 막에서의 분리 속도와 세포 생존 능력을 유지시키면서 RPMI와 같은 배양 배지가 분리 (및 배양, 산발성 세포의 추가적인 배양을 목적으로 하는 경우) 성공률을 증가시키기 위해 직접적으로 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.

산발성 세포가 없는 여과된 체액은 여과 막 개구를 통해 통과하며, 여과 막 개구보다 큰 분자는 포획된다(혈액 세포의 전형적인 크기는 6μm 미만이고 산발성 세포의 전형적인 크기는 10μm 초과이다).

분리된 산발성 세포는 그 크기로 인해 여과 막 상에 머무르고, 이후 막은 여전히 홀더에 고정된 채 흡수재로부터 분리될 수 있다. 다른 실시양태에서, 막은 그 후 완전히 홀더로부터 제거될 수 있다.

산발성 세포가 없는 체액의 막을 통한 흐름은 흡수재로 액체가 흡입되게 하는 모세관력에 의해 지속적으로 가속화된다. 여과 중 여과되는 체액에 대해 필터 전 가압 및 필터 후 감압(진공)이 가해지지 않는다. 액체는 어떠한 통제도 필요 없이 흡수재로의 필터를 통한 적절한 속도로, 모세관력에 의해서만 흡입된다(이러한 맥락에서, 체액 컬럼의 높이에 의해 필터에 가해지는 정수압은 무시된다). 모세관력의 양은 예를 들어 필터 후에 진공을 이용하거나 필터 전에 가압을 이용하는 방법에서 흔히 관찰되는 여과 막 전 또는 표면에서의 어떠한 응고 없이, 체액의 지속적인 여과를 야기한다.

본 발명에 따른 방법의 장점은 저 농축된 산발성 세포일지라도 높은 효율의 포획과 분리 공정의 가속화, 또한 검출 속도의 가속화 및 배양 효율의 증가이다. 본 발명에 따른 방법을 이용하면, 산발성 세포와 수용체 및 항원간 상호 작용이 관찰되지 않고, 따라서 시험관 내 그리고 생체 내 실험에 사용될 수 있는 진정한 생 CTC/DTC를 선택하는 것이 가능하다. 본 방법은 여과된 세포가 추가 분석을 위해 매우 양호한 생명 상태를 유지하게 한다. 특별한 실험 장비가 필요하지 않다. 본 방법은 상대적으로 큰 부피의 혈액 또는 기타 체액의 가공도 가능하게 한다(예: 50 ml).

따라서, 본 발명은 세포 직경보다 작은 개구를 가진 여과 막 상에 산발성 세포가 포획되게 하는 것에 의한 환자 체액에 존재하는 산발성 세포를 분리하는 방법으로서, 체액 내 산발성 세포가 여과 막 제1 면에 존재하고, 산발성 세포가 없는 체액은 여과막의 제2 면과 긴밀하게 접촉되도록 위치한 흡수재를 향한 모세관력에 의해 여과 막을 투과되는 것인 방법을 제공한다.

체액에 존재하는 산발성 세포에는 예를 들어 순환 종양 세포, 파종성 종양 세포, 자궁내막 세포 및 순환 태아 영양막 세포가 있다.

체액은 사람 또는 동물의 몸으로부터 직접(수집) 또는 간접적으로(임의의 종류의 후속 처리에 의한 것) 얻은 임의의 액체이다. 바람직하게는, 중심 혈액 또는 말초 혈액 군, 골수, 복수액, 흉막 삼출액, 복막 세척액 및 양막액으로부터 선택된다.

시험 대상은 원발 암 또는 전이성 질환을 갖는 환자가 바람직할 수 있다.

또한, 시험 샘플은 전이 실험 모델로 승인된 동물로부터 성공적으로 수집될 수 있다.

다른 실시양태에서, 말초 혈액은 EDTA와 같은 항응고제를 포함하는 표준 혈액 수집 튜브로 수집되는 혈액과 같은 항응고 처리된 말초 혈액이다.

체액이 분리 전에 침전물을 포함하는 경우, 침전물을 녹이고 여과/분리를 용이하게 하기 위해 여과된 체액은 바람직하게는 PBS(인산 완충액을 갖는 생리학적 식염수) 및/또는 TrypLE^TM과 같은 적절한 완충제로 희석된다.

그러나 본 발명은 혈액 수집 중 혈전 형성을 예방하기 위한 알려진 방법을 사용하는 것을 배제하는 것은 아니다. 점진적인 로딩(loading) 및 선택적인 효소 용해(예를 들면, Invitrogen 의 TrypLE^TM 이용)를 예로 들 수 있으나, 바람직하게는 용해는 사용되지 않는다.

혈액 침전물 존재 시 여과를 개선하기 위해, 말초 혈액은 PBS 용액 또는 배양 배지에 의해 추가로 희석될 수 있다. 혈액 침전물과 기타 굵은 불순물을 제거하기 위해, 혈액 또는 기타 체액은 예를 들어 0.1mm 공극 크기의 체를 통해 여과된 뒤 PBS로 여러 차례 세척될 수 있다. 그 뒤 잔여 혈액 부피를 로딩한다. 마지막으로, 혈액 수집 튜브를 PBS로 세정하고, 세정액을 체를 통해 여과시킨다.

그 후 분리된 산발성 세포는 더욱 우수한 현미경에서의 평가를 위해 필터 상에서 예를 들면, PBS와 같은 완충제 또는 RPMI와 같은 배지로 세정될 수 있다. 진공 여과에 비해, 본 발명에 따른 방법은 모든 측면에서 상당한 이익을 제공한다.

분리된 세포는 그 후 추가적으로 분석되거나 예를 들면, 바람직하게는 면역조직화학 또는 기타 염색 이후 현미경으로, 정량되거나 (예를 들면, 현미경으로, 수작업으로 또는 자동화로), 배양되거나 또는 기타 가공이 이뤄질 수 있다. 다른 실시 양태에서, 분리된 세포의 검출 및/또는 정량 및/또는 배양이 분리 이후 여과 막 상에서 바로 또는 배양 용기에서 수행된다.

산발성 세포를 갖는 필터는 추후 분석에서 사용하기 위해 통상적인 방법에 의해 냉동, 건조 또는 고정되어 장기간 보관될 수 있다.

이미 언급된 바와 같이, 특히 산발성 세포의 후속 배양이 계획된 경우, 체액은 분리 전에 분리된 세포의 후속적인 배양에 사용되는 RPMI 배지와 같은 배양 배지에 의해 직접적으로 희석될 수 있고, 이에 의해 여과 및 후속적인 배양 성공률을 높일 수 있다.

산발성 세포의 후속 배양은 필터로부터 세포를 세척한 뒤 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 통상적인 배양 접시 또는 플라스틱 또는 유리병에서 통상적인 방법으로 수행될 수 있다. 이러한 목적으로, 예를 들어 필터는 2x1ml의 RPMI 배지로 세정하고, 세포가 포함된 배지는 플라스틱 플레이트 또는 삽입된 현미경 커버 슬립 표면 상에서 세포가 직접적으로 배양될 수 있는 24웰 플레이트로 이동된다. 세포의 면역조직화학적 및 면역 형광 분석이 요구되는 경우 커버 슬립 배양이 바람직하다.

배양은 바람직하게는 포획된 세포를 포함하는 필터를 배양 접시 내 배양 배지에 삽입하거나 또는 배양 접시에 삽입된, 포획된 세포를 포함하는 필터에 배양 배지를 붓는 것에 의해 수행할 수 있다.

다른 바람직한 실시양태에서, 배양은 하기 기술된 홀더 상에 올려진 여과막을 분리 후 즉시, 예를 들면, 각 웰마다 첨가된 성장 배지를 갖는 6웰 배양 플레이트에 이동시키는 것에 의해 수행될 수 있다. 이후 세포는 표준 조직 배양에 따라 배양될 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, 체액은 흑색종, 유방암, 위암, 대장암, 췌장암 및 간암과 같은 위장관의 암; 비뇨생식기 종양, 및 두경부종양과 같은 연부 조직 종양, 및 기타 고형 종양을 갖는 환자의 체액이다.

본 발명의 방법 및 장치는 예를 들면, 말초 또는 중심 혈액으로부터의 순환 종양 세포(CTC), 위장관(식도, 위, 대장, 소장, 간, 췌장, 담낭 및 담관)의 종양 세포, 비뇨 생식계(난소, 자궁내막, 전립선, 방광 및 고환) 종양, 호흡계(폐, 종격막 및 상부 호흡기) 종양, 신경분비계 종양, 골종양, 두경부 종양, 유방종양, 원발 지역(primary localization)이 없는 전이성 종양 및 기타 희귀 고형 종양의 분리에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법 및 장치는 선택된 조혈성 질환, 신경내분비 종양, 복수, 흉막 삼출액, 가래, 세척액(기관지 폐포 세척액, 복막 및 흉강 세척액, 후복막강 세척액 등)으로부터의 파종성 종양 세포, 순환 및 파종성 자궁내막 세포(혈액 및 세척액으로부터)에 사용될 수 있다.

또한, 중요한 활용으로서, 혈액 또는 양수천자 액(amniocentic fluid)으로부터의 순환 태아 영양 막 세포(CFTC)의 분리에 적용될 수 있는데, CFTC가 임신 5주부터 모체 말초 혈액에 존재하고 임신 말기 이후에는 순환 혈액에 존재하지 않기 때문이다(Bianchi et al., 1996). 따라서, CFTC는 비침습적 출산 전 진단(PND-NI)에 의한 검사를 위한 DNA/RNA의 매우 매력적인 공급원이다. CFTC에 기반을 둔 시험과 융모 천자(choriocentesis) 비교 시 CFTC 기반 시험이 모두 100% 진단 민감도 및 특이도를 갖는 것으로 확인되었다. 혈액 세포와 CFTC가 다른 기본 특징은 CFTC의 크기이다(CFTC 세포는 표준 크기 10μm 이상에 이른다). 현재 보고서에 따르면, 임신 여성이 99%의 가능성으로, 각 세포가 15μm 크기 이상이고, 태아 유래인 CFTC를 갖는 것으로 나타났다(Mouawia,2012). 새로운 방법으로 인해, 손상되지 않은 CFTC를 재생산 가능하게 분리하고 이를 추후 분석을 위해 사용하는 것이 가능하다.

CTC와 DTC의 검출은 동물 종양 모델에서 수행될 수 있고, 1종류 이상의 종양을 갖는 개체에서 CTC/DTC를 검출할 수 있다.

분리 이후, 세포는 면역조직화학법 및 유전자 발현을 위한 단일-세포 방법 모두에 의해 가공될 수 있다.

본 발명은 추가적으로 상기 기술한 방법에 의해 환자의 체액에 존재하는 산발성 세포 혼합물의 분리를 수행하기 위한 장치를 제공하고, 이 장치는 흡수재와 긴밀하게 접촉하여 위치한 여과 막을 포함한다.

막의 기하학적 구조는 일반적으로 막 공극의 크기, 모양 및 밀도를 포함한다. 그러므로 막 필터의 효과는 막 공극의 크기, 모양 및 밀도를 조절함으로써 최적화될 수 있다. 이러한 막의 구조는 혈액 세포에서 종양 및 산발성 세포 포획이 우세하도록 선택된다. 여과 막은 바람직하게는 10μm 초과 크기의 산발성 세포를 포획하고 6μm 크기까지의 혈액 구성요소를 투과하는 막과 같은 것으로, 즉, 7-10 μm 공극 크기를 갖는 막, 예를 들면, 8μm 또는 유사한 값(예를 들어, 제조자에 의해 ±1μm 범위 이내로 언급된 것)의 공극 크기를 갖는 막이다. 여과 막은 바람직하게는 폴리카보네이트와 같은 생체적합적인 물질로 만들어져 유연성과 생체적합성의 장점을 제공한다.

응고 효과를 최소화하고 여과 속도를 증가시키는 것은 최대 이용 여과 면적을 갖는 큰 필터를 사용함으로써 추가적으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 8μm 의 공극 크기 및 25mm 막 직경을 갖는 폴리카보네이트 막이 사용될 수 있다.

용어“긴밀 접촉(intimate contact)”은 막에서 흡수재를 향한 모세관 현상이 영향을 받지 않도록 하는 여과 막과 흡수재간 밀접한 접촉을 지칭하는 것으로, 즉, 공기가 막의 공극을 통해서만 여과된 액체와 직접 접촉되고, 작업 중 막과 흡수재 사이의 접점으로의 공기의 접근이 방지된다. 이는 예를 들어 막 또는 적합한 장치에 클램프된 막의 가장자리를, 흡수재의 표면으로 밀거나, 또는 약간의 압력하에 적합한 홀더에 고정된 막의 가장자리를 흡수재의 유연한 표면으로 미는 것에 의해 달성할 수 있다.

흡수재는 충분한 흡수 능력을 갖고 있고, 다양한 점도를 가진 체액 내에 존재하는 모든 혈액 구성요소 및 기타 구성요소를 부드럽게 흡수할 수 있으며, 구체적으로 흡수재는 주로 펄프, 미세지, 텍스타일 섬유 또는 이들의 조합으로 구성된다.

여과된 체액의 부피는 흡수재의 흡입 용량 및 그의 부피에 의해 제한된다. 따라서, 장치의 크기 및/또는 부피 및 흡수재의 특성은 사용목적에 따라 조정 가능하다. 유리하게는, 1개의 단일 장치를 이용하여 50ml 이상의 부피를 여과할 수 있다. 방법 및 장치는 1ml 미만과 같은 최소 부피의 혈액부터 작동하고, 그러나 여과된 체액의 부피가 증가함에 따라 산발성 세포 포획 가능성은 높아진다.

본 발명에 따른 장치는 바람직하게는 체액 내 존재하는 산발성 세포 혼합물을 수용하기 위한 상부- 및 하부-개방 중공 용기를 더 포함하고, 용기의 하부 주변부가 막의 제1 면 상부의 적어도 일부와 밀접하게 접촉되고, 막의 하부 제2 면의 적어도 일부가 흡수재와 긴밀하게 접촉되어 막이 상기 흡수재로부터 용기 내부 공간을 분리한다. 용기의 상부 가장자리는 바람직하게는 깔때기 모양을 얻기 위해 넓혀지거나 및/또는 상기 가장자리는 혈액 등에 이미 존재하는 응고물을 제거하기 위한 체와 함께 제공될 수 있다.

상기 이유로 최대 여과 면적을 얻기 위해, 막의 제1 면의 적어도 일부 및 막의 제2 면의 적어도 일부는, 흡수재 및 막에 의해 분리된 체액 내 산발성 세포간의 접촉 면적을 최대화하는 최대한의 면적 상에 서로 맞닿아 위치한다.

다른 실시양태에서, 환상 막 홀더가 그 위로 분리 가능하게 맞물려 있는 상부 덮개가 제공된 수집 기본 용기에 흡수재가 배치되고, 상기 홀더는 압박 링에 의해 그의 주변부를 따라 밀접하고 분리 가능하게 막을 고정하고, 저장 용기가 홀더 위부터 상기 홀더의 주변부를 따라 밀접하게 부착될 수 있다. 장치는 바람직하게는 일회용을 위해 디자인되나 장치의 일 실시양태는 막과 흡수재를 제외한 모든 구성요소를 재활용하는 것을 배제하지 않는다.

본 방법을 이용하는 것에 의해 예를 들어 순환 종양 세포(CTC, circulating tumor cell) 및 파종성 종양 세포(DTC, disseminated tumor cell), 자궁 내막 세포 및 순환 태아 영양 막 세포(CFTC, circulating fetal trophoblast cell)를 분리하는 것이 가능하여, 후속적인 검출, 정량, 특성화 및 특히 배양이 이루어 질 수 있다.

도 1은 두 가지 시점에서의 여과 장치의 일 실시양태를 도시한다.
도 2는 여과 장치의 일 실시양태를 확대도로 나타낸다(흡수재는 보이지 않음).
도 3은 홀더 내 막을 고정시키는 것의 일 실시양태를 도시한다.
도 4는 전립선암 환자의 말초 혈액에서 분리한 CTC의 시험관 내 세포 배양으로 여과 막 상에 CTC가 증식한 것을 나타낸다.
도 5는 혈액학적 분석에 사용되어 온 May-Grunwald 염색법을 사용한 여과 막 상 CTC의 시험관 내 배양을 나타낸다.
도 6은 면역조직화학염색에 의한 분리 세포의 가공을 도시한다. (pan-cytokeratin에 대한 항체에 의해 염색된 전이성 전립성 암을 가진 환자의 혈액에서 분리된 CTC)
도 7은 배양 과정에서 배양 웰의 바닥 상 필터를 통과한 분리된 CTC 한 쌍을 나타낸다. (May-Grunwald 염색법이 분석에 사용되었다)

약어

CTC: 순환 종양 세포(circulating tumor cell)

DTC: 파종성 종양 세포(disseminated tumor cell)

CFTC: 순환 태아 영양막 세포 (circulating fetal trophoblast cell)

NI-PLD: 비-침습성 출산 전 진단 (non-invasive prenatal diagnosis)

PBS: 0.15M NaCl를 갖는 인산염 완충제 용액, 기본적으로 완충 식염수

FBS: 소 태아 혈청 (fetal bovine serum)

EDTA: Chelaton 2, 에틸렌디아민테트라아세트산

실시예 1

원발 종양의 수술적 제거를 받는 환자의 말초 혈액에서 전립선암의 순환 종양 세포의 결정

5-10ml의 말초 혈액을 EDTA(예를 들면, Vacuette K3E(REF 456 036), S-monovette K3E(REF 02,1066,001))가 포함된 수집 튜브에 수술 중 수집하였다. 혈액을 즉시 가공하거나 또는 4℃에서 최대 24시간 보관하였다.

말초 혈액을 여과를 수행하기 위해 장치의 용기 3에 피펫을 이용해 점진적으로 적용하였다. 막 1의 제1 면 상에 존재하는 혈액을 공극 크기가 8 미크론을 갖는 폴리카보네이트막(PCTE)으로 이루어진 직경 25mm의 여과 막 1(GE, 폴리카보네이트, 8.0 미크론, 25mm)을 통해 여과시켰고, 여과 막 1은 흡수재 2인 펄프(Pur-Zellin Hartmann)와 긴밀하게 접착되어 있었다. 여과 공정은 여과되는 혈액 부피 및 혈액의 점도에 따라 약 5분이 소요되었다.

추가적으로, 여러 방식으로 공정이 진행될 수 있다:

1. 여과 후, 홀더 6에 고정되어 있고, 분리된 CTC를 포함하는 여과 막 1을 FBS(F2442, Sigma)로 풍부화된 RPMI 성장 배지(4ml), RPMI(Sigma R8758) 및 항생제(페니실린-스트렙토마이신 (P4458, Sigma), 암포테리신(A2942, Sigma))이 첨가된 6웰 배양 플레이트의 하나의 웰에 이동시켰다. 그 후, 포획된 세포들을 통상적인 조직 배양과 같이, 적어도 14일 동안, 37℃, 5% CO₂ 에서, 3일 마다의 배지 교환과 함께, 배양시켰다.

성장한 세포 배양을 May-Grunwald 면역조직화학 염색의 표준 프로토콜에 의해 염색하였고, 도립 광학 현미경(inverted light microscope)에 의한 사진이 도 4에 나타나 있다.

도 5는 Prolong Gold™ with DAPI 로 덮인, 전립선암의 CTC의 면역 형광 염색 (pan-cytokeratin-FITC, Sigma)의 형(variation)의 유사한 배열을 나타낸다.

2. 여과 후, 분리된 CTC를 포함하는 여과 막 1을 1ml의 배지로 세정하고, 필터로부터 세척된 세포를 갖는 상기 배지를 그 후 웰 바닥(Assistent, N.1001, 12 mm 직경)상에 위치한 현미경 슬라이드 상에 덮어 씌워진 24웰 플레이트로 이동시켰다. 그 후. 세포를 현미경 슬라이드 상에서 3일마다 배지를 교환하고, 5% CO₂ 대기, 37℃에서 적어도 14일간 직접적으로 증식시켰고, 추가적으로 면역조직화학 염색 및 후속적인 면역조직화학 분석 동안 처리를 용이하도록 하였다.

3. 여과 후, 분리된 CTC를 포함하는 여과 막 1을 1ml의 배지로 세정하고, 막으로부터 세포를 갖는 배지를 공초점 현미경(실시간 비디오 캡쳐링 타임랩스 영상화 장비를 위한 시스템, Leica)을 위한 배양 챔버(Nunc^® Lab-Tek® ChamberSlide™ (4 chambers))로 피펫에 의해 이동시키고, 3일마다 배지를 교환하고, 5% CO₂ 대기, 37℃에서 적어도 14일간 통상적인 조직 배양과 같이 배양하였다.

상기 언급된 모든 예시에서, 막 상의 산발성 세포 및 막으로부터 세정된 산발성 세포 모두의 배양이 어떠한 문제없이 수행되었다. 비슷하게, 본 발명의 방법에 의해 분리된 다른 종류의 종양의 세포 배양도 어떠한 문제없이 수행되었다. 대조적으로, 당업계의 기술 분야에 알려진 방법에 의해 환자의 체액으로부터 분리된막 상 또는 막으로부터 분리된, 산발성 세포의 성공적인 배양은 아직까지 입증된 바 없다.

4. 여과 및 필터 상에 포획된 산발성 세포의 2ml RPMI에 의한 세척 후, 홀더에 고정된 분리된 CTC를 포함하는 여과 막 1을 표준 May Grunwald 염색 프로토콜에 의해 바로 염색시키고 현미경 하에서 산발성 세포의 존재를 평가하였다.

실시예 2

흉막 삼출액 중의 전이성 난소암의 파종성 종양 세포의 결정

전이성 난소암을 앓고 있는 환자에서 제거된 흉막 삼출액으로부터의 파종성 종양 세포를 다음과 같이 분리하였다. 피펫에 의해 삼출액을 여과 장치의 용기 3에 적용시켰다. 막 1의 제1 면 상의 삼출액을 실시예 1에서와 같이, 흡수재 2, 펄프(Pur-Zellin,Hartmann)와 직접 인접하는 8μm의 공극 크기를 갖는 폴리카보네이트 막(PCTE)으로 제조된 25mm 직경의 여과 막 1을 통해 여과시켰다. 세포들을 필터에 고정시키고, 혈청학적 혈액염색에 의해 분석하고, 표준 May Grunwald 염색 프로토콜에 의해 염색시키며, 현미경 하에서 평가하였다.

실시예 3

여과 수행 장치

도 1 내지 3에 나타난 여과를 수행하기 위한 장치의 일 실시양태는 8μm의 공극 크기를 갖는 폴리카보네이트 여과 막 1을 포함하며, 이는 상기 막의 바닥면으로부터, 펄프로 구성된 흡수재 2와 밀접하게 접촉되어 있다. 장치는 추가적으로 체액 내 존재하는 산발성 세포 혼합물을 수용하기 위한 상부-및 하부-개방 중공 용기 3을 포함한다. 액체를 보다 쉽게 따르기 위해, 용기 3의 상부 가장자리는 깔때기를 형성하도록 넓혀질 수 있다. 용기 3의 하부 주변부는 막 1의 상부 제1 면과 밀접하게 접촉되어 있고, 막 1의 하부 제2 면은 흡수재 2와 긴밀 접촉되어 막 1이 상기 흡수재 2로부터 용기 3의 내부 공간을 분리할 수 있게 한다.

환상 막 홀더 6이 그 위로 분리 가능하게 맞물려 있는 상부덮개 5가 제공된 수집 기본 용기 4에 흡수재 2가 배치된다. 홀더 6은 덮개 5와의 관계에서 수직으로 움직일 수 있고, 흡수재 2와의 관계에서도 마찬가지여서 여과 막 1과 흡수재 2와의 긴밀한 접촉을 가능케 하거나 여과 막 1과 흡수재 2의 완전한 접촉을 위해 압박 링 7을 흡수재 2로 밀어낼 수 있다. 홀더 6은 압박 링 7에 의해 막 1을 그의 주변부를 따라 밀접하게 고정하고, 스레드(thread)를 이용하여 분리 가능하게 하여, 홀더 6, 여과 막 1 및 압박 링 7의 세트가 장치로부터 전체로서 제거될 수 있게 하고, 포획된 세포가 막 1 상에서 바로 염색되거나 배양될 수 있다. 용기 3은 베이오넷 연결(bayonet connection)에 의해 홀더 6의 주변부를 따라 분리 가능하게 부착된다.

실시예 4

침전물 존재에 관한 2 종류의 여과 기술의 비교

본 실험의 목적은 여과 막 상의 주로 침전물 및 잔여 혈액 세포 구성요소의 존재에 의존하는 여과 막 상에 수집된 산발성 세포의 존재 평가와 관련하여 진공에 의해 가속된 산발성 세포를 포함하는 혈액 세포의 여과와 본 발명에 따른 모세관력을 이용한 여과를 비교하기 위한 것이다.

두 공정에서 실시예 1과 같은 7-8μm의 공극 크기를 갖는 것으로 기재된 막과 흡수재를 사용하였다. 대략 동일한 여과 시간을 달성하기 위해 다른 크기의 필터를 사용하여, 진공 여과에는 7mm 직경의 필터를, 모세관력을 사용하는 여과에는 25mm 직경의 필터를 사용하였다.

실시예 1의 전립선암 환자에서 획득한 2ml의 동일한 부피의 혈액을 실온에서 2개의 막 시스템을 통해 여과시켰고, 여과 시간은 진공시스템을 사용한 여과는 87초, 본 발명의 모세관력을 사용한 여과는 97초였다.

진공 여과의 경우 필터 상에 혈액 침전의 잦은 발생이 관찰되었고, 이는 현미경을 통한 필터 상 산발성 세포의 존재 평가를 불가능하게 하였다. 본 발명에 따른 모세관력을 사용한 여과 방법을 이용한 경우, 필터 상에 침전물이 존재하지 않았다.

실시예 5

세정 관점에서의 2 종류의 여과 기술의 비교

혈액 샘플이 유방암 환자에서 채취되었다는 점을 제외하고는 실시예 4에서 사용된 동일한 실험 조건을 사용하였다. 본 발명자들은 이러한 유형의 샘플에서 진공 여과 중 빈번하게 응고 형성을 맞닥뜨렸고, 이는 주로 침전물 중에 끼인 적혈구에 의해 평가가 어려워졌으므로, 혈액 여과 후 추가적인 2ml의 성장 배지(RPMI)로 필터를 세척하였다.

예상한대로, 진공 여과 이후 필터 상에 침전물이 잔존하였으나 세정은 적혈구 잔여물 제거를 도왔으며, RPMI에 의한 세정 이후 필터 상 산발성 세포의 전반적인 존재 평가는 세정이 없는 경우에 비해 더욱 우수했다. 총 여과 시간 및 RPMI 배지로 필터를 세정한 시간은 4분 37초였다.

여과에 모세관력을 이용한 후, 필터는 세정을 하지 않은 경우에 진공을 사용한 경우의 필터보다 우수한 평가를 나타내었다. RPMI에 의한 세정 이후 필터 상 산발성 세포의 존재 평가는 더욱 개선되었고, 이는 세정된 진공 사용 필터의 평가 보다 우수했다. 총 여과 시간 및 RPMI 배지로 필터를 세정한 시간은 이 경우 단지 39초였다.

따라서, 산발성 세포의 여과 분리에의 모세관력의 사용의 장점이 응고 발생의 측면과 또한 산발성 세포 존재 평가 측면에서 확인되었다. 나아가, RPMI 배지에 의한 세정 단계에서 여과 시간의 단축이 관찰되었다.

Claims (15)

1. 세포의 직경보다 작은 개구를 갖는 여과 막 상에 포획하는 것에 의해 환자의 체액 내 존재하는 산발성 세포(sporadic cell)를 분리하는 방법으로서, 상기 체액에 존재하는 산발성 세포가 여과 막의 제1 면 상에 존재하고, 상기 여과 막의 제2 면과 긴밀하게 접촉되어 위치한 흡수재로의 모세관력에 의해 산발성 세포가 없는 체액이 여과 막을 통해 통과하는 것을 특징으로 하는 산발성 세포를 분리하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 체액 내 존재하는 산발성 세포가 순환 종양 세포, 파종성 종양 세포, 자궁내막 세포 또는 순환 태아 영양 막 세포임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 체액은 말초 혈액 또는 중심 혈액(central blood), 골수, 복수액, 흉막 삼출액, 복막 세척액, 기관지 폐포 세척액 및 양막액에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체액은 흑색종, 유방암, 위암, 대장암, 췌장암 및 간암과 같은 위장관 종양; 비뇨생식기 종양, 두경부종양과 같은 연부조직종양 또는 기타 고형 종양이 있는 환자의 체액인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제3항에 있어서, 말초 혈액은 항응고 처리된 말초 혈액으로서 수집되는 것임을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 전, 침전물 용해를 위해 체액을 함유하는 침전물이 완충제, 특히 PBS로 희석되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 이후, 여과 막 상에 분리된 세포 또는 여과 막으로부터 배출된 배양 용기 중의 세포의 검출 및/또는 정량 및/또는 배양이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 후속 배양의 성공을 높이기 위해, 분리 전, 체액이 배양 배지, 특히 RPMI,으로 희석되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 장치로서, 흡수재(2)와 긴밀하게 접촉되어 위치한 여과 막(1)을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
10. 제9항에 있어서, 여과 막(1)이 8μm의 공극 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 여과 막(1)이 폴리카보네이트로 제조되는 것을 특징으로 하는 장치.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 흡수재(2)는 셀룰로오스, 미세지(fine paper), 텍스타일 섬유(textile fibers) 또는 이들의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 장치.
13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 체액 내 존재하는 산발성 세포 혼합물을 수용하기 위한 상부- 및 하부- 개방 중공 용기(3)를 포함하고, 용기(3)의 하부 주변부가 여과 막(1)의 상부 제1 면의 적어도 일부분과 밀접하게 접촉되고, 막(1)이 상기 흡수재(2)로부터 용기(3)의 내부 공간을 분리하도록 막(1)의 하부 제2 면의 적어도 일부분이 흡수재(2)와 긴밀하게 접촉되는 것을 특징으로 하는 장치.
14. 제13항에 있어서, 환상 막 홀더(6)가 그 위로 분리 가능하게 맞물려 있는 상부 덮개(5)가 제공된 수집 기본 용기(4)에 흡수재(2)가 배치되고, 상기 홀더(6)가 압박 링(7)에 의해 그의 주변부를 따라 막(1)을 밀접하고 분리 가능하게 고정시키고, 저장 용기(3)이 상기 홀더(6)의 위부터 홀더(6)의 주변부를 따라 밀접하게 부착될 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.
15. 제7항에 있어서, 검출 및/또는 정량 및/또는 배양을 수행하기 위해, 분리된 세포가 제14항의 홀더(6)에 고정된 여과 막(1) 상에 이동되는 것을 특징으로 하는 방법.
    

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