CN111751543A

CN111751543A - 一种稀有肿瘤细胞富集方法及试剂盒

Info

Publication number: CN111751543A
Application number: CN201910239358.2A
Authority: CN
Inventors: 郑磊; 司徒博; 叶昕怡
Original assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Current assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2020-10-09

Abstract

本发明公开了一种稀有肿瘤细胞的富集方法，包括如下步骤，用粘附剂包被细胞分离载体，将待富集的样品加入包被后的载体中，将加样后的多孔培养板进行富集处理，吸附于底部粘附剂包被层的为稀有肿瘤细胞。本发明利用包被的粘附剂层形成粘性界面，而且肿瘤细胞表面粘附性蛋白的表达量较白细胞高，粘附能力较白细胞更强，在同等条件下，肿瘤细胞先被粘附，白细胞未粘附而被去除，从而达到富集目的。本发明还公开了用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒。本发明所述的富集方法操作简单，富集效果好，白细胞去除率和肿瘤细胞回收率高，有良好的应用前景。

Description

一种稀有肿瘤细胞富集方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种稀有肿瘤细胞富集方法、富集用试剂盒以及牛血清白蛋白在制备该试剂盒中的应用。

背景技术

恶性肿瘤在播散、侵袭、转移的过程中常伴有肿瘤细胞进入体液，如血液、胸水、腹水、脑脊液等。因此，在此类样本中对肿瘤细胞进行检测是判定肿瘤存在、转移的关键，具有重要的临床意义。例如，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)主要指为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞。透过基底膜进入血液后，少数CTCs能逃避机体的免疫杀伤而存活下来，部分肿瘤细胞团也可以直接从原发灶脱离并进入循环系统，形成循环肿瘤微栓。

血中的CTCs不仅具有循环的特性，还保留了原始肿瘤细胞的生物学特性，包括细胞体积、表面蛋白及糖蛋白、电荷等特性。这些CTCs和CTM随血液播散后可在其他部位形成新的转移灶，与肿瘤的转移和复发密切相关。因而CTCs的检测及分析在微转移灶早期发现、疗效评估与个体化治疗等方面具有重要临床应用价值。但是，这类样本中的肿瘤细胞通常数量非常稀少，例如CTCs在外周血中十分稀少，大约为每10¹⁰(100亿)个血细胞或每10^8-9个白细胞中存在1个CTC。

因此，稀有肿瘤细胞的富集是一切研究工作的基础，目前，如何从恶性肿瘤患者体液样本中分离稀有肿瘤细胞，从而中得到更多的诊断信息和治疗信息是生物医学领域面临的共同挑战。

现有的稀有肿瘤细胞富集方法主要有以下几种：

a)基于生物学特性-蛋白表达：包括正向富集(使用表面蛋白抗体结合稀有肿瘤细胞，如Epcam抗体)，或者负向富集(CD45抗体结合白细胞等非稀有肿瘤细胞，再利用磁珠去除白细胞，达到富集目的)。

b)基于物理特性-大小、电荷：包括膜过滤、芯片过滤、密度梯度离心、介电电泳等。膜过滤和芯片过滤是指利用肿瘤细胞比白细胞体积大，使用带固定孔隙的膜或芯片进行过滤，得到体积较大的细胞；密度梯度离心是使用固定的密度分离液，将肿瘤细胞与其他单个核细胞进行分离，去除了除单个核细胞以外的红细胞及白细胞；介电电泳法是基于细胞的介电性质例如膜容量、膜阻抗和胞质电导率是随细胞结构和活动而变化，不同细胞有不同的介电性质，经测定证明肿瘤细胞的电容远大于各种血细胞，因此可通过介电性质的不同将肿瘤细胞与其他各种血细胞进行分离。

c)基于物理特性结合生物学特性：例如droplet微滴芯片、微流控。

但是，上述方法中，基于抗原抗体结合从而进行富集的方法如细胞表面蛋白EpCAM等这类标志物富集稀有肿瘤细胞的特异性欠佳，部分正常内皮细胞也会表达上皮型标志物，甚至有研究表明极少数中性粒细胞也会表达；而且，这类标志物只表达在部分上皮源性的恶性肿瘤(癌)中，无法用于间叶组织源性的恶性肿瘤，并且即使是源自上皮组织的恶性肿瘤，研究也证实肿瘤细胞亦会在转移、进展和治疗等情况下发生EMT而导致该类标志物的表达降低甚至缺失，从而导致漏检。此外也有文献报道，循环肿瘤细胞在与抗体结合后改变其原有的信号通路；采用类似的方法，通过耗尽CD45阳性白细胞来富集稀有肿瘤细胞，但相当一部分白细胞只有低水平的表面标志物表达，导致富集的效率欠佳。

此外，基于生物学特性的富集需要使用的抗体量较大，抗体使用的价格较高，限制大规模的临床使用。且分离后的细胞可能会因为磁珠无法与细胞完全分离干净而导致细胞完整性和活性受到破坏，导致捕获细胞的再利用受到一定影响。

基于细胞大小或介电性质等物理特性的富集方法，由于稀有肿瘤细胞和外周血单个核细胞(PBMC)大小之间存在相当大的重叠，这些方法虽然可以富集一定纯度的稀有肿瘤细胞，但纯粹基于大小的分离可能造成部分体积较小的细胞的丢失，即损失了用于下游分析的重要转移信息；而基于介电性质的富集方法首先要用密度梯度法富集细胞，这可能造成稀有肿瘤细胞细胞的丢失，并且各种肿瘤细胞的介电性不同，并不适用于所有的肿瘤细胞，适用面窄。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种稀有肿瘤细胞富集方法、富集用试剂盒、粘附剂在制备上述试剂盒中的用途、用于稀有肿瘤细胞富集的细胞分离载体、以及改善肿瘤细胞粘附性的方法。

本发明的第一方面，提供一种稀有肿瘤细胞富集方法，包括如下步骤：

S1.包被：用粘附剂包被细胞分离载体，形成包被层；

S2.加样：将待富集的样品加入包被后的载体中；

S3.富集：将载体中的样品进行富集处理，吸附于底部粘附剂包被层的为稀有肿瘤细胞。

根据本发明，所述方法还包括步骤S4：弃去上层液体，获得富集的稀有肿瘤细胞。

根据本发明，所述粘附剂可以选自牛血清白蛋白(BSA)，多聚赖氨酸，Fn纤维连接蛋白、胶原蛋白中的至少一种；优选牛血清白蛋白。

根据本发明，所述载体可以为多孔培养板、酶标板、细胞离心管、玻片、PDMS芯片、仿生生物膜、玻璃芯片、纸芯片、细胞培养微流控芯片等中的一种。所述多孔培养板或酶标板没有特别的限定，可以为本领域已知的各种类型和规格；作为本发明的一个实施方式，所述多孔培养板为96孔板或48孔板。

根据本发明，所述稀有肿瘤细胞的来源并没有特别限定，例如可以为来源于肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、间质瘤、胶质瘤中一种或两种以上的肿瘤细胞。

根据本发明，所述步骤S1为将粘附剂溶于无菌水，配成溶液，加至载体中，干燥至表面无液体流动。

根据本发明，所述干燥为水浴箱中温干；优选地，所述干燥温度为37℃。

根据本发明，所述载体在干燥前可封上封板纸。

根据本发明，所述步骤S1的粘附剂溶液质量浓度为0.1％-75％。作为本发明的一个实施方案，所述步骤S1的粘附剂为0.1％-10％的多聚赖氨酸，优选0.3-5％，例如1％、1.5％、2％、3％、4％。作为本发明另一实施方案，所述步骤S1的粘附剂为10％-75％的牛血清白蛋白，优选15％-50％，例如20％、25％、30％、35％、40％。根据本发明，所述粘附剂溶液的使用量为每孔2-5μL，例如为4μL。

根据本发明，所述步骤S2中样品为血液、细胞悬浮液、胸水、腹水、脑脊液中、肿瘤组织、肿瘤活检物和/或组织试样的一种。

根据本发明，所述步骤S2包括将去除全血中红细胞后重悬的步骤；所述红细胞可通过本领域已知的方法去除，例如红细胞裂解、密度梯度离心、Ficoll分离法或者免疫磁珠分离法等。

根据本发明，所述步骤S2中，每个多孔培养板孔中加入样品的量为100-220μL，例如200μL。根据本发明，所述步骤S3中，离心力为10g-150g，例如为20-90g、25g-70g、35g-50g；具体地，例如为35g、40g、50g、70g。

根据本发明，所述步骤S3的富集处理为采用离心力、负压或者脉冲电场，促使稀有肿瘤细胞粘附于包被层；作为一个具体实施方式，将加样的载体例如多孔培养板、酶标板或细胞离心管进行离心。

根据本发明，所述步骤S3中，离心时间为1-5min，例如为1-3min；具体地，例如为1min、2min、3min、4min、5min。

根据本发明，所述稀有肿瘤细胞富集方法为离体操作；具体地，是采用离体样本进行细胞富集。

本发明的第二方面，提供一种用于富集稀有肿瘤细胞的试剂盒，包括粘附剂、无菌水。

根据本发明的试剂盒，还包括红细胞裂解液和细胞重悬液。

根据本发明的试剂盒，还包括载体；例如多孔培养板、酶标板、玻片，优选96孔板。

根据本发明的试剂盒，所述稀有肿瘤细胞富集步骤如第一方面所述。

本发明的第三方面，提供上述粘附剂在制备用于稀有肿瘤细胞富集的试剂盒中的应用。

根据本发明的应用，所述稀有肿瘤细胞富集步骤如第一方面所述。

本发明的第四方面，提供一种用于稀有肿瘤细胞富集的细胞分离载体，所述载体经粘附剂包被。所述粘附剂可以为多聚赖氨酸，Fn纤维连接蛋白、胶原蛋白中的至少一种。

本发明的第五方面，还提供一种改善肿瘤细胞粘附性的方法，包括用粘附剂包被细胞分离载体，例如所述粘附剂可以为牛血清白蛋白、多聚赖氨酸，Fn纤维连接蛋白、胶原蛋白中的至少一种。

根据本发明所述改善肿瘤细胞粘附性的方法，还包括将含有肿瘤细胞的样品加入包被后的载体中；将加样后的载体进行富集处理，吸附于底部包被层的为肿瘤细胞；示例性地，所述肿瘤细胞来源于肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、间质瘤、胶质瘤中一种或两种以上的肿瘤细胞。

作为本发明的具体实施方案，本发明的稀有肿瘤细胞富集方法用于非治疗或非诊断目的的用途，例如用于死亡个体的病理解剖、细胞系培养的细胞样本分离等非治疗或非诊断目的。

应当理解，本发明第四方面、第五方面所述的载体和粘附剂包被的步骤具有和第一方面相同的含义。

此外，本领域技术人员应当理解，本发明的富集方法并不涉及任何诊断步骤或者检测步骤，是一种脱离人体或动物体的样本的处理方法，富集方法实施后所获得的肿瘤细胞仅可作为一种中间纯化样本，并不能直接获得受试者的疾病诊断结果或者健康状况。

有益效果

1.本发明利用包被的粘附剂在孔板上形成粘性界面，而且肿瘤细胞表面粘附性蛋白的表达量较白细胞高，因而肿瘤细胞的粘附能力较白细胞更强，在同等条件下，肿瘤细胞先被粘附，而白细胞未粘附而被去除，从而达到富集目的。本发明的富集方法不依赖于蛋白表达，摆脱癌种限制，可适用于泛癌检测。

2.本发明使用粘附剂包被在多孔板或离心管上，富集过程只需要经过离心或负压等简单处理即可完成，无需特殊的仪器及耗材，富集装置简单且成本低廉，易于操作，方便快捷。

3.本发明通过粘附力富集体液中的稀有肿瘤细胞，例如血中的CTCs进行富集，不依赖抗体捕获，在不同肿瘤细胞的细胞系回收率均可达到70％左右，且与传统富集方法(免疫磁珠阴性富集、Ficoll密度梯度离心富集等)相比，回收率更高，且方法稳定性及白细胞去除效率更有优势。

术语定义和说明术语

术语“稀有肿瘤细胞”是指肿瘤组织中从原位脱落、散播进入体液的肿瘤细胞，如血液、胸水、腹水、脑脊液等。

术语“循环肿瘤细胞”、“CTC”和“CTCs”在本文中可互换使用，是指从肿瘤脱落并在血液中(即在循环中)存在的肿瘤细胞，包括自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞。

术语“样品”或“标本”是指从生物有机体获取或分离的试样，例如来自受试者的血液试样，示例性的生物学试样包括但不限于：生物流体试样、血清、血浆、尿液、唾液、肿瘤组织、肿瘤活检物和/或组织试样等；还包括未处理或预处理的生物学试样。在一些实施方式中，还可以包括来自受试者的细胞，例如来自受试者肿瘤细胞的试样。

术语“癌症”或“肿瘤”是指干扰机体器官和系统的正常功能的不受控的细胞生长，包括良性和恶性。患有癌症或肿瘤的受试者是在受试者体内存在客观上可测量的癌细胞的受试者。

附图说明

图1：本发明富集方法的操作示意图。

图2：BSA包被对白细胞粘附作用的影响；图A为未包被的孔板和BSA包被的96孔板中同等离心条件下白细胞清除率对比，图B为BSA包被后同等离心条件下白细胞的粘附情况，图C为未包被96孔板中白细胞的粘附情况。

图3：BSA包被对于肺癌细胞系A549粘附作用的影响；图A为未包被的96孔板和BSA包被的96孔板中同等离心条件下肿瘤细胞回收率对比，图B为未包被的96孔板和BSA包被的96孔板中同等离心条件下白细胞清除率对比。

图4：实施例1中离心前、离心后30min和60min的A549肿瘤细胞活性对比。

图5：本发明的富集方法富集MCF-7、HeLa、SSMC-7721、MDA-MB231、A549、H1975、HT29、HepG2肿瘤细胞系的回收率。

图6：离心力大小对于肿瘤细胞回收率和白细胞清除率的影响。

图7：离心时间对于肿瘤细胞回收率和白细胞清除率的影响。

图8：实施例4中富集肺癌患者5mL外周血样CTC后的阳性细胞数散点图。

图9：实施例5采用多聚赖氨酸作为粘附剂富集A549细胞系的电镜图。

图10：实施例1与对比例1的Ficoll密度梯度离心法和对比例2的免疫磁珠阴性富集法的肿瘤细胞回收率和白细胞清除率对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外，应理解，在阅读了本发明所公开的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1BSA包被孔板对于肿瘤细胞和血液白细胞粘附作用的影响

S1.将BSA粉末溶于无菌水，配制质量浓度为20％的溶液，取4μL每孔加至96孔板中，封上封板纸后于37℃水浴箱中进行温干，至表面无液体流动；

空白对照为无任何处理的96孔板；

S2.用红细胞裂解液裂解全血中的红细胞，弃去上清，取下层白细胞进行重悬，以PBS重悬至200μL，分别加入到S1经BSA包被的96孔板和空白的96孔板中，将白细胞以5×10⁸每孔记录(相当于一毫升全血裂解后所得的白细胞重悬液加入两个孔中)；

S3.将S2加样后的96孔板放置在离心机中，35g 1min离心后弃去上层液体，并于镜下进行观察(参见图2B、图2C所示)。

将S2步骤替换为如下操作，其他操作不变：

S2’.取A549细胞肺癌细胞系，使用CFDA预标记的A549细胞消化后在荧光显微镜下进行计数。将全血裂解出白细胞后使用PBS进行重悬至400μL，取10μL重悬液进行计数。按一毫升血液裂解出的白细胞加入一百个左右肿瘤细胞的比例进行添加，将混合样品分别加入到BSA包被和未包被的96孔板中。然后先于荧光显微镜下计数具体掺入的细胞数n₁，再进行35g离心1min，弃去上清后再次进行计数n₂，将两次荧光显微镜下计数得肿瘤细胞数比值n₂/n₁作为回收率，取离心后剩余的白细胞进行稀释后计数，与全血裂解后的白细胞计数进行对比，得出白细胞去除率。分别计算BSA包被和未包被的96孔板离心后白细胞的清除率和肿瘤细胞的回收率，结果分别如图2A/图3B、图3A所示。

根据图2、图3可以看出，包被了BSA之后，白细胞的粘附较未包被的孔板大为减少，而孔板包被了BSA之后对于肿瘤细胞的粘附大大增加，使得肿瘤细胞能被特异性富集到BSA包被层。可见，BSA包被增大了白细胞和肿瘤细胞之间的粘附差异。

进一步考察该富集方法对于肿瘤细胞活性的影响，发现离心前、离心后30min和60min的A549肿瘤细胞活性没有明显变化，说明该富集方法对于肿瘤细胞活性影响非常小，可以很大程度保留循环肿瘤细胞的活性和基因完整性，有利于对细胞的下游分析与应用。

实施例2BSA包被孔板对于其他肿瘤细胞系的粘附作用

分别取MCF-7、HeLa、SSMC-7721、MDA-MB231、A549、H1975、HT29、HepG2肿瘤细胞系重复上述操作，结果如图5所示。结果显示，BSA包被对于上述细胞的回收率均在70％左右，具有较大的临床应用价值。

实施例3离心条件对富集效果的影响

在实施例1的基础上，保持其他条件不变，分别以13g、23g、29g、36g、43g、51g、70g、91g的离心力离心1min，另一组以35g的离心力分别离心1min、2min、3min、4min、5min。

各条件下离心力大小和离心时间对肿瘤细胞回收率和白细胞清除率影响如图6、图7所示；由此可见，离心力为25-45g、离心时间1-2min范围内，可以达到非常好的回收率和白细胞清除率。

实施例4BSA包被孔板应用于人外周血循环肿瘤细胞富集

共收集受试者11份肺癌全血标本，10例健康志愿者血样(血液样品由南方医院检验科提供)。

S1.将BSA粉末溶于无菌水，配制质量浓度为20％溶液，取4μL每孔加至96孔板中，封上封板纸后于37℃水浴箱中进行温干，至表面无液体流动；

S2.用红细胞裂解液裂解全血中的红细胞，弃去上清，取下层细胞进行重悬后，以PBS重悬至200μL，分别加入到S1经BSA包被的96孔板，一毫升全血裂解后所得的细胞重悬液加入两个孔中；

S3.将S2加样后的96孔板放置在离心机中，35g 1min离心后弃去上层液体，并于镜下进行观察。

肺癌血液样本和健康血样中阳性细胞数量分布如图8所示。

由以上实施例可以看出，多孔板被BSA包被后其表面具有较大的粘性，可对细胞产生粘附作用，而且肿瘤细胞表面高表达的特异性粘附蛋白介导肿瘤细胞表面粘附力增加，在离心过程中，肿瘤细胞体积较大且表面粘附能力较强，更易与底部的包被层结合。而白细胞体积较小且表面无相关粘附蛋白的高表达，在离心过程中尚不能贴到管底即被弃去，从而实现血液中循环肿瘤细胞与白细胞的分离，进而实现循环肿瘤细胞的富集。

实施例5：多聚赖氨酸包被孔板应用于稀有肿瘤细胞富集

使用质量浓度3％的多聚赖氨酸溶液对九十六孔板进行包被，每孔4μL，温浴至表面无液体流动时即可进行使用。参照实施例1的步骤，取全血裂解后所得的白细胞PBS重悬后，与CFDA预标记的A549细胞悬浮液混合，将样品加入包被的96孔板中使用离心机进行低速离心，镜下可观察到肿瘤细胞同样可被粘附在粘附剂介质表面(图9)，即通过二者的粘附能力差异可实现稀有肿瘤细胞富集的目的.对比例1Ficoll密度梯度离心富集法

1.在15mL离心管中加入于血液两倍体积的淋巴细胞分离液。

2.取肝素抗凝静脉血和A549细胞肺癌细胞系的混合液(两毫升全血加入约一百个CFDA预标记的肿瘤细胞)，与等量RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。

3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带。

4.用胶头吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。

5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞，即可稀释后于显微镜下计数。

对比例2免疫磁珠阴性富集法

将采集的外周血转移到50mL离心管中，按体积1:3加红细胞裂解液；450g离心5min后弃去上清；再加入红细胞裂解液至50mL，置暗室室温匀速旋转孵育8min；450g离心5min分钟后再次弃上清；充分裂解残余的红细胞后加入缓冲液至5mL，细胞重悬后显微镜下计数；取A549细胞肺癌细胞系，使用CFDA预标记的A549细胞消化后在荧光显微镜下进行计数。按一毫升血液裂解出的白细胞加入一百个左右肿瘤细胞的比例进行添加，再次450g离心5min后弃去上清；按10⁷个细胞加入20μL抗人CD45磁珠的比例，将细胞与磁珠混匀，并在4℃避光孵育15min；加入10mL缓冲液，450g离心，弃上清；按照每10⁷个细胞加入500μL缓冲液的比例，重悬细胞；细胞悬液放入磁力架中，在强磁场的作用下收集悬液，滴在载玻片上，室温干燥细胞滴片；滴加2％多聚甲醛固定40min，PBS洗涤3次，干燥后的滴片进行细胞免疫荧光染色鉴定。

本发明实施例1与对比例1、对比例2的方法的肿瘤细胞回收率和白细胞清除率如图10所示。分析本发明的富集方法与对比例1、2的方法的各项指标，如表1所示。

表1

由此可见，本发明包被法肿瘤细胞回收率和白细胞清除率均高于传统的Ficoll密度梯度离心富集法和免疫磁珠阴性富集法，且所需时间和成本均远低于后者，操作简单，方便快捷，具有良好的临床应用前景。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种稀有肿瘤细胞富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.包被：用粘附剂包被细胞分离载体，形成包被层；

S2.加样：将待富集的样品加入包被后的载体中；

2.根据权利要求1所述的稀有肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述方法还包括步骤S4：弃去上层液体，获得富集的循环肿瘤细胞；优选地，粘附剂选自牛血清白蛋白(BSA)，多聚赖氨酸，Fn纤维连接蛋白、胶原蛋白中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的稀有肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述循环肿瘤细胞为来源于肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、间质瘤、胶质瘤中一种或两种以上的肿瘤细胞；优选地，所述载体为多孔培养板、酶标板、细胞离心管、玻片、PDMS芯片、仿生生物膜、玻璃芯片、纸芯片、细胞培养微流控芯片等中的一种。

4.根据权利要求1-3任一项所述的稀有肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述步骤S1为将粘附剂溶于无菌水，配成溶液，加至多孔培养板中，干燥至表面无液体流动；

优选地，所述步骤S1所述粘附剂溶液质量浓度为0.1％-75％；

优选地，所述粘附剂溶液的使用量为每孔2-5μL。

5.根据权利要求1-4任一项所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述步骤S2中样品为血液、细胞悬浮液、胸水、腹水、脑脊液中的一种；

优选地，所述步骤S2包括将全血加入红细胞裂解液后重悬的步骤。

优选地，所述步骤S2中，每个多孔培养板孔中加入样品的量为100-220μL。

6.根据权利要求1-5任一项所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述步骤S3的富集处理为采用离心力、负压或者脉冲电场，促使稀有肿瘤细胞粘附于包被层；优选地，所述步骤S3中，离心力为10g-150g；离心时间为1-5min。

7.一种用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，包括粘附剂、无菌水；

优选地，所述粘附剂为牛血清白蛋白、多聚赖氨酸、Fn纤维连接蛋白、胶原蛋白中的至少一种；

优选地，所述试剂盒还包括红细胞裂解液和细胞重悬液；优选地，所述试剂盒还包括细胞分离载体，例如多孔培养板、酶标板、细胞离心管、玻片、PDMS芯片、仿生生物膜、玻璃芯片、纸芯片、细胞培养微流控芯片等中的一种；

优选地，所述试剂盒用于循环肿瘤细胞富集时采用如权利要求1-6任一项所述的步骤。

8.牛血清白蛋白在制备如权利要求7-9任一项所述用于富集稀有肿瘤细胞的试剂盒中的应用。

9.一种用于稀有肿瘤细胞富集的细胞分离载体，其特征在于，所述载体经粘附剂包被；

优选地，所述粘附剂为牛血清白蛋白、多聚赖氨酸、Fn纤维连接蛋白、胶原蛋白中的至少一种。

10.一种改善肿瘤细胞粘附性的方法，其特征在于，包括用粘附剂包被细胞分离载体，然后将细胞样品加入所述载体中进行富集处理；例如所述粘附剂为牛血清白蛋白、多聚赖氨酸，Fn纤维连接蛋白、胶原蛋白中的至少一种。