CN105087778A - 一种基于稀有细胞检测her-2/cep17基因状态的方法及相关试剂盒 - Google Patents

一种基于稀有细胞检测her-2/cep17基因状态的方法及相关试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于稀有细胞检测HER-2/CEP17基因状态的方法及试剂盒,所述方法包括以下步骤:步骤1,获得血液样本或体液样本,样本中包含循环肿瘤细胞或其他稀有细胞与白细胞的混合细胞群;步骤2,用缓冲液稀释样本,去除血浆,并回收CTC或其他稀有细胞;步骤3,用红细胞裂解液裂解,去除红细胞,并回收CTC或其他稀有细胞;步骤4,用包被有抗人白细胞相关抗原抗体的磁微粒同回收细胞混匀孵育,结合并形成磁微粒-白细胞混合体;步骤5,离心将磁微粒-白细胞混合体与其他细胞分离,得到含有CTC或其他稀有细胞及少量白细胞的混合细胞群;步骤6,使用免疫荧光细胞化学与荧光原位杂交的相结合的方法,测定HER-2/CEP17的状态,同时进行CTC或其他稀有细胞的鉴别。

Description

-种基于稀有细胞检测HER-2/CEP1 7基因状态的方法及相 关试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及医学诊断学,特别涉及肿瘤细胞的检测。更具体地讲,本发明涉及检测 癌症和评估患者的治疗方案的诊断方法。
背景技术
[0002] 循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell,CTC)指进入到血液循环中的肿瘤细胞, 其可由原发灶或转移灶脱落入血,亦可能在形成实体瘤病灶之前进入血液中。肿瘤细胞侵 入循环系统,大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡,只有极少数 存活下来,并在远端或原发组织及器官种植,进一步发展为转移灶,是导致肿瘤转移和复发 的最直接因素。
[0003]CTC作为一种可以代表原发肿瘤的"液体活检"样本,外周血标本易获取、创伤性 小、可反复采集,是临床检测更为理想的标本来源,可对肿瘤治疗进行实时全面监测。可有 效实现肿瘤复发预警,疗效及时评价以及肿瘤个体化治疗用药指导,目前CTC检测已广泛 运用于临床肿瘤患者的疗效实时评价、病情实时监测、耐药析因、预后判断中。
[0004]焚光原位杂交(fluorescentinsituhybridization,FISH)是一种细胞遗传学 技术,可以用来对核酸进行检测和定位。目前基于脱落稀有细胞的FISH技术一般为定性检 测,很难做到精准定量且保证其效果。究其根本原位在于目前适用于组织标本的FISH检测 方法及普通的脱落细胞学FISH检测方法,当数量级在0-100间的细胞涂片后,无法在着色 效果和有效保持细胞方面取得较好的平衡并保持较高的稳定性,更难以形成有效稳定定量 检测的成型产品。目前虽有相应专利阐述一种有效方法(US6, 524, 798),但需极其高昂成 本的专用检测设备,无法在常规实验室完成这基于及少量稀有细胞、甚至是单细胞层面的 FISH检测工作。
[0005] 此前已描述了来自生物样品的肿瘤细胞、稀少细胞或其他生物实体的鉴定方法 (如中国专利申请号:200810097889. 4、201310057307. 0)。此两步法要求有效富集以确保 在分析之前获取靶细胞,同时去除大量碎片和其他干扰物质,使得可通过成像技术进行细 胞检验。此方法以独特的阴性富集策略将免疫磁微粒与多密度离心方式、荧光原位杂交和 免疫荧光细胞化学分析组合起来,精确定量地检测几乎所有实体肿瘤类型中脱落至含血 液、胸/腹腔积液、尿液、脑脊液等多种生物体液标本中的稀有细胞(含CTC)。此组合方法 用于富集和计数血样中的染色体扩增型肿瘤细胞,因此提供了一种量度癌症的工具。
[0006] 原癌基因人类表皮生长因子受体2(HER-2)基因,即c-erbB-2基因,定位于染色 体17ql2_21. 32上,编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白,具有酪氨酸激酶活性。 目前基于HER-2基因的检测,广泛应用于乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤的预后分析,尤其是基于 HER-2靶点的曲妥珠单抗(商品名:Here印tin)药物的临床应用方面。
[0007]《乳腺癌HER-2检测指南》中指出乳腺癌HER-2检测方法及报告推荐用两种方法检 测乳腺癌HER-2,即检测蛋白的免疫组化法(IHC)和检测基因的荧光原位杂交(FISH)法,该 指南建议,ffiR-2检测FISH报告主要包括:所计数的浸润癌细胞数量、平均每个细胞核中HER-2信号数量、平均每个细胞核中CEP17信号数量、平均每个细胞核中HER-2和CEP17信 号数量的比值。
[0008] 但是临床检测时,会由于例如已手术切除、患者主观意愿不胁从等诸多无法有效 获得肿瘤组织的情况,而存在以下局限性:
[0009] 1、作为有创性且受限于病灶位置的组织学检测,存在标本取材不易或无法取材等 局限性,且术后不能反复取材,导致组织取材无法提供实时性的监测信息。
[0010] 2、且受治疗的影响等,肿瘤细胞的分子信息有可能发生动态改变。如:有研究报 道,接受新辅助化疗的乳腺癌患者,在化疗前接受活检,并将结果与术后病理进行对照,发 现存在治疗前后ffiR-2表达不一致的情况。
[0011] 3、肿瘤组织异质性的存在以及单点活检造成的只是局部信息反映的现状,使得传 统组织学检测缺乏全面整体性的评价,如原发灶、多发转移灶信息的综合评价等。
[0012] 本发明在于提供了一种检测CTC或其他稀有细胞的同时对HER-2/CEP17的数量及 比值进行检测的方法。以获得更加全面的信息。本发明在分离获取血液中CTC(或其他稀 有细胞)的基础上,进行单细胞分子分析,检测ffiR-2表达情况,以此来从单细胞水平上,即 时地发现HER-2的分子信息,以便对患者的状态进行实时观察。
发明内容
[0013] 本发明提供一种检测CTC或其他稀有细胞的同时对HER-2/CEP17的数量及比值进 行检测的方法。直接帮助临床医师了解肿瘤患者实时的基因状态,以辅助预测生存情况并 拟定下一步治疗方案。本发明的方法包括以下全部及部分步骤:
[0014] 步骤1,从患者获得血液样本或其他含有稀有细胞的体液样本,样本中包含CTC或 其他稀有细胞与白细胞的混合细胞群;
[0015] 步骤2,用缓冲液稀释样本,离心去除血浆,并回收CTC或其他稀有细胞;
[0016] 步骤3,用红细胞裂解液裂解,离心去除红细胞并回收CTC或其他稀有细胞;
[0017] 步骤4,用包被有抗人白细胞相关抗原抗体的磁微粒同步骤3所得的回收细胞混 匀孵育,以使磁微粒同标的白细胞充分结合并形成磁微粒-白细胞混合体;
[0018] 步骤5,离心将磁微粒-白细胞混合体与其他细胞分离,得到含有CTC或其他稀有 细胞及少量白细胞的混合细胞群;
[0019] 步骤6,使用免疫荧光细胞化学与荧光原位杂交的相结合的方法,测定HER-2/ CEP17的状态,同时进行CTC或其他稀有细胞的鉴别。
[0020] 本发明所述的方法,其中,步骤2所述缓冲液为一种与血液密度相近的缓冲液,含 有BSA、PBS等物质,pH7-8之间,能够保证去除血浆的同时,保护各种有核细胞。
[0021] 本发明所述的方法,其中,步骤3所述红细胞裂解液为一种红细胞裂解液,利用等 渗不等张的原理,裂解红细胞的同时,不会损伤其他有核细胞。
[0022] 如以下配方的裂解液:
[0023] NH4C1 82. 9g
[0024] KHC0310g
[0025] EDTAO. 37g
[0026] 加H20至1000ml(高压灭菌,4°C保存)
[0027]或
[0028] 红细胞裂解液(Tris-MMCl):称取3. 735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷(Tris)I. 3g 加水溶解并稀释至500ml。0. 22ym滤膜过滤除菌,4°C保存。
[0029] 本发明所述的方法,其中,步骤4所述包被有抗人白细胞相关抗原抗体的磁微粒 为一种包被抗白细胞共同抗原抗体的链亲和素磁珠。能够最大量地、牢固地结合白细胞,利 于后续的分选处理。
[0030] 本发明所述的方法,其中步骤5所述离心介质为一种密度介于1. 070-1. 080之间 的密度梯度离心液,其中以1. 072最优,可以在去除结合磁珠的白细胞的同时,保存其他单 个有核细胞不丢失。
[0031] 本发明所述的方法,其中,步骤6所述使用免疫荧光细胞化学与荧光原位杂交的 方法,对CTC或其他稀有细胞进行CTC鉴别,同时测定HER-2/CEP17,方法如下:
[0032] (l)HER-2扩增型CTC:将标本置于荧光显微镜相应通道下观察,若发现多个HER-2 信号点分布(彡3个),且数目大于CEP17的信号点数,并且无⑶45抗原表达,则计为一个 CTC阳性细胞,且直接视该细胞为HER-2阳性细胞;
[0033] (2)染色体扩增型CTC:计数单个有核细胞CEP17信号数目,若大于等于3个信号 点且无⑶45抗原表达,则计为一个CTC阳性细胞;
[0034] (3)HER-2/CEP17-CTC总数目:记录所有HER-2扩增型及染色体扩增型CTC数目, 总和视为HER-2/CEP17-CTC总数目;
[0035] (4)HER-2基因扩增状态记录:在所有标本区域中若有明显且典型HER-2扩增,则 记为HER-2扩增;若无,则将所有CTC细胞内平均每个细胞核中HER-2信号数量、平均每个 细胞核中CEP17信号数量、平均每个细胞核中HER-2和CEP17信号比值的结果。
[0036] -种用于上述方法的试剂盒一,包括如下成分:
[0037]
Figure CN105087778AD00071
[0038]
Figure CN105087778AD00081
[0039] 其中,IOX、20X表示浓度,即该溶液为10倍/20倍的浓度。
[0040] 本发明所述的试剂盒制备方法如下:
[0041] 试剂盒一包含下述富集及鉴别两部分的试剂。
[0042] 富集部分:
[0043] CSl浓缩缓冲液(IOX):
[0044] 每1000 mL水中,含有 60gBSA,5 包PBS粉末(2L/ 包),IOOmL0• 5M的EDTA,0• 8mL Proclin300。
[0045] CS2浓缩储存液(IOX):
[0046]每1000 mL水中,称取 82. 9gNH4Cl、10gKHC03、0. 37gEDTA,水以及 0• 8mL Proclin300,进行充分的搅拌溶解,定容,配制为IOX浓缩液。
[0047]CS3分离介质:
[0048] 将密度为1. 077的梯度离心液稀释,稀释过程中测试密度,使其密度在 1. 070-1. 075 之间。
[0049] 磁微粒混悬液:
[0050] 将⑶45抗体浓度调整为lmg/mL,与链亲和素免疫磁珠按照IOOuL:ImL的比例进行 孵育lh,即配制为磁微粒混悬液。
[0051] 鉴别部分:
[0052] CFl固定液:
[0053] 混合PEG和无水乙醇,使PEG终浓度为1 %,无水乙醇终浓度为50 %。
[0054] 10XCF2 固定液:
[0055] 以PBS为溶剂,溶解PFA粉末,配制为5 %的PFA浓缩液。
[0056] 甲酰胺工作液:
[0057] 将甲酰胺原液稀释为50%的工作液。
[0058] 20XSSC浓缩缓冲液:
[0059]1000 mL水中,加入氯化钠175. 3g,柠檬酸铵88. 2g。
[0060]HER-2/CEP17 探针:
[0061] 使用甲酰胺、硫酸葡聚糖钠盐将HER-2及CEP17,配制为探针工作液。
[0062]BSA粉末:
[0063] 外购分装。
[0064]CD45-AF594 荧光抗体:
[0065] 将⑶45抗体与Alexa Flour 594荧光素避光孵育lh,荧光素即可与⑶45抗体连 接。
[0066]DAPI染色液:
[0067] 使用防淬灭剂Mountingmedium将lmg/mL的DAPI原液按照1:1000进行稀释,配 制为DAPI染色工作液。
[0068] 本发明所述试剂盒一的使用方法,步骤如下:
[0069] (1)将0•l_5mL血液标本加入至50mL离心管中,加入稀释好的CSl工作液至45mL, 650Xg离心5分钟,吸弃上清并剩余约12mL液体;
[0070] (2)轻摇混匀,加入稀释好的CS2裂解工作液至45mL,混匀8-10分钟,650 X g离心 5分钟,吸弃上清液体;
[0071] (3)加入CSl工作液适量并轻摇混匀,再次加入一定量CSl工作液,加入清洗过的 磁微粒混悬液200uL,水平摇匀(120rpm) 20分钟;
[0072] (4)吸取全部混匀后液体,叠加至CS3分离介质上,300Xg离心5分钟;
[0073] (5)吸取除磁微粒沉淀以外的上两层液体至15mL离心管中,加入CSl工作液至 15mL,950Xg离心5分钟,吸弃上清;
[0074] (6)加入ImLCSl工作液,吹打混匀并加入至新2mL离心管中,磁力分选2分钟。 转移上清至I. 5mL离心管中,放置在15mL离心管上,3400rpm离心3分钟。
[0075] (7)吸弃上清,加入CFl固定液,吹打混匀并涂片,自然晾干;
[0076] (8)加入CF2固定工作液,计时8-10分钟;
[0077](9)吸弃液体,放入已预热的2XSSC染缸10分钟;
[0078] (10)依次放入75%、85%、无水乙醇中2-5分钟;
[0079] (11)加入IOuLHER-2/CEP17探针,盖上盖玻片,封片并放入杂交仪或其他控温装 置,76°C5 分钟,37°C4-20 小时;
[0080] (12)取出标本,撕下封片物质,放入已预热的甲酰胺工作液,计时15分钟;(13)置 于2XSSC中5-10分钟;
[0081](14)取出,加入配制好的CD45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL2%BSA),每玻 片200uL,避光反应1-5小时;
[0082] (15)吸弃多余液体,0. 2%BSA清洗1-3次,加入DAPI复染剂10uL,封片。本发明 还提供另外一种用于本发明方法的试剂盒二,包括如下成分:
[0083]
Figure CN105087778AD00101
[0084] 其中,IOX、20X表示浓度,即该溶液为10倍/20倍的浓度。
[0085] 试剂盒二包含下述鉴别部分的试剂。
[0086] 鉴别部分:
[0087] CFl固定液:
[0088] 混合PEG和无水乙醇,使PEG终浓度为1 %,无水乙醇终浓度为50 %。
[0089] 10XCF2固定液:
[0090]以PBS为溶剂,溶解PFA粉末,配制为5 %的PFA浓缩液。
[0091] 甲酰胺工作液:
[0092] 将甲酰胺原液稀释为50%的工作液。
[0093] 20XSSC浓缩缓冲液:
[0094]1000 mL水中,加入氯化钠175. 3g,柠檬酸铵88. 2g。
[0095]HER-2/CEP17 探针:
[0096] 使用甲酰胺、硫酸葡聚糖钠盐将HER-2及CEP17,配制为探针工作液。
[0097]BSA粉末:
[0098] 外购分装。
[0099]CD45-AF594 荧光抗体:
[0100] 将⑶45抗体与AlexaFlour594荧光素避光孵育lh,荧光素即可与⑶45抗体连 接。
[0101]DAPI染色液:
[0102] 使用防淬灭剂Mountingmedium将lmg/mL的DAPI原液按照1:1000进行稀释,配 制为DAPI染色工作液。
[0103] 所述试剂盒二的使用方法,步骤如下:
[0104] (1)将本方法步骤(7)或其他方法获得的细胞悬液,涂于载玻片或膜片上,并自然 晾干。加CF2固定工作液,计时8-10分钟;
[0105] (2)吸弃液体,放入已预热的2XSSC染缸10分钟;
[0106] (3)依次放入75%、85%、无水乙醇中2-5分钟;
[0107] (4)加入IOuLHER-2/CEP17探针,盖上盖玻片,封片并放入杂交仪或其他控温装 置,76°C5 分钟,37°C4-20 小时;
[0108] (5)取出标本,撕下封片物质,放入已预热的甲酰胺工作液,计时15分钟;
[0109] (6)置于 2XSSC中 5-10 分钟;
[0110] (7)取出,加入配制好的CD45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL2%BSA),每玻 片200uL,避光反应1-5小时;
[0111] (8)吸弃多余液体,0. 2%BSA清洗1-3次,加入DAPI复染剂10uL,封片。
[0112] 封片后即可利用显微镜进行结果的判别,即可对CTC或其他稀有细胞进行鉴别, 同时获得ffiR-2扩增型CTC的数目、染色体扩增型CTC的数目、HER-2/CEP17-CTC的总数目、 HER-2基因扩增状态。
[0113] 注:处理过程中,可视实际情况,使用TritonX-100、Saponin等打孔剂(但不限于 这两种打孔剂)对细胞进行打孔处理,以减小探针进入细胞的阻力。
[0114] 本发明进一步提供本发明试剂盒的用途,即在鉴别CTC同时,该试剂盒还可以测 定HER-2/CEP17结果,为此,本发明在于提供本发明的试剂盒在鉴别CTC同时,还可以测定 HER-2/CEP17结果以判断肿瘤患者实时的基因状态中的应用。名词解释:
[0115] 稀有细胞:其在体液样本内的所有有核细胞中的占有比例小于0. 1 %。包括CTC, 循环内皮细胞,胎儿细胞,肿瘤干细胞,干细胞,及某些免疫细胞等。
[0116] 循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell,CTC):指进入到血液循环中的肿瘤细 胞。
[0117] 表格中的名词:
[0118]
Figure CN105087778AD00121
Figure CN105087778AD00131
具体实施方式
[0120] 以下通过实施例进一步说明本发明,但不作为对本发明的限制。
[0121] 实施例1
[0122] 使用试剂盒一对血液样本的检测
[0123] 测试20例正常人、20例乳腺良性疾病、20例乳腺癌患者血液样本,方法为将3. 2mL 血液标本加入至50mL离心管中,加入CSl工作液,650Xg离心5分钟,吸弃上清;加入CS2 工作液裂解8分钟,650Xg离心5分钟,吸弃上清液体;再次加入一定量CSl工作液,加入磁 微粒混悬液200uL,摇匀20分钟;吸取全部混匀后液体,叠加至CS3分离介质上,300Xg离 心5分钟;吸取除磁微粒沉淀以外的液体至15mL离心管中,加入CSl工作液至15mL,950Xg 离心5分钟,吸弃上清;加入ImLCSl工作液,吹打混匀并加入至新2mL离心管中,磁力分选 2分钟。转移上清至I. 5mL离心管中,放置在15mL离心管上,3400rpm离心3分钟。吸弃上 清,加入CFl固定液,吹打混匀并涂片,自然晾干;加入CF2固定工作液8分钟;吸弃液体,放 入已预热的2XSSC染缸10分钟;依次放入75%、85%、无水乙醇中脱水2分钟;加入IOuL HER-2/CEP17探针,盖上盖玻片,封片并放入杂交仪或其他控温装置,76°C5分钟,37°C4小 时;取出标本,揭去盖玻片,放入已预热的甲酰胺工作液中15分钟;置于2XSSC中洗涤5分 钟;加入配制好的CD45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL2 %BSA),每玻片200uL,避光 反应1小时;吸弃多余液体,0. 2%BSA清洗1-3次,加入DAPI复染剂10uL,封片。
[0124]结果显示最终显微镜下剩余有核细胞数目分布范围(2-79个/3. 2mL),CEP17扩增 型CTC中位值32个/3. 2mL,HER-2扩增型CTC中位值5个/3. 2mL。各亚组间无显著性差 异。
[0125] 而同时,使用目前市场上常用的阳性方法对上述病人的另外7. 5mL外周血进行处 理作为对照组,方法为:将7. 5mL外周血裂解后,使用EpCAM包被的磁珠结合血液中的CTC; 然后将悬液利用磁分选装置分离磁珠,从而得到了结合在磁珠表面的CTC;最后对这些CTC 进行CK/⑶45染色,如CK+/⑶45-视为一个阳性细胞。对照组结果为58个/3. 2mL。
[0126] 实施例2
[0127] 本发明试剂盒的制备
[0128] 试剂盒一:
[0129] CSl浓缩缓冲液(IOX):
[0130]每1000 mL水中,含有 60gBSA,5 包PBS粉末(2L/包),100mL0.5M的EDTA,0.8mL Proclin300。
[0131] CS2浓缩储存液(IOX):
[0132]每1000 mL水中,称取82. 9gNH4Cl、10gKHC03、0. 37gEDTA,水以及0• 8mL Proclin300,进行充分的搅拌溶解,定容,配制为IOX浓缩液。
[0133] CS3分离介质:
[0134] 将密度为1. 077的梯度离心液稀释,稀释过程中测试密度,使其密度在 1. 070-1. 075 之间。
[0135] 磁微粒混悬液:
[0136] 将⑶45抗体浓度调整为lmg/mL,与链亲和素免疫磁珠按照IOOuL: ImL的比例进行 孵育lh,即配制为磁微粒混悬液。
[0137]CFl固定液:
[0138] 混合PEG和无水乙醇,使PEG终浓度为1 %,无水乙醇终浓度为50 %。
[0139] 10XCF2 固定液:
[0140] 以PBS为溶剂,溶解PFA粉末,配制为5 %的PFA浓缩液。
[0141] 甲酰胺工作液:
[0142] 将甲酰胺原液稀释为50%的工作液。
[0143] 20XSSC浓缩缓冲液:
[0144]1000 mL水中,加入氯化钠175. 3g,柠檬酸铵88. 2g。
[0145] HER-2/CEP17探针:
[0146] 使用甲酰胺、硫酸葡聚糖钠盐将HER-2及CEP17,配制为探针工作液。
[0147]BSA粉末:
[0148] 外购分装。
[0149]CD45-AF594 荧光抗体:
[0150] 将⑶45抗体与Alexa Flour 594荧光素避光孵育lh,荧光素即可与⑶45抗体连 接。
[0151]DAPI染色液:
[0152] 使用防淬灭剂Mountingmedium将lmg/mL的DAPI原液按照1:1000进行稀释,配 制为DAPI染色工作液。
[0153] 试剂盒二仅包含5)-12)部分,制备方法相同。
[0154] 实施例3
[0155] 用本发明的试剂盒一对其他体液样本进行检测
[0156] 说明:本试剂盒不仅适用于血液,也适用于其他体液中稀有细胞的检测,例如胸 水、腹水、盥洗液、羊水等,但不限于这几种体液。
[0157] 使用本试剂盒对6例胃癌腹水进行检测,均发现CEP17扩增型阳性细胞,中位值 9. 5 (范围4-15)。其中2例发现HER-2扩增型阳性细胞,数量分别为:2, 5。
[0158] 实施例4
[0159] 使用试剂盒二对其他方法获取到的CTC进行检测
[0160] 说明:试剂盒二中组份,即HER-2/CEP17探针、⑶45-AF594荧光抗体、DAPI染色液 等,也适用于其他方法获取到的CTC,例如过滤法、ChIP法等等,但不限于这两种方法。
[0161] 使用膜过滤法对12例乳腺癌外周血标本进行处理,将直径为Sum的 Ispore™MembraneFilters配合SWINNEX滤器配合使用。具体方法为,首先将5mL血液标 本与IOmLPBS混匀,加入至过滤器中,通过重力作用自然沉降,CTC因体积较大,留在膜表 面,将滤膜转移至标准载玻片上。干燥后,按照试剂盒二的操作方法对CTC进行染色处理, 方法如下:将干燥后的标本经过CF2固定工作液8分钟;吸弃液体,放入已预热的2XSSC 染缸10分钟;依次放入75%、85%、无水乙醇中脱水2分钟;加入10此1^-2/^?17探针, 盖上盖玻片,封片并放入杂交仪或其他控温装置,76°C5分钟,37°C4小时;取出标本,揭去 盖玻片,放入已预热的甲酰胺工作液中15分钟;置于2XSSC中洗涤5分钟;加入配制好的 CD45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL2%BSA),每玻片200uL,避光反应1小时;吸弃多 余液体,0. 2%BSA清洗1-3次,加入DAPI复染剂10uL,封片,并在荧光显微镜下观察。结果 统计,9例表现出CEP17扩增型CTC阳性,2例HER-2扩增型阳性。
[0162] 实施例5
[0163] 本试剂盒一适用于血液中其他稀有细胞的检测
[0164] 说明:有些患者血液中含有CEC(即循环内皮细胞),本试剂盒同样可以检测。
[0165] 使用本试剂盒对5例肾癌患者进行了CEC的检测,其中1例检测出HER-2扩增型 CEC2 个。

Claims (10)

1. 一种基于稀有细胞检测HER-2/CEP17基因状态的方法,其特征在于,所述方法包括 以下步骤: 步骤1,从患者获得血液样本或其他含有稀有细胞的体液样本,样本中包含CTC或其他 稀有细胞与白细胞的混合细胞群; 步骤2,用缓冲液稀释样本,离心去除血浆,并回收CTC或其他稀有细胞; 步骤3,用红细胞裂解液裂解,离心去除红细胞并回收CTC或其他稀有细胞; 步骤4,用包被有抗人白细胞相关抗原抗体的磁微粒同步骤3所得的回收细胞混匀孵 育,以使磁微粒同标的白细胞充分结合并形成磁微粒-白细胞混合体; 步骤5,离心将磁微粒-白细胞混合体与其他细胞分离,得到含有CTC或其他稀有细胞 及少量白细胞的混合细胞群; 步骤6,使用免疫荧光细胞化学与荧光原位杂交的相结合的方法,测定HER-2/CEP17的 状态,同时进行CTC或其他稀有细胞的鉴别。
2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2所述缓冲液为与血液密度相近、包 含BSA及PBS、PH7-8的缓冲液,其中,步骤3所述红细胞裂解液为任意一种红细胞裂解液。
3. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4所述包被有抗人白细胞相关抗原抗 体的磁微粒为一种包被抗白细胞共同抗原抗体的链亲和素磁珠,能够牢固地结合白细胞。
4. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤5所述离心介质为一种密度介于 1. 070-1. 080之间的密度梯度离心液。
5. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤6所述使用免疫荧光细胞化学与荧光 原位杂交的方法,测定HER-2/CEP17,对CTC或其他稀有细胞进行鉴别,方法如下: (1) HER-2扩增型CTC :将标本置于荧光显微镜相应通道下观察,若发现多个HER-2信号 点分布(彡3个),且数目大于CEP17的信号点数,并且无⑶45抗原表达,则计为一个CTC 阳性细胞,且直接视该细胞为ffiR-2阳性细胞; (2) 染色体扩增型CTC :计数单个有核细胞CEP17信号数目,若大于等于3个信号点且 无⑶45抗原表达,则计为一个CTC阳性细胞; (3) HER-2/CEP17-CTC总数目:记录所有HER-2扩增型及染色体扩增型CTC数目,总和 视为 HER-2/CEP17-CTC 总数目; (4) HER-2基因扩增状态记录:在所有标本区域中若有明显且典型HER-2扩增,则记为 HER-2扩增;若无,则将所有CTC细胞内平均每个细胞核中HER-2信号数量、平均每个细胞 核中CEP17信号数量、平均每个细胞核中HER-2和CEP17信号数量比值的结果。
6. -种用于权利要求1方法的试剂盒,其特征在于,包括如下成分: CSl浓缩缓冲液(IOX) CS2浓缩储存液(IOX) CS3分离介质 磁微粒混悬液 CFl固定液 10XCF2固定液 DAPI染色液 HER-2/CEP17 探针 CD45-AF594荧光抗体 甲酰胺工作液 20 X SSC浓缩缓冲液 BSA0
7. 权利要求6所述试剂盒的使用方法,其特征在于,步骤如下: (1) 将0. l-5mL血液标本加入至50mL离心管中,加入稀释好的CSl工作液至45mL, 650 X g离心5分钟,吸弃上清并剩余约12mL液体; (2) 轻摇混匀,加入稀释好的CS2裂解工作液至45mL,混匀8-10分钟,650 X g离心5分 钟,吸弃上清液体; (3) 加入CSl工作液适量并轻摇混匀,再次加入一定量CSl工作液,加入清洗过的磁微 粒混悬液200uL,水平摇匀(120rpm) 20分钟; (4) 吸取全部混匀后液体,叠加至CS3分离介质上,300 X g离心5分钟; (5) 吸取除磁微粒沉淀以外的上两层液体至15mL离心管中,加入CSl工作液至15mL, 950 X g离心5分钟,吸弃上清; (6) 加入ImL CSl工作液,吹打混匀并加入至新2mL离心管中,磁力分选2分钟。转移 上清至I. 5mL离心管中,放置在15mL离心管上,3400rpm离心3分钟; (7) 吸弃上清,加入CFl固定液,吹打混匀并涂片,自然晾干; (8) 加入CF2固定工作液,计时8-10分钟; (9) 吸弃液体,放入已预热的2XSSC染缸10分钟; (10) 依次放入75%、85%、无水乙醇中2-5分钟; (11) 加入IOuL HER-2/CEP17探针,盖上盖玻片,封片并放入杂交仪或其他控温装置, 76°C 5 分钟,37°C 4-20 小时; (12) 取出标本,撕下封片物质,放入已预热的甲酰胺工作液,计时15分钟; (13) 置于2 X SSC中5-10分钟; (14) 取出,加入配制好的CD45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL 2% BSA),每玻片 200uL,避光反应1-5小时; (15) 吸弃多余液体,0. 2% BSA清洗1-3次,加入DAPI复染剂10uL,封片。
8. -种用于权利要求1方法的试剂盒,其特征在于,包括如下成分: CFl固定液 10XCF2固定液 DAPI染色液 HER-2/CEP17 探针 CD45-AF594荧光抗体 甲酰胺工作液 20 X SSC浓缩缓冲液 BSA0
9. 权利要求8所述试剂盒的使用方法,其特征在于,步骤如下: (1)将本方法步骤(7)或其他方法获得的细胞悬液,涂于载玻片或膜片上,并自然晾 干,加CF2固定工作液,计时8-10分钟; ⑵吸弃液体,放入已预热的2XSSC染缸10分钟; (3) 依次放入75%、85%、无水乙醇中2-5分钟; (4) 加入IOuL HER-2/CEP17探针,盖上盖玻片,封片并放入杂交仪或其他控温装置, 76°C 5 分钟,37°C 4-20 小时; (5) 取出标本,撕下封片物质,放入已预热的甲酰胺工作液,计时15分钟; (6) 置于2 X SSC中5-10分钟; (7) 取出,加入配制好的⑶45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL 2% BSA),每玻片 200uL,避光反应1-5小时; (8) 吸弃多余液体,0. 2 % BSA清洗1-3次,加入DAPI复染剂10uL,封片。
10.权利要求6或8任意一项试剂盒在测定稀有细胞的同时,检测HER-2/CEP17基因状 态的应用。
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