JP6936984B2 - 希少細胞を用いて癌患者の予後を予測する方法 - Google Patents
希少細胞を用いて癌患者の予後を予測する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6936984B2 JP6936984B2 JP2017007767A JP2017007767A JP6936984B2 JP 6936984 B2 JP6936984 B2 JP 6936984B2 JP 2017007767 A JP2017007767 A JP 2017007767A JP 2017007767 A JP2017007767 A JP 2017007767A JP 6936984 B2 JP6936984 B2 JP 6936984B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cancer
- blood
- cell
- prognosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 55
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title claims description 51
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 276
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 37
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 33
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 claims description 22
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 22
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims description 17
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 14
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 13
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 13
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 claims description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 61
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 61
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 40
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 24
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 19
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 17
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 17
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 15
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 14
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 12
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 10
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 10
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 10
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 8
- 239000000306 component Substances 0.000 description 8
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 description 7
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 7
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 7
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 5
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 5
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 5
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 3
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- -1 mixing Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010011906 Death Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010051066 Gastrointestinal stromal tumour Diseases 0.000 description 1
- 206010067807 Gingival cancer Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000994460 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 20 Proteins 0.000 description 1
- 102100032700 Keratin, type I cytoskeletal 20 Human genes 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 206010027459 Metastases to lymph nodes Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 201000011165 anus cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000004948 cheek mucosa cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000013170 computed tomography imaging Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004720 dielectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 208000025189 neoplasm of testis Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000004798 organs belonging to the digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008529 pathological progression Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940086066 potassium hydrogencarbonate Drugs 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000037968 sinus cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
- G01N33/491—Blood by separating the blood components
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
- G01N33/48735—Investigating suspensions of cells, e.g. measuring microbe concentration
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5002—Partitioning blood components
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
- G01N15/075—Investigating concentration of particle suspensions by optical means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N2015/0019—Means for transferring or separating particles prior to analysis, e.g. hoppers or particle conveyors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N2015/0294—Particle shape
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1028—Sorting particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1029—Particle size
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N2015/1486—Counting the particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4742—Keratin; Cytokeratin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70589—CD45
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Ecology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
癌を患っている患者における全生存予後を決定する方法であって、
1)該患者から得られた生体試料から、標的細胞を濃縮して濃縮液を得る工程と、
2)前記濃縮液において細胞核を有し、かつ白血球マーカー及び上皮系マーカーを実質的に発現していない細胞を光学的に検出し、計数する工程と、
3)計数された標的細胞数と、全生存予後を関連づけることを含む、前記方法である。
1)該患者から得られた生物試料から標的細胞を濃縮して濃縮液を得る工程と、
2)前記濃縮液において細胞核を有し、かつ白血球マーカーおよび上皮系マーカーが実質的に発現していない細胞を光学的に検出し、計数する工程と、
3)計数された標的細胞数と全生存予後を関連づける工程
を含む、前記方法に関する。
濃縮工程は、生物試料から標的細胞を濃縮し、濃縮液を得る工程である。比重分離を利用することで、標的細胞を含む細胞懸濁液から、標的細胞を含む画分を分離回収することで、全細胞中の標的細胞の割合を増加することができる。標的細胞を含む画分を収容した部分と、細胞懸濁液中に含まれる夾雑物及び/又は標的細胞以外の細胞を含む画分を収容した部分とに分離可能な容器を使用することで、この比重分離による標的細胞を含む画分の分離回収が容易になる。一般に、生細胞と死細胞とでは比重が異なっていることから、生物試料の比重差を利用することで生細胞を死細胞から分離して濃縮することができる。また損傷を受けた細胞の比重が高くなることから、標的細胞の中でも無傷の細胞を分離出来る点からも好ましい(WO2014/192919号参照)。
展開工程は、濃縮工程を経て得られた濃縮液を基板上に展開することにより行なわれる。濃縮液を展開することで、濃縮液に含まれる細胞を検出に適した間隔で基板上に分布させることができる。非凝集状態で展開させることが好ましく、展開前に濃縮液を十分に懸濁しておくことが好ましい。展開工程は、細胞を検出に適した間隔で基板上に分布させることができれば任意の手法を用いることができ、単に濃縮液を基板上に適用するのみであってもよいが、必要に応じてさらなる処理を行なってもよい。一例として、濃縮液を基板上に適用後に、振動や誘導泳動力をあたえることにより、細胞を展開することもできる。細胞を均一に展開するために、基板上に保持孔があけられていることが好ましく、各保持孔につき、概ね一個の細胞を配置することで、その後の検出工程にて標的細胞の検出が容易になる。所望される細胞の展開密度に応じて、濃縮液中の細胞数を計数し、適切な細胞数が展開されるように希釈されてもよく、また展開に供する濃縮液を計量して展開することもできる。
本工程では、溶血処理液を遠心分離することで分離回収した細胞から、標的細胞内ではほとんど発現していないタンパク質を利用して当該細胞を検出すればよい。標的細胞内でほとんど発現していないタンパク質としては、上皮系細胞で特異的に発現する上皮系マーカーに関するタンパク質や白血球で特異的に発現する白血球マーカーに関するタンパク質などがあげられる。より具体的には上皮系マーカーとしてはサイトケラチン(CK)やEpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)、白血球マーカーとしてはCD45が例示できる。なおCKにはCK1からCK20まで20種類のタンパク質が知られているが、そのいずれもが本発明で利用可能な、上皮系細胞で発現するタンパク質に含まれる。本発明の検出工程では、白血球マーカー、上皮マーカー、又はその組合せを発現していない細胞を検出することで、標的細胞を検出することができる。さらに細胞核を有している細胞を標的細胞として検出することができる。
検出工程により検出された標的細胞数を、患者における予後と、当該患者における標的細胞数との関係を示す識別表やグラフなどに従い、患者の生存予後を決定することができる。そのような識別表やグラフは、予め患者群において標的細胞数を検査し、さらに予後を追跡調査することで決定することができる。本発明により決定される予後として、一例として、根治群、再発群、要治療群などに分類することができ、さらには1年生存率、3年生存率、5年生存率、及び10年生存率など、生存率により分類することもできる。この関連付け工程は、医師が行なわずに、医療補助者などが行なうことができるし、装置及びソフトウェア上で自動で関連付けすることができる。したがって、本発明の予後の決定方法は、診断のための予備的方法ということもできる。
(1)癌の疑いのある患者もしくは癌患者から血液を採取する。なお血液を採取する際、クエン酸、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの抗凝固剤を添加してもよい。また必要に応じ、採取した血液を生理食塩水などで希釈してもよい。
(2)採取した血液(または希釈した血液)の所定量を、密度勾配遠心を用いて、標的細胞を含む画分分離する。密度勾配遠心は細胞をその比重に基づき分離する方法であり、密度勾配を形成した媒体(密度勾配溶液)上に採取した血液(または希釈した血液)を重層した後、遠心分離を行ない、標的細胞を含む層(上層)を回収することで、不要な細胞やごみを除去した標的細胞を含む画分を得る。なお密度勾配遠心を行なう前に、採取した血液(または希釈した血液)に、不要な細胞である赤血球、白血球と結合可能な結合剤(例えば、RosetteSep(StemCell Technologies社製))を添加することもできる。前記結合剤は、赤血球、白血球、および/またはこれら細胞の表面抗原と結合することで細胞凝集体を形成し、これら細胞の密度を大きくすることができるため、密度勾配遠心法による標的細胞の分離を容易にする。
(3)(2)で得られた標的細胞を含む画分に塩化アンモニウムを含む溶液を添加して撹拌することで、当該画分に混入した赤血球を溶血させる。本操作により、分離回収した標的細胞の観察が良好になる。
(4)(3)で得られた溶血処理後の標的細胞を含む溶液を遠心分離することで血液成分を除去し、当該細胞をペレット状にした後、適切な溶液を用いて当該細胞を懸濁させる。
(5)(4)で調製した標的細胞を含む懸濁液を再度遠心分離し、当該細胞を含むペレットを回収する。なお必要に応じ、前記回収したペレットを溶液に再度懸濁させ、遠心分離する工程を追加してもよい。
(6)(5)で得られた濃縮された標的細胞を、例えばWO2011/149032号に記載の装置を用いて基板上に展開し、保持部へ保持させた後、当該細胞に対し保存および膜透過処理を施す。保存処理剤としては、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒドドナー化合物(加水分解を受けることでホルムアルデヒドを放出可能な化合物)、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類や、メタノール、エタノールなどのアルコール類や、重金属を含む溶液が例示できる。細胞膜透過処理剤としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類や、サポニンなどの界面活性剤が例示できる。
(7)抗体による非特異的な反応を防ぐため、保存および膜透過処理後の標的細胞を保持した保持部に対しタンパク質によるブロッキング処理を施した後、蛍光基が修飾された白血球が発現するタンパク質、もしくは上皮系細胞が発現するタンパク質に対する抗体や、細胞核を蛍光染色させる試薬を添加し、洗浄後、蛍光顕微鏡などで細胞の蛍光像および明視野像を観察する。白血球が発現するタンパク質に対する抗体としては、抗CD45抗体を用いることができる。また、上皮系細胞が発現するタンパク質に対する抗体としては、抗CK抗体や抗EpCAM抗体などを用いることができる。細胞核を蛍光染色させる試薬としては、4’,6−diamidino−2−phenylindole(DAPI)やHoechst 33342(商品名)などを用いることができる。
(8)観察した蛍光像および明視野像を基に標的細胞を検出することができる。標的細胞は、細胞核が標識されており、抗CD45抗体では標識されず、抗CK抗体でも標識されず、さらに赤血球や白血球と比較して明視野像での細胞の形状が大きい細胞である。
(1)インフォームドコンセントを得た胃癌患者から、血液を治療経過に合わせて4回採取した。前記患者から採血した時点としては、以下の:
臓器転移は確認されず、リンパ節転移のみが認められたステージIVであり、化学療法はまだ行なわれていない状況(採血1)、
採血1から4週間経過しており、化学療法が2サイクル行なわれた後に、病状の変化が認められていない状況(採血2)、
採血2から4週間経過しており、CT画像診断による病状の変化が認められていない状況(採血3)、または、
採血3から7週間経過しており、摂食時に通過障害が発生する病状の悪化が認められた状況(採血4)、
で採血を行なった。また、採血4から半年以内に、当該患者は亡くなっている。
(2)(1)で採取した血液に、生理食塩水、白血球・血小板結合剤(RosetteSep、StemCell Technologies社製)を添加することで、希釈血液試料を調製した。
(3)調製した希釈血液試料を、密度1.091g/mLの密度勾配溶液に重層し、2000×gで10分間、室温にて遠心後、上清を回収した。
(4)(3)で回収した上清に、0.9%(w/v)塩化アンモニウムと0.1%(w/v)炭酸水素カリウムと含む溶血液で30mLまでメスアップし、300×gで10分間、室温にて遠心分離した。当該操作により上清に混入した赤血球が破壊され、分離回収した細胞の観察が良好になる。
(5)上清を除去後、分離回収した細胞を含むペレットを、300mMマンニトールを含む溶液30mLで再懸濁し、300×gで5分間、室温にて遠心分離後、上清を除去した。再度300mMマンニトールを含む溶液30mLで再懸濁した後、300×gで5分間、室温にて遠心分離し、上清を除去した。当該操作は、血液成分を除去し、標的細胞を濃縮するための操作である。
(6)(5)で上清を除去した細胞を含む懸濁液を細胞診断チップに展開し、交流電圧を3分間印加することで前記チップが有する保持部に細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞診断チップは、直径30μmで深さ40μmの微細孔からなる微細孔を複数有した絶縁体と前記絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光性のクロム膜とからなる保持部を、厚さ1mmのスペーサーと下部電極基板とで挟んだ構造であり、前記スペーサーを上部電極基板と下部電極基板とで挟んだ構造である。
(7)(6)の条件で交流電圧を印加しながら、0.01(w/v)%のポリ−L−リジンを含む300mMマンニトール水溶液を導入し、3分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、前記水溶液を吸引除去した。
(8)50%(v/v)エタノールと1%(w/v)ホルムアルデヒドを含む水溶液(以下、細胞膜透過試薬)を導入し、10分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部に導入した細胞を標本化した。
(9)細胞膜透過試薬を吸引除去し、PBS(Phosphate buffered saline)を導入することで、残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
(10)細胞膜内外のタンパク質と特異的に結合可能な蛍光標識された抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬(DAPI:4’,6−diamidino−2−phenylindole(株式会社同仁化学研究所))を含む水溶液(以下、標識試薬)を導入し、30分間静置した。なお前記標識された抗体として、白血球表面に発現しているCD45に対する抗体(Beckman−Coulter)と、上皮系細胞の細胞質内で発現しているCKに対する抗体(Miltenyi Biotec)を用いている。
(11)標識試薬を吸引除去し、PBSを導入することで、残留した標識試薬を除去した。
(12)(11)で標識した細胞を含む細胞診断チップを蛍光顕微鏡のステージ上に載置した後、複数の保持孔に捕捉した全ての細胞を観察するために保持部全体の撮像を行なった。これにはコンピューター制御式電動ステージ、電子増倍型冷却CCDカメラ(EMCCD;FLOVEL,ADT−100)を装備した蛍光顕微鏡(IX71; Olympus)を用いた。画像取得及び解析ソフトウェアにはLabVIEW(National Instruments)を用いた。
(13)(12)で撮像した細胞の中から、
細胞核を有していることを示すDAPIで染色されている細胞(DAPI陽性)であり、
白血球で発現しているCD45に対する抗体で染色されていない細胞(CD45陰性)であり、
上皮系の性質を有していることを示すCKに対する抗体で染色されていない細胞(CK陰性)であり、かつ、
赤血球や白血球と比較して明視野像での細胞の形状が大きい細胞である、上記特徴を満たした標的細胞(DAPI陽性/CD45陰性/CK陰性細胞)を計数した。
実施例1(13)において撮像した細胞の中から、DAPI陽性であり、CD45陰性であり、かつCK陽性である、DAPI陽性/CD45陰性/CK陽性細胞を計数した他は、実施例1と同様な方法で、DAPI陽性/CD45陰性/CK陽性細胞の計数を行なった。
実施例1(1)で採血した血液を用いて、上皮系細胞マーカーであるEpCAMを発現している細胞を濃縮し、DAPI陽性であり、CD45陰性であり、かつCK陽性である細胞の測定が可能な先行技術であるCellSearch(セルサーチ)システム(Janssen Diagnostics)を用いて、CTCの計数を行なった。
実施例1(1)で採血した血液を用いて、消化器官での腫瘍診断時の診断マーカーとして従来から用いられているCEAとCA19−9の値を測定した。
比較例3の結果を表2に示す。CA19−9に関しては、正常であることを示す基準値(37U/mL)以下の値をすべての採血時のサンプルが示しており、病態との相関は認められなかった。CEAに関しては、正常であることを示す基準値(5ng/mL)以上の値をすべての採血時のサンプルが示した。しかし、採血1から採血3までは経時的に値が低下していき、一見治療効果があるように見られたが、採血4では病態が悪化し、CEAの値も上昇する傾向となった。この結果は、CEAの測定では治療効果を含めた予後を予測することは困難であることを示している。
実施例1(1)と同様に癌患者からインフォームドコンセントを得て血液を採取した。癌患者としては、以下の:
腫瘍の大きさの和が20%以上増加かつ絶対値においても5mm以上増加、または新病変の出現が認められる状態(PD:Progressive Disease)までの期間が、採血後のCTC検出評価から133日後であったステージIVの乳癌患者A、
PDまでの期間が、採血後のCTC検出評価から295日後であったステージIVの乳癌患者B、
PDまでの期間が、採血後のCTC検出評価から17日後であった終末期のステージIVの口腔癌患者A、
PDまでの期間が、採血後のCTC検出評価から83日後であった終末期のステージIVの口腔癌患者B、
PDまでの期間が、採血後のCTC検出評価から91日後であったステージIVの小細胞肺癌患者A、
PDまでの期間が、採血後のCTC検出評価から268日後であったステージIVの小細胞肺癌患者B、
PDまでの期間が、採血後のCTC検出評価から137日後であったステージIBの非小細胞肺癌患者A、または
採血後のCTC検出評価から250日間にPDと認められなかったステージIAの非小細胞肺癌患者B、
から採血を行なった。次に、実施例1(2)〜(12)と同様な方法で撮像を行い、撮像した細胞の中から、DAPI陽性であり、CD45陰性であり、かつCK陰性である、標的細胞(DAPI陽性/CD45陰性/CK陰性細胞)を計数した。
実施例2で採血した血液を用いて、撮像された画像において、DAPI陽性であり、CD45陰性であり、CK陰性であり、かつ赤血球や白血球と比較して明視野像での細胞の形状が大きい細胞である、上記特徴を満たした標的細胞(DAPI陽性/CD45陰性/CK陰性細胞)を計数した。
実施例2で採血した血液を用いて、撮像された画像において、DAPI陽性であり、CD45陰性であり、かつCK陽性である、DAPI陽性/CD45陰性/CK陽性細胞を計数した。
実施例2で採血した血液を用いた他は、比較例2と同様な方法で、CellSearch(セルサーチ)システム(Janssen Diagnostics)を用いて、CTCの計数を行なった。
2:筒状部材(上側)
3:筒状部材(下側)
4:キャップ
5:底部
6:連通開口
7:保持孔
8:生物試料検出構造体
9:基板
10:上蓋基板
11:絶縁体膜
12:遮光膜
13:収容部
14:導入口
15:排出口
16、17:電極
18:櫛形電極
19:交流電源
20:光
21:検出部
22:導電線
23:細胞
24:誘電泳動力
25:密度勾配溶液
26:生物試料溶液
27:標的細胞を含む分画
Claims (7)
- 癌を患っている患者における全生存予後を決定する方法であって、
1)該患者から得られた生物試料から標的細胞を濃縮して濃縮液を得る工程と、
2)前記濃縮液において細胞核を有し、かつ白血球マーカーおよび上皮系マーカーであるCKが実質的に発現していない直径が10μm以上の細胞を光学的に検出し、計数する工程と、
3)計数された標的細胞数と全生存予後を関連づける工程
を含む、前記方法。 - 前記白血球マーカーがCD45である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的細胞が、循環腫瘍細胞(CTC)である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記濃縮液を得る工程が、生体試料の比重差を用いた濃縮方法であることを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮液を得る工程が、一端は閉塞して底部を形成し、他端は開口した筒状の構造体と、開口を密閉するキャップからなり、前記構造体は2以上の筒状部材より構成され、分離部にて分離可能である構造体を用いて生体試料を濃縮することを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 濃縮液を得る工程に用いる密度勾配溶液の比重が、1.082〜1.091g/mLの範囲である、請求項4又は5に記載の方法。
- 濃縮液を得る工程に用いる密度勾配溶液の浸透圧が、300〜400mOsm/kgの範囲である、請求項6に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016008259 | 2016-01-19 | ||
JP2016008259 | 2016-01-19 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017129584A JP2017129584A (ja) | 2017-07-27 |
JP6936984B2 true JP6936984B2 (ja) | 2021-09-22 |
Family
ID=59362197
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017007767A Active JP6936984B2 (ja) | 2016-01-19 | 2017-01-19 | 希少細胞を用いて癌患者の予後を予測する方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11371982B2 (ja) |
JP (1) | JP6936984B2 (ja) |
WO (1) | WO2017126634A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018116040A (ja) * | 2017-01-19 | 2018-07-26 | 東ソー株式会社 | 遠沈管およびその使用方法 |
JP2019101021A (ja) * | 2017-11-28 | 2019-06-24 | 東ソー株式会社 | 生体物質保持装置、および生体物質の検出方法 |
KR102309284B1 (ko) * | 2018-08-03 | 2021-10-06 | 주식회사 엘지에너지솔루션 | 고분자 솔루션의 미용해물 측정법 |
JPWO2021132489A1 (ja) * | 2019-12-27 | 2021-07-01 | ||
JP7521750B2 (ja) | 2020-01-14 | 2024-07-24 | 学校法人杏林学園 | 上皮系マーカー陰性の腫瘍細胞を検出する方法 |
JP2021110664A (ja) * | 2020-01-14 | 2021-08-02 | 学校法人杏林学園 | 癌被験体の予後を予測する方法 |
CN112557261B (zh) * | 2020-12-07 | 2022-12-09 | 昆明理工大学 | 一种基于c形微柱的红细胞分离检测装置及分离检测方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL1861509T3 (pl) | 2005-03-14 | 2016-01-29 | Janssen Diagnostics Llc | Sposób predykcji przeżywalności bez progresji i przeżywalności całkowitej przy wizytach kontrolnych w trakcie terapii u pacjentów z rozsianym rakiem piersi wykorzystujący krążące komórki nowotworowe |
WO2011050103A1 (en) | 2009-10-21 | 2011-04-28 | The Scripps Research Institute | Method of using non-rare cells to detect rare cells |
JP5704590B2 (ja) * | 2010-02-05 | 2015-04-22 | 国立大学法人東京農工大学 | サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた循環腫瘍細胞の検出 |
JP6364946B2 (ja) * | 2013-05-31 | 2018-08-01 | 東ソー株式会社 | 分離構造体及び分離方法 |
CN109504599A (zh) | 2013-09-30 | 2019-03-22 | 积水医疗株式会社 | 循环肿瘤细胞浓缩分离设备及循环肿瘤细胞的浓缩分离方法 |
JP6840330B2 (ja) * | 2014-05-13 | 2021-03-10 | 学校法人順天堂 | 細胞の検出方法 |
-
2017
- 2017-01-19 JP JP2017007767A patent/JP6936984B2/ja active Active
- 2017-01-19 US US16/070,706 patent/US11371982B2/en active Active
- 2017-01-19 WO PCT/JP2017/001817 patent/WO2017126634A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US11371982B2 (en) | 2022-06-28 |
US20190025282A1 (en) | 2019-01-24 |
JP2017129584A (ja) | 2017-07-27 |
WO2017126634A1 (ja) | 2017-07-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6936984B2 (ja) | 希少細胞を用いて癌患者の予後を予測する方法 | |
US9506927B2 (en) | Method for detecting low concentrations of specific cell from high concentrations of cell populations, and method for collecting and analyzing detected cell | |
JP6639906B2 (ja) | 生物試料検出方法 | |
Hyun et al. | Isolation and enrichment of circulating biomarkers for cancer screening, detection, and diagnostics | |
CN105954246B (zh) | 一种在人的生物液体样本中检测游离的稀有肿瘤细胞的方法和试剂盒 | |
JP2016527907A (ja) | 細胞への物質の選択的送達 | |
MX2014006884A (es) | Aparato, sistema y metodo para identificar celulas tumorales circulantes. | |
US11292012B2 (en) | Apparatus for performing contactless optically-induced dielectrophoresis for separation of circulating tumor cells | |
CN103031276A (zh) | 一种获取循环肿瘤单细胞的方法 | |
Myung et al. | Integration of biomimicry and nanotechnology for significantly improved detection of circulating tumor cells (CTCs) | |
JP5580117B2 (ja) | 細胞分析装置 | |
JP6617516B2 (ja) | 血液試料中に含まれる目的細胞の検出方法 | |
CN104807996A (zh) | 细胞表面标志分子用于检测肝癌循环肿瘤细胞的用途 | |
JP6582486B2 (ja) | 血液中の稀少細胞検出方法 | |
JP6700048B2 (ja) | 抗癌剤の評価方法 | |
CN108865655B (zh) | 一种单细胞捕获装置及捕获方法 | |
CN111751543A (zh) | 一种稀有肿瘤细胞富集方法及试剂盒 | |
JP6860165B2 (ja) | 抗癌剤投与効果予測方法 | |
TWI618931B (zh) | 使用細胞增殖法之循環腫瘤細胞的檢測、分離取得方法 | |
Gaitas et al. | Chemically modified plastic tube for high volume removal and collection of circulating tumor cells | |
CN111707833A (zh) | 小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法及其应用 | |
JP2018044950A (ja) | 試料中に含まれる細胞の検出方法 | |
JP2020144054A (ja) | 末梢血循環癌細胞の検出方法及び検出装置 | |
JP2018157812A (ja) | 試料中に含まれる細胞の検出方法 | |
CN114729055B (zh) | 共表达CD45和EpCAM的细胞群的检测和分离方法及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
AA64 | Notification of invalidation of claim of internal priority (with term) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A241764 Effective date: 20170221 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170420 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170529 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191218 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201020 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201221 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210330 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210525 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210727 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210819 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6936984 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |