CN111707833A - 小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法及其应用 - Google Patents

小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法及其应用，所述方法包括静脉注射抗CD45抗体、制备单个核细胞、制备流式样本和分析血管内外淋巴细胞标记情况等步骤。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)可实现样本的多标记检测；(2)可同时检测多个器官的淋巴细胞情况；(3)实验结果可靠；(4)操作步骤简单，耗时短；(5)所述方法应用前景十分广泛，可以根据淋巴细胞浸润严重程度，作为判断疾病预后的一个因素。淋巴细胞浸润情况可以与疾病或肿瘤分型、临床疗法的反应的预测、疾病进展某个环节的调控是否关联进行分析研究。

Description

小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法及其应用
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，涉及一种高效、快速、准确的活体小鼠淋巴细胞检测方法，具体为小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法及其应用。
背景技术
生理情况下，初始T淋巴细胞主要集中在次级淋巴器官(Secondary lymphoidorgan,SLO)比如脾脏和淋巴结，并在血液循环和淋巴循环之间游走发挥免疫监视作用，极少到非淋巴器官中驻留。然而，当机体出现炎症、肿瘤或者病理损伤时，初始T淋巴细胞活化为效应T细胞。效应细胞在其表达的趋化因子受体作用下，从血管或淋巴管中渗透出来，分布在各个非淋巴器官，包括肝脏、肠道、肺脏、皮肤等。浸润到非淋巴组织的效应T细胞可在病变部位进一步增殖、分化，与浸润的其他淋巴细胞群一并停留较长时间，部分效应T细胞可形成记忆T细胞长期存在于非淋巴组织。组织浸润的淋巴细胞在病变局部发挥重要的免疫应答和调控作用，尤其是对肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL)的研究近十年来备受关注。现有研究表明，TIL是肿瘤局部免疫微环境的重要部分，对患者的治疗和预后具有重要意义，有效获取和利用TIL甚至被作为一项肿瘤细胞免疫治疗的手段在临床应用。
TIL是异质性淋巴细胞群体，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、DC等，在多种不同肿瘤类型中浸润的细胞组分也有不同，但CD3+T淋巴细胞是公认的组成TIL的主要成分，包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。目前的研究认为，TILs类型和数量与肿瘤治疗效果和患者生存率密切相关。因此，有效检测浸润到非淋巴组织的淋巴细胞数量，并进一步分析浸润的淋巴细胞的免疫学特征尤其重要。目前，对非淋巴器官中浸润淋巴细胞的检测方法主要有两种，其一是机械处理或酶消化法获得单细胞悬液后检测，其二是对病变组织进行切片利用免疫组化或者免疫荧光染色进行淋巴细胞检测。此两种方法均存在一定缺陷，不能将从血管渗出后浸润到组织中的淋巴细胞和在血管中循环的淋巴细胞进行区分，导致最终的检测结果为病变局部组织中血管内外混合的所有淋巴细胞，与浸润到病变实质的淋巴细胞的实际情况偏差较大。建立一种能快速鉴别血管内外淋巴细胞，且能实现对分选的浸润T细胞进行更深入的免疫学特征和功能检测的方法具有重要意义。
现有技术中，检测淋巴细胞浸润的方法手段有三种，一是制作普通HE染色石蜡切片，显微镜观察浸润情况；二是免疫组化及免疫荧光方法，DAB显色，选用特异性一抗标记淋巴细胞；三是流式细胞术检测。有研究提出，目前利用手术切除的肿瘤标本，不但可以采用免疫组织化学(IHC)技术和多重荧光免疫组织化学(multiplexed fluorescentimmunohistochemistry，m IHC)技术对原位TIC进行表型鉴定和半定量分析，而且还可以采用流式细胞术对分离的TIC进行功能学研究。TIC是指肿瘤浸润性免疫细胞(tumor-infiltrating immunocyte，TIC)。
HE染色石蜡切片，一般用于粗略评价淋巴细胞浸润情况，并未形成统一的评判标准。根据显微镜观察到的结果，可以依据淋巴细胞浸润程度分为三级，(1)轻度浸润:少量淋巴细胞浸润，约占有核细胞的20％以内；(2)中度浸润:中量淋巴细胞，约占有核细胞的20％～40％；(3)重度浸润:大量淋巴细胞，约占有核细胞的40％以上。在Nakagawa S的研究中，他们根据HE染色的结果评估肿瘤中淋巴细胞浸润情况，根据五个高倍视野(×200)下的平均浸润淋巴细胞数，将浸润到肿瘤中的淋巴细胞评分为0-2。0，0-5cells；1，5-20cells:2，>20cells。亦有根据浸润灶指数(focus score，FS)，每例标本均由不同病理科医师检测3次，取平均值。按照CHSHOLM等标准进行病理分级，Ⅰ级:浸润灶1个/4mm2；Ⅱ级:浸润灶2个/4mm2；Ⅲ级:浸润灶3个/4mm2，Ⅳ级:浸润灶4个/4mm2。在Sakata J等人的研究中，他们判断淋巴细胞的浸润程度是由三个独立的观察者检查淋巴细胞浸润状态。局限于结缔组织浅表部分的明确浸润的淋巴细胞的存在被认为是高淋巴细胞浸润。另一方面，没有或仅有少量淋巴细胞浸润被认为是低淋巴细胞浸润。当检查者之间评估不同时，基于检查者之间的协商进行统一的评估。
应用免疫组化检测淋巴细胞浸润在已有的研究中较为广泛，常见以CD3、CD4、CD8进行染色。在Pinto MP等人的研究中，对于淋巴细胞亚群(CD3+，CD4+和CD8+)浸润评估，在肿瘤内基质和上皮内淋巴细胞进行计数，并计算每个观察视野中(40×)免疫标记淋巴细胞的平均数量(从0到>100)。为了进行统计分析，将每种特定因子(CD3，CD4或CD8)在40倍放大倍数下的临界值设置为染色为阳性的10个细胞，因此当≥10个细胞染色为阳性时，将其视为浸润“阳性”，当<10个细胞染色为阴性时，视为浸润“阴性”[i]。在其他文献报道中，结果判读的方法发生了改变，没有形成统一的判读标准规范描述淋巴细胞浸润程度。在Withers SS等人的研究中，通过对细胞区域内计数阳性细胞的数量(阳性细胞/mm2)计算CD3+和FOXP3+浸润细胞数。也有研究采用的是选取高倍镜下的若干个视野对淋巴细胞计数取平均值，然后再进行比较。Feng Y等人的研究评估淋巴细胞浸润是借助图形软件来计算，先进行免疫染色(抗小鼠CD4、CD8和抗人CD4、CD8)，免疫染色后，在整个组织块的每十分之一组织切片中计数阳性细胞数。脑切片中免疫标记细胞相对于DAPI评估的细胞总数的百分比表示为阳性细胞数。使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)进行图像分析。Schroeder BA的研究涉及对细胞浸润作简单描述，则会使用免疫组化方法检测T细胞浸润程度，进一步分析浸润T细胞中CD20+cell和CD68+cell的数量和分布情况。在Seo J等人的研究中，使用DAB/VIP和免疫荧光染色可以观察到T淋巴细胞和TH神经元的共定位，在组织切片上与抗TH、抗CD4、抗CD8、抗DAT和抗Iba1孵化结合，在免疫荧光染色的图像上可以得到CD4+T cell和CD8+ Tcell的共定位信息，并且进行两组间T细胞浸润程度的比较。有研究采用免疫荧光的方法检测脊髓中T淋巴细胞的浸润，选用抗CD2、CD8抗体，在荧光显微镜下观察CD2+ T cell和CD8+T cell的浸润情况。
有项研究在检测肿瘤浸润淋巴细胞时，采用了流式细胞术结合免疫组化共同使用，分析流式数据可得到肿瘤浸润性细胞毒性T细胞(CD45+CD3+ T cell和CD45-CD8+ Tcell)的百分比，使用IHC染色进一步检查肿瘤浸润的CD8+ T细胞，根据染色结果评分比较CD8+ T细胞的浸润情况。在Gaspar M等人的研究中他们用各种CD137激动剂抗体在小鼠中观察到肝T细胞浸润增加，应用流式细胞术观察肝和脾中T细胞的浸润，增殖和活化。在这里，流式细胞检测技术可通过单克隆抗体对单个细胞进行多参数的定量分析，可高速分析上万个细胞。但流式细胞检测技术只能对新鲜的标本组织进行检测，且不能提供免疫细胞在免疫微环境中分布的相关信息。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，建立一种能够快速检测并区分血管内外淋巴细胞的方法，且能够联合多种标记抗体同时检测，从而获得一种快速、高效、准确的活体小鼠淋巴细胞检测手段；鉴于此，本发明提供了小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法及其应用。
技术方案：小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、静脉注射抗CD45抗体
小鼠经内眦静脉丛注射抗CD45抗体，注射剂量为3-5μg/只，注射后2.5min眼球取血，3min断颈处死小鼠并解剖取材，包括淋巴组织和非淋巴组织；
S2、制备单个核细胞
分别制作S1获得的外周血及解剖获取组织的单个核细胞；
S3、制备流式样本
取S2单个核细胞的悬浮液置于流式管中，并向其中加入抗体，室温避光15-20min，PBS缓冲液洗涤细胞、离心、弃上清、PBS缓冲液重悬细胞，置于流式细胞仪上检测；
S4、分析血管内外淋巴细胞标记情况
采用流式细胞术分析单个核细胞血管内外的CD45+百分比，并以此识别淋巴组织或非淋巴组织中淋巴细胞的位置。
优选的，S1中解剖获取的淋巴组织为淋巴结、脾脏和骨髓，非淋巴组织为肝脏和肺脏。
优选的，S1中注射剂量为3μg/只。
优选的，S2中单个核细胞的制备方法为：
(1)外周血单个核细胞
小鼠眼球取血后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；
(2)淋巴结、脾脏单个核细胞
分别将淋巴结、脾脏混合PBS缓冲液置于筛网中研磨直至筛网中只剩结缔组织，分别吸取二者的悬浮液，离心后去上清；其中，淋巴结细胞残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存，脾脏细胞残液弹起后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；
(3)骨髓单个核细胞
取双侧腿和坐骨，分离胫骨、股骨和坐骨，PBS缓冲液冲出骨髓，吹散后离心、去上清，残液弹起后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；
(4)肝脏单个核细胞
取肝脏混合PBS缓冲液置于筛网中研磨直至筛网中只剩结缔组织，吸取细胞悬液离心后取上清，转移上清液后离心、去上清，残液弹起后采用40％细胞分离液重悬，然后将悬液加入80％细胞分离液中，升3降3离心，中间细胞层即为单个核细胞，PBS缓冲液洗涤、离心去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；
(5)肺脏单个核细胞
取肝脏混合PBS缓冲液置于筛网中研磨直至筛网中只剩结缔组织，吸取细胞悬液离心后去上清，残液弹起后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起PBS缓冲液洗涤、离心去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存。
优选的，S3中加入的抗体为CD45-BV570或CD45-APCcy7。
优选的，S3中抗体采用荧光标记；优选采用荧光标记鼠抗人单克隆抗体CD4-PEcy7(clone No.RM4-5)，CD8-APC(clone No.53-6.7)，但不限于此。
优选的，S4中淋巴组织血管内CD45-群较CD45+占主要成分，而非淋巴组织血管内CD45+群较CD45-群占主要成分。
以上任一所述小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法在判断小鼠淋巴细胞浸润程度中的应用。
本发明所述方法的原理在于：本方法基于抗原抗体快速、特异性识别结合的免疫学原理，利用白细胞共同表达的表面分子CD45作为抗原识别位点，静脉直接注射抗CD45分子抗体，实现血管内抗体对抗原分子的结合标记。此外，抗原抗体结合反应迅速从几秒到几分钟即可完成有效结合，而血细胞经历一次正常体循环时间为9-16s,肺循环时间为2-4s，全身血细胞循环一周时间大概3分钟。基于上述理论，本发明在大量前期实验的基础上，明确了利用静脉给药途径给活体小鼠注射抗CD45抗体，利用血液循环途径运输CD45抗体到全身各脏器，实现细胞表面标记染色；且严格控制染色时间，保障血管内血细胞全部被染色，而器官实质中浸润的细胞无法被标记。
本发明从摸索CD45抗体的有效浓度入手，比较了不同荧光标记的抗体染色效果，结合淋巴细胞各亚群的特异性标记物，最后验证了此方法在淋巴器官和非淋巴器官中对血管内外淋巴细胞分型的有效鉴定。
有益效果：(1)可实现样本的多标记检测。本技术方法可结合其他流式抗体一起使用，不仅能区分血管内外经CD45标记的淋巴细胞，还可进一步进行细胞胞内外多标记染色，包括细胞表面标志或者胞内细胞因子、转录因子等的染色，可实现多色、多参数检测分析，此点优势是以往任何检测技术均不能达到的。(2)可同时检测多个器官的淋巴细胞情况。经内眦静脉丛注射抗体进入小鼠体外，小鼠的淋巴器官和非淋巴器官均可以同时检测到血管内外淋巴细胞。得到的数据更加全面。避免传统病理切片标本来源的局限性，以及显微镜观察计数结果的人工误差，此方法获得的结果更真实反应器官细胞浸润的整体情况。(3)实验结果可靠。从已有实验数据可知，CD45细胞群染色明确，淋巴细胞在各器官中分布数据贴合实际，淋巴结中因血管少见CD45阳性细胞百分比近似于0％，而外周血中CD45阳性淋巴细胞百分率近似于100％，通过外周血阳性对照和不注射抗体的阴性对照，得到科学的实验结果。(4)操作步骤简单，耗时短。经内眦静脉丛注射抗体，3分钟后即可处死小鼠取材，获得单个核细胞后直接可进行流式细胞仪检测，随即可获得结果。与制作HE染色石蜡切片，免疫组化染色比较，步骤少，耗时明显缩短；(5)所述方法应用前景十分广泛，可以根据淋巴细胞浸润严重程度，作为判断疾病预后的一个因素。淋巴细胞浸润情况可以与疾病或肿瘤分型、临床疗法的反应的预测、疾病进展某个环节的调控是否关联进行分析研究。
附图说明
图1是抗体注射浓度分析结果图；
图2是不同荧光标记抗体检测结果图；
图3是淋巴细胞活体快速染色各器官染色分析结果图；其中，A为设门于活细胞检测各器官中CD45+细胞百分比，B为设门于CD4+细胞检测各器官中CD45+细胞百分比；(C)设门于CD8+细胞检测各器官中CD45+细胞百分比。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1抗体注射浓度分析
1材料
1.1实验动物
C57BL/6J小鼠，鼠龄13-16周，雄性，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于徐州医科大学血液病研究所动物中心IVC系统(意大利TECNIPLAST公司，合格证号：13103254)。
1.2主要试剂与仪器
荧光标记鼠抗人单克隆抗体CD4-PEcy7(clone No.RM4-5)，CD8-APC(cloneNo.53-6.7)，，CD45-BV570(clone No.30-F11)，购自美国Biolegend公司，CD45-APCcy7(clone No.30-F11)，购自美国BD公司，小鼠红细胞裂解液以及staining buffer自行配制。流式细胞仪器机型为FACSCalibur(美国BD公司)，数据分析用flowjo v10软件。
2方法
2.1静脉注射抗CD45抗体
抗CD45抗体由PBS配置，剂量分别为3ug/只(300ul)或5ug/只(300ul)，C57BL/6J小鼠经内眦静脉丛分别注射抗CD45抗体，注射后2.5min眼球取血，3min断颈处死小鼠，解剖取材BM、LN、SP、liver、lung。
3结果
分别利用不同浓度的anti mCD45抗体注射小鼠，以blood样本为阳性对照组，明确anti mCD45抗体体内注射的最低剂量。由图1可见，小鼠未注射抗体对照组live细胞、CD4+T和CD8+ T细胞中，几乎没有CD45+淋巴细胞群。使用3ug/只注射时，CD45+CD4+ T细胞和CD45+CD8+ T细胞的百分率分别是96.2％和99.3％。使用5ug/只剂量注射小鼠，活细胞总体染色率由3ug/只时的5.73％提高到62.6％；CD4+ T和CD8+ T细胞中CD45+细胞百分率分别是99.7％和99.8％，与3ug/只组小鼠染色百分率无显著差别(图1)。上述结果发现，在两种抗体剂量下虽然外周血全部淋巴细胞比率染色差别较大，但是CD4+ T cell和CD8+ T cell中CD45+cell百分比数值基本相当，都达到95％以上，表明3ug的体内注射剂量已足够将血管内T淋巴细胞全部、快速染色，可作为后续应用的有效浓度。
实施例2不同荧光标记抗体检测
为检测不同标记和厂家的抗体是否能达到相似的体内染色效果，使用克隆号(clone No.30-F11)相同的anti mCD45-APCcy7和anti mCD45-BV570抗体进行检测。分别注射3ug/只的anti-mCD45-APCcy7和anti-mCD45-BV570两种抗体，live细胞中CD45+细胞百分率无明显差别。两种不同抗体染色的CD4+ T细胞和CD8+ T cell中96％意思为CD45+细胞，两者之间无染色效果相当(图2)。上述结果表明，相同克隆号的CD45抗体即便标记抗体荧光不同，并不影响体内快速与抗原结合的能力，抗体识别血管内淋巴细胞效果不受影响。
实施例3淋巴器官与非淋巴器官中血管内外淋巴细胞标记情况
1方法
1.1制备单个核细胞
外周血单个核细胞：准备EDTA抗凝EP管，1.5mlEP管中加入50ul 0.5M EDTA，小鼠眼球摘除取血后滴入EP管中，立即震荡弹匀防止凝血；微量移液器吸取200ul外周血转移到15ml离心管中，加入5ml小鼠红细胞裂解液室温裂解6min，加入10mlPBS到离心管终止裂解，1100rpm，8min，4℃离心，弃上清，残液弹起加入1mlPBS置于冰上。
LN和SP单个核细胞制备：在平皿中加入PBS没过筛网中的组织，注射器针芯研磨淋巴结和脾，直到筛网中只剩结缔组织，分别吸取淋巴结和脾细胞悬液到15ml离心管，1100rpm，8min，4℃离心，弃上清，淋巴结细胞残液弹起加入3mlPBS置于冰上；脾细胞残液弹起后加入5ml小鼠红细胞裂解液，室温裂解5min，加10mlPBS到离心管终止裂解，1100rpm，8min，4℃离心，弃上清，残液弹起加入4mlPBS置于冰上。
BM单个核细胞制备：取双侧腿和坐骨一起撕下，减去脚后放入PBS平皿中，用剪刀和镊子去掉腿上的肌肉，分出胫骨、股骨和坐骨。2ml注射器吸取PBS后，冲出骨髓到离心管，一只小鼠6根骨头，只用3mlPBS反复冲洗即可，直到骨头发白，将冲出的骨髓用注射器吹散到单个细胞转移至15ml离心管，1100rpm，8min，4℃离心，弃上清，残液弹起后加入5ml小鼠红细胞裂解液，室温裂解5min，加10mlPBS到离心管终止裂解，1100rpm，8min，4℃离心，弃上清，残液弹起后加入5mlPBS置于冰上。
liver单个核细胞制备:在平皿中加入PBS没过筛网中的肝脏组织，先用剪刀剪碎组织，接着使用注射器针芯研磨肝脏，吸取细胞悬液到50ml离心管，再加入PBS体积达到50ml，400rpm，3min，4℃离心，上清转移至新的50ml离心管，1500rpm，10min，4℃离心，弃上清，残液弹起，加入8ml 40％percoll重悬，取15ml离心管管底加入4ml 80％percoll，然后将细胞悬液缓慢加入，保持分层，800g，30min，室温，升3降3离心，中间细胞层即为单个核细胞，PBS洗2遍，400g，5min4℃离心，弃上清，残液弹起后加入200ulPBS置于冰上。
lung单个核细胞制备:在平皿中加入PBS没过筛网中的肺组织，先用剪刀剪碎组织，接着使用注射器针芯研磨肺脏，吸取细胞悬液到15ml离心管，3000rpm或800g，8min，4℃离心，弃上清，残液弹起，加入5ml小鼠红细胞裂解液，室温裂解5min，加入10mlPBS到离心管终止裂解，3000rpm或800g，8min，4℃离心，弃上清，残液弹起，8-10mPBS洗涤，3000rpm或800g，8min，4℃离心，残液弹起加入100ulPBS置于冰上。
1.2制备流式样本
从每个样本的单个核细胞悬液中取100ul于流式管中，并在流式管上作好标记，准备好空白管，单染管，空白管先置于冰上，其余管进行以下操作：用微量移液器加抗体于相应管中(抗体总体积为5ul，根据抗体的推荐用量或正确的滴度，剩余体积用stainingbuffer补齐)，室温避光15-20min，2mlPBS洗涤细胞，1100rpm，8min，4℃离心，弃上清，100ulPBS重悬细胞，和空白管一起用流式细胞仪上机检测。
2结果
明确anti mCD45抗体体内染色浓度和荧光标记后，进一步检测淋巴器官和非淋巴器官血管内外CD45+cell的百分比。结果如图3A所示，在淋巴器官淋巴结、脾和骨髓中的live细胞中可见明显的CD45分群，淋巴结中CD45+细胞百分率低于脾和骨髓，两种抗体染色百分率相似。非淋巴器官肝脏和肺脏中CD45+和CD45-细胞分群明显，且anti mCD45-BV570染色百分率略高。进一步检测CD4+淋巴细胞经anti mCD45染色后情况，结果如图3B所示，淋巴结中罕见血管故绝大多数CD4+细胞为CD45-，且在脾和骨髓中CD45-群占其主要成分，表明淋巴细胞多数分布于淋巴组织内。肝脏中CD4+细胞群中86％以上为CD45+细胞，提示淋巴细胞在肝脏中主要位于血液循环中，而仅少量细胞位于肝脏实质。肺脏中CD45+细胞群可达到80％以上。CD8+淋巴细胞在淋巴器官和非淋巴器官中的血管内外分布情况与CD4+淋巴细胞类似，再次证明淋巴器官中的淋巴细胞均位于淋巴组织内，而非淋巴器官的淋巴细胞则绝大多数在血管中循环(图3C)。上述结果，证明了利用anti mCD45抗体的体内标记染色的准确性，可获得客观科学的血管内外淋巴细胞数据。

Claims (8)

1.小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、静脉注射抗CD45抗体
小鼠经内眦静脉丛注射抗CD45抗体，注射剂量为3-5μg/只，注射后2.5min眼球取血，3min断颈处死小鼠并解剖取材，包括淋巴组织和非淋巴组织；
S2、制备单个核细胞
分别制作S1获得的外周血及解剖获取组织的单个核细胞；
S3、制备流式样本
取S2单个核细胞的悬浮液置于流式管中，并向其中加入抗体，室温避光15-20min，PBS缓冲液洗涤细胞、离心、弃上清、PBS缓冲液重悬细胞，置于流式细胞仪上检测；
S4、分析血管内外淋巴细胞标记情况
采用流式细胞术分析单个核细胞血管内外的CD45+百分比，并以此识别淋巴组织或非淋巴组织中淋巴细胞的位置。
2.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S1中解剖获取的淋巴组织为淋巴结、脾脏和骨髓，非淋巴组织为肝脏和肺脏。
3.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S1中注射剂量为3μg/只。
4.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S2中单个核细胞的制备方法为：
(1)外周血单个核细胞
小鼠眼球取血后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；
(2)淋巴结、脾脏单个核细胞
分别将淋巴结、脾脏混合PBS缓冲液置于筛网中研磨直至筛网中只剩结缔组织，分别吸取二者的悬浮液，离心后去上清；其中，淋巴结细胞残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存，脾脏细胞残液弹起后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；
(3)骨髓单个核细胞
取双侧腿和坐骨，分离胫骨、股骨和坐骨，PBS缓冲液冲出骨髓，吹散后离心、去上清，残液弹起后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；
(4)肝脏单个核细胞
取肝脏混合PBS缓冲液置于筛网中研磨直至筛网中只剩结缔组织，吸取细胞悬液离心后取上清，转移上清液后离心、去上清，残液弹起后采用40％细胞分离液重悬，然后将悬液加入80％细胞分离液中，升3降3离心，中间细胞层即为单个核细胞，PBS缓冲液洗涤、离心去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；
(5)肺脏单个核细胞
取肝脏混合PBS缓冲液置于筛网中研磨直至筛网中只剩结缔组织，吸取细胞悬液离心后去上清，残液弹起后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起PBS缓冲液洗涤、离心去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存。
5.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S3中加入的抗体为CD45-BV570或CD45-APCcy7。
6.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S3中抗体采用荧光标记。
7.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S4中淋巴组织血管内CD45-群较CD45+占主要成分，而非淋巴组织血管内CD45+群较CD45-群占主要成分。
8.权利要求1-7任一所述小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法在判断小鼠淋巴细胞浸润程度中的应用。
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