CN108179134A

CN108179134A - 基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108179134A
Application number: CN201711451102.5A
Authority: CN
Inventors: 汪付兵; 陈浩; 尹长青; 袁纯辉; 陈明
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2018-06-19
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN108179134B

Abstract

本发明公开了一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用。本发明还公开了一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片捕获前列腺癌CTCs的方法以及在此基础上对捕获到的前列腺癌CTCs进行相关分子表征谱分析，所述相关分子表型为前列腺癌转移相关标志物SChLAP1/PSA及靶向治疗响应标志物AR/PD‑L1，从而建立一种前列腺癌CTCs分子表征谱联合检测方法及检测试剂盒。本发明高效、高度特异性、高灵敏度以及高准确性，同时非常具有临床实用价值，四分子联合检测用于前列腺癌CTCs中与转移复发早期预警、疗效评估以及靶向治疗增加了临床应用的可行性和可信。

Description

基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用

技术领域

本发明研究前列腺癌CTCs的分离捕获及其相关分子表型谱鉴定，涉及前列腺癌转移复发的分子生物学诊断与疗效评估领域，可用于前列腺癌患者临床治疗靶点响应的选择及为肿瘤伴随诊断提供循证依据，具体涉及基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用。

背景技术

在全世界范围内，前列腺癌(PCa,prostate cancer)已经成为男性最常见的恶性肿瘤之一，也是导致男性因癌症死亡的第二大原因。在美国，其发病率仅低于皮肤癌，统计数据显示2014大约有230,000例前列腺癌新增病例以及大约29,500人死于前列腺癌。虽然目前我国前列腺癌的发病率远低于西方欧美国家，但随着人口老龄化不断加剧，前列腺癌在我国老龄人口中的发病率也在逐年上升。前列腺癌患者死亡的主要原因是部分局限性前列腺癌患者在根治术和放疗后仍会出现转移，在初期经抗雄治疗病情得到较好控制的患者仍有较大概率发展成为转移性激素抵抗性前列腺癌(mCRPC，metastatic castrationresistant prostate cancer)，患者5年相对生存率可由早期的100％下降到低于30％。目前常规用于前列腺癌早期筛查的技术主要包括直肠指检(DRE，digital rectalexamination)、经直肠超声(TRUS，transrectal ultrasound)和血清前列腺特异性抗原(PSA，prostate specific antigen)检测等。其中血清PSA水平检测仍然是目前临床最常用的前列腺癌诊断标志物。然而，当血清PSA浓度处于灰度值范围时(4-10ng/mL)，则无法准确有效的将早期前列腺癌患者与前列腺增生患者(BPH，benign prostatic hyperplasia)辨别开来，因此其诊断效能依旧受到其特异性较低的限制，同时，不必要的有创检查导致许多患者产生了严重的心理负担，有时甚至遭受过度诊断与治疗，目前对于其用作筛查和早期诊断临床上仍然存在争议。因此，我们亟待发现更加经济准确的前列腺癌标志物。

循环肿瘤细胞(CTCs)具有特定的生物学特性和行为，有关分析对于进一步了解肿瘤患者的异质性，选择个体化治疗方案，并在治疗过程中实时监测疗效具有广泛的应用前景。CTCs早期从肿瘤原发灶脱落，经过上皮间质化(EMT)后侵袭并进入人体血液循环或淋巴系统中，随之到达不同的组织器官，在一定条件下形成新的转移灶。由此可见，CTCs可能是癌症血行转移的基础，导致术后复发的关键因素。在前列腺癌发生发展过程中，前列腺癌CTCs作为具有肿瘤代表性的“液体活检”样本，允许多次、实时、非侵入获取，其表现出的多种生物学特性及其分子机制都可能代替传统的前列腺癌组织被用于前列腺癌的分子分型，并且可能成为前列腺癌个体化诊疗靶点。

近年来关于CTCs的研究报道越来越多，其研究热点主要包括：①临床诊断；②预后判断；③转移机制研究；④个体化诊疗。现行的CTCs分离方法大多基于梯度密度离心法、细胞大小的膜过滤法、免疫亲合捕获法及功能化微流控芯片法。目前CTCs分离的标准方法是基于肿瘤细胞表面上皮性抗原的磁性激活细胞分选技术。EpCAM是一种上皮细胞特异性粘附分子，广泛表达于上皮细胞和上皮来源的肿瘤细胞表面。基于EpCAM抗体磁珠的CellSearch系统已被美国FDA和国内SFDA批准用于乳腺癌、结肠癌和前列腺癌CTCs的检测。然而越来越多的证据表明EpCAM在部分癌种中表达率较低，同时部分肿瘤细胞由于转移过程中的EMT改变而不表达或者弱表达EpCAM，因此单纯依靠EpCAM抗体捕获方法势必将导致具有高转移潜能的EpCAM阴性CTCs亚细胞群体的漏检。因此目前更多的研究是注重于CTCs富集、分离方法学的改进或升级，以及CTCs计数临床意义的评价，至于CTCs分子表型鉴定及其临床意义的研究尚处于起步阶段。

虽然基于免疫磁珠法的CTCs捕获计数已被证实可用于转移性前列腺癌患者的预后判断，但单纯的CTCs计数已经不能完全满足临床需要，基于分子表型检测少数更具存活力和侵袭性的CTCs比单独计数CTCs更有价值。Miyamoto等研究发现前列腺癌患者CTCs中PSA表达上升很大程度上预示着患者倾向于发生去势抵抗。Darshan等通过免疫荧光染色对来源于CRPC患者的CTCs进行AR核定位分析，结果证实对紫杉醇化疗敏感的患者AR在细胞核内聚集程度减少。因此对捕获后的前列腺癌CTCs进行分子表型分析，进一步获得其恶性相关的分子表征谱以及评价其侵袭潜能对于指导临床治疗决策制定显得非常重要。有研究发现LncRNA-SChLAP1(第二号染色体与前列腺-相关位点)可作为侵袭性前列腺癌的一个潜在生物标志物，与早期前列腺癌相比，SChLAP1在转移性前列腺癌患者中的表达更高，且主要存在于前列腺癌细胞中，而不在其他肿瘤细胞或正常细胞中表达，因此通过检测前列腺癌患者CTCs这种非侵入性的方式来检测SChLAP1将有助于帮助临床医生对前列腺癌患者做出治疗决策。同时，随着免疫治疗作为一种新的治疗方法逐渐被大家所熟知，程序性细胞死亡受体1及配体(PD-1/PD-L1，programmed death-1，PD-1；programmed death ligand-1，PD-L1)也开始被广泛的研究。在正常情况下，PD-1在T细胞受到炎症信号刺激后被诱导产生，通过限制T细胞的功能，调整免疫反应的程度和持续时间，从而避免正常组织的损伤。然而，肿瘤细胞正好“狡猾”的利用了这一机制，通过过表达PD-L1，持续刺激T细胞表达PD-1，抑制T细胞受体的信号传递，下调一些抗凋亡分子和促炎因子的表达，导致T细胞耗竭，最终使肿瘤细胞成功逃避机体免疫杀伤，从而在机体内无限增殖。为此，目前基于PD-1/PD-L1的免疫治疗主要是使用针对PD-1/PD-L1的单克隆抗体，来遏制肿瘤细胞表达的PD-L1与T细胞表达的PD-1结合，从而达到治疗肿瘤的目的，其中以纳武单抗(OPDIVO)，派姆单抗(Keytruda)，阿特珠单抗(Atezolizumab)使用最为广泛。目前PD-L1的检测主要是在肿瘤细胞蛋白水平，即对患者手术或穿刺后取得的肿瘤组织进行免疫组化分析PD-L1表达情况。然而，目前利用组织进行PD-L1组化检测，还有存在一些技术性的问题：PD-L1在肿瘤组织中散在表达，也就是说肿瘤组织的不同位置PD-L1的表达是不一样的，并且T细胞分泌的干扰素会上调肿瘤细胞PD-L1的表达。由于通过组织活检仅仅是一小块肿瘤组织，染色后只能代表一个很小区域的PD-L1表达状态，无法完整准确地反应整个肿瘤组织的情况，因此可能造成假阴性。这或许就是不同临床试验中PD-L1在同一类肿瘤的不同患者中阳性率差异较大，并且存在与疗效的相关性互相矛盾的原因之一。

循环肿瘤细胞(CTCs，circulating tumor cells)反映肿瘤实时进展，为基于前列腺癌的“液相活检”提供了可能。然而由于上皮间质化转化(EMT，epithelialmesenchymaltransition)及特异性靶分子的缺乏，导致前列腺癌患者体内CTCs的捕获及其相关分子表征谱的研究进展缓慢。

发明内容

发明目的：本发明拟建立基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片前列腺癌CTCs捕获体系，并进一步通过实时荧光定量qRT-PCR检测前列腺癌细胞恶性特征相关的分子表征谱，从而对目的分子靶标进行高效、准确的检测。本发明基于研究发现的PSA、LncRNA-SChLAP1、AR及PD-L1等分子分别在前列腺癌转移预警、去势抵抗、化疗敏感性评估以及免疫靶向治疗的作用，通过联合检测PSA、LncRNA-SChLAP1、AR及PD-L1的表达水平，证明了前列腺癌CTCs中PSA及SChLAP1表达水平的动态监测将有助于前列腺癌的伴随诊断以及转移复发的早期预警，同时动态监测前列腺癌CTCs中AR及PD-L1的表达水平具有实时判断抗雄治疗疗效以及确定能否实施针对PD-L1的免疫治疗的潜在应用价值，从而反映患者靶向治疗的响应性。联合检测PSA、LncRNA-SChLAP1、AR、PD-L1这四种表型分子，可为临床上基于前列腺癌CTCs的“液相活检”提供可能。

本发明所要解决的技术问题是提供了一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片在捕获前列腺癌CTCs方面的应用。

针对目前CTCs分离捕获困难以及其相关分子表征谱尚未鉴定等问题，本发明还要解决的技术问题是提供了一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片捕获前列腺癌CTCs的方法以及提供了基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片的前列腺癌CTCs分子表征谱的检测方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种前列腺癌诊断试剂盒。

本发明最后要解决的技术问题是提供了基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片、所述的核酸引物、所述的前列腺癌诊断试剂盒在制备前列腺癌早期诊断、转移复发预警、去势抵抗及靶向治疗的试剂中的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片，所述基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片是将经过表面化学修饰偶联有链霉亲和素的磁珠与生物素修饰的EpCAM和PSMA抗体共孵育后通过注射泵冲入到两侧加有外加磁场的微流控芯片里获得。

其中，上述生物素修饰的EpCAM和PSMA抗体指的是生物素修饰的EpCAM抗体和生物素修饰的PSMA抗体。

一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：将经过表面化学修饰偶联有链霉亲和素的磁珠与生物素修饰的EpCAM和PSMA抗体共孵育后通过注射泵冲入到两侧加有外加磁场的微流控芯片里获得。

一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片在捕获前列腺癌CTCs方面的应用。

一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片捕获前列腺癌CTCs的方法，其特征在于，所述方法包括收集前列腺癌患者的外周血标本，加入红细胞裂解液去除红细胞后，进一步通过EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片识别并捕获外周血环境中的前列腺癌CTCs。

上述的基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片捕获前列腺癌CTCs的方法，具体包括以下步骤：

1)前列腺癌细胞上皮间质转化前后相关指标检测：

首先通过TGF-β1诱导前列腺癌细胞LnCAP进行上皮间质转化，然后通过qRT-PCR，Western-blotting及流式细胞技术对上皮间质转化前后相关分子指标的表达改变进行检测，为后续微流控芯片修饰靶标分子的选择提供实验依据；

其中，通过该qRT-PCR检测刺激前后LnCAP细胞ZEB1，E-cadherin，EpCAM，PSMA，Snail和Twist mRNA表达水平变化；qRT-PCR检测所用引物如下：

EpCAM-F：5’-GTGGTTGTGGTGATAGCAGTTG-3’

EpCAM-R：5’-CCATCTCCTTTATCTCAGCCTTCT-3’

PSMA-F：5’-ATGCTTATAGGCGTGGAATTGC-3’

PSMA-R：5’-TGCTATCTGGTGGTGCTGAG-3’

ZEB1-F：5’-CAGCCAAATGGAAATCAGGATGAA-3’

ZEB1-R：5’-GGCGGTGTAGAATCAGAGTCA-3’

Snail-F：5’-GCCTAGCGAGTGGTTCTTCT-3’

Snail-R：5’-TGCTGGAAGGTAAACTCTGGATT-3’

Twist-F：5’-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3’

Twist-R：5’-TGGAGGACCTGGTAGAGGAA-3’

CDH1-F：5’-AGACCAAGTGACCACCTTAGAG-3’

CDH1-R：5’-GAGCAGCAGAATCAGAATTAGCA-3’

GAPDH-F：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’

GAPDH-R：5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’

2)基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片的制备；

3)临床前列腺癌患者外周血中CTCs的识别及捕获：

收集临床前列腺癌患者的外周血标本1mL，经过适当处理后，通过EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片，从前列腺癌患者外周血环境中识别并捕获得到循环前列腺癌CTCs。

本发明通过联合检测PSA、LncRNA-SChLAP1、AR及PD-L1的表达水平，证明了前列腺癌CTCs中PSA及SChLAP1表达水平的动态监测将有助于前列腺癌的伴随诊断以及转移复发的早期预警，同时动态监测前列腺癌CTCs中AR及PD-L1的表达水平具有实时判断抗雄治疗疗效以及确定能否实施针对PD-L1的免疫治疗。

本发明的一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片的前列腺癌CTCs分子表征谱的检测方法，所述方法包括收集前列腺癌患者的外周血标本，加入红细胞裂解液去除红细胞后，进一步通过EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片识别并捕获外周血环境中的前列腺癌循环肿瘤细胞，并进一步通过实时荧光定量PCR对捕获到的前列腺癌CTCs中长链非编码RNA SChLAP1、前列腺特异性抗原(PSA)、雄激素受体(AR)及程序性死亡受体-配体(PD-L1)等分子的表达情况进行检测并通过统计学软件分析前列腺癌CTCs分子表征谱。

进一步地，所述前列腺癌CTCs分子表征谱为LncRNA-SChLAP1、PSA、AR及PD-L1中的一种或几种的分子表征谱。

进一步地，通过实时荧光定量PCR联合检测前列腺癌CTCs中LncRNA-SChLAP1、PSA、AR及PD-L1四种分子的表达水平。

进一步地，所述实时荧光定量PCR中采用的核酸引物包括检测前列腺癌CTCs的长链非编码RNA SChLAP1、前列腺特异性抗原(PSA)、雄激素受体(AR)及程序性死亡受体-配体(PD-L1)的核酸引物中的一种或几种，所述核酸引物的序列分别为：

SChLAP1-F 5’-TGGACACAATTTCAAGTCCTCA-3’

SChLAP1-R5’-CATGGTGAAAGTGCCTTATACA-3’

PD-L1-F 5’-CTGGCATTTGCTGAACGCAT-3’

PD-L1-R 5’-GGGAGAGCTGGTCCTTCAAC-3’

AR-F 5’-CAGCCTATTGCGAGAGAGCTG-3’

AR-R 5’-GAAAGGATCTTGGGCACTTGC-3’

PSA-F 5’-GTGACCAAGTTCATGCTGTGT-3’

PSA-R 5’-CCACCTTCCAGGACTACTCTC-3’。

一种前列腺癌诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括所述的基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片和/或所述的核酸引物。

其中，所述诊断试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录试剂和RT-qPCR试剂。

其中，所述的基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片、所述的核酸引物和/或所述的前列腺癌诊断试剂盒在制备前列腺癌早期诊断、转移复发预警和/或去势抵抗及靶向治疗的试剂中的应用。

本发明的捕获方法还可以衍生出基于其他特异性靶标的前列腺癌CTCs捕获方法以及衍生出的基于其他特异性靶标的相关肿瘤CTCs捕获方法，所述的相关肿瘤为肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等。

本发明的分子表征谱的检测方法还可以衍生出其他前列腺癌相关分子表征谱的检测方法。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：

①本发明提供了一种高效、高度特异性、高灵敏度以及高准确性，同时非常具有临床实用价值的用于前列腺癌CTCs中与转移复发早期预警、疗效评估以及靶向治疗等相关的分子表征谱的检测方法。

②本发明综合EpCAM及PSMA两种特异性抗体的优势，结合微流控芯片技术可有效分离和鉴定循环肿瘤细胞，有效避免了前列腺癌发生发展过程中由于EMT转化所致CTCs相关分子表型变化，进而导致高转移潜能CTCs漏检的问题，而采用实时荧光定量PCR检测目标基因表达具有很好的特异性、灵敏度、准确性和可重复性，可广泛应用于临床检测。

③由于所设计的核酸引物对于目标基因的检测是特异的，且信号经过放大，因此较常规的染色方法检测更为灵敏，具有更高的区分度和准确性。本发明特异性强，具有切实的临床实用价值。

④基于分子表型检测在临床肿瘤转移复发早期预警、疗效评估以及靶向治疗等方面的重要意义，本发明基于前期工作所建立的双抗体功能化微流控芯片技术重点研究PSA、LncRNA-SChLAP1、AR及PD-L1四种分子在前列腺癌CTCs中的表达水平以及其与前列腺癌患者临床表现之间的关系，从而为临床前列腺癌转移复发早期预警、疗效评估以及靶向治疗等提供新的思路。本发明通过联合检测循环肿瘤细胞中PSA、SChLAP1、AR及PD-L1的表达水平，证明了前列腺癌CTCs中PSA及SChLAP1表达水平的动态监测将有助于前列腺癌的伴随诊断以及转移复发的早期预警，同时动态监测前列腺癌CTCs中AR及PD-L1的表达水平具有实时判断抗雄治疗疗效以及确定能否实施针对PD-L1的免疫治疗的潜在应用价值，从而反映患者靶向治疗的响应性。

⑤联合检测PSA、LncRNA-SChLAP1、AR及PD-L1四种分子可有效预测前列腺癌早期转移、评估治疗后去势抵抗状况及化疗敏感性，同时指导临床免疫靶向治疗，四分子联合检测增加了临床应用的可行性和可信度。

附图说明

图1临床组织和细胞水平选择PSMA做捕获标志物的必要性的相关图形；

1a)前列腺癌组织免疫组化染色结果图；其中，良性前列腺增生症患者(BPH)、低Gleason评分前列腺癌患者(low gleason)、高Gleason评分前列腺癌患者(High gleason)、合并淋巴结转移的前列腺癌患者(LN metastasls)、合并骨转移的前列腺癌患者(Bonemetastasls)；

1b)实时荧光定量qRT-PCR检测刺激前后LnCAP细胞ZEB1，E-cadherin，EpCAM，PSMA，Snail和Twist mRNA表达水平变化图；

1c)Western blotting检测刺激前后LnCAP细胞EpCAM和PSMA蛋白表达变化图；(GAPDH是指甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是一种内参蛋白)

1d)免疫荧光检测刺激前后LnCAP细胞EpCAM和PSMA蛋白表达变化图；其中，DAPI是指4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测，用于显示细胞核；Merge是指将三张于同一视野下不同激发光所拍摄的荧光图片进行整合到一张图片上；

1e)流式分析检测刺激前后LnCAP细胞EpCAM和PSMA蛋白表达变化图；

图2双抗体微流控芯片捕获模拟血循环肿瘤细胞的相关图形；

2a)基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片的循环肿瘤细胞捕获模式图；

2b)模拟血CTCs捕获后荧光显微镜下三色荧光鉴定、计数图；

2c)不同捕获分子条件下模拟血中CTCs捕获效率比较图；

2d)模拟血CTCs常见LncRNA、AR、PSA及PD-L1表达分析；

图3前列腺癌患者循环肿瘤细胞鉴定及临床特征相关性分析图；

3a)前列腺癌患者外周CTCs三色荧光鉴定图；

3b)24例前列腺癌患者CTCs数目统计图；

3c)24例前列腺癌患者CTCs数目与患者临床特征相关性分析图；

图4前列腺癌患者CTCs分子表征谱分析图；

4a)15名前列腺癌患者CTCs中SChLAP1的表达情况图；

4b)15名前列腺癌患者CTCs中AR的表达情况图；

4c)15名前列腺癌患者CTCs中PSA的表达情况图；

4d)15名前列腺癌患者CTCs中PD-L1的表达情况图；

4e)前列腺癌患者CTCs中SChLAP1的表达与患者TNM分期的关系图；

4f)前列腺癌患者CTCs中AR的表达与患者TNM分期的关系图；

4g)前列腺癌患者CTCs中PSA的表达与患者TNM分期的关系图；

4h)前列腺癌患者CTCs中PD-L1的表达与患者TNM分期的关系图；

4i)前列腺癌患者血清PSA水平与CTCs中PSA表达水平相关性分析图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，通过结合实施例和附图进一步详述本发明的特点和优点。所该实施例仅是对本发明的解释，不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实施例1：免疫组化检测前列腺癌组织PSMA表达水平

通过免疫组织化学技术检测不同类型前列腺癌患者及前列腺增生患者组织PSMA表达水平。

1)收集伴发骨转移(Bone metastasis)、淋巴结转移(LN metastasis)或是不同Gleason评分(不同评分指的是低评分和高评分，低评分是指gleason评分在小于7，高评分是指gleason评分大于7)的前列腺癌患者肿瘤组织病理切片，并以BPH患者组织做对照；以上切片统称为石蜡组织切片；

2)分别将步骤1)得到的石蜡组织切片置于65℃烘箱中烘片2h，脱蜡至水，用PBS(浓度为10mM，pH7.2～7.4)洗三次，然后将切片置于EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10min低火至沸。

3)自然冷却后PBS(浓度为10mM，pH7.2～7.4)洗3次，每次5min，然后将石蜡组织切片置于3％过氧化氢溶液中，室温下避光孵育10min。

4)PBS(浓度为10mM，pH7.2～7.4)洗3次，每次5min，甩干后5％BSA封闭20min。

5)去除BSA液，加入约50μl稀释的一抗(PSMA：1:50)(购买于福州迈新生物技术开发有限公司公司，货号：MAB-0575)覆盖石蜡组织切片，4℃孵育过夜。

6)PBS洗3次，每次5min，加入50μl羊抗鼠二抗(1:200)(购买于BioLegend公司，货号：405301)覆盖石蜡组织切片，37℃孵育50min。

7)PBS洗3次，每次5min，加入100μl新鲜配制DAB溶液覆盖石蜡组织切片，显微镜控制显色；DAB是指二氨基联苯胺，配方为10mM Tris-HCl(pH7.6)(9mL)、DAB(diaminobezidin3，3-二氨基联苯胺)、0.3％(W/V)NiCl₂或CoCl₂(1mL)，显色时加入30％H₂O₂(5-10mL)混匀后立即使用；

8)显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，1％盐酸酒精分化(约1s)，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

9)石蜡组织切片再经过梯度酒精75％，90％，100％，100％，各10min，脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

10)显微镜下拍照，观察PSMA染色差异，染色结果参见图1a，PSMA表达水平在前列腺癌患者中明显高于前列腺增生的患者；在高Gleason评分患者中的表达水平高于低Gleason评分患者；在淋巴结转移(lymph node metastasis)患者或者骨转移(bonemetastasis)患者中，其表达水平也高于未转移患者，这从病理学的角度说明了PSMA在疾病发展过程中的动态变化。

实施例2前列腺癌LnCAP细胞经TGF-β1诱导上皮间质转化(EMT)前后相关分子表达水平变化检测

1、TGF-β1诱导前列腺癌细胞LnCAP上皮间质转化(EMT)

通过TGF-β1处理前列腺癌LnCAP细胞以获取EMT后的前列腺癌细胞模型。

1)重组人TGF-β1(买于美国PeproTech公司，货号：100-21C)用10mM Citric Acid(柠檬酸，pH3.0)，溶解，吹打至其完全溶解(20ng/mL)，最后用完全培养基将其进一步稀释并分装成1mL每一个管(10ng/mL)，置于-20℃冰箱储存。

2)将培养的前列腺癌细胞系LnCAP接种于六孔板中，时不时置于倒置显微镜下观察，待细胞长至融合度达70％且状态良好时，更换培养基为无血清的不完全培养基(不加入胎牛血清的完全培养基)。

3)向六孔板中加入TGF-β1至终浓度为10ng/mL，做好相应的标记，分别刺激细胞24h，48h，72h。

4)到相应的时间点后，分别用于细胞的免疫荧光实验、qRT-PCR、westernblotting及流式细胞术检测。

2、Trizol法提取总RNA及实时荧光定量qRT-PCR

2.1Trizol裂解细胞

1)将步骤1经过TGF-β1处理过的细消化下来(指将贴壁细胞从培养瓶壁上洗脱下来)或者直接去除培养基上清后加入Trizol进行裂解，不断吹打细胞并在显微镜下观察，直至没有完整的细胞形态即可。

2)把步骤1)处理的细胞加入到无酶EP管中，若无需立即使用则可放置到-80℃冰箱保存。

2.2RNA提取

1)将Trizol裂解后的细胞产物在室温下静置20min，之后加入200μl三氯甲烷(裂解物：三氯甲烷体积比＝5：1)，加入后上下颠倒EP管或在涡旋器上震动直至混合均匀。

2)混合均匀后，将EP管在室温下静置5-10min，然后置入低温高速离心机内以12000rpm的转速离心15min。

3)离心完成后，可见EP管内液体被分为三层，上清即含所需的RNA，转移上清至新的无酶EP管中，吸取的过程中要轻柔缓慢，避免吸到中间那层白膜，因其含基因组遗传物质，会对提取的RNA产生干扰。

4)将上清转移至新的EP管中后，按上清:异丙醇＝2:1的比例加入异丙醇，然后将EP管颠倒混匀并在室温下静置10-15min。

5)然后置入低温高速离心机内以12000rpm的转速离心15min。

6)离心完成后，可见EP管底部有白色沉淀物即为所需的RNA沉淀，用加样枪小心去除上清，然后加入75％酒精洗涤，置入低温高速离心机内以7500rpm的转速离心5min，弃上清，然后重复洗涤一次，最后离心后，继续吸弃净上清液。

7)室温下自然晾干RNA沉淀或者置于超净工作台内晾干，待RNA沉淀呈现半透明状态时，即可加入20-50μl无RNA酶的DEPC水溶解RNA沉淀，并放入-80℃冰箱待用。

2.3RNA浓度及质量检测

1)RNA浓度测定采用NanoDrop2000检测器，使用前先用双蒸水清洗检测孔。

2)用双蒸水给机器调零，检测线在基线附近时表明该机器在控。

3)在检测孔上加入待测样品，该机器便立即显示出吸收曲线，同时也会给出A260/A230、A260/A280比值用来帮助我们确定样品纯度，用以判断我们提取的RNA样品是否去盐充分或者是否存在蛋白质和其他有机物的污染。

2.4实时荧光定量qRT-PCR检测TGF-β1诱导LnCAP产生EMT过程

1)将按上述步骤提取好的总RNA置于65℃变性5min，然后立即放于冰上冷却。

2)冰上操作，在0.5mL的无RNA酶的EP管中加入以下成分：(试剂盒购买于Takara、货号RR036A)

模板总RNA 0.5pg-1μg

5×RT Buffer 2μl

Enzyme Mix 0.5μl

Primer Mix 0.5μl

最后加无RNAse的水至总体系为10μl

3)按照以下条件进行实验：37℃，15min；98℃，5min；4℃或者-20℃保存。

4)上述反应结束后，取0.2mL PCR管加入以下成分，体系如下：(该试剂盒购买于Takara、货号RR047A)

模板cDNA 1μl

2×SYBR master mix 10μl

Forward primer(10μM) 1μl

Reverse Primer(10μM) 1μl

ROXⅡ 0.4μl

ddH₂O 6.6μl

5)按照以下温度条件进行实验：95℃，5min；(95℃，30s；63℃(退火温度均为63℃)，20s；72℃，20s)×40个循环；72℃，2min，设置在72℃，20s处采集荧光信号，所用引物见表1。

表1.qRT-PCR检测所用引物

从图1b中看出，实时荧光定量qRT-PCR结果显示LnACP在TGF-β1刺激后，在RNA水平，E-cadherin，EpCAM表达水平下降，PSMA，Twist，Snail，ZEB1表达水平上升。

3、Western blotting检测蛋白表达变化情况

通过Western blotting技术检测经TGF-β1刺激前后前列腺癌LnCAP细胞蛋白表达变化。

1)将玻璃板预先刷洗干净并放置在烤箱中烤干待用。

2)配制12％分离胶：向50mL配胶离心管内依次加入1.0mL蒸馏水、2.0mL 30％Acr-Bis、1.9mL 1M Tris(pH8.8)、0.05mL 10％SDS、0.05mL 10％过硫酸铵、0.002mL TEMED，用加样枪轻柔缓慢的混合均匀。

3)将配制好的分离胶沿着玻璃板边缘缓慢小心的加入玻璃板内，加至一定高度后，用加样枪加入一定量无水乙醇，用以使分离胶上缘保持一条直线，然后室温放置30min左右待其凝固，凝固后弃掉上层无水酒精，并用双蒸水冲洗后待用。

4)配制5％SDS-PAGE浓缩胶：向50mL配胶离心管内依次加入，1.4mL蒸馏水、0.33mL30％Acr-Bis、0.25mL 1M Tris(pH6.8)、0.02mL 10％SDS、0.02mL 10％AP、0.002mL TEMED，用加样枪轻柔缓慢的吹打均匀。

5)将配制好的浓缩胶沿着玻璃板边缘缓慢的加入玻璃板内分离胶上层，尽量避免产生气泡，灌满玻璃夹板后应立即水平插入梳子，然后室温放置30min左右待其凝固备用。

6)浓缩胶凝固后将整个玻璃版取下，用电泳夹夹好并置入预先装有适量电泳缓冲液的电泳槽内，观察几分钟看电泳夹内页面是否降低，若没有溶液漏出，则可轻轻将梳子拔出。

7)取前期提取好的前列腺癌细胞LnCAP细胞蛋白进行蛋白电泳，用加样枪加10-20μl样品于胶板的孔内，同时加入5μl蛋白质marker，采用稳压80V电泳，待看到溴酚蓝跑过浓缩胶后，可将电压加压至120V，直至目的蛋白条带分开时结束。

8)将配制好转膜液倒入转膜槽中，同时将6张新的滤纸和2块海绵垫，浸泡在转膜液中，同时将PVDF膜浸泡在甲醇里活化以激活其上带的正电荷。

9)取下上述步骤中电泳好的胶块，切除不含目的蛋白的胶块，含目的蛋白的胶块待用。

10)将转膜用的夹子打开，在两面上各放一块海绵垫，然后在海绵垫上各放3层滤纸，此过程中应尽量避免气泡的产生，然后将上一步中切下的胶块放置在滤纸正中央，此过程中也应尽量避免气泡的产生，然后将PVDF膜覆盖在胶块上，若有气泡产生，应慢慢吹打将其驱散。最后夹紧夹子。

11)把电泳槽置于放满冰块的容器中，然后把夹子放置到电泳槽中，黑面对着阴极，白面对着阳极，以稳流200mA开始转膜2h。

12)完成上述转膜步骤后，取下PVDF膜并将其放入盛有5％脱脂奶粉平皿中，置于4℃冰箱中封闭过夜。

13)封闭完成后，将PVDF膜放入盛有TBST溶液的平皿，并置于摇床上洗涤3次，每次10min。

14)将上述步骤中洗净的PVDF膜放入杂交桶内，加入相应的EpCAM抗体或者PSMA抗体，使PVDF膜充分浸润于抗体，37℃孵育2h。

15)一抗孵育完毕后，将PVDF膜放入盛有TBST溶液的平皿，并置于摇床上洗涤3次，每次10min。

16)再次将膜放入杂交桶内，加入HRP标记兔抗羊或是兔抗鼠二抗，使PVDF膜充分浸润于抗体中，37℃孵育1h。

17)二抗孵育完毕后，将PVDF膜放入盛有TBST溶液的平皿，并置于摇床上洗涤3次，每次10min。

18)将上述洗净的PVDF放到显影板内，同时配置ECL显影液，在EP管中按A液:B液＝1:1混合均匀后，滴加到PVDF膜上。

19)然后放入UVP全自动化学发光成像仪器中观察结果(结果参见图1c，Westernbloting结果显示在蛋白水平，TGF-β1刺激72小时后EpCAM蛋白表达水平下降，PSMA蛋白表达水平上升)。

4、免疫荧光技术检测TGF-β1刺激LnCAP后蛋白表达变化

通过细胞免疫荧光技术检测经TGF-β1刺激前后前列腺癌LnCAP细胞蛋白表达变化。

1)实验前期准备：用自来水清洗20mm×20mm的盖玻片及试剂瓶后，置于烘箱中烘干，然后将烘干后的盖玻片及试剂瓶小心放入酸缸中经硫酸-重铬酸钾清洁液(用硫酸配制5％-10％的重铬酸钾溶液)浸泡，泡酸过夜后，流水冲洗20遍，然后再用双蒸水冲洗20遍，最后装满双蒸水浸泡过夜，烘干后备用；

2)分别称取8.0g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，3.63g Na₂HPO₄并置于试剂瓶中，然后向试剂瓶中加入1L双蒸水，磁力搅拌使其充分溶解混匀，配制成1×PBS溶液并进行高压灭菌，备用；

3)细胞预处理：用无菌PBS溶液小心洗涤各细胞株2次后，小心加入适量0.02％EDTA消化液至刚好铺满整个细胞培养瓶底部，室温下静置适宜时间以消化细胞，直至细胞完全脱壁，反复吹打细胞，使其形成均匀一致的细胞悬液，用吸管小心吸出均匀一致的细胞溶液至15mL离心管中，室温下1500rpm离心5min；然后吸去0.02％EDTA消化液，向离心管中加入适量无菌PBS溶液洗涤细胞，洗涤完成后，将离心管置于离心机中离心，然后小心倒掉离心管中的PBS洗液，再向离心管中加入适量1640培养基(购买于美国Gibco公司，RPMI1640货号：11875-093)或DMEM培养基(购买于美国Gibco公司，DMEM货号：11965-092)重悬细胞，轻轻吹打以形成均匀一致的细胞悬浮液；

4)向预先放置有高压灭菌盖玻片的六孔细胞培养板中依次加入1mL上述细胞悬浮液，然后补充一定体积的1-1.5mL培养基，充分混匀后，做好标记并放在二氧化碳培养箱中培养；

5)于显微镜下间断观察玻片上细胞状况，并定期换液；待细胞铺满玻片后，取出爬片，并准备进行细胞爬片染色实验；

6)小心弃去六孔板中的培养基，注意不要触动细胞爬片，然后向每个孔中加入适量PBS溶液洗涤细胞爬片，轻轻晃动洗涤2次，每次3min，然后弃去PBS洗液，用吸水纸小心吸干细胞爬片周围的液体(切勿触动爬片)，然后小心滴加200μL细胞固定剂至细胞爬片上(使细胞固定剂盖满细胞爬片即可)，置于室温下固定30min；

7)用移液枪小心弃去细胞固定剂，然后向六孔板中加入适量PBS溶液洗涤细胞爬片，轻轻晃动洗涤3次，每次5min，弃去PBS洗液，用吸水纸小心吸干细胞爬片周围的液体，然后向细胞爬片上小心滴加200μL稀释后的破膜剂(购买于Biolegend公司，货号：421402)，置于室温下处理30min；

8)用移液枪小心弃去细胞破膜剂，然后向六孔板中加入适量PBS溶液洗涤细胞爬片，轻轻晃动洗涤3次，每次5min，弃去PBS洗液，用吸水纸小心吸干细胞爬片周围的液体，然后向细胞爬片上小心滴加适量羊来源的EpCAM(EpCAM：美国R&D公司，货号：AF960)和小鼠来源的PSMA抗体(按1:1000的比例)(PSMA：购买于福州迈新生物技术开发有限公司公司，货号：MAB-0575)，4℃避光孵育1h；

9)用移液枪小心弃去多余抗体，然后向六孔板中加入适量PBS溶液洗涤细胞爬片，轻轻晃动洗涤3次，每次5min，弃去PBS洗液，用吸水纸小心吸干细胞爬片周围的液体，然后向细胞爬片上小心滴加适量FITC anti-Goat EpCAM(FITC标记二抗：购买于美国R&D公司，货号：F0109)和PE anti-mouse PSMA二抗(PE标记二抗：购买于美国R&D公司，货号：F0120B)，室温避光孵育30min。

10)用移液枪小心弃去未结合二抗，然后向六孔板中加入适量PBS溶液洗涤细胞爬片，轻轻晃动洗涤3次，每次5min，再向细胞爬片上小心滴加200μL DAPI染液(购买于Sigma-Aldrich公司，浓度为20ng/ml)进行细胞核染色，将六孔板置于铝盒内，室温下避光染色15min；

11)小心弃去DAPI染液后，向六孔板中加入适量PBS溶液洗涤细胞爬片，轻轻晃动洗涤3次，每次5min；

12)小心取出细胞爬片，并倒置于滴有适量50％甘油的载玻片上，用吸水纸吸干周围的液体，将载玻片置于荧光显微镜下观察EMT转化前后前列腺癌细胞LnCAP蛋白表达变化情况(结果参见图1d，细胞爬片结果进一步证实，经TGF-β1刺激72小时后细胞内EpCAM蛋白表达水平下降，PSMA蛋白表达水平上升)。

5、流式细胞技术检测TGF-β1刺激LnCAP后蛋白表达变化

1)按如上所述步骤用TGF-β1刺激LnCAP细胞72h后，收获细胞，1200rpm离心5min，弃上清收获细胞沉淀。

2)用加样枪吸取细胞保存液重悬细胞，使其终浓度为1×10⁶cells/mL，然后取500μl加入到新的EP管中，同时加入羊来源的EpCAM和小鼠来源的PSMA抗体(按1:1000的比例)，4℃避光孵育1h。

3)一抗孵育完成后，加入细胞保存液洗涤细胞后，1200rpm离心5min后，弃上清。

4)取500μl细胞固定剂固定细胞，室温下避光固定30min。

5)固定后，加入细胞保存液洗涤细胞后，1200rpm离心5min后，弃上清。

6)然后加入FITC anti-Goat EpCAM和PE anti-mouse PSMA二抗，室温避光孵育30min。

7)二抗孵育完成后，加入细胞保存液洗涤细胞后，1200rpm离心5min后，弃上清。

8)加入细胞保存液重悬细胞，用200目(74μm)滤膜过滤细胞，获得单个细胞悬液并上流式检测目的细胞群比例。(结果参见图1e，流式检测经过TGF-β1刺激72h的LnCAP细胞表型变化，结果显示EpCAM阳性LnCAP细胞由未刺激前的97.0％下降为15.2％，PSMA阳性的LnCAP细胞由54.8％上升到98.9％)

实施例3模拟血环境中前列腺癌CTCs捕获效率验证

取适宜数量的前列腺癌细胞LnCAP和TGF-β1刺激后的LnCAP-EMT加入到1mL健康体检者外周全血中，充分混匀，从而模拟外周血环境中的循环肿瘤细胞的检测。加入红细胞裂解液去除红细胞后，进一步通过EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片识别并捕获外周血模拟环境中的前列腺癌细胞，并对捕获到的细胞进行免疫荧光鉴定。

1)采集24例健康人外周静脉血液各2mL，用EDTA(Ethylene diamine tetraaceticacid，乙二胺四乙酸)真空采血管抗凝保存。

2)取制备好的LnCAP和TGF-β1刺激后的LnCAP-EMT单细胞悬液1mL，用PBS溶液分别稀释得到100个细胞/ml、200个细胞/ml、300个细胞/ml、400个细胞/ml四个浓度梯度的LnCAP和LnCAP-EMT单细胞悬液。

3)将上述稀释好的前列腺癌细胞系加入到健康人血中制备得到含有不同细胞浓度的人造病人血即为模拟血。

4)将上述模拟血收集至离心管中，3000rpm离心5min，弃掉上层血清。

5)加入5mL红细胞裂解液，充分混匀细胞，室温裂解5min，期间摇动1-3次；红细胞裂解液的配制：称取3.735g NH₄Cl，1.300g Tris加ddH₂O溶解并定容至500mL，然后经0.22μm滤膜过滤后，4℃保存即可。

6)300g离心5min，去上清，观察底层细胞沉淀中红细胞是否裂解完全，未裂解完全则按照上述步骤再裂解一次摇动。

7)将底层红细胞去除干净的细胞沉淀用500μl PBS重悬(本实验中的PBS浓度均为10mM，pH7.2-7.4)。

8)修饰特异性捕获抗体：将已经过表面化学修饰偶联有链霉亲和素(Streptavidin)的磁珠、生物素(biotin)修饰的EpCAM抗体和生物素(biotin)修饰的PSMA抗体共孵育，室温30min，然后通过注射泵冲入到两侧加有外加磁场的微流控芯片里，磁珠则吸附在微流控芯片里的镍柱上。

9)预先用注射泵向芯片内注入PBS洗涤芯片一次，然后将上述步骤中制备的不同数量级的人造血通过注射泵以0.8mL/h的速度注入微流控芯片。

10)上述反应结束后，在荧光电子显微镜下观测和计数捕获的LnCAP和LnCAP-EMT细胞，最后计算并比较数量级前列腺癌细胞系条件下的捕获效率，每组实验重复至少三次。双抗体微流控芯片捕获模拟血循环肿瘤细胞的结果参见图2，图2b为模拟血CTCs经EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片捕获后，分别用DAPI，FITC-CD45以及PE-CK对其进行三色荧光鉴定图，图2c单独使用EpCAM抗体捕获LnCAP的平均效率为73.8％，然而对于LnCAP-EMT的平均捕获效率则下降到38.1％，基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片捕获CTCs的效率均大于85％。且高于单独使用任意一种抗体的捕获效率；。

11)采用qRT-PCR检测正常前列腺上皮细胞RWPE1以及前列腺癌细胞LnCAP、PC3及DU145相关lncRNA表达。qRT-PCR检测的条件和体系与实施例2相同，所涉及引物与表2中的引物序列相同；图2d结果显示，LncRNA SChLAP1在前列腺癌细胞LnCAP及PC3表达量最高，且远远高于其他lncRNA的表达，并且在正常细胞中不表达；另外发现在前列腺癌细胞中AR，PSA以及PD-L1的拷贝数均呈高表达水平。

实施例4前列腺癌患者外周血中CTCs捕获及鉴定

收集临床上前列腺癌患者的外周血标本1mL，加入红细胞裂解液去除红细胞后，进一步通过EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片识别并捕获外周血环境中的前列腺癌细胞，并对捕获到的细胞进行免疫荧光鉴定。

1)将前列腺癌患者的外周血至于离心管中，3000rpm离心5min，弃上清。

2)加入5mL红细胞裂解液，充分混匀细胞，室温裂解5min，期间摇动1-3次。

3)300g离心5min，去上清，观察底层细胞沉淀中红细胞是否裂解完全，未裂解完全则按照上述步骤再裂解一次摇动。

4)将底层红细胞去除干净的细胞沉淀用500μl PBS重悬。

5)将已经过表面化学修饰偶联有Streptavidin的磁珠与biotin修饰的EpCAM和biotin修饰的PSMA抗体共孵育，室温30min，然后通过注射泵冲入到两侧加有外加磁场的微流控芯片里，磁珠则吸附在微流控芯片里的镍柱上。

6)预先用注射泵向芯片内注入PBS洗涤芯片，然后将上述步骤中制备的破红后的细胞通过注射泵以0.8mL/h的速度注入微流控芯片。

7)反应完成后，通入PBS洗涤芯片，除去非特异性结合的细胞。

8)洗涤完成后，通入细胞固定剂(购买于Biolegend公司，货号：421403)，室温条件下静置30min，使细胞被充分固定。

9)固定完成后，通入PBS洗涤芯片，洗去细胞固定剂，然后通入细胞破膜剂(购买于Biolegend公司，货号：421402)，室温破膜20min。

10)破膜完成后，通入PBS洗涤芯片，洗去细胞破膜剂。

11)洗涤完成后，通入1％BSA溶液，然后向其中加入PE anti-CK(PE-CK：美国BDBiosciences公司，货号：563615；)及FITC anti-CD45(FITC-CD45：美国BD Biosciences公司，货号：555482)，将芯片置于4℃条件下避光孵育过夜。

12)取出芯片，通入PBS洗涤芯片一次，然后用PBS溶液重悬细胞，并加入DAPI染液进行细胞核染色，室温避光孵育15min。

13)染色完成后，通入PBS洗涤芯片，洗去DAPI染液。

14)最后通入PBS溶液，在荧光显微镜下对捕获的细胞进行鉴定计数；图3a)为前列腺癌患者外周血CTCs经DAPI，FITC-CD45以及PE-CK三色荧光鉴定，第一排为经典的CTC(CK+CD45-DAPI+)，第二排为间质化的CTC，CK表达为阴性，我们仍然根据细胞大小及细胞上黏附的大量磁珠将其判定为CTC(CK-CD45-DAPI+)，第三排为CTCs簇(CTC cluster)即两个及两个以上的CTC成团出现；

15)将患者CTCs数目与临床特征进行相关性分析。图3b)24例患者中检测到前列腺癌CTCs的有20例(83.3％)，具体数目见图中折线；且基于EpCAM/PMSA双抗体捕获到的CTCs数量依旧较单独采用EpCAM抗体捕获到的多，并且在III/IV患者中的优势更为明显。图3c为我们分别根据相应病人血清PSA水平、TNM分期以及Gleason评分将病人分为两组，实验数据显示，CTCs数目与患者TNM分期显著相关，CTCs数目也从I/II期的2.4±2.4个/2mL升高至III/IV期的9.6±4.0个/2mL(P＜0.0001)，然而随着PSA血清水平的升高或者Gleason评分的升高，CTCs检出个数并未出现显著性升高(P＝0.2828；P＝0.0619)。

实施例5前列腺癌患者CTCs分子表征谱分析

收集临床上前列腺癌患者的外周血标本10mL，加入红细胞裂解液去除红细胞后，通过EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片识别并捕获外周血环境中的前列腺癌细胞，并进一步通过qRT-PCR技术对捕获到的CTCs中SChLAP1、PD-L1、AR、PSA等分子的表达情况进行检测。

1)进一步收集了15例前列腺癌患者10mL外周血进行前列腺癌CTCs分子表征谱分析。

2)CTCs富集方法同实施例4，捕获后利用磁性释放(撤去磁场后，通过PBS洗脱)，提取RNA进行实时荧光定量qRT-PCR，该qRT-PCR的条件和体系与实施例2相同，所涉及引物见表2；

3)分析富集后的外周血前列腺癌CTCs中SChLAP1、PD-L1、AR、PSA等指标的表达情况。

表2.qRT-PCR检测所用引物

本发明所有涉及的实验结果均采用了SPSS17.0软件分析，计量资料用Mean±SD进行统计，均数组间差异分析采用Student’s t-test，非参数相关分析用Spearman秩相关分析，P<0.05则差异显著。图4a)CTCs中SChLAP1的表达水平与患者淋巴结转移和骨转移存在明显相关性，在转移性前列腺癌患者中表达明显较高(P＝0.0090)。图4b)CTCs中PSA的表达水平淋巴结转移和骨转移患者中也明显增高(P＝0.0148)。图4c)CTCs中的AR表达水平在两组患者中并未出现明显差异(P＝0.4473)。图4d)CTCs中PD-L1的表达水平在两组患者中并未出现明显差异(P＝0.0648)。图4e)前列腺癌患者CTCs中SChLAP1的表达与患者TNM分期呈正相关。图4f)前列腺癌患者CTCs中PSA的表达与患者TNM分期呈正相关。图4g)前列腺癌患者CTCs中AR的表达与患者TNM分期无相关性。图4h)前列腺癌患者CTCs中PD-L1的表达与患者TNM分期无相关性。图4i)CTCs中PSA表达水平与血清PSA水平存在明显的相关性(r＝0.8025，P<0.001)。

以上所述内容，仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> EpCAM-F(Artificial Sequence)

<400> 1

gtggttgtgg tgatagcagt tg 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> EpCAM-R(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatctcctt tatctcagcc ttct 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> PSMA-F(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcttatag gcgtggaatt gc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> PSMA-R(Artificial Sequence)

<400> 4

tgctatctgg tggtgctgag 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> ZEB1-F(Artificial Sequence)

<400> 5

cagccaaatg gaaatcagga tgaa 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> ZEB1-R(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcggtgtag aatcagagtc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Snail-F(Artificial Sequence)

<400> 7

gcctagcgag tggttcttct 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Snail-R(Artificial Sequence)

<400> 9

tgctggaagg taaactctgg att 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Twist-F(Artificial Sequence)

<400> 9

gtccgcagtc ttacgaggag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Twist-R(Artificial Sequence)

<400> 10

tggaggacct ggtagaggaa 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> CDH1-F(Artificial Sequence)

<400> 11

agaccaagtg accaccttag ag 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> CDH1-R(Artificial Sequence)

<400> 12

gagcagcaga atcagaatta gca 23

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> GAPDH-F(Artificial Sequence)

<400> 13

taaagacctc tatgccaaca cagt 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> GAPDH-R(Artificial Sequence)

<400> 14

cacgatggag gggccggact catc 24

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> SChLAP1-F(Artificial Sequence)

<400> 15

tggacacaat ttcaagtcct ca 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> SChLAP1-R(Artificial Sequence)

<400> 16

catggtgaaa gtgccttata ca 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> PD-L1-F(Artificial Sequence)

<400> 17

ctggcatttg ctgaacgcat 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> PD-L1-R(Artificial Sequence)

<400> 18

gggagagctg gtccttcaac 20

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> AR-F(Artificial Sequence)

<400> 19

cagcctattg cgagagagct g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> AR-R(Artificial Sequence)

<400> 20

gaaaggatct tgggcacttg c 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> PSA-F(Artificial Sequence)

<400> 21

gtgaccaagt tcatgctgtg t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> PSA-R(Artificial Sequence)

<400> 22

ccaccttcca ggactactct c 21

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> PCAT1-F(Artificial Sequence)

<400> 23

tgagaagaga aatctattgg aacc 24

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> PCAT1-R(Artificial Sequence)

<400> 24

ggtttgtctc cgctgcttta 20

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> PCA3-F(Artificial Sequence)

<400> 25

gaaggacctg atgatacaga ggtgag 26

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> PCA3-R(Artificial Sequence)

<400> 26

cacagggcga ggctcatcg 19

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> PCGEM1-F(Artificial Sequence)

<400> 27

cacgtggagg actaagggta 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> PCGEM1-R(Artificial Sequence)

<400> 28

ttgcaacaag ggcatttcag 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> PRNCR1-F(Artificial Sequence)

<400> 29

ccagattcca agggctgata 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> PRNCR1-R(Artificial Sequence)

<400> 30

gatgtttgga ggcatctggt 20

Claims

1.一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片，其特征在于，所述基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片是将经过表面化学修饰偶联有链霉亲和素的磁珠与生物素修饰的EpCAM和PSMA抗体共孵育后通过注射泵冲入到两侧加有外加磁场的微流控芯片里获得。

2.一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将经过表面化学修饰偶联有链霉亲和素的磁珠与生物素修饰的EpCAM和PSMA抗体共孵育后通过注射泵冲入到两侧加有外加磁场的微流控芯片里获得。

3.一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片在捕获前列腺癌CTCs方面的应用。

4.一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片捕获前列腺癌CTCs的方法，其特征在于，所述方法包括收集前列腺癌患者的外周血标本，加入红细胞裂解液去除红细胞后，进一步通过EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片识别并捕获外周血环境中的前列腺癌循环肿瘤细胞。

5.一种基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片的前列腺癌CTCs分子表征谱的检测方法，其特征在于，所述方法包括收集前列腺癌患者的外周血标本，加入红细胞裂解液去除红细胞后，进一步通过EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片识别并捕获外周血环境中的前列腺癌循环肿瘤细胞，并进一步通过实时荧光定量PCR对捕获到的循环肿瘤细胞中SChLAP1、PD-L1、AR、PSA等分子的表达情况进行检测并通过统计学软件分析前列腺癌CTCs分子表征谱。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述前列腺癌CTCs分子表征谱为前列腺癌转移相关标志物SChLAP1/PSA和靶向治疗响应标志物AR/PD-L1的分子表征谱。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR中采用的核酸引物包括检测前列腺癌CTCs的长链非编码RNA SChLAP1、前列腺特异性抗原PSA、雄激素受体AR及程序性死亡受体-配体PD-L1的核酸引物中的一种或几种，所述核酸引物的序列分别为：

SChLAP1-F 5’-TGGACACAATTTCAAGTCCTCA-3’

SChLAP1-R 5’-CATGGTGAAAGTGCCTTATACA-3’

PD-L1-F 5’-CTGGCATTTGCTGAACGCAT-3’

PD-L1-R 5’-GGGAGAGCTGGTCCTTCAAC-3’

AR-F 5’-CAGCCTATTGCGAGAGAGCTG-3’

AR-R 5’-GAAAGGATCTTGGGCACTTGC-3’

PSA-F 5’-GTGACCAAGTTCATGCTGTGT-3’

PSA-R 5’-CCACCTTCCAGGACTACTCTC-3’。

8.一种前列腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括权利要求1所述的基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片和/或权利要求5所述的核酸引物。

9.根据权利要求8所述的前列腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录试剂和RT-qPCR试剂。

10.权利要求1所述的基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片、权利要求5所述的核酸引物和/或权利要求8所述的前列腺癌诊断试剂盒在制备前列腺癌早期诊断、转移复发预警和/或去势抵抗及靶向治疗的试剂中的应用。