CN110527726A - 用于非小细胞肺癌检测及分期判断的外泌体检测装置及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于非小细胞肺癌检测及分期判断的外泌体检测装置及其应用。本发明装置包括：外泌体的提取机构；外泌体的表征机构；外泌体蛋白表达量信息测定机构和外泌体表达量信息分析机构。本发明装置操作简便，成本低，有望实现对病情的实时追踪，可根据病情发展及时调节治疗方案，在实现疾病早筛和个性化医疗方面均有着很好的应用前景。

Description

用于非小细胞肺癌检测及分期判断的外泌体检测装置及应用

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种用于非小细胞肺癌检测及分期判断的外泌体检测装置及应用。

背景技术

肺癌是当今世界上发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤，是目前全世界癌症死因的第一名。在各种类型的肺癌中，非小细胞肺癌(NSCLC)的比例约为85％，是最为常见的肺癌。它主要包括腺癌、鳞状细胞癌即肺鳞癌、大细胞未分化癌三类，肺腺癌是其中最主要类型，约占比40％。

临床上，病理诊断仍是诊断肺癌的“金标准”，通过病理诊断确定肺癌的类型，辅助其他检测手段如核磁共振，CT等确定肺癌的分期等特征，进而帮助肺癌患者制定有效的治疗方案。非小细胞肺癌对传统放化疗的敏感度相对较低，特别是晚期转移性病人及老年体弱患者，传统的放化疗往往无法获得很好的治疗效果。近年来，肺癌基因突变的发现促进了分子靶向治疗的发展，靶向药物是针对肿瘤细胞的表面抗原或者基因突变而设计的，对正常的细胞影响较小，提高了转移性疾病患者亚群的生存率。目前比较常见的驱动基因是表皮生长因子受体(EGFR)，EGFR是ErbB/HER家族的一种受体酪氨酸激酶，调控细胞的增殖，分化，迁移等生理活动，在40％-80％的NSCLC患者体内过表达。在肺腺癌患者中，约20％的病人发生基因突变，其中，最常见的为19号外显子上E746-A750氨基酸缺失突变及21号外显子的L858R点突变。大量研究表明，这两类基因突变患者，对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)十分敏感。吉非替尼，厄洛替尼为已被FDA批准的TKI药物，是基因突变患者的重要辅助治疗药物，可大大提高患者的生活质量和生存期。基于以上认识，肺癌的诊断，分期，及肺癌EGFR基因突变检测在帮助医生判断病情，确定治疗方案，跟踪治疗效果等方面有着至关重要的意义。

现有的肿瘤常规检测方法为病理检查，对从病人体内取出的活体组织进行染色观察，通过细胞的形态和结构判断是否出现癌变。大部分时候，病理检查是判断是否是癌症的最重要的依据。免疫组化检查(IHC)和荧光原位杂交法(FISH)是临床常用的判断癌细胞中目标蛋白表达量的方法，通过手术切除或穿刺的手段取组织进行分析。基因测序则是基因突变检测的重要手段，对肿瘤组织细胞中的基因组进行分析，确定突变类型和突变位点。然而，现有的检测方法有着不可忽视的弊端，单针穿刺活检取样位置的局限性有可能给检测结果造成极大的偏差。除此之外，在肿瘤进展和治疗过程中，瘤内异质性、遗传漂变、以及治疗手段给肿瘤带来的压力等因素均有可能导致肿瘤中蛋白水平和基因序列发生变化，而现有检测方法均为侵入性，给患者带来极大痛苦，也就导致了这些方法无法对病人的病情进展实时监测，因此在很大程度上导致检测结果的滞后性，影响了靶向治疗的实时性和有效性。

如今，一种体外检测手段液体活检技术正开始兴起，这是一种非侵入式的血液测试，能监测到肿瘤或转移灶释放到血液中的循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(CtDNA)和外泌体。液体活检对于癌症的早筛，动态监测，指导用药等方面有着重要的意义。其中一类重要的液体活检对象外泌体是由细胞分泌的膜囊泡，直径在50-150nm,存在于几乎所有类型的体液当中。相比血液中含量极少的CTCs，外泌体的数量十分庞大，每毫升血液中高达10⁸-10¹⁰个，相比血液中易降解的CtDNA,外泌体的膜结构对其内部携带的分子起到很好的保护作用。由细胞分泌的外泌体携带其来源细胞的信号分子，包括蛋白质、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯，并将所携带分子递送至靶细胞。在癌症中，外泌体被认为与癌症的进展息息相关，癌细胞可通过分泌外泌体将信号递送至与下游细胞或微环境中，加速肿瘤的增殖，转移，复发等。因此，外泌体中的信号常常可用于反映其分泌细胞的生理及病理功能状态,从而提供了潜在的生物分子标志物，故从体液中纯化出外泌体具有良好的临床应用前景，可以作为肿瘤诊断和预后判断的生物标志物。然而，纳米级的小尺寸使得外泌体的分离纯化和检测都面临着极大的挑战，除此之外，从外泌体携带的多种信号分子中选择合适的生物标志物也具有一定的难度。这些问题都迫切需要解决与完善。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于非小细胞肺癌检测及分期判断的外泌体检测装置及应用。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种非小细胞肺癌检测及分期判断的外泌体检测装置，所述装置包括：

(1)外泌体提取机构：通过离心提取细胞培养上清中的外泌体；

(2)外泌体表征机构：对所述外泌体提取机构提取得到的外泌体进行表征，以确定确实提取到了外泌体，其中，所述表征指标选自以下一种或多种：形貌、大小、浓度；

(3)外泌体蛋白表达量信息测定机构：对所述外泌体提取机构提取的外泌体进行蛋白表达量信息的测定；

优选地，所述目标蛋白选自以下一种或多种：EGFR蛋白,EGFR突变蛋白，CXCR4蛋白；

更优选地，所述EGFR突变蛋白至少包括19号外显子上E746-A750氨基酸缺失突变及21号外显子的L858R点突变；

(4)外泌体表达量信息分析机构：对所述外泌体蛋白表达量信息测定机构测定的表达量信息进行分析，进行非小细胞肺癌检测及分期判断。

根据本发明第一方面所述的装置，其中，所述细胞选自以下一种或多种：结直肠癌细胞SW620，肺癌细胞A549，H1975，H1650。

根据本发明第一方面所述的装置，其中，所述外泌体提取机构中，所述外泌体的提取方法选自以下一种或多种：超速离心法、微孔膜过滤法、微流通道法，优选为超速离心法，更优选地，所述超速离心法包括以下步骤：

(a)取细胞培养上清进行离心，第一次离心弃沉淀，取上清第二次离心弃掉沉淀，再次取上清第三次离心弃掉沉淀；

优选地，所述第一次离心速度为300g～1000g，优选为800g；第一次离心时间为5分钟；所述第二次离心速度为2000g～5000g，优选为2000g；第二次离心时间为10分钟；所述第三次离心速度为8000g～10000g，优选为10000g；第三次离心时间为1小时；所述离心温度为4℃；

(b)用滤膜过滤步骤(a)所得上清，过滤后的液体再次离心得沉淀，即得到外泌体；

优选地，所述滤膜孔径为0.1～0.5μm，优选为0.22μm；所述离心速度为100000～150000g，优选为100000g；所述离心时间为0.5～5小时，优选为2小时；所述离心温度为4℃。

优选地，所述外泌体的提取还包括以下步骤：

(c)将步骤(b)离心所得的沉淀，重悬在PBS中。

根据本发明第一方面所述的装置，其中，所述外泌体提取机构中，所述细胞培养上清的培养基含10％胎牛血清；

优选地，所述外泌体提取机构还包括以下操作机构：

在外泌体提取前将细胞培养上清的培养基换成由扣除外泌体的胎牛血清配制的培养基进行培养；优选地，所述更换时间为提取前24～76小时。

进一步优选地，所述扣除外泌体的胎牛血清配制的培养基通过以下方法制备：

(i)将血清加入基础培养基中，使细胞培养基中FBS浓度为20％；

(ii)将步骤(i)所得细胞培养基4℃条件下，超速离心过夜；优选地，所述离心速度为100000-130000g；

(iii)超速离心结束后，收集上清，用基础培养基将含20％FBS的培养基稀释为FBS浓度为10％,加入1％的双抗；

(iv)用滤膜对培养基进行过滤，装瓶待用；优选地，所述滤膜孔径为0.22μm。

根据本发明第一方面所述的装置，其中，所述外泌体表征机构中，所述形貌表征的机构为透射电镜，优选为生物型透射电镜；所述大小表征的机构为动态光散射机构和/或纳米颗粒跟踪分析机构；所述浓度表征的机构为纳米颗粒跟踪分析机构。

根据本发明第一方面所述的装置，其中，所述蛋白表达量的测定机构为流式细胞机构和/或Western blot机构。

优选地，所述流式细胞机构测定蛋白表达量包括以下步骤：

(I)将外泌体与醛基化微球结合；

(II)加5％的BSA/PBS溶液溶液停止实验，并封闭微球的非特异性结合位点；加入相应抗体进行反应，离心去除非特异性结合的抗体；加入对应的二抗进行反应；

(III)使用对应通道的流式细胞仪进行监测并与同型对照抗体的结果对比确定阳性率，确定表达量。

本发明的第二方面提供了第一方面所述的装置在制备用于诊断和/或治疗的肺癌医疗产品中的应用；优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。

本发明的目的之一是提供一种利用外泌体进行肺癌体外检测的装置。该装置可对肺癌实现诊断，分期及预后评价。该装置成本低，检测过程迅速，检测结果准确，非侵入的特性避免了常规的病理检测给患者带来的痛苦。该发明的另一目的是通过肺癌外泌体中EGFR蛋白表达量给出基因突变及与肿瘤发展相关的其他重要信息。该发明有望实现肿瘤的早筛，可对病情进行实时追踪，根据病情发展及时调节治疗方案，为实现个性化医疗提供了指导思路。

本发明公开了一种利用外泌体进行肺癌液体活检的装置，利用外泌体中EGFR和CXCR4蛋白表达量的差异实现对肺癌的体外诊断及分期。借助流式细胞术分析肺癌患者外泌体中EGFR蛋白表达量，反映出基因突变及与肿瘤发展相关的其他重要信息。本发明的实验，在肺癌细胞系中建立了完整的细胞外泌体的肺癌检测模型，在临床血液样本的检测中证实了该装置用于NSCLC临床诊断和分期的可行性，获得了较高准确性。

本发明提供了一种外泌体中目标蛋白表达量在肺癌体外检测方面的应用，原理图如图1所示。

所述应用至少包括肺癌的诊断，分期,预后评价及反映基因突变水平等。

所述目标蛋白至少包括EGFR蛋白,EGFR突变蛋白，CXCR4蛋白等。

优选地，外泌体中蛋白表达量的检测需借助醛基化微球的吸附

优选地，外泌体中蛋白表达量的检测是通过特异性识别抗体对蛋白进行识别。

优选地，蛋白表达量的检测方法为流式细胞术

本发明提供了一种利用细胞系培养上清中外泌体EGFR蛋白的表达量建立肺癌诊断细胞模型的方法。

本发明提供了一种利用细胞系培养上清中外泌体CXCR4蛋白的表达量建立肺癌分期细胞模型的方法。

本发明还提供了所述细胞系外泌体肺癌检测模型的建立，包括细胞系的选取，细胞培养上清中外泌体提取，EGFR或CXCR4蛋白表达量的检测。可在体外验证本发明在NSCLC诊断及分期等领域的可行性。

优选地，所述细胞系为结直肠癌细胞SW620，肺癌细胞A549，H1975，H1650。

优选地，所述细胞系的培养基中含10％胎牛血清FBS。

优选地，细胞培养上清外泌体提取自12-15皿细胞。

优选地，所述细胞培养上清应在外泌体提取前24-76h换成由扣除外泌体的胎牛血清(FBS)配制的培养基。

具体地，由扣除外泌体的血清进行培养基的配制，包括以下步骤：

1)将血清加入基础培养基中，使细胞培养基中FBS浓度为20％；

2)将该细胞培养基4℃条件下，离心力100000-130000g,超速离心过夜；

3)超速离心结束后，收集出上清，用基础培养基将含20％FBS的培养基稀释为FBS浓度为10％,加入1％的双抗；

4)用0.22μm滤膜对培养基进行过滤，装瓶待用。

检测受试者外泌体中EGFR的表达量在诊断或辅助诊断受试者是否为肺癌患者中的应用。

本发明提供了一种根据受试者外泌体中EGFR的表达量判断EGFR基因突变水平的方法

优选地，所述EGFR基因突变至少包括19号外显子上E746-A750氨基酸缺失突变及21号外显子的L858R点突变。

优选地，EGFR基因突变水平根据Western blot结果进行定量。

检测受试者血清样本外泌体中CXCR4的表达量在指导肺癌分期方面的应用。

所述外泌体的在肺癌诊断，基因突变检测，及肺癌分期等领域的应用。具体包括血清的分离，血清中外泌体提取，及EGFR或CXCR4蛋白表达量的检测。

优选地，血清为健康人血清及NSCLC病人血清，由新鲜血液分离得到。

具体的，血清的分离包括以下步骤：

1)使用无抗凝剂的采血管收集受试者的全血；

2)采血后静置1h以上使其分层，12h内离心，转速5000rpm,离心3-5min；

3)离心后收集上层血清。

细胞培养上清或血清中外泌体的提取，使用超速离心的方法。

优选地，超速离心温度为4℃。

优选地，离心力为100000-130000g。

优选地，超速离心时间为2-16h。

优选地，超速离心后的外泌体重悬至PBS中。

优选地，重悬外泌体的PBS缓冲液经过0.22μm的滤膜过滤。

本发明的用于非小细胞肺癌检测及分期判断的外泌体检测装置可以具有但不限于以下有益效果：

1、本发明提供了借助流式细胞术检测外泌体中EGFR蛋白表达量作为诊断肺癌，及检测外泌体CXCR4表达量对肺癌患者进行分期的新方案。本发明在临床血液样本中证实了该方法用于诊断和癌症分期的可行性，曲线下面积(AUC)分别为0.889和0.906，且检测结果与病理切片免疫组化染色结果相印证。证明了本方法在肺癌诊断及分期方面的高准确度。除此之外，外泌体EGFR和CXCR4表达量可反映患者EGFR突变信息及肿瘤干细胞信息，对NSCLC患者的治疗及病情追踪有着重要的指导意义。阐明了外泌体EGFR和CXCR4有望成为临床肺癌诊断，分期，指导用药，预后评价等方面的生物标志物。本发明不仅避免了传统病理检测的侵入性及滞后性，而且可全面反映癌细胞的特征，克服了组织切片及穿刺局部取样的给检测结果带来的偏差。

2、本发明涉及非小细胞肺癌(NSCLC)的诊断，基因突变检测及分期的装置。利用外泌体中目标蛋白标志物的表达量对受试者进行体外诊断及分期，同时给出患者基因突变信息。该方法为辅助肺癌检测，制定靶向治疗策略以及预后评价提供了新思路。由于该方法操作简便，成本低，有望实现对病情的实时追踪，可根据病情发展及时调节治疗方案，在实现疾病早筛和个性化医疗方面均有着很好的应用前景。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了本发明所述利用外泌体进行肺癌诊断及分期的原理图。

图2示出了从细胞培养上清中提取出的外泌体进行形貌及尺寸表征图,其中：图2a是由透射电镜(TEM)拍摄的外泌体形貌图；图2b是由NTA测得的外泌体的尺寸分布及数量；图2c是DLS测得的外泌体的尺寸分布。

图3示出了本发明所述外泌体-微球复合物的形貌表征图,其中：图3a是由透射电镜(TEM)拍摄的外泌体-微球复合物的形貌图；图3b是由扫描电镜(SEM)拍摄的外泌体-微球复合物的表面形貌图。

图4a示出了流式细胞术测得的三种细胞系EGFR表达量的结果图。图中百分数为抗体与细胞的结合率；图4b示出了三种细胞系提取的外泌体中EGFR表达量结果。图中的百分数为抗体与外泌体-微球复合物的结合率。

图5a示出了流式细胞术测得的三种细胞系CXCR4表达量的结果图。图中百分数为抗体与细胞的结合率；图5b示出了三种细胞系提取的外泌体中CXCR4表达量结果。图中的百分数为抗体与外泌体-微球复合物的结合率。

图6a示出了血清中提取到的外泌体形貌图；图6b示出了NTA检测血清中提取到的外泌体的数量级尺寸分布图；

图7a示出了分别在健康人，NSCLC病人外泌体中检测到的EGFR表达量的流式结果图，图中的百分数为EGFR抗体特异性结合外泌体的阳性率；图7b示出了由健康人，NSCLC患者外泌体中EGFR表达量绘制的散点图(**P<0.01,t检验)；图7c示出了用免疫组化染色法检测两例NSCLC患者原位肿瘤组织切片中EGFR蛋白的表达量(右)，与本发明所述方法测得的其外泌体EGFR含量相对比(左)；图7d示出了利用ROC曲线对本发明所述外泌体EGFR表达量在NSCLC诊断方面的应用进行分析的结果；

图8a示出了Western blot方法检测1-10号患者中EGFR突变蛋白表达量；图8b示出了EGFR E746-A750缺失突变水平与外泌体EGFR表达量之间的相关性分析,图中的数字皮尔森相关性分析结果；图8c示出了根据ROC曲线的截断点4.56％将10例病人分为EGFR低表达和高表达两组，将两组病人EGFR E746-A750缺失突变水平作散点图；图8d示出了EGFRL858R点突变水平与外泌体EGFR表达量之间的相关性分析,图中的数字皮尔森相关性分析结果；图8e示出了根据ROC曲线的截断点4.56％将10例病人分为EGFR低表达和高表达两组，将两组病人EGFR L858R点突变水平作散点图。

图9a示出了分别在NSCLC早期和晚期病人外泌体中检测到的EGFR表达量的流式结果图，图中的百分数为EGFR抗体特异性结合外泌体的阳性率；图9b示出了由NSCLC早期和晚期病人外泌体中EGFR表达量绘制的散点图(***P<0.001,t检验)；图9c示出了用免疫组化染色法检测两例NSCLC患者原位肿瘤组织切片中CXCR4蛋白水平(右)，与本发明所述方法测得的其外泌体CXCR4含量相一致(左)；图9d示出了利用ROC曲线对本发明所述外泌体CXCR4表达量在NSCLC病人癌症分期方面的应用进行分析的结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

除非特别指明，以下实施例中所用的细胞系,结直肠癌细胞SW620，肺癌细胞A549，H1975，H1650均购自中国医学科学院。

除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液，水质参数为电阻率18.2MΩ.cm@25℃。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。

除非特别指明，以下实施例中所用的PBS溶液均为1×PBS溶液，且经0.22μm滤膜过滤。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：试剂：

PBS缓冲液，蛋白裂解液，直径4μm的醛基化乳胶微球购自Thermo FisherScientific

戊二醛，乙酸双氧铀，，甘氨酸，BSA购自Sigma Aldrich

EGFR抗体，EGFR突变蛋白，CXCR4抗体，购自Cell Signaling Technology

超薄碳支持膜，购自Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd.,China；

BCA蛋白定量试剂盒，购自索莱宝公司；

滤膜,PVDF膜，购自Millipore,Bedford,MA。

仪器：

透射电子显微镜，购自日本日立公司、型号Hitachi High-Tech7700；

纳米颗粒跟踪分析仪，购自英国马尔文公司，型号NanoSight LM14system；

纳米粒径电位分析仪，购自英国马尔文公司，型号Zetasizer Nano ZS90；

离心机，购自北京雷勃尔离心机有限公司，型号LD5-2A；

流式细胞仪购自Life Technologies，Carlsbad，CA，型号acousticfocusing cytometer，AppliedBiosystems。

实施例1

本实施例用于说明细胞培养上清中外泌体的提取。

1、所使用的细胞材料

结直肠癌细胞系SW620，三种肺癌细胞系A549，H1975，H1650。

2、具体步骤包括：

1)待细胞生长至密度60％时，换上由事先扣除外泌体的血清配制的培养基，将其放在细胞培养箱中48h。

其中，扣除外泌体的血清进行培养基的配制，包括以下步骤：

①将血清加入基础培养基中，使细胞培养基中FBS浓度为20％；

②将该细胞培养基4℃条件下，离心力100000g,超速离心过夜；

③超速离心结束后，收集出上清，用基础培养基将含20％FBS的培养基稀释为FBS浓度为10％,加入1％的双抗；

④用0.22μm滤膜对培养基进行过滤，装瓶待用。

2)收集14皿细胞培养上清液至50mL离心管中，4℃条件下，离心力800g，离心5min；

3)将步骤2)中离心后上清液缓缓倒入新的离心管中，4℃条件下，离心力2000g，离心10min；

4)将步骤3)中离心后上清液缓缓倒入新的离心管中，4℃条件下，离心力10000g，离心1h；

5)取步骤4)中离心所得上清液，用0.22μm滤膜进行过滤，滤液收至新的离心管中。

6)将过滤后的样品装入超速离心管，确保离心管中无气泡，每两根离心管间质量差小于0.05g。4℃条件下，离心力100000g，离心2h。7)超速离心后弃去上清培养基，将底部沉淀重悬至PBS缓冲液中，4℃条件下，离心力100000g，离心2h。8)弃去上清的PBS缓冲液，将提取得到的外泌体重悬在200μL体积的PBS缓冲液中，PBS缓冲液提前用0.22μm的滤膜过滤。

实施例2

本实施例用于说明对提取出的外泌体进行形貌及尺寸表征。

1、透射电子显微镜(TEM)表征

吸取按实施例1方法提取的10μL外泌体滴加于超薄碳支持膜上(BeijingZhongjingkeyi Technology Co.,Ltd.,China)，在室温条件下自然干燥30min,吸去浮液，滴加10μL PBS缓冲液于支持膜上，1min后吸去，滴加固定液1％的戊二醛10uL，静置5min,吸去浮液，滴加富染剂2％乙酸双氧铀于支持膜上，染色1min,滤纸吸去浮液，常温干燥24h后,用日本日立公司生产的Hitachi High-Tech 7700透射电子显微镜在80kV的加速电压下观察。

图2a是实施例2得到的从细胞培养上清中提取的外泌体形貌图，从图2a可以得到外泌体为边缘厚中间薄的纳米囊泡，尺寸约为60-150nm。图中的插图是该外泌体的放大TEM图，从图中可以清楚地看出外泌体的轮廓。

2、尺寸及数量表征(NTA)

吸取细胞培养上清中分离出的外泌体20μL，PBS稀释50倍至1mL。用英国马尔文公司生产的NanoSight LM14system进行检测，激光器为405nm。用注射器将稀释后的外泌体注入样品池中，用高敏感度的金属氧化物半导体(CMSO)相机进行检测，收集时间为60s,检测限设置为7，每个样品做三次平行，每两个样品之间用PBS缓冲液仔细清洗样品池三遍。检测完毕后，用英国马尔文公司的数据分析软件NTA software,version 2.3对测试结果进行分析。

图2b是NTA测得的实施例2中外泌体的尺寸分布及数量。结果显示，外泌体的平均直径为130.5±42.5nm，尺寸分布为50-300nm,尺寸较大的部分是由于外泌体的聚集导致，该结果与TEM图中外泌体的尺寸分布基本一致。外泌体的数量为10¹⁰量级。

3、尺寸分布测试(DLS)

吸取实施例2中分离出的外泌体20μL，稀释50倍至1mL，用英国马尔文公司生产的Zetasizer Nano ZS90仪器对外泌体的尺寸分布进行测试，所用激光器为633nm的HeNe激光器，探测器为雪崩光电二极管探测器。样品注入石英比色皿中，保证比色皿中无气泡。使用DLS的反响散射模式进行检测，散射角为173°，温度为25℃，每个样品做三次平行，每两个样品之间用PBS缓冲液仔细清洗比色皿三遍。

图2c是DLS测得的实施例2中外泌体的尺寸分布。结果显示，外泌体的平均直径为141.8±22.79nm，尺寸分布为100-190nm。该方法测得的尺寸稍大于NTA及TEM，是由于DLS测试的为样品的水化半径。因此，该结果与TEM及NTA测出的外泌体的尺寸基本一致。

实施例3

本实施例用于说明外泌体-微球复合物的制备及形貌表征。

1、外泌体蛋白定量

取按实施例1方法提取的20μL外泌体于离心管中，加入20uL蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)，充分混合，于冰上裂解1h,使用索莱宝公司生产的BCA蛋白定量试剂盒对外泌体的蛋白含量进行定量。

2、外泌体-微球复合物的制备

1)根据蛋白定量结果，取蛋白含量为10μg的外泌体,和2.5uL微球充分混合,室温下孵育15min，加入PBS缓冲液至总体积为250ul,4度孵育过夜。

2)加入浓度为1M的甘氨酸28μL至上述混合液中，使甘氨酸终浓度为100mM，室温反应30min，以结合外泌体上多余的氨基位点，0.5％BSA/PBS清洗，离心，离心力14800g，如此重复三遍，将底部的外泌体-微球复合物重悬在PBS缓冲液中。

3、外泌体-微球复合物的形貌表征

1)透射电子显微镜(TEM)表征

吸取10μL外泌体-微球复合物，滴加于碳支持膜上(Beijing ZhongjingkeyiTechnology Co.,Ltd.,China)，在室温条件下自然干燥30min,吸去浮液，滴加10μL PBS缓冲液于支持膜上，1min后吸去，滴加固定液1％的戊二醛10uL，静置5min,吸去浮液，滴加富染剂2％乙酸双氧铀于支持膜上，染色1min,滤纸吸去浮液，常温干燥24h。用日本日立公司生产的Hitachi High-Tech 7700透射电子显微镜在80kV的加速电压下观察。

图3a是外泌体-微球复合物的形貌图，从图3a可以看出，外泌体紧密的的连接在微球上，尺寸均在100nm左右。图中的插图是放大的微球上外泌体的形貌，从图中可以清楚地看出外泌体已经成功的连接在微球上。

2)扫描电子显微镜(SEM)表征

将外泌体-微球复合物滴加在硅片上，室温下自然干燥，为便于观察，在干燥的样品表面溅射一层金薄膜。用日本日立公司生产的Hitachi S-3400N电子显微镜进行观察，加速电压为15KV。

图3b是外泌体-微球复合物的SEM形貌图，从图3b可以看出，外泌体紧密的的连接在微球上，尺寸在100nm左右。图中的插图是放大的微球表面的外泌体图像，从图中可以清楚地看出外泌体在微球表面仍保持囊泡状的形貌。

实施例4

本实施例用于说明利用细胞系外泌体建立肺癌诊断模型的方法。

1、所使用的细胞材料

结直肠癌细胞SW620，肺癌细胞系H1975、A549。

2、细胞中EGFR蛋白表达量的检测

1)收集细胞：按照细胞培养方法培养SW620，H1975、A549三种细胞，待其生长至80～90％铺满培养皿并连接成网状时，将其消化离心，弃去培养液，加入PBS重悬，轻轻吹打均匀后计数。

2)封闭细胞：分别收集一定量(≥106个)的SW620，H1975、A549细胞于1.5mL的离心管中，加入5％BSA/PBS,用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育1h。

3)孵育抗体：将封闭后的细胞离心，弃去上清，1000rpm的离心机(LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司)中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此重复三次，收集底部细胞。将EGFR抗体(兔源)稀释至指定浓度，取100μL加至收集了细胞的离心管，同型对照取同种属的IgG母液稀释至100μL，空白对照取100μL PBS，加至收集了细胞的离心管，用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育1h。将孵育好一抗的细胞悬浮液在转速为1000rpm的离心机(LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司)中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此重复三次，去除非特异性结合的抗体，收集底部细胞。加入稀释至指定浓度的荧光标记的兔二抗，用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育40min。

4)流式细胞仪测量：将孵育好抗体的细胞悬浮液在转速为1000rpm的离心机(LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司)中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此重复三次，去除非特异性结合的抗体，然后将细胞重悬成200-1000μL的溶液。用流式细胞仪(FCM，acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)进行检测，先检测空白对照组细胞的流式测试液，圈门。再检测同型对照组细胞的流式测试液，调节参数使细胞阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，选择流式细胞仪的FL-4通道(APC荧光检测通道，激发波长为640nm)检测细胞EGFR表达量，记录抗体与细胞的结合率。

得到的流式细胞术结果如图4a所示，图中的百分数为抗体与细胞的结合率。

3、流式细胞术方法检测细胞分泌的外泌体中EGFR蛋白表达量

2)将EGFR抗体稀释至工作浓度，取100μL加入至封闭后的外泌体-微球复合物中，室温反应1h,。离心力14800g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍，去除非特异性结合的抗体。

3)将对应种属的二抗稀释至工作浓度，取100μL加入至已连接一抗的外泌体-微球复合物中，室温反应1h。离心力14800g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

4)每个样品设置一个空白对照，一个同型对照，同型对照组只加入100μL二抗，空白对照只加入100μL PBS，至收集了细胞的离心管中，用移液枪轻轻吹打至外泌体-微球复合物分散均匀，摇床孵育1h，离心力14800g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

5)将上述所有样品重悬在200uLPBS中，移液枪吹打均匀，用流式细胞仪(FCM，acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)进行检测，先检测空白对照组的流式测试液，圈门。再检测同型对照组的流式测试液，调节参数使阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，选择流式细胞仪的FL-4通道(APC荧光检测通道，激发波长为640nm)检测细胞EGFR表达量，记录抗体与外泌体-微球复合物的结合率。

图4b为三种细胞系提取的外泌体中EGFR表达量结果。图中的百分数为抗体与外泌体-微球复合物的结合率。

实施例5

本实施例用于说明利用细胞系外泌体建立肺癌分期模型的方法。

1、所使用的细胞材料

三种肺癌细胞系H1650、A549、H1975。

2、细胞中CXCR4蛋白表达量的检测

1)收集细胞：按照细胞培养方法培养H1650、A549、H1975三种细胞，待其生长至80～90％铺满培养皿并连接成网状时，将其消化离心，弃去培养液，加入PBS重悬，轻轻吹打均匀后计数。

2)封闭细胞：分别收集一定量(≥10⁶个)的H1650、A549、H1975细胞于1.5mL的离心管中，加入5％BSA/PBS,用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育1h。

3)孵育抗体：将封闭后的细胞离心，弃去上清，1000rpm的离心机(LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司)中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此重复三次，收集底部细胞。将CXCR4抗体(羊源)稀释至指定浓度，取100μL加至收集了细胞的离心管，同型对照取同种属的IgG母液稀释至100μL，空白对照取100μL PBS，加至收集了细胞的离心管，用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育1h。将孵育好一抗的细胞悬浮液在转速为1000rpm的离心机(LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司)中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此重复三次，去除非特异性结合的抗体，收集底部细胞。加入对应种属的，稀释至指定浓度的荧光标记二抗，用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育40min。

4)流式细胞仪测量：将孵育好抗体的细胞悬浮液在转速为1000rpm的离心机(LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司)中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此重复三次，去除非特异性结合的抗体，然后将细胞重悬成200-1000μL的溶液。用流式细胞仪(FCM，acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)进行检测，先检测空白对照组细胞的流式测试液，圈门。再检测同型对照组细胞的流式测试液，调节参数使细胞阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，选择流式细胞仪的FL-1通道(FITC荧光检测通道，激发波长为488nm)检测细胞CXCR4表达，记录抗体与细胞的结合率及中值荧光强度。

得到的流式细胞术结果如图5a所示，图中的百分数为抗体与细胞的结合率。

3、流式细胞术方法检测细胞分泌的外泌体中CXCR4蛋白表达量

1)将实施例3中制备的外泌体-微球复合物中加入5％的BSA/PBS溶液，室温下反应1h,封闭外泌体上的非特异性结合位点。离心力14800g条件下离心3min，温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

2)将CXCR4抗体稀释至工作浓度，取100μL加入至封闭后的外泌体-微球复合物中，室温反应1h,。离心力14800g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍，去除非特异性结合的抗体。

3)将对应种属的二抗稀释至工作浓度，取100μL加入至已连接一抗的外泌体-微球复合物中，室温反应1h。离心力14800g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

4)每个样品设置一个空白对照，一个同型对照，同型对照组只加入100μL二抗，空白对照只加入100μL PBS，至收集了细胞的离心管中，用移液枪轻轻吹打至外泌体-微球复合物分散均匀，摇床孵育1h，离心力14800g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

5)将上述所有样品重悬在200uLPBS中，移液枪吹打均匀，用流式细胞仪(FCM，acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)进行检测，先检测空白对照组的流式测试液，圈门。再检测同型对照组的流式测试液，调节参数使阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，选择流式细胞仪的FL-1通道(FITC荧光检测通道，激发波长为488nm)检测细胞CXCR4表达量，记录抗体与外泌体-微球复合物的结合率。

图5b为三种细胞系提取的外泌体中CXCR4表达量结果。图中的百分数为抗体与外泌体-微球复合物的结合率。

实施例6

本实施例用于说明血清中外泌体的提取。

1、受试者入组

受试者为18例健康人，19例早期(I期)NSCLC患者，16例中晚期(III，IV期)NSCLC患者。所有受试者均签订了知情同意书。病人的入选标准为经免疫组化结果确认过的肺腺癌患者，健康人的入选标准为没有任何急性，慢性，及转移性疾病。血液样本的收集为静脉取血，组织标本为组织穿刺得到。

2、血清的分离

1)对受试者进行静脉取血，使用非抗凝采血管收集受试者的全血；

2)采血后静置1h以上使其分层，12h内离心，转速5000rpm,离心3-5min；

3)离心后收集上层血清。

3、血清中外泌体的提取

1)用0.22μm滤膜过滤的PBS稀释血清，装至50mL离心管中，4℃条件下，离心力800g，离心5min；

3)将步骤2)中离心后上清液缓缓倒入新的离心管中，4℃条件下，离心力2000g，离心10min；

4)将步骤3)中离心后上清液缓缓倒入新的离心管中，4℃条件下，离心力10000g，离心1h；

5)取步骤4)中离心所得上清液，用0.22μm滤膜进行过滤，滤液收至新的离心管中。

6)将过滤后的样品装入超速离心管，确保离心管中无气泡，每两根离心管间质量差小于0.05g。4℃条件下，离心力130000g，离心12h。

7)超速离心后弃去上清培养基，将底部沉淀重悬至PBS缓冲液中，4℃条件下，离心力130000g，离心2h。

8)弃去上清的PBS缓冲液，将提取得到的外泌体重悬在200μL体积的PBS缓冲液中，PBS缓冲液提前用0.22μm的滤膜过滤。

血清中提取到的外泌体形貌图如图6a所示，尺寸分布如图6b所示。

实施例7

本实施例用于说明利用外泌体进行肺癌诊断的实验。

1、血清来源

血清分离自18例健康人，19例早期(I期)NSCLC患者，16例中晚期(III，IV期)NSCLC患者。

2、利用外泌体中EGFR表达量对NSCLC患者进行诊断的实验。

1)向按实施例3方法制备的外泌体-微球复合物中加入5％的BSA/PBS溶液，室温下反应1h,封闭外泌体上的非特异性结合位点。离心力14000g条件下离心3min，温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

2)将EGFR抗体稀释至工作浓度，取100μL加入至封闭后的外泌体-微球复合物中，室温反应1h,。离心力14000g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍，去除非特异性结合的抗体。

3)将对应种属的二抗稀释至工作浓度，取100μL加入至已连接一抗的外泌体-微球复合物中，室温反应1h。离心力14000g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

4)每个样品设置一个空白对照，一个同型对照，同型对照组只加入100μL二抗，空白对照只加入100μL PBS，至收集了细胞的离心管中，用移液枪轻轻吹打至外泌体-微球复合物分散均匀，摇床孵育1h，离心力14000g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

5)将上述所有样品重悬在150uLPBS中，移液枪吹打均匀，用流式细胞仪(FCM，acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)进行检测，先检测空白对照组的流式测试液，圈门。再检测同型对照组的流式测试液，调节参数使阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，选择流式细胞仪的FL-4通道(APC荧光检测通道，激发波长为640nm)检测外泌体EGFR表达量，记录抗体与外泌体-微球复合物的结合率。

图7a为两例分别在健康人，NSCLC病人外泌体中检测到的EGFR表达量的流式结果图，图中的百分数为EGFR抗体特异性结合外泌体的阳性率。图7b为由健康人，NSCLC患者外泌体中EGFR表达量绘制的散点图(**P<0.01,t检验)。可以看出，病人外泌体中EGFR蛋白表达量明显高于健康人，说明该方法可有效的对NSCLC患者进行诊断。

3、免疫组化染色法验证本发明所述肺癌诊断方法的准确性

为验证本发明所述方法的准确性，在入组的受试者中抽取两例外泌体EGFR含量各不相同的样本，用免疫组化染色法检测其原位肿瘤组织切片中EGFR蛋白的表达量。结果如图7c，将该结果与本发明所述方法测得结果进行对比，发现本发明所述方法测得的外泌体中EGFR蛋白的表达量(左)与免疫组化法测得的其肿瘤组织切片中EGFR蛋白的表达量(右)结果相一致。进一步验证了本发明所述方法的准确性。

4、本发明所述肺癌诊断方法的评价

利用ROC曲线对本发明所述外泌体EGFR表达量在NSCLC病人诊断方面的效力进行分析。分析结果如图7d，通过对健康组和NSCLC病人组中EGFR蛋白表达量的测定结果进行分析，得到曲线下面积(AUC)为0.889，截断点(cut-off value)为4.56％,95％置信区间为0.798-0.980。由于AUC越接近于1，说明诊断效果越好，因此，通过ROC曲线分析，表明本发明的检测方法在肺癌的诊断方面有很高的准确性。

实施例8

本实施例用于说明对比外泌体中EGFR蛋白表达量与EGFR基因突变间关系的实验。

1、样本来源

在入组的NSCLC患者中随机抽取10例，用本发明所述方法检测其外泌体中EGFR表达量，记录EGFR抗体与外泌体结合的百分率，并按照百分率从低到高的顺序将10例患者编号为1-10。

2、外泌体蛋白的提取及定量

取100μL外泌体于离心管中，加入100μL蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)，充分混合，于冰上裂解0.5h。裂解完全后，使用索莱宝公司生产的BCA蛋白定量试剂盒对外泌体的蛋白含量进行定量。

裂解后的外泌体，加入4×的蛋白上样缓冲液，与蛋白充分混合，95℃条件下加热10min使蛋白其变性。待其冷却至室温后保存在-20℃冰箱中待用。

3、免疫印迹法(Western blot)检测外泌体中EGFR突变蛋白含量

取上样量为10μg的外泌体蛋白，加入聚丙烯酰胺凝胶中，110V条件下恒压跑电泳100min。将凝胶转至孔径0.45μm的PVDF膜(Millipore,Bedford,MA)上。封闭液(5％的脱脂奶粉)室温震荡孵育一小时。封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，以避免下一步加入的抗体与膜发生非特异性结合。将封闭好的PVDF膜浸泡在EGFR E746-A750缺失突变或L858R点突变的抗体(兔来源)中。4℃孵育12小时。然后用0.1％Tween 20-Tris缓冲盐溶液(TBST)溶液清洗PVDF膜，室温震荡洗涤3次，每次5分钟。将洗涤后的PVDF膜浸泡在含有辣根过氧化物酶HRP标记的抗兔IgG二抗溶液中，室温震荡孵育1小时，然后用TBST溶液清洗，室温震荡洗涤3次，每次5分钟。最后，将膜浸于荧光显色剂中，在超高灵敏度化学发光成像系统(ECLchemiluminescence system Bio-Rad)中成像。

为证明外泌体的纯度，一种外泌体高表达蛋白CD81作为阳性对照。

结果如图8a所示，发现1-10号患者中EGFR突变蛋白水平依次升高。

4、外泌体中EGFR蛋白表达量和EGFR突变水平的相关性分析

将上述用Western blot方法测得的EGFR E746-A750缺失突变或L858R点突变蛋白条带用ImageJ软件进行定量，记录每个条带的灰度值。将突变的定量结果与其外泌体EGFR表达量作图，并做皮尔森相关性分析。EGFR E746-A750缺失突变水平与外泌体EGFR表达量之间的相关性如图8b,相关性系数r＝0.918,代表了强相关性。EGFR L858R点突变水平与外泌体EGFR表达量之间的相关性如图8d,相关性系数r＝0.683,代表了较强相关性。若根据ROC曲线的截断点4.56％将10例病人分为EGFR低表达和高表达两组，并将两组病人EGFR蛋白E746-A750缺失突变水平和EGFR蛋白L858R点突变水平作散点图，可看出两组病人间EGFR突变水平有显著性差异，结果如图8c,8e。该实验说明外泌体中EGFR表达量与EGFR突变水平之间呈正相关，外泌体EGFR表达量可在一定程度上反映EGFR的突变水平。

实施例9

本实施例用于说明利用外泌体进行肺癌分期的实验。

1、血清来源

血清分离自19例早期(I期)NSCLC患者，16例中晚期(III，IV期)NSCLC患者。

2、利用外泌体中CXCR4表达量对NSCLC患者进行分期的实验。

1)向按实施例3方法制备的外泌体-微球复合物中加入5％的BSA/PBS溶液，室温下反应1h,封闭外泌体上的非特异性结合位点。离心力14000g条件下离心3min，温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

2)将EGFR抗体稀释至工作浓度，取100μL加入至封闭后的外泌体-微球复合物中，室温反应1h,。离心力14000g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍，去除非特异性结合的抗体。

3)将对应种属的二抗稀释至工作浓度，取100μL加入至已连接一抗的外泌体-微球复合物中，室温反应1h。离心力14000g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

4)每个样品设置一个空白对照，一个同型对照，同型对照组只加入100μL二抗，空白对照只加入100μL PBS，至收集了细胞的离心管中，用移液枪轻轻吹打至外泌体-微球复合物分散均匀，摇床孵育1h，离心力14000g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

5)将上述所有样品重悬在200uLPBS中，移液枪吹打均匀，用流式细胞仪(FCM，acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)进行检测，先检测空白对照组的流式测试液，圈门。再检测同型对照组的流式测试液，调节参数使阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，选择流式细胞仪的FL-1通道(FITC荧光检测通道，激发波长为488nm)检测外泌体CXCR4表达量，记录抗体与外泌体-微球复合物的结合率。

图9a为分别在NSCLC早期病人和中晚期病人外泌体中检测到的CXCR4表达量的流式结果图，图中的百分数为CXCR4抗体特异性结合外泌体的阳性率。图9b为由NSCLC早期病人和中晚期患者外泌体中CXCR4表达量绘制的散点图(***P<0.001,t检验)。可以看出，中晚期患者外泌体中CXCR4蛋白表达量明显高于早期患者，说明该方法可有效的对NSCLC患者进行分期。

3、免疫组化染色法验证本发明所述肺癌诊断方法的准确性

为验证本发明所述方法的准确性，在入组的受试者中抽取两例，用免疫组化染色法检测其原位肿瘤组织切片中CXCR4蛋白的表达量。结果如图9c，将该结果与本发明所述方法测得结果进行对比，发现本发明所述方法测得的外泌体中CXCR4蛋白的表达量(左)与免疫组化法测得的其肿瘤组织切片中CXCR4蛋白水平(右)结果相一致。进一步验证了本发明所述方法的准确性。

4、本发明所述肺癌诊断方法的评价

利用ROC曲线对本发明所述外泌体CXCR4表达量在NSCLC病人癌症分期方面的应用进行分析。分析结果如图9d，通过对NSCLC早期和中晚期病人组中CXCR4蛋白表达量的测定结果进行分析，得到曲线下面积(AUC)为0.906，截断点(cut-off value)为13.45％,95％置信区间为0.810-1.000。由于AUC越接近于1，说明诊断效果越好，因此，通过ROC曲线分析，表明本发明的检测方法在肺癌的分期方面有很高的准确性。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种用于非小细胞肺癌检测及分期判断的外泌体检测装置，其特征在于，所述装置包括：

(1)外泌体提取机构：通过离心提取细胞培养上清中的外泌体；

(2)外泌体表征机构：对所述外泌体提取机构提取得到的外泌体进行表征，以确定确实提取到了外泌体，其中，所述表征指标选自以下一种或多种：形貌、大小、浓度；

(3)外泌体蛋白表达量信息测定机构：对所述外泌体提取机构提取的外泌体进行蛋白表达量信息的测定；

优选地，所述目标蛋白选自以下一种或多种：EGFR蛋白,EGFR突变蛋白，CXCR4蛋白；

更优选地，所述EGFR突变蛋白至少包括19号外显子上E746-A750氨基酸缺失突变及21号外显子的L858R点突变；

(4)外泌体表达量信息分析机构：对所述外泌体蛋白表达量信息测定机构测定的表达量信息进行分析，进行非小细胞肺癌检测及分期判断。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述细胞选自以下一种或多种：结直肠癌细胞SW620，肺癌细胞A549，H1975，H1650。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述外泌体提取机构中，所述外泌体的提取方法选自以下一种或多种：超速离心法、微孔膜过滤法、微流通道法，优选为超速离心法，更优选地，所述超速离心法包括以下步骤：

(a)取细胞培养上清进行离心，第一次离心弃沉淀，取上清第二次离心弃掉沉淀，再次取上清第三次离心弃掉沉淀；

优选地，所述第一次离心速度为300g～1000g，优选为800g；第一次离心时间为5分钟；所述第二次离心速度为2000g～5000g，优选为2000g；第二次离心时间为10分钟；所述第三次离心速度为8000g～10000g，优选为10000g；第三次离心时间为1小时；所述离心温度为4℃；

(b)用滤膜过滤步骤(a)所得上清，过滤后的液体再次离心得沉淀，即得到外泌体；

优选地，所述滤膜孔径为0.1～0.5μm，优选为0.22μm；所述离心速度为100000～150000g，优选为100000g；所述离心时间为0.5～5小时，优选为2小时；所述离心温度为4℃。

4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述外泌体的提取还包括以下步骤：

(c)将步骤(b)离心所得的沉淀，重悬在PBS中。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其特征在于，所述外泌体提取机构中，所述细胞培养上清的培养基含10％胎牛血清；

优选地，所述外泌体提取机构还包括以下操作机构：

在外泌体提取前将细胞培养上清的培养基换成由扣除外泌体的胎牛血清配制的培养基进行培养；优选地，所述更换时间为提取前24～76小时。

6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述扣除外泌体的胎牛血清配制的培养基通过以下方法制备：

(i)将血清加入基础培养基中，使细胞培养基中FBS浓度为20％；

(ii)将步骤(i)所得细胞培养基4℃条件下，超速离心过夜；优选地，所述离心速度为100000-130000g；

(iii)超速离心结束后，收集上清，用基础培养基将含20％FBS的培养基稀释为FBS浓度为10％,加入1％的双抗；

(iv)用滤膜对培养基进行过滤，装瓶待用；优选地，所述滤膜孔径为0.22μm。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的装置，其特征在于，所述外泌体表征机构中，所述形貌表征的机构为透射电镜，优选为生物型透射电镜；所述大小表征的机构为动态光散射机构和/或纳米颗粒跟踪分析机构；所述浓度表征的机构为纳米颗粒跟踪分析机构。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的装置，其特征在于，所述蛋白表达量的测定机构为流式细胞机构和/或Western blot机构。

9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述流式细胞机构测定蛋白表达量包括以下步骤：

(I)将外泌体与醛基化微球结合；

(II)加5％的BSA/PBS溶液溶液停止实验，并封闭微球的非特异性结合位点；加入相应抗体进行反应，离心去除非特异性结合的抗体；加入对应的二抗进行反应；

(III)使用对应通道的流式细胞仪进行监测并与同型对照抗体的结果对比确定阳性率，确定表达量。

10.权利要求1至9中任一项所述的装置在制备用于诊断和/或治疗的肺癌医疗产品中的应用；优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。