CN110531082A

CN110531082A - 用于乳腺癌检测及分子分型的外泌体检测装置和应用

Info

Publication number: CN110531082A
Application number: CN201810515962.9A
Authority: CN
Inventors: 杨延莲; 李文哲; 朱凌; 王华艺; 王琛
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2019-12-03

Abstract

本发明提供了一种用于用于乳腺癌检测及分子分型的外泌体检测装置及其应用。本发明装置包括：外泌体的提取机构；外泌体的表征机构；外泌体蛋白表达量信息测定机构和外泌体表达量信息分析机构。本发明装置在乳腺癌检测及分子分型方面的高准确度，并可指导乳腺癌患者用药。本发明中血液样本外泌体的检测可在肿瘤发展的初期便给出疾病信息，大大避免了传统病理检测的侵入性及滞后性，为乳腺癌的早筛及分子分型提供了新方案。

Description

用于乳腺癌检测及分子分型的外泌体检测装置和应用

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种用于乳腺癌检测及分子分型的外泌体检测装置和应用。

背景技术

现阶段，尽管医学成像和肿瘤治疗等领域有了巨大的进步，但癌症的发病率和死亡率仍居高不下。其中，乳腺癌的发病率也呈逐年递增之势，已成为威胁女性健康的"头号杀手"。众所周知，上皮细胞黏附因子(EpCAM) 和人表皮生长因子受体-2(HER2)蛋白为乳腺癌中非常重要的两类蛋白标志物。EpCAM在几乎所有肿瘤中过表达，是肿瘤检测的重要蛋白靶点，同时被认为是肿瘤预后不佳的标志。HER2蛋白的过表达，意味着肿瘤细胞恶性程度更高、疾病进展速度更快、更易发生转移和复发、且预后不佳。在乳腺癌患者中，约有20-30％为HER2阳性乳腺癌患者。研究表明，HER2 阳性乳腺癌患者的总生存时间仅有HER2阴性患者的一半。因此，HER2 阳性乳腺癌也被称为"最凶险的乳腺癌"。专门针对HER2阳性乳腺癌的分子靶向药物——(曲妥珠单抗)，就是以癌细胞表面的HER2分子为"靶点"，通过阻断HER2分子这个环节，从而抑制并杀死肿瘤细胞。被国内外专家认可为治疗HER2阳性乳腺癌的基础用药。自1998年上市以来，全球已有超过72万名患者因使用而获益。最新研究结果也证实，联合化疗能将肿瘤的复发风险降低52％，将患者的死亡风险降低 33％。更有80％左右的早期乳腺癌患者使用后获治愈。而对于晚期患者，也能提高患者生存质量，并显著延长总生存期。因此，乳腺癌HER2分子分型在肿瘤治疗，特别是靶向用药方面有着非常重要的意义。

临床上，肿瘤的常规检测方法为病理检查，对从病人体内取出的活体组织进行染色观察，通过细胞的形态和结构判断是否出现癌变。大部分时候，病理检查是判断是否是癌症的最重要的依据。免疫组化检查(IHC)和荧光原位杂交法(FISH)是临床常用的乳腺癌HER2分子分型的方法，通过手术切除或穿刺的手段取组织进行分析。然而，在肿瘤进展和治疗过程中，瘤内异质性、遗传漂变、以及治疗手段给肿瘤带来的压力等因素均会导致肿瘤中HER2蛋白的表达量发生变化(Cardoso,Di Leo et al.2001,Yao,Lu et al.2014)。更重要的是，单针穿刺活检也会因取样位置的局限性给检测结果造成极大的偏差。除此之外，现有检测方法均为侵入性，给患者带来极大痛苦，也就导致了这些方法无法对病人的病情进展实时监测，因此在很大程度上影响了靶向治疗的实时性和有效性。

针对现有肿瘤检测技术的缺陷。基于血液的液体活检应运而生，液体活检对于癌症的早筛，动态监测，指导用药等方面有着重要的意义。循环肿瘤细胞(CTCs),循环肿瘤DNA(CtDNA)，外泌体为三类重要的液体活检目标靶点。其中，外泌体是最新发现的肿瘤液体活检对象，是一类由细胞分泌的膜囊泡，直径在50-150nm,存在于几乎所有类型的体液当中。相比血液中含量极少的CTCs，外泌体的数量十分庞大，每毫升血液中高达 10⁸-10¹⁰个，相比血液中易降解的CtDNA,外泌体的膜结构对其内部携带的分子起到很好的保护作用。由细胞分泌的外泌体携带其来源细胞的信号分子，包括蛋白质、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯，并将所携带分子递送至靶细胞。在癌症中，外泌体被认为与癌症的进展息息相关，癌细胞可通过分泌外泌体将信号递送至与下游细胞或微环境中，加速肿瘤的增殖，转移，复发等。因此，外泌体中的信号常常可用于反映其分泌细胞的生理及病理功能状态,从而提供了潜在的生物分子标志物，故从体液中纯化出外泌体具有良好的临床应用前景，可以作为肿瘤诊断和预后判断的生物标志物。然而，纳米级的小尺寸使得外泌体的分离纯化和检测都面临着极大的挑战。现有的技术手段集中在借助微流控芯片实现对外泌体的捕获和检测，但纳米级芯片设计的复杂性及高成本限制了该技术的广泛应用，难以实现大量样本分析。为更好的实现外泌体在液体活检领域的应用，开发低成本，操作简便的新技术十分迫切。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于乳腺癌检测及分子分型的外泌体检测装置和应用。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种用于乳腺癌检测及分子分型的外泌体检测装置，所述装置包括：

(1)外泌体提取机构：通过离心提取细胞培养上清中的外泌体；

(2)外泌体表征机构：对所述外泌体提取机构提取得到的外泌体进行表征，以确定确实提取到了外泌体，其中，所述表征指标选自以下一种或多种：形貌、大小、浓度；

(3)外泌体蛋白表达量信息测定机构：对所述外泌体提取机构提取的外泌体进行蛋白表达量信息的测定；

优选地，所述目标蛋白选自以下一种或多种：EpCAM蛋白，HER2蛋白；

(4)外泌体表达量信息分析机构：对所述外泌体蛋白表达量信息测定机构测定的表达量信息进行分析，进行非小细胞肺癌检测及分期判断。

根据本发明第一方面的装置，其中，所述细胞选自以下一种或多种：乳腺上皮细胞MCF-10A，乳腺癌细胞MDA-MB-468，MCF-7，SK-BR-3。

根据本发明第一方面的装置，其中，所述外泌体提取机构中，所述外泌体的提取方法选自以下一种或多种：超速离心法、微孔膜过滤法、微流通道法，优选为超速离心法，更优选地，所述超速离心法包括以下步骤：

(a)取细胞培养上清进行离心，第一次离心弃沉淀，取上清第二次离心弃掉沉淀，再次取上清第三次离心弃掉沉淀；

优选地，所述第一次离心速度为300g～1000g，优选为800g；第一次离心时间为5分钟；所述第二次离心速度为2000g～5000g，优选为2000g；第二次离心时间为10分钟；所述第三次离心速度为8000g～10000g，优选为 10000g；第三次离心时间为1小时；所述离心温度为4℃；

(b)用滤膜过滤步骤(a)所得上清，过滤后的液体再次离心得沉淀，即得到外泌体；

优选地，所述滤膜孔径为0.1～0.5μm，优选为0.22μm；所述离心速度为100000～150000g，优选为100000g；所述离心时间为0.5～5小时，优选为2小时；所述离心温度为4℃。

优选地，所述外泌体的提取还包括以下步骤：

(c)将步骤(b)离心所得的沉淀，重悬在PBS中。

根据本发明第一方面的装置，其中，所述外泌体提取机构中，所述细胞培养上清的培养基含10％胎牛血清；

优选地，所述外泌体提取机构还包括以下操作机构：

在外泌体提取前将细胞培养上清的培养基换成由扣除外泌体的胎牛血清配制的培养基进行培养；优选地，所述更换时间为提取前24～48小时。

优选地，所述扣除外泌体的胎牛血清配制的培养基通过以下方法制备：

(i)将血清加入基础培养基中，使细胞培养基中血清浓度为30％；

(ii)将步骤(i)所得细胞培养基4℃条件下，超速离心过夜；优选地，所述离心速度为100000～150000g；

(iii)超速离心结束后，收集上清，用基础培养基将含30％血清的培养基稀释为FBS浓度为10％,加入1％的双抗；

(iv)用滤膜对培养基进行过滤，装瓶待用；优选地，所述滤膜孔径为 0.22μm。

根据本发明第一方面的装置，其中，所述外泌体表征机构中，所述形貌表征的机构为透射电镜，优选为生物型透射电镜；所述大小表征的机构为动态光散射机构和/或纳米颗粒跟踪分析机构；所述浓度表征的机构为纳米颗粒跟踪分析机构。

根据本发明第一方面的装置，其中，所述蛋白表达量的测定机构通过流式细胞仪和扫描电镜对单个外泌体中蛋白标志物表达量进行计算。

优选地，所述对单个外泌体中蛋白标志物表达量进行计算以下步骤：

(I)将外泌体与微球结合，通过流式细胞仪测量结合外泌体的微球上蛋白表达量的中值荧光强度值；

(II)通过扫描电镜(SEM)结果计算出单个微球上结合的外泌体数量；

(III)通过(I)和(II)的比值，得到单个外泌体中蛋白表达量的结果。

本发明的第二方面提供了第一方面所述的装置在制备用于诊断和/或治疗癌症的医疗产品中的应用；优选地，所述癌症为乳腺癌；更优选地，所述应用为乳腺癌的诊断和/或HER2分子分型。

本发明的目的之是提供一种利用外泌体进行乳腺癌液体活检的方法。该方法可对乳腺癌实现体外诊断及分子分型。该方法操作简便、成本低，检测过程迅速，非侵入的特性避免了常规的病理检测给患者带来的痛苦。除此之外，该方法有望对病情进行实时追踪，根据病情发展及时调节治疗方案，为实现个性化医疗提供了指导思路。

本发明公开了外泌体EpCAM,HER2蛋白作为乳腺癌诊断及分子分型标志物的应用。本发明提供了借助流式细胞术检测外泌体中EpCAM蛋白表达量作为诊断乳腺癌，及检测HER2表达量对乳腺癌患者进行分子分型的应用。本发明的实验，在乳腺癌细胞系中建立了完整的细胞外泌体模型，在临床血液样本的检测中证实了该方法用于诊断和分子分型的可行性，获得了较高的敏感度和特异性，且与免疫组化结果相印证。

本发明提供了一种外泌体中目标蛋白表达量在乳腺癌体外检测方面的应用。

所述应用至少包括乳腺癌的诊断，HER2分子分型等。

所述目标蛋白至少包括EpCAM蛋白,HER2蛋白等。

本发明提供了一种利用细胞系培养上清中外泌体EpCAM蛋白的表达量建立乳腺癌诊断细胞模型的方法。

本发明提供了一种利用细胞系培养上清中外泌体HER2蛋白的表达量建立乳腺癌分子分型细胞模型的方法。

本发明还提供了所述细胞系外泌体检测模型的建立，包括细胞系的选取，细胞培养上清中外泌体提取，及EpCAM或HER2蛋白表达量的检测。可在体外验证该发明在肿瘤诊断及分子分型领域的可行性。

优选地，所述细胞系为乳腺上皮细胞MCF-10A，乳腺癌细胞 MDA-MB-468，MCF-7，SK-BR-3。

优选地，所述细胞系的培养基中含10％胎牛血清FBS。

优选地，细胞培养上清外泌体提取自8-12皿细胞。优选地，所述细胞培养上清应在外泌体提取前24-48h换成由扣除外泌体的胎牛血清(FBS) 配制的培养基。

具体地，由扣除外泌体的胎牛血清(FBS)进行培养基的配制，包括以下步骤：

1)将血清加入基础培养基中，使细胞培养基中血清浓度为30％；

2)将该细胞培养基4℃条件下，离心力120000-150000g,超速离心过夜；

3)超速离心结束后，取出上清，用基础培养基将含30％血清的培养基稀释为血清浓度10％,加入1％的双抗；

4)用0.22μm滤膜对培养基进行过滤，装瓶待用。

检测受试者外泌体中EpCAM的表达量在诊断或辅助诊断受试者是否为乳腺癌患者中的应用。

检测受试者样本外泌体中HER2的表达量在对其进行HER2分子分型或辅助HER2分子分型中的应用

本发明还提供了所述外泌体的在肿瘤诊断及分子分型领域的应用，包括血清的分离，血清中外泌体提取，及EpCAM或HER2蛋白表达量的检测。可在体外证实该发明在肿瘤诊断及分子分型领域的应用。

优选地，血清为健康人血清及乳腺癌病人血清，由新鲜血液分离得到。

具体的，血清的分离包括以下步骤：

1)使用非抗凝采血管收集受试者的全血；

2)采血后静置使其分层，24h内离心，转速4000rpm,离心5-10min.

3)离心后收集上层血清。

细胞培养上清或血清中外泌体的提取，使用超速离心的方法。

优选地，超速离心温度为4℃。

优选地，离心力为100000-150000g。

优选地，超速离心时间为2-12h。

优选地，离心后的外泌体重悬至PBS中。

优选地，重悬外泌体的PBS缓冲液已经过0.22μm的滤膜过滤。

外泌体中EpCAM或HER2蛋白表达量，使用特异性识别抗体进行检测。

优选地，所述抗体为EpCAM或HER2蛋白的特异性识别抗体。

本发明提供了一种计算单个外泌体中蛋白标志物表达量的方法，所述方法包括：

1)通过流式细胞术结果获得结合外泌体的微球上EpCAM或HER2蛋白表达量的中值荧光强度值。

2)通过扫描电镜(SEM)结果计算出单个微球上结合的外泌体数量。

通过1)和2)的比值，得到单个外泌体中EpCAM或HER2蛋白表达量的结果。

本发明的用于乳腺癌检测及分子分型的外泌体检测装置可以具有但不限于以下有益效果：

1、本发明公开了借助流式细胞术检测外泌体中EpCAM蛋白表达量作为诊断乳腺癌，及检测外泌体HER2表达量对乳腺癌患者进行分子分型的应用。本发明在乳腺癌细胞系中建立了完整的细胞外泌体模型，在临床血液样本的检测中证实了该方法用于诊断和分子分型的可行性，曲线下面积(AUC)高达0.972，且检测结果与病理切片免疫组化染色结果相印证。证明了本方法在乳腺癌检测及分子分型方面的高准确度。阐明了外泌体 EpCAM和HER2有望成为临床乳腺癌诊断及分子分型的生物标志物，并可指导乳腺癌患者用药。本发明中血液样本外泌体的检测可在肿瘤发展的初期便给出疾病信息，大大避免了传统病理检测的侵入性及滞后性，为乳腺癌的早筛及分子分型提供了新方案。

2、本发明涉及借助外泌体进行乳腺癌的诊断及分子分型的方法。利用外泌体中目标蛋白标志物的表达量对受试者进行体外诊断及HER2分子分型，该方法有望实现疾病的早筛及病情的实时追踪，为辅助肿瘤检测及跟踪治疗效果提供了新方法，同时还可成为预后评价的重要手段，为实现个性化医疗提供了指导思路，在提高患者的生存质量，延长生存期方面有着很好的应用前景。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了本发明所述利用外泌体进行乳腺癌诊断及HER2分子分型的原理图。

图2a示出了流式细胞术测得的EpCAM特异性识别抗体与四种细胞结合的结果图。图中百分数为结合率；图2b示出了流式细胞术测得的HER2 特异性识别抗体与四种细胞结合的结果图。图中百分数为结合率；图2c示出了流式细胞术测得的EpCAM特异性识别抗体与四种细胞结合的中值荧光强度值作柱状图；图2d示出了流式细胞术测得的HER2特异性识别抗体与四种细胞结合的中值荧光强度值作柱状图。

图3示出了从细胞培养上清中提取出的外泌体进行形貌及尺寸表征图。

图4示出了本发明所述外泌体-微球复合物的形貌表征图。

图5a示出了本发明所述四种细胞系提取的外泌体中EpCAM表达量的流式结果图；图5b示出了本发明所述四种细胞分泌的外泌体的EpCAM表达量柱状图；图5c示出了本发明所述四种细胞系提取的外泌体中HER2表达量的流式结果图；图5d示出了本发明所述四种细胞分泌的外泌体的 HER2表达量柱状图。

图6示出了免疫印迹法(Western blot)对外泌体中EpCAM和HER2 蛋白含量检测的结果图

图7a示出了血清中提取到的外泌体形貌图；图7b示出了NTA检测血清中提取到的外泌体的数量级尺寸分布图。

图8a示出了利用流式细胞术在健康人组，HER2-乳腺癌病人组，HER2+ 乳腺癌组提取的外泌体中检测到的EpCAM表达量的结果图，图中的百分数为EpCAM抗体特异性结合外泌体的阳性率；图8b示出了由健康人组， HER2-病人组，HER2+病人组血清外泌体中EpCAM表达量绘制的散点图 (**P<0.01,***P<0.001，t检验)。

图9a示出了利用流式细胞术在健康人组，HER2-乳腺癌病人组，HER2+ 乳腺癌组提取的外泌体中检测到的HER2表达量的结果图，图中的百分数为HER2抗体特异性结合外泌体的阳性率；图9b示出了由健康人组，HER2- 病人组，HER2+病人组血清外泌体中HER2表达量绘制的散点图(**P<0.01, ***P<0.001，t检验)。

图10示出了利用ROC曲线对本发明在乳腺癌病人HER2分子分型方面的检测效力进行分析。

图11示出了利用免疫组化染色法验证本发明所述分子分型方法的准确性。

图12示出了本发明所述单个外泌体中目标蛋白标志物表达量的计算方法。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

除非特别指明，以下实施例中所用的细胞系MCF-10A,MDA-MB-468, MCF-7,SK-BR-3均购自中国医学科学院。

除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液，水质参数为电阻率18.2MΩ.cm@25℃。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。

除非特别指明，以下实施例中所用的PBS溶液均为1×PBS溶液。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：

试剂：

PBS缓冲液，蛋白裂解液，直径4μm的醛基化乳胶微球购自Thermo FisherScientific.

戊二醛，乙酸双氧铀，甘氨酸，BSA购自Sigma Aldrich.

EpCAM抗体，HER2抗体，购自Cell Signaling Technology.超薄碳支持膜，购自Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd.,China.

BCA蛋白定量试剂盒，购自索莱宝公司。

滤膜，0.45μm PVDF膜，购自Millipore,Bedford,MA。

仪器：

透射电子显微镜，购自日本日立公司、型号Hitachi High-Tech 7700；

纳米颗粒跟踪分析仪，购自英国马尔文公司，型号NanoSight LM14 system；

纳米粒径电位分析仪，购自英国马尔文公司，型号Zetasizer Nano ZS90；

离心机，购自北京雷勃尔离心机有限公司，型号LD5-2A；

流式细胞仪购自Life Technologies，Carlsbad，CA，型号acousticfocusing cytometer，AppliedBiosystems。

实施例1

本实施例用于说明本发明细胞系中EpCAM和HER2蛋白表达量的检测

1、所使用的细胞材料

乳腺上皮细胞系MCF-10A，三种乳腺癌细胞系MDA-MB-468，MCF-7, SK-BR-3。

2、具体方法

1)收集细胞：按照细胞培养方法培养MCF-10A，MDA-MB-468，MCF-7, SK-BR-3四种细胞，待其生长至90％铺满培养皿并连接成网状时，将其消化离心，弃去培养液，加入PBS重悬，轻轻吹打均匀后计数。

2)封闭细胞：分别收集一定量(≥10⁶个)的MCF-10A，MDA-MB-468， MCF-7,SK-BR-3细胞于1.5mL的离心管中，加入5％BSA/PBS,用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育1h。

3)孵育抗体：将封闭后的细胞离心，弃去上清，1000rpm的离心机 (LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司)中离心3min，弃去上清，再用 PBS重悬，如此重复三次，收集底部细胞。将EpCAM抗体,HER2一抗分别稀释至指定浓度，取100μL加至收集了细胞的离心管，同型对照取同种属的IgG母液稀释至100μL，空白对照取100μL PBS，加至收集了细胞的离心管，用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育1h。将孵育好一抗的细胞悬浮液在转速为1000rpm的离心机(LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司)中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此重复三次，去除非特异性结合的抗体，收集底部细胞。加入对应种属的，稀释至指定浓度的荧光标记荧光二抗，用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育40min。

4)流式细胞仪测量：将孵育好抗体的细胞悬浮液在转速为1000rpm 的离心机(LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司)中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此重复三次，去除非特异性结合的抗体，然后将细胞重悬成200-1000μL的溶液。用流式细胞仪(FCM，acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA) 进行检测，先检测空白对照组细胞的流式测试液，圈门。再检测同型对照组细胞的流式测试液，调节参数使细胞阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，选择流式细胞仪的FL-4通道 (APC荧光检测通道，激发波长为640nm)检测细胞EpCAM表达量，FL-1 通道(FITC荧光检测通道，激发波长为488nm)检测细胞HER2表达，记录抗体与细胞的结合率及中值荧光强度。

得到的流式细胞术结果如图2a,2b所示,流式细胞术测得的四种细胞的中值荧光强度值做柱状图如图2c,2d所示。

实施例2

本实施例用于说明本发明细胞培养上清中外泌体的提取。

1、所使用的细胞材料

2、具体步骤包括：

1)待细胞生长至密度50％时，换上由事先扣除外泌体的血清配制的培养基，将其放在细胞培养箱中48h。

2)收集12皿细胞的细胞培养上清液至50mL离心管中，4℃条件下，离心力800g，离心5min；

3)将步骤2)中离心后上清液缓缓倒入新的离心管中，4℃条件下，离心力2000g，离心10min；

4)将步骤3)中离心后上清液缓缓倒入新的离心管中，4℃条件下，离心力10000g，离心1h；

5)取步骤4)中离心所得上清液，用0.22μm滤膜进行过滤，滤液收至新的离心管中。

6)将过滤后的样品装入超速离心管，确保离心管中无气泡，每两根离心管间质量差小于0.05g。4℃条件下，离心力100000g，离心2h；

7)超速离心后弃去上清培养基，将底部沉淀重悬至PBS缓冲液中，4 ℃条件下，离心力100000-150000g，离心2h。

8)弃去上清的PBS缓冲液，将提取得到的外泌体重悬在100-500μL 体积的PBS缓冲液中，PBS缓冲液提前用0.22μm的滤膜过滤。

实施例3

本实施例用于说明本发明对提取出的外泌体进行形貌及尺寸表征。

1、透射电子显微镜(TEM)表征

吸取10μL外泌体滴加于超薄碳支持膜上(Beijing Zhongjingkeyi TechnologyCo.,Ltd.,China)，在室温条件下自然干燥30min,吸去浮液，滴加10μL PBS缓冲液于支持膜上，1min后吸去，滴加固定液1％的戊二醛 10uL，静置5min,吸去浮液，滴加富染剂2％乙酸双氧铀于支持膜上，染色 1min,滤纸吸去浮液，常温干燥24h后,用日本日立公司生产的Hitachi High-Tech 7700透射电子显微镜在80kV的加速电压下观察。

图3a是实施例2得到的从细胞培养上清中提取的外泌体形貌图，从图 3a可以得到外泌体为边缘厚中间薄的纳米囊泡，尺寸约为60-150nm。图中的插图是该外泌体的放大TEM图，从图中可以清楚地看出外泌体的轮廓，与之前的报道相一致。

2、尺寸及数量表征(NTA)

吸取实施例2中分离出的外泌体20μL，PBS稀释50倍至1mL。用英国马尔文公司生产的NanoSight LM14system进行检测，激光器为405nm。用注射器将稀释后的外泌体注入样品池中，用高敏感度的金属氧化物半导体(CMSO)相机进行检测，收集时间为60s,检测限设置为7，每个样品做三次平行，每两个样品之间用PBS缓冲液仔细清洗样品池三遍。检测完毕后，用英国马尔文公司的数据分析软件NTA software,version 2.3对测试结果进行分析。

图3b是NTA测得的实施例2中外泌体的尺寸分布及数量。结果显示，外泌体的平均直径为124.4±53.3nm，尺寸分布为50-300nm,尺寸较大的部分是由于外泌体的聚集导致，该结果与TEM图中外泌体的尺寸分布基本一致。外泌体的数量为10¹⁰量级。

3、尺寸分布测试(DLS)

吸取实施例2中分离出的外泌体20μL，稀释50倍至1mL，用英国马尔文公司生产的Zetasizer Nano ZS90仪器对外泌体的尺寸分布进行测试，所用激光器为633nm的HeNe激光器，探测器为雪崩光电二极管探测器。样品注入石英比色皿中，保证比色皿中无气泡。使用DLS的反响散射模式进行检测，散射角为173°，温度为25℃，每个样品做三次平行，每两个样品之间用PBS缓冲液仔细清洗比色皿三遍。

图3c是DLS测得的实施例2中外泌体的尺寸分布。结果显示，外泌体的平均直径为141.5±15.04nm，尺寸分布为100-180nm。该方法测得的尺寸略大于NTA及TEM，是由于DLS测试的为样品的水化半径，因此，该结果与TEM及NTA测出的外泌体的尺寸基本一致。

实施例4

本实施例用于说明本发明外泌体-微球复合物的制备及形貌表征

1、外泌体蛋白定量

取20μL外泌体于离心管中，加入20uL蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)，充分混合，于冰上裂解1h,使用索莱宝公司生产的BCA蛋白定量试剂盒对外泌体的蛋白含量进行定量。

2、外泌体-微球复合物的制备

1)根据蛋白定量结果，取蛋白含量为10μg的外泌体,和2.5uL醛基化微球充分混合,室温下孵育15min，加入PBS缓冲液至总体积为250ul,4 度孵育过夜。

2)加入浓度为1M的甘氨酸28μL至上述混合液中，使甘氨酸终浓度为100mM，室温反应30min，以结合外泌体上多余的氨基位点， 0.5％BSA/PBS清洗，离心，离心力14800g，如此重复三遍，将底部的外泌体-微球复合物重悬在PBS缓冲液中。

3、外泌体-微球复合物的形貌表征

1)透射电子显微镜(TEM)表征

吸取10μL外泌体-微球复合物，滴加于碳支持膜上(Beijing ZhongjingkeyiTechnology Co.,Ltd.,China)，在室温条件下自然干燥30min, 吸去浮液，滴加10μL PBS缓冲液于支持膜上，1min后吸去，滴加固定液 1％的戊二醛10uL，静置5min,吸去浮液，滴加富染剂2％乙酸双氧铀于支持膜上，染色1min,滤纸吸去浮液，常温干燥24h。用日本日立公司生产的Hitachi High-Tech 7700透射电子显微镜在80kV的加速电压下观察。

图4a是外泌体-微球复合物的形貌图，从图4a可以看出，外泌体紧密的的连接在微球上，尺寸均在100nm左右。图中的插图是放大的外泌体- 微球复合物图，从图中可以清楚地看出外泌体的形貌。

2)扫描电子显微镜(SEM)表征

将外泌体-微球复合物滴加在硅片上，室温下自然干燥，为便于观察，在干燥的样品表面溅射一层金薄膜。用日本日立公司生产的Hitachi S-3400N电子显微镜进行观察，加速电压为15KV。

图4b是外泌体-微球复合物的SEM形貌图，从图4b可以看出，外泌体紧密的的连接在微球上，尺寸在100nm左右。图中的插图是放大的微球表面的外泌体图像，从图中可以清楚地看出外泌体在微球表面仍保持囊泡状的形貌。

实施例5

本实施例用于说明本发明细胞系中提取出的外泌体EpCAM和HER2 蛋白表达量的检测实验。

1、流式细胞术方法检测外泌体中EpCAM蛋白表达量

1)将实施例3中得到的外泌体微球复合物中加入5％的BSA/PBS溶液，室温下反应1h,封闭外泌体上的非特异性结合位点。离心力14800g条件下离心3min，温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

2)将EpCAM抗体稀释至工作浓度，取100μL加入至封闭后的外泌体-微球复合物中，室温反应1h,。离心力14800g条件下离心3min,温度为 4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍，去除非特异性结合的抗体。

3)将对应种属的二抗稀释至工作浓度，取100μL加入至已连接一抗的外泌体-微球复合物中，室温反应1h。离心力14800g条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

4)每个样品设置一个空白对照，一个同型对照，同型对照组只加入 100μL二抗，空白对照只加入100μL PBS，至收集了细胞的离心管中，用移液枪轻轻吹打至外泌体-微球复合物分散均匀，摇床孵育1h，离心力14800g 条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

5)将上述所有样品重悬在200uLPBS中，移液枪吹打均匀，用流式细胞仪(FCM，acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)进行检测，先检测空白对照组的流式测试液，圈门。再检测同型对照组的流式测试液，调节参数使阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，选择流式细胞仪的FL-4通道(APC荧光检测通道，激发波长为640nm)检测细胞EpCAM 表达量，记录抗体与外泌体-微球复合物的结合率。

图5a为四种细胞系提取的外泌体中EpCAM的表达量结果。图5b为将四种外泌体的EpCAM表达量作成柱状图。

2、流式细胞术方法检测外泌体中HER2蛋白表达量

4)每个样品设置一个空白对照，一个同型对照，同型对照组只加入100μL二抗，空白对照只加入100μL PBS，至收集了细胞的离心管中，用移液枪轻轻吹打至外泌体-微球复合物分散均匀，摇床孵育1h，离心力14800g 条件下离心3min,温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

5)将上述所有样品重悬在200uLPBS中，移液枪吹打均匀，用流式细胞仪(FCM，acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)进行检测，先检测空白对照组的流式测试液，圈门。再检测同型对照组的流式测试液，调节参数使阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，选择流式细胞仪的FL-1通道(FITC荧光检测通道，激发波长为488nm)检测细胞HER2 表达，记录抗体与外泌体-微球复合物的结合率。

图5c为四种细胞系提取的外泌体中EpCAM的表达量结果。图5d为将四种外泌体的EpCAM表达量作成柱状图。

实施例6

本实施例用于说明本发明免疫印迹法(Western blot)检测细胞系提取的外泌体中EpCAM和HER2蛋白表达量。

1、外泌体蛋白的提取及定量

取100μL外泌体于离心管中，加入100μL蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)，充分混合，于冰上裂解1h。裂解完全后，使用索莱宝公司生产的 BCA蛋白定量试剂盒对外泌体的蛋白含量进行定量。

裂解后的外泌体，加入4×的蛋白上样缓冲液，与蛋白充分混合，95 ℃条件下加热10min使蛋白变性。待其冷却至室温后保存在-20℃冰箱中待用。

2、免疫印迹法(Western blot)对外泌体中EpCAM和HER2蛋白含量的检测

取上样量为10μg的外泌体蛋白，加入聚丙烯酰胺凝胶中，110V条件下恒压跑电泳100min。将凝胶转至孔径0.45μm的PVDF膜(Millipore, Bedford,MA)上。封闭液(5％的脱脂奶粉)室温震荡孵育一小时。封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，以避免下一步加入的抗体与膜发生非特异性结合。将封闭好的PVDF膜浸泡在EpCAM(小鼠来源)抗体或HER2(兔来源)抗体中，4℃孵育12小时。然后用0.1％Tween 20-Tris缓冲盐溶液 (TBST)溶液清洗PVDF膜，室温震荡洗涤3次，每次5分钟。将洗涤后的PVDF膜浸泡在含有辣根过氧化物酶HRP标记的抗小鼠或抗兔IgG二抗溶液中，室温震荡孵育1小时，然后用TBST溶液清洗，室温震荡洗涤3次，每次5分钟。最后，将膜浸于荧光显色剂中，在超高灵敏度化学发光成像系统(ECLchemiluminescence system Bio-Rad)中成像。

为证明外泌体的纯度，CD81，CD63，Flotillin-1三种外泌体高表达的蛋白作为阳性对照，内质网来源的Calnexin为外泌体阴性蛋白，作为阴性对照。外泌体中此四种蛋白含量的Western blot检测方法同上述 EpCAM,HER2蛋白的检测方法。

如图6所示，对于EpCAM蛋白，MCF-10A细胞分泌的外泌体几乎无 EpCAM蛋白，MDA-MB-468，MCF-7，SK-BR-3三种细胞分泌的外泌体均为EpCAM高表达。对于HER2蛋白，MCF-10A细胞和MDA-MB-468细胞分泌的外泌体中几乎无表达，MCF-7细胞分泌的外泌体HER2为低表达， SK-BR-3分泌的外泌体为HER2高表达。此结果与流式细胞术结果一致，验证了本发明所述检测方法的准确性。此外，四种细胞分泌的外泌体中均有CD81，CD63，Flotillin-1三种蛋白表达，均无阴性对照Calnexin的蛋白表达。表明外泌体纯度较高。

实施例7

本实施例用于说明本发明血清中外泌体的提取。

1、受试者入组

受试者为19例HER2+乳腺癌复发转移病人，12例HER2-乳腺癌复发转移病人，7例健康人。所有受试者均签订了知情同意书。病人的入选标准为经免疫组化结果确认过的乳腺癌患者，健康人的入选标准为没有任何急性，慢性，及转移性疾病的人。血液为静脉取血，室温静置30min。组织标本为穿刺得到。

2、血清的分离

1)对受试者进行静脉取血，使用非抗凝采血管收集受试者的全血；

2)采血后静置30min以上使其分层，24h内离心，转速4000rpm,离心 5-10min；

3)离心后收集上层血清。

3、血清中外泌体的提取

1)用0.22μm滤膜过滤的PBS稀释血清，装至50mL离心管中，4℃条件下，离心力800g，离心5min；

6)将过滤后的样品装入超速离心管，确保离心管中无气泡，每两根离心管间质量差小于0.05g。4℃条件下，离心力130000g，离心12h；

7)超速离心后弃去上清培养基，将底部沉淀重悬至PBS缓冲液中，4 ℃条件下，离心力130000，离心2h。

8)弃去上清的PBS缓冲液，将提取得到的外泌体重悬在100μL体积的PBS缓冲液中，PBS缓冲液提前用0.22μm的滤膜过滤。

血清中提取的外泌体形貌的透射电镜图如图7a所示，尺寸分布由NTA 方法检测，如图7b所示。

实施例8

本实施例用于说明本发明利用外泌体进行乳腺癌诊断的实验。

1、血清来源

血清分离自19例HER2+乳腺癌复发转移病人，12例HER2-乳腺癌复发转移病人，7例健康人的血液。

2、流式细胞术方法外泌体中EpCAM表达量。

1)向外泌体-微球复合物中加入5％的BSA/PBS溶液，室温下反应1h, 封闭外泌体上的非特异性结合位点。离心力14800g条件下离心3min，温度为4℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍。

图8a为分别在健康人，HER2-乳腺癌病人，HER2+乳腺癌病人外泌体中检测到的EpCAM表达量的流式结果图，图中的百分数为EpCAM抗体特异性结合外泌体的阳性率。图8b为由健康人，HER2-病人，HER2+病人外泌体中EpCAM表达量绘制的散点图(**P<0.01,***P<0.001，t检验)。可以看出，HER2+病人外泌体中EpCAM蛋白表达量明显高于健康人和 HER2-病人，说明该方法可有效的对HER2+患者进行诊断。

实施例9

本实施例用于说明本发明利用外泌体进行乳腺癌HER2分子分型的实验。

1、血清来源

2、流式细胞术方法血清外泌体中HER2蛋白表达量。

2)将HER2抗体稀释至工作浓度，取100μL加入至封闭后的外泌体- 微球复合物中，室温反应1h,。离心力14800g条件下离心3min,温度为4 ℃，弃去上清液后，加入0.5％BSA/PBS重悬，再次离心，如此重复三遍，去除非特异性结合的抗体。

5)将上述所有样品重悬在200uLPBS中，移液枪吹打均匀，用流式细胞仪(FCM，acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)进行检测，先检测空白对照组的流式测试液，圈门。再检测同型对照组的流式测试液，调节参数使阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，选择流式细胞仪的FL-1通道(FITC荧光检测通道，激发波长为488nm)检测细胞HER2 表达量，记录抗体与外泌体-微球复合物的结合率。

图9a为分别在健康人，HER2-乳腺癌病人，HER2+乳腺癌病人外泌体中检测到的HER2蛋白表达量的流式结果图，图中的百分数为HER2抗体特异性结合外泌体的阳性率。图9b为由健康人，HER2-病人，HER2+病人外泌体中HER2表达量绘制的散点图(***P<0.001，t检验)。可以看出， HER2+病人外泌体中HER2蛋白表达量明显高于健康人和HER2-病人，说明该方法可有效的区分HER2+病人与HER2-病人。

3、检测方法的评价

利用ROC曲线对本发明在乳腺癌病人HER2分子分型方面的检测效力进行分析。分析结果如图10，通过对HER2+病人组和HER2-病人组中HER2 蛋白表达量的测定结果进行分析，得到曲线下面积(AUC)为0.972，截断点(cut-off value)为52.1％,95％置信区间为0.927-1.000。作为对照，以外泌体的蛋白浓度作为诊断标准，通过对HER2+病人组和HER2-病人组中提取出的外泌体蛋白浓度进行分析，绘制ROC曲线，曲线下面积(AUC) 为0.611。由于AUC越接近于1，说明诊断效果越好，因此，通过ROC曲线分析，表明本发明的检测方法在乳腺癌分子分型方面有很高的准确性。

实施例10

本实施例用于说明免疫组化染色法验证本发明所述分子分型方法的准确性。

为验证本发明所述方法的准确性，在入组的受试者中抽取四例外泌体 HER2含量各不相同的样本，用免疫组化染色法检测其原位肿瘤组织切片中 HER2蛋白的表达量。结果如图11所示，将两种方法所测结果进行对比，发现本发明所述方法测得的外泌体中HER2蛋白的表达量(左)与免疫组化法测得的其肿瘤组织切片中HER2蛋白的表达量(右)结果相一致。进一步验证了本发明所述方法的准确性。

实施例11

本实施例用于说明本发明计算单个外泌体中目标蛋白标志物表达量的方法。

通过流式细胞术可得到外泌体-微球复合物的平均荧光强度值，通过扫描电镜计数得到单个微球上连接的外泌体数量，二者的比值可得出单个外泌体的荧光强度值。

基于此方法，计算出单个外泌体上EpCAM蛋白平均荧光强度值及 HER2蛋白平均荧光强度值，将健康人组，HER2-病人组，HER2+病人组的检测结果绘制成柱状图，如图12(**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001, t检验)。该结果进一步证明了利用外泌体进行乳腺癌诊断及HER2分子分型的准确性。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims

1.一种用于乳腺癌检测及分子分型的外泌体检测装置，其特征在于，所述装置包括：

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述细胞选自以下一种或多种：乳腺上皮细胞MCF-10A，乳腺癌细胞MDA-MB-468，MCF-7，SK-BR-3。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述外泌体提取机构中，所述外泌体的提取方法选自以下一种或多种：超速离心法、微孔膜过滤法、微流通道法，优选为超速离心法，更优选地，所述超速离心法包括以下步骤：

优选地，所述第一次离心速度为300g～1000g，优选为800g；第一次离心时间为5分钟；所述第二次离心速度为2000g～5000g，优选为2000g；第二次离心时间为10分钟；所述第三次离心速度为8000g～10000g，优选为10000g；第三次离心时间为1小时；所述离心温度为4℃；

4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述外泌体的提取还包括以下步骤：

(c)将步骤(b)离心所得的沉淀，重悬在PBS中。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其特征在于，所述外泌体提取机构中，所述细胞培养上清的培养基含10％胎牛血清；

优选地，所述外泌体提取机构还包括以下操作机构：

6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述扣除外泌体的胎牛血清配制的培养基通过以下方法制备：

(iv)用滤膜对培养基进行过滤，装瓶待用；优选地，所述滤膜孔径为0.22μm。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的装置，其特征在于，所述外泌体表征机构中，所述形貌表征的机构为透射电镜，优选为生物型透射电镜；所述大小表征的机构为动态光散射机构和/或纳米颗粒跟踪分析机构；所述浓度表征的机构为纳米颗粒跟踪分析机构。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的装置，其特征在于，所述蛋白表达量的测定机构通过流式细胞仪和扫描电镜对单个外泌体中蛋白标志物表达量进行计算。

9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述对单个外泌体中蛋白标志物表达量进行计算以下步骤：

10.权利要求1至9中任一项所述的装置在制备用于诊断和/或治疗癌症的医疗产品中的应用；优选地，所述癌症为乳腺癌；更优选地，所述应用为乳腺癌的诊断和/或HER2分子分型。