CN110095608B - 基于磁性分离和dna自组装的肿瘤外泌体纳米荧光传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于磁性分离和DNA自组装的肿瘤外泌体纳米荧光传感器，包括偶联GPC‑1抗体的功能化磁珠、触发链、三个茎环状核酸探针。本发明实现了乳腺癌GPC‑1(+)外泌体亚群的定量检测，检测特异性高、灵敏度高、检测范围宽，通过对临床血浆来源标本中的乳腺癌GPC‑1(+)外泌体亚型进行检测以评估该方法的临床应用价值，该方法具有普适性，可运用于其它已筛出特异核酸适体的生物标志物。可用于其它外泌体亚型、蛋白、细胞和金属离子等的检测。

Description

基于磁性分离和DNA自组装的肿瘤外泌体纳米荧光传感器
技术领域
本发明涉及肿瘤液体检测技术领域，特别是涉及一种基于磁性分离和DNA自组装的肿瘤外泌体纳米荧光传感器。
背景技术
乳腺癌是全球最常见的女性恶性肿瘤。2015年中国癌症统计数据显示：近十年，中国乳腺癌患者占所有女性癌症患者的15％，且死亡率有明显上升趋势，是45岁以下女性最常见的癌症死因。早期发现、早期诊断是改善乳腺癌患者预后、提高生存率的重要手段。目前乳腺癌早期筛查措施包括：乳腺X线、乳腺超声、乳腺核磁共振、临床体检和自检；诊断措施包括：细胞学检查、病理活检，正电子发射计算机断层显像(Pet-CT)。以上筛查或诊断措施不同程度存在灵敏度低、特异性差、有创、有放射性、检查周期长等缺点，因此建立敏感、特异、无创、便捷、快速的替代检测方法用于早期乳腺癌的筛查、诊断或监测，对控制乳腺癌发展和提高患者生存质量显得尤为重要。
液体活检有着迅速、便捷、损伤性小等众多优点，在大幅度缩短癌症确诊时间的同时，可对癌症患者的治疗情况进行随时监测，有望成为乳腺癌筛查、诊断或监测的理想方法。最新研究发现外泌体与乳腺癌的发生、发展、转移以及抗药性具有一定的相关性，被认为是具有广泛应用前景的乳腺癌液体活检生物标志物。
目前外泌体的实验室检测主要包括分离和分析两大步骤。外泌体分离方法金标准是超速离心法，耗时长、需要昂贵的实验设备、所需标本量大(＞2mL)等缺点限制了其临床应用；已出现的商业化外泌体分离沉淀试剂盒耗时较短、所需标本量小，但分离纯度有限，且试剂明显影响外泌体的生物活性。而目前外泌体分析的主流方法：纳米粒子跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)和电镜仅可提供外泌体的大小、浓度、形态等参数，不能确定外泌体来源；其它如ELISA或Western blot检测外泌体蛋白等方法，由于需要样本量较大，操作步骤繁琐，同样不适用于临床检测。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于磁性分离和DNA自组装的肿瘤外泌体纳米荧光传感器，用于解决现有技术中外泌体的检测方法操作繁琐、所需样本量大、不适用于临床检测等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于肿瘤外泌体检测的试剂盒，包括偶联有抗体的功能化磁珠、触发链、三个茎环状核酸探针。
可选地，所述触发链包括用于与标志物互补结合的识别区、用于与所述三个茎环状核酸探针互补结合的触发区。
可选地，所述触发区含有如下核苷酸序列：GCACTACTCCCTAACATCTCAAGC。
可选地，所述偶联有抗体的功能化磁珠选自偶联GPC-1抗体的功能化磁珠。
可选地，所述触发链的识别区含有如下核苷酸序列： CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA。
可选地，所述偶联GPC-1抗体的功能化磁珠可以从是市场上购买链霉亲和素化磁珠和 GPC-1抗体，自行包被得到，针对不同的标志物，磁珠上可以偶联不同的抗体。
可选地，所述触发链选自CD63aptamer-ssDNA，所述CD63aptamer-ssDNA含有如SEQID NO.1所示的核苷酸序列。
可选地，所述三个茎环状核酸探针包括探针H1、H2、H3，所述探针H1含有如SEQ IDNO.2 所示的核苷酸序列，所述探针H2含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述探针H3含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
可选地，还包括荧光报告基团。
可选地，所述荧光报告基团选自聚集诱导发光分子(AIE分子)。
可选地，所述聚集诱导发光分子选自四苯基乙烯的衍生物，
可选地，所述聚集诱导发光分子选自TPE-TA、[12]aneN3modifiedtetraphenylethene(TPE) compounds([12]aneN3改性的四苯乙烯(TPE)化合物，来源于DOI：10.1021/acsami.6b01949)、 TPE-Py分子(来源于DOI：10.1021/acs.analchem.5b04756)、TPE-Z分子(来源于DOI： 10.1016/j.talanta.2017.02.064)。
上述AIE分子仅仅是部分列举，只要能够和DNA结合的AIE分子都适用于本发明。
可选地，还包括荧光猝灭基团。
可选地，所述荧光淬灭基团选自氧化石墨烯。
可选地，所述氧化石墨烯选自单层氧化石墨烯，其可以从市场上购买得到，其形态可以为片状、粉末、分散液，优选为粉末。
可选地，单层氧化石墨烯片状、粉末的片径为500nm-5μm。
可选地，所述单层氧化石墨烯厚度为0.8-1.2nm。
可选地，还包括缓冲液。
可选地，所述缓冲液包括PBS buffer。
可选地，所述PBS buffer中含有0.1％BSA(牛血清白蛋白)。
可选地，所述缓冲液还包括NE Buffer。
可选地，还包括核酸外切酶Ⅲ，其可以从市场上购买得到。
本发明还提供上述试剂盒在制备或筛选用于诊断和/或预防和/或治疗肿瘤的药剂中的应用。
可选地，所述试剂盒对乳腺癌GPC-1(+)外泌体进行检测。
如上所述，本发明的一种基于磁性分离和DNA自组装的肿瘤外泌体纳米荧光传感器，具有以下有益效果：本发明实现了乳腺癌GPC-1(+)外泌体亚群的定量检测，检测特异性高、灵敏度高、检测范围宽，最后通过对临床血浆来源标本中的乳腺癌GPC-1(+)外泌体亚型进行检测以评估该方法的临床应用价值，旨为构建免超离、高敏的乳腺癌液体活检新方法提供实验基础与理论依据。该方法具有普适性，可运用于其它已筛出特异核酸适体的生物标志物。针对不同生物标志物，合成含有不同核酸适配体序列的Trigger，即可用于其它外泌体亚型、蛋白、细胞和金属离子等的检测。同时，该方法全程在恒温液相体系中进行，适合液体微流控芯片平台，有望通过制作对应的微流控芯片构建微型检测体系，开发快速简便高效的POCT 检测试剂盒，实现肿瘤外泌体的真正意义上的临床快速检测。
附图说明
图1显示为本发明实施例的靶标催化三种DNA发夹自组装信号放大原理图。
图2显示为本发明实施例中通过(a)透射电子显微镜，(b)NTA和(c)免疫印迹实验分别表征外泌体结果图。
图3显示为本发明实施例中采用双通道超分辨成像技术对MDA-MB-231细胞培养基中分离的外泌体中CD63和GPC-1的表征图。(a)PKH67染外泌体膜；(b)Alexa Fluor 647荧光标记CD63；(c)双通道超分辨融合图像；(d)PKH67染外泌体膜；(e)Alexa Fluor 647荧光标记GPC-1；(f)双通道超分辨融合图像。
图4显示为本发明实施例中透射电子显微镜图像显示功能化磁珠捕获GPC-1(+)外泌体结果图；(a)和(b)是对照组功能化的GPC-1磁珠在透射电子显微镜下的整体图和局部图；(c)和(d) 是捕获GPC-1(+)外泌体的功能化磁珠在透射电子显微镜下的整体图和局部图。
图5显示为本发明实施例中流式细胞技术验证磁珠捕获的MDA-MB-231外泌体上膜蛋白 CD63。
图6显示为本发明实施例中12％PAGE表征“Y”字形DNA纳米结构反应过程：泳道(1)至 (8)分别为(1)DNA ladder(20-500bp)；(2)H1；(3)H2；(4)H3；(5)H1+H2+H3；(6)H1+ H3+H3+ExoⅢ；(7)H1+H2+H3+T；(8)H1+H3+H3+ExoⅢ+T。
图7显示为本发明实施例中基于磁性分离和DNA自组装的外泌体纳米荧光传感技术的荧光光谱图。(a)高浓度MDA-MB-231外泌体；(b)中浓度MDA-MB-231外泌体；(c)低浓度MDA-MB-231外泌体；(d)空白对照的荧光信号图
图8显示为本发明实施例中对Trigger浓度和探针浓度条件进行研究。(a)Trigger浓度为 0.2μM，0.4μM，0.6μM，0.8μM，1μM和1.5μM的荧光响应值信噪比；(b)探针浓度为1μM，2μM，3μM，4μM和5μM的荧光响应值信噪比。
图9显示为本发明实施例中TPE-TA浓度、GO浓度条件对荧光信号响应值的影响结果图。(a)TPE-TA反应浓度为1.6nM,3.2nM,4.8nM,6.4nM，9.6nM条件下的荧光信号响应值；(b)GO反应浓度为0μg/mL,8μg/mL,16μg/mL,32μg/mL,48μg/mL,64μg/mL条件下的荧光信号响应值。
图10显示为本发明实施例中反应时间、反应温度条件对荧光响应值信噪比的影响结果图。 (a)反应时间为10min,20min,30min,40min,50min的荧光响应值信噪比；(b)反应温度为 25℃,37℃,42℃的荧光响应值信噪比。
图11显示为本发明实施例中外切酶的用量和外切酶孵育时间条件探索结果图。(a)在 TPE-TA溶液中分别加入30，40和50单位的外切酶Ⅲ对荧光信号无明显影响；(b)不同酶切时间检测体系的荧光值信噪比。
图12显示为本发明实施例中基于磁性分离和DNA自组装的乳腺癌外泌体纳米荧光传感技术检测特异性结果图。
图13显示为本发明实施例中基于磁性分离和DNA自组装的乳腺癌外泌体纳米荧光传感技术灵敏度及线性检测范围分析图。(a)检测不同浓度GPC-1(+)外泌体所采集的荧光光谱图； (b)检测不同浓度GPC-1(+)外泌体的标准曲线。
图14显示为本发明实施例中基于磁性分离和DNA自组装的乳腺癌外泌体纳米荧光传感技术临床标本检测结果图。(a)7例健康人和26例乳腺癌病人血浆标本GPC-1(+)外泌体检测荧光响应值；(b)散点图显示健康人组和乳腺癌患者组GPC-1(+)外泌体浓度有显著性差异。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
若发展一种适用于临床实验室的外泌体检测方法，应满足以下要求：一、应具备良好的特异性，能区分出不同肿瘤来源的外泌体亚型；二、应具备敏感的检测能力，能定量检测出不同临床标本甚至极低丰度的外泌体；三、检测过程相对简便，外泌体的分离和分析过程一次完成；四、检测成本相对低廉，无需昂贵的设备和试剂。
生物传感技术由于集高效、灵敏、特异、小巧、经济等优点于一身，是满足临床实验室外泌体检测需求的重要技术平台。纳米技术的应用是生物传感器发展的新方向之一，而其中纳米荧光生物传感器因其具有检测抗干扰性强、无需参比器件、样品用量少、操作简便等优点逐渐引起人们的关注。并且纳米荧光生物传感器的出现，使体液中微量生物大分子的高敏液相检测及细胞内多种生理分析物的原位监测成为可能。因此，基于纳米荧光生物传感技术构建一种操作简便、设备小巧便宜，又具有高灵敏度和特异性的外泌体快速检测方法，是目前乳腺癌液体活检的迫切需求。
本发明在GPC-1抗体包被免疫磁珠作为外泌体分离方法和生物传感检测微载体的基础上，拟利用GPC-1抗体和CD63aptamer组成的“三明治”结构特异性识别GPC-1(+)外泌体亚群，并将该识别系统信号通过连接ssDNA的CD63aptamer抗体转换成DNA纳米结构形成信号，通过构建“Y”字形DNA纳米结构自组装放大系统和TPE-TA/GO免标记“Turn-on”型荧光报告系统增加分析灵敏度，构建基于磁性分离和DNA自组装的外泌体纳米荧光传感技术。在此基础上，研究分析条件，阐明响应机理，验证临床诊断性能，旨在为构建高敏、快速、经济、简便的乳腺癌液体活检新方法提供实验基础与理论依据。
基于核酸适配体的“Turn-on”型外泌体纳米荧光传感技术可用于外泌体亚型的荧光检测，但是该方法分析前外泌体样品分离步骤需要简化、分析性能有待进一步提高。为满足以上需求，本课题组密切关注外泌体分离及纳米荧光生物传感技术性能研究最关键的四个要素。
实施例1
1.原理分析
(一)分离方法
免疫亲合法是利用抗体与外泌体表面膜蛋白质间的特异性相互作用，实现外泌体的特异性捕获。抗体通常被固载于磁性颗粒、色谱固定相和微流体装置等基质上。最常用的免疫磁珠法是由包被有单克隆抗体的球型磁性纳米颗粒作为反应界面与表达特定蛋白的外泌体亚型特异性结合，并利用磁场对结合在磁性纳米颗粒表面的外泌体进行分离。由于分离过程简便快速，免疫磁珠法特别适用于样品量较少的外泌体分离和后续生物传感快速检测。并且由于以免疫磁珠为反应界面的液相(Solution-phase)反应在均相体系中进行，反应面积较大，物质间的接触更全面充分，识别反应更容易进行，亦更容易达到平衡，因而具有简便、快速、高敏、线性范围广等优点，由此而开发的生物传感技术更适用于液体活检领域。因此，我们拟采用免疫亲合磁珠法进行外泌体样品分离，并以此磁珠作为反应微载体进行下一步生物传感分析。在使用过程中需要注意一点，由于免疫亲和法主要依赖于外泌体表面标记物，因此往往会导致外泌体特定亚型的捕获量小于实际量，从而导致计数偏低。
(二)识别元件
外泌体膜结构主要由磷脂双分子层、膜蛋白、骨架蛋白和伴侣蛋白等基本成分组成，而特异性膜蛋白成分可能介导不同细胞来源外泌体的特殊功能，也成为不同细胞来源外泌体检测的主要靶标。据文献报道，除了不同来源外泌体均高表达的跨膜蛋白(如CD63、CD9、 CD81)、MHCⅡ类分子等膜蛋白外，磷脂酰基醇蛋白聚糖-1(Glypican-1,GPC-1)在胰腺癌和乳腺癌患者外周血循环中外泌体表面特异性高表达，其作为早期胰腺癌标志物的诊断价值已被证实并发表在国际权威杂志Nature上，而本课题组也已证实早期乳腺癌患者血液循环中外泌体表面特异性高表达膜蛋白GPC-1，故GPC-1膜蛋白特异性高表达的外泌体亚群，简称 GPC-1(+)外泌体亚群，可作为早期乳腺癌筛查与诊断的靶标应用于临床检测。
核酸适配体因化学性质稳定、免疫原性低和易被各种基团灵活修饰等优点，可作为外泌体较理想的识别元件供临床应用。为增加检测特异性，“三明治”型识别体系常被应用于生物传感检测技术的构建。而目前乳腺癌外泌体检测靶标GPC-1的aptamer尚未见报道，故拟用 CD63aptamer对GPC-1单克隆抗体包被的免疫磁珠捕获的GPC-1(+)外泌体亚型进行“三明治”型特异识别，并在此基础上构建纳米荧光生物传感技术，以达到对乳腺癌GPC-1(+)外泌体特异性检测的目的。
(三)信号体系
课题组前期实验已证实AIE分子TPE-TA荧光报告基团与GO荧光猝灭基团共同构成的免标记“Turn-on”型荧光报告系统可用于外泌体亚型的荧光检测，本部分我们将继续沿用此荧光信号体系。但是由于外周血中来源于特定肿瘤组织或细胞的外泌体数量较少，加之免疫磁珠分离过程中的外泌体的损耗较大，故需要对GPC-1抗体捕获的外泌体信号进行放大，以提高检测灵敏度，实现临床标本极低丰度外泌体亚型的定量检测。传统的信号放大步骤主要依靠工具酶，但aptamer标记工具酶难度较大，且其活性受环境因素影响较大，易失活。DNA 纳米结构(DNA Nanostructure)是利用脱氧核糖核酸或其他核酸的自组装特性建构出的可操控型纳米尺度结构。最近研究人员通过单链DNA(ssDNA)引发DNA自组装纳米结构的信号放大策略引入到aptamer的识别反应中，此处ssDNA作为激发序列能够启动滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)、杂交链式反应(Hybridization ChainReaction,HCR)、催化茎环自组装技术(Catalytic Hairpin Assembly,CHA)等经典DNA自组装反应。这启发我们将外泌体“三明治”型识别信号通过连接ssDNA的CD63aptamer转换为DNA自组装纳米结构，形成信号进行放大和检测。
近年来，基于“Toehold”的CHA反应因具有快速而高效的放大性能受到广泛关注。经典的CHA检测体系由一条链状核酸序列Trigger和两个茎环状核酸探针(H1、H2)组成，链状核酸序列Trigger通过碱基互补配对原则与茎环状核酸探针(H1、H2)上成核区，即“Toehold”结合，并因拓扑反应动力学作用相继改变H1和H2结构，完成核酸之间的自组装过程，并在此过程中形成大量重复双链DNA结构，以实现相应的信号放大目的。在此基础上，我们拟利用连接ssDNA的CD63aptamer作为Trigger启动改良的CHA反应生成大量的“Y”字形DNA 纳米结构，从而对CD63aptamer识别GPC-1(+)外泌体的信号进行放大。“Y”字形DNA纳米结构自组装放大系统的反应原理如图1所示：在Trigger存在的条件下,茎环状DNA探针H1茎部打开，形成Trigger/H1复合物，并暴露H2的引发序列，使得H2的茎部打开，形成Trigger/H1/H2复合物，并暴露H3的引发序列，最后H3的茎部也打开，形成“Y”字形DNA 纳米结构Trigger/H1/H2/H3复合物的同时释放Trigger，进而启动下一个茎环状DNA自组装反应，如此循环往复，生成大量的“Y”字形高分子量DNA自组装纳米结构。
然而基于“Tohold”的DNA自组装纳米结构构建的荧光传感系统通常都需要在DNA序列上进行荧光标记，才能实现“Turn-on”型高灵敏荧光检测，用免标记的AIE纳米分子TPE-TA 作为荧光报告基团，可能会因DNA探针过多而出现较高的荧光背景值。核酸外切酶Ⅲ (ExonucleaseⅢ,ExoⅢ)对平末端或3’端凹陷末端DNA有最大切割活性，而对3’端突出的产物双链DNA分子不能切割，利用此特点对未反应的DNA原料进行酶切处理，降低背景信号，提高信噪比。最后，结合前期已验证成功的TPE-TA/GO免标记“Turn-on”型荧光报告系统，构建基于DNA自组装的外泌体荧光检测体系。
基于前期研究成果，并参阅大量文献资料，我们提出在GPC-1抗体包被免疫磁珠作为外泌体分离方法和生物传感检测微载体的基础上，拟利用GPC-1抗体和CD63aptamer组成的“三明治”结构特异性识别GPC-1(+)外泌体亚群，并将该识别系统信号通过连接ssDNA的CD63 aptamer抗体转换成DNA纳米结构形成信号，通过构建“Y”字形DNA纳米结构自组装放大系统和TPE-TA/GO免标记“Turn-on”型荧光报告系统增加分析灵敏度，构建基于磁性分离和 DNA自组装的外泌体纳米荧光传感技术。在此基础上，研究最适分析条件，阐明响应机理，验证临床诊断性能，旨在为构建高敏、快速、经济、简便的乳腺癌液体活检新方法提供实验基础与理论依据。
2.材料与方法
2.1材料
2.1.1细胞系
人乳腺癌细胞系：MDA-MB-231，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，保存于液氮中。
2.1.2主要试剂耗材
表1
Figure BDA0002025954900000081
Figure BDA0002025954900000091
TPE-TA分子的参考文献为：Dual-Mode Ultrasensitive Detection of NucleicAcids via an Aqueous“Seesaw”Strategy by Combining Aggregation-InducedEmissionand Plasmonic Colorimetry，Jianlei Shen,Yiru Zhang,Rong Hu,RyanT.K.Kwok,Zhiming Wang,Anjun Qin,and Ben Zhong Tang,ACS Appl.Nano Mater.2019,2,163-169。
TPE-TA分子的具体结构还可参考专利申请公布号为CN 108949919A的中国发明专利《一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法》，其说明书第[0038-0039]段对分子结构做了详细说明，其制备方法参考文献“Hong,Y.；Xiong,H.；Lam,J.W.Y.；
Figure BDA0002025954900000103
M.； Liu,J.；Yu,Y.；Zhong,Y.；Sung,H.H.Y.；Williams,I.D.；Wong,K.S.；Tang,B.Z.Fluorescent Bioprobes:Structural Matching in the Docking Processes ofAggregation-Induced Emission Fluorogens on DNA Surfaces.Chem.-Eur.J.2010,16,1232-1245”。
2.1.3主要仪器
表2
Figure BDA0002025954900000101
表3本实施例所涉及的核苷酸序列
Figure BDA0002025954900000102
表3的序列中，CD63aptamer-ssDNA中的下划单波浪线部分碱基可与待检测的标志物 (GPC-1(+)外泌体膜上表达的CD63蛋白)特异性识别，引发H1/H2/H3的自组装反应，下划单直线部分碱基与探针互补结合，生成大量游离的“Y”字形DNA纳米结构。
H1序列中下划单直线部分碱基与CD63aptamer-ssDNA中下划单直线部分碱基互补结合， H1序列中下划双直线部分碱基与H2序列中下划双直线部分碱基互补结合，H2序列中下划双波浪线部分碱基与H3序列中下划双波浪线部分碱基互补结合，H3序列中下划单直线部分碱基与CD63aptamer-ssDNA中下划单直线部分碱基互补结合。
2.2方法
2.2.1细胞培养与细胞上清液中外泌体的分离纯化
(1)细胞培养
1)细胞复苏：首先将冻存在液氮罐中的MDA-MB-231细胞株冻存管取出，迅速转移至 37℃恒温水浴箱中使之快速溶解，孵育过程中时不时的摇动冻存管使其受热均匀。待细胞完全溶解后，取15mL离心管加入5mL RPMI-1640培养液，将冻存管中的细胞悬液吹打混匀移至离心管中，1200rpm离心2min，吸弃离心管中的上清液，然后加入5mL完全培养基(10％胎牛血清与90％RPMI-1640培养液)重悬混匀后移至25cm2细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2的湿润恒温培养箱中培养2-3天后，观察细胞状态及密度情况，待细胞生长繁殖至覆盖培养瓶或培养皿底面积的70-80％时传代。
2)细胞传代：首先使用移液枪吸弃培养瓶或皿中旧的培养基，然后PBS清洗培养瓶或皿 2-3次，加入1mL胰酶，轻摇培养瓶或皿使胰酶均匀分布于细胞表面，胰酶消化细胞1min 左右，倒置显微镜下观察，若细胞间隙明显增大、细胞形态开始变圆，则加入200μL血清终止消化，加入适量PBS轻轻吹打细胞，待细胞脱离培养瓶或皿底部且混匀后转移至15mL离心管，1200rpm离心3min，吸弃上清液后加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬，1：3或1：4传代后置于37℃、5％CO2的湿润恒温培养箱中培养。
3)细胞上清液收集与前处理：观察MDA-MB-231细胞生长情况，待细胞生长繁殖至覆盖培养瓶或皿底面积60-70％时，弃掉瓶或皿中旧的培养基，PBS清洗瓶或皿2-3次，加入无血清的RPMI-1640培养液，然后同样的条件下在培养箱中培养12h(去除残余血清分泌外泌体的影响)，然后再弃掉瓶或皿中旧的培养基，PBS清洗瓶或皿2-3次，加入含1-2％Exo-FBSTM去Exosomes胎牛血清的RPMI-1640培养液，继续培养48h，使得细胞分泌一定数量的外泌体至培养液中。48h后收集MDA-MB-231细胞上清液进行前处理，具体步骤为：300g离心10min去除培养上清液中的残余细胞，弃沉淀收集上清液，3000g离心15min去除上清液中的细胞碎片，弃沉淀收集上清液10,000g离心30min，去除上清液中较大的囊泡，弃沉淀收集上清液备用。
(2)细胞上清液中外泌体的分离纯化
用低温超高速离心机L-80XP135000g离心70min获得沉淀为粗提外泌体，加入适量的 PBS重悬混匀后继续135000g离心70min以去除溶解在PBS中的杂质蛋白，最终所得沉淀即为较纯的外泌体，最后用100μL PBS重悬沉淀，即为后续试验所用外泌体标本，储存于-80℃冰箱备用。
2.2.2透射电子显微镜观察外泌体形态结构
将分离纯化的外泌体进行不同的稀释，然后从中吸取15μL的外泌体样本滴于电镜专用的铜网上，室温静止2min，用滤纸从铜网的样本另一侧吸干液体，然后在铜网上滴加20μL 的2％的磷钨酸染液，室温条件下静止10min，吸干多余的磷钨酸，用蒸馏水清洗1-2次，用滤纸吸干蒸馏水，室温静置10min，待铜网干燥。使用尖头镊子夹取负载样本的铜网放入样品安装槽内，装上垫片，固定好，然后将样品管对准透射电镜的进样口，在卡口处用拇指将其轻轻推入，听到响声后，红灯变亮。打开下方开关，见到绿灯变亮，右拧进样管，样本将自动吸入，随后往左回拧5℃左右，使其吸入最底部，然后就可以在透射电子显微镜H-7650下观察外泌体的形态并拍照。
2.2.3 NanoSight NS300分析外泌体浓度及其粒径分布
由于NanoSight NS300分析仪的理想上机粒子浓度为1×108-1×109particles/mL，因此上机前需要对分离提纯的外泌体进行稀释，使其浓度在理想的检测范围，并且上机样本量是1mL。分析样本前，用PBS作为空白对照，选取405nm的激光，观测检测室的背景值，用PBS清洗上样管道及检测室直至背景无粒子亮点出现。然后用1mL的注射器吸取1mL的稀释样品溶液，缓慢的推入管道，待液流稳定后，为保证结果准确，一般重复三次进样与检测，并且每次拍摄持续60s(30frames/s)的视频，拍摄期间要保持操作台面的稳定性。然后，对拍摄视频中的粒子设置阈值，减少离子假阳性与假阴性的计数。随后基于NTA software(Version 3.2, NanoSight)软件对视频中布朗运动的粒子进行计算分析，结合粒子的散射强度和爱因斯坦方程式，得到检测粒子的浓度和流体力学直径，绘制颗粒散射强度、浓度和粒径分布强度的三维图谱。最后，将检测室中的样品抽回到注射器中，拆卸激光器与检测通道部件后，用擦镜纸擦干激光器上的残余样品，并用水清洗检测通道，晾干后放置好备用。
2.2.4 Western Blot验证外泌体上的CD63蛋白与GPC-1蛋白的含量
(1)主要溶液配制
10％过硫酸胺(AP)：过硫酸铵0.1g，加去离子水1mL溶解，溶解后置于4℃冰箱保存。
10％SDS：按SDS重量(g)/溶液终体积(mL)＝1:10在SDS粉末中加入去离子水定容，混合均匀后用滤纸过滤，置于室温保存。
5×Tris-甘氨酸电泳液缓冲液
Figure BDA0002025954900000131
溶解后室温保存，溶液可重复使用3～5次。
1×转移缓冲液
Figure BDA0002025954900000132
溶解后室温保存，溶液可重复使用3～5次。
TBST缓冲液
Figure BDA0002025954900000133
封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液)：在1g脱脂奶粉中加TBST定容为20mL，置于室温保存。
10％分离胶和5％浓缩胶，TEMED在灌胶前再加入。
表4
Figure BDA0002025954900000134
Figure BDA0002025954900000141
(2)外泌体蛋白提取与定量
1)外泌体蛋白的提取
取4％SDS，100mM Tris-HCl，1mM DTT配置成pH 7.6的SDT裂解液，将100μL裂解液加入外泌体悬液中，充分裂解后，14,000g离心15min，取上清即为外泌体蛋白提取物。
2)外泌体蛋白浓度的定量
采用ThermoFisher微量BCA蛋白定量试剂盒进行样本蛋白浓度测定。利用试剂盒中蛋白质标准溶液配置相应浓度蛋白液与待测样品，分别吸取25μL的样本到96孔板中，再分别都加入200μL工作液l(A:B＝1：50)，震荡30s，彻底混匀后封口，在37℃水浴箱中孵育30min，冷却至室温，然后在酶标仪562nm波长下测量样品吸光度。以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。待测样品根据所测吸光度值，在标准曲线查得相应蛋白质含量(μg)，根据悬液体积换算蛋白浓度及上样量。
3)蛋白样品变性：在蛋白提取物中按蛋白样品与Loading buffer＝4:1的比例加入Loading buffer，沸水浴10min后，-20℃冰箱储存。
(3)SDS-PAGE电泳
1)将清洗处理干净的两块玻璃平板叠放底部对齐，固定在灌胶支架上，加入双蒸水至小玻板上缘，等待20-30min，评估液面下降情况，如果下降＞5mm重新固定，捡漏后倒掉水液并用滤纸吸干(少量残留水液不影响灌胶)。
2)灌胶：
按溶液配制7)配制10％分离胶，最后加入AP和TEMED，加入TEMED后混匀立即灌胶；分离胶加至小玻璃板2/3宽处，大约在插入齿梳的下缘以下1cm处(根据漏胶情况可适当多加一点)，然后立即加入双蒸水至小玻璃板边缘，静置30min(夏天可以缩短至20分钟)，可见明显的分界线，说明分离胶已凝固，倒掉胶上的双蒸水，并用滤纸将残余的水吸干；加入5％浓缩胶至小玻璃板上缘，立即插入上样齿梳，插入时要将齿梳平行插入并避免产生气泡，于室温静置30-45min待胶凝固。
3)上样：
胶凝后小心拔出齿梳，将胶板从胶架上取下，两块小板相对的固定于电泳槽中，在两块玻璃板间加入SDS电泳缓冲液至小板上缘5mm处，在电泳槽和玻板间倒入适当的电泳缓冲液；使用微量注射器进行加样，吸取预染蛋白Marker 5μL，样品10μg，加样时将针尖伸到加样孔底部，缓慢小心加入。
4)电泳：
浓缩胶部分使用低电压80V，20min，使样品浓缩成一条窄带，待条带移动到分离胶时，选择高电压恒压电流120v，直至溴酚蓝到达底部停止电泳。
(4)转膜
切胶：取下胶板，小心分开大小玻璃板，避免牵拉破坏胶，并且防止胶干燥，根据目标蛋白分子量，按照Marker所示分子量大小，切下所需部分，根据切下胶的大小剪出同样大小的6张滤纸和一张PVDF膜(剪角以标示正反面)。将PVDF膜在100％甲醇中浸泡约10秒，然后放入蒸馏水漂洗2-3min，再转移至转膜缓冲液中平衡5min，将滤纸放入转膜缓冲液中浸泡3-5min。
转膜夹(三明治夹心)制作：将转膜夹打开使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒擀走里面的气泡，垫子上垫4层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。把切好的胶平整置于滤纸上，将膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并去除气泡。在膜上盖4张滤纸并除去气泡。盖上另一侧海绵垫，用玻璃棒擀走里面的气泡后，合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。合上转膜夹，黑色对黑色，白色对红色将转膜夹放入转膜槽中，加满转膜缓冲液，放入冰袋，同色的电极相对连接电源；转膜槽放入冷水中并放入冰袋，200A恒流电转移约1h(Bio-rad湿转)。
(5)封闭
打开转膜夹，取出膜见marker被转在PVDF膜上，间接证明蛋白电转成功。将膜取出置于封闭液中，室温条件下，摇床80rpm/min封闭2h，对于抗体特异性较差的可在4℃冰箱孵育过夜，以封闭膜上的的非特异性位点。
(6)一抗、二抗孵育
分别加入CD63和GPC-1不同比例的一抗稀释液，塑料膜封闭，4℃冰箱摇床上孵育过夜；次日TBST洗膜3次，每次5min；分别加入稀释好的辣根过氧化酶标记的抗兔二抗稀释液，室温条件下摇床孵育1-2h，TBST清洗膜3次，每次10min。
(7)化学发光显影
曝光液A、B液按1:1混合，各1mL左右，置于平皿中；将膜在滤纸上轻轻滤干，放入混匀的A、B液中；利用ChemiDocXRS显像系统扫描条带，分析各条带显示的蛋白表达水平。
2.2.5超分辨显微镜成像验证CD63和GPC-1在外泌体膜上的表达
(1)超分辨成像缓冲液配制
Buffer A：先在管内加入5mL H2O；加入90μL配好的1M Tris溶液(即第一步配好的溶液)；加入450μL配好的1M NaCl溶液(即第二步配好的溶液)；定容至9mL。
Glucose Oxidase(70mg/mL)：称取105mg Glucose Oxidase粉末；溶于Buffer A中，定容至1.5mL；分装为20μL每管，共75管；保存在-20℃冰箱内。
Catalase(17mg/mL)：称取8.5mg Catalase粉末；溶于Buffer A中，定容至0.5mL(即500 μL)；分装为5μL每管，共100管；保存在-20℃冰箱内。
0.25M HCl：取170μL浓盐酸；用Buffer A定容至7mL。
MEA(1M)：称取539mg MEA粉末；溶于0.25M HCl，定容至7mL；分装为70μL每管，共100管；保存在-20℃冰箱内。
Buffer B：先在烧杯内加入10mL H2O；加入2.5mL 1M Tris(即第一步配好的溶液)；加入0.5mL 1M NaCl(即第二步配好的溶液)；称取5.5g Glucose·H2O粉末，加入溶液中；用 H2O定容至50mL，充分混匀(可以用磁力搅拌器)；抽真空(用抽真空泵和干燥器，或者向溶液内充氮气，半小时左右)；分装为5mL每管，共10管；保存在4℃冰箱内。
GLOX：20μL Glucose Oxidase+5μL Catalase。GLOX如果没有用完，可在4℃冰箱内存放两周左右。
最终的成像缓冲液：7μL GLOX+70μL MEA+620μL Buffer B。随用随配，使用约1-2小时。
(2)外泌体超分辨成像操作步骤
1)PLL-coated coverslip，用50uL 1mg/mL的Poly-L-lysine覆盖在拍摄皿上，常温30min孵育，适量PBS洗涤3次。
2)10μL样品+40μLPBS中(设置不同浓度)，50μL加在拍摄皿，常温孵育30min。
3)在遮光的EP管中加入50μL Dilution C和0.25μL PKH67,混匀。
4)将混匀的PKH67悬液加入到拍摄皿中，室温孵育4min，轻摇。
5)吸弃溶液后加入100μL的1％BSA孵育2min，适量PBS清洗三次。
6)50μL 1：400的CD63/GPC-1孵育1h，适量PBS清洗三次。
7)使用1：2000稀释羊抗兔Alexa Fluor 647标记荧光二抗进行孵育40min，PBS清洗3次。
8)PBS覆盖样品区，4℃保存。
9)将PBS吸弃后，换成超分辨成像缓冲液覆盖整个样品区域。
10)使用尼康N-STROM超分辨率显微镜系统在488nm和647nm波长激光下进行全内反射荧光(TIRF)照射后捕获图像。
2.2.6偶联GPC-1抗体的功能化磁珠的制备
(1)将试剂盒中的磁珠在
Figure BDA0002025954900000171
Sample Mixer上进行30min混匀，取100μL磁珠至1.5mL EP管中。
(2)将EP管置于磁铁上2min，吸弃上清，加入100μL 0.1％BSA PBS缓冲液，涡旋 5-10s，吸弃上清，并重复一次。
(3)用0.1％BSA PBS缓冲液重悬磁珠，加入25μL 0.2mg/mL的biolated-GPC-1抗体，并在室温下在混匀仪上孵育30min后，置于磁铁上2min，弃上清。
(4)加入200μL0.1％BSA PBS缓冲液洗涤。
(5)将试管置于磁铁上2分钟，取出上清液，加入300μL含0.1％BSA PBS缓冲液，重复步骤(4)和(5)5次。
(6)用含有0.1％BSA PBS缓冲液重悬磁珠，此时磁珠的浓度为2×105particles/μL。
2.2.7透射电子显微镜验证功能化磁珠捕获GPC-1(+)外泌体的效果。
(1)取2×105个步骤2.2.6制备的GPC-1功能化磁珠与10μL浓度为1×108个/μL的MDA-MB-231外泌体，室温条件下孵育1h，置于磁铁上2min，吸弃上清液后用100μL 0.1％BSA PBS三次，重悬在20μL的PBS中。
(2)电镜样品制作同第一部分2.2.2。
2.2.8流式细胞技术验证功能化磁珠捕获GPC-1(+)外泌体的CD63表达量
(1)取2×105个制备的GPC-1功能化磁珠，加入0.1％BSA PBS缓冲液200μL，充分混匀后置于磁铁上弃去上清液，重悬于90μL缓冲液中。
(2)洗涤好的磁珠与10μL浓度为1×108个/μL的MDA-MB-231外泌体在混匀器上室温孵育20h。
(3)用缓冲液洗涤磁珠三次，除去游离外泌体，将其重悬于100μL缓冲液中，加入10μL CD63-FITC抗体，避光孵育45min。
(4)将样本放置于磁铁上2min，弃去上清液，加入缓冲液洗涤三次，除去未结合的荧光抗体。
(5)用流式细胞仪测量样本荧光值。
2.2.9非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳验证“Y”字形DNA纳米结构形成
(1)器材准备
①反复清洗所需的厚玻璃板(1mm边条)、短玻璃板、制胶梳、制胶支架和制胶框，然后用去离子水冲洗干净，将所需用具晾干。
②将洁净的玻璃板对齐后插入垂直的制胶框的凹槽中，注意箭头朝上，两侧用夹子夹紧固定，底部调节确保下端平齐，并将制胶框固定在制胶支架上。
③向厚玻璃板和短玻璃板之间缝隙内注满去离子水，观察10min进行测漏，保证配胶体系不漏液后再制胶。
④倾斜将制胶框内水倒出，并用滤纸在制胶框各角充分吸除残余水，备用。
(2)试剂配制
①5×TBE缓冲液：用电子分析天平称取54g Tris-base，27.5g硼酸，4.65g EDTA，加入 500mL去离子水，并用玻璃棒搅拌至溶液完全溶解，再定容至1L，常温储存。0.5×TBE缓冲液：量筒准确量取50mL的5×TBE缓冲液，并加入450mL去离子水稀释，并于使用前充分摇匀。
②10％的AP：用电子分析天平称取1g过硫酸铵粉末，加入5mL去离子水溶解，并用玻璃棒搅拌至溶液完全溶解，再定容至10mL，置于4℃保存。
③NaCl溶液(1M)：用电子分析天平称取58.44g NaCl粉末，加入500mL去离子水，并用玻璃棒搅拌至溶液完全溶解，再定容至1L，常温储存。
④3×核酸染色液：取45mL去离子水，5mL 1M NaCl溶液，并加入15μL的4S RedPlus 核酸染色剂(10 000×)，充分混匀后置于4℃避光保存。使用前需将其平衡至室温，此核酸染色液可回收，重复使用3次。
(3)制备凝胶
根据“Y”字形DNA纳米结构反应底物和产物条带大小，选用12％的胶，具体组成成分如表 5：
表5 PAGE凝胶的制备配方(12％Gel)
Figure BDA0002025954900000181
Figure BDA0002025954900000191
(4)注胶
将(3)中凝胶溶液按体积配置好后，充分混匀，迅速用加样枪将配制好的凝胶溶液沿厚玻璃板和短玻璃板之间的缝隙缓慢注满，加入过程中避免气泡的产生。然后，贴着厚玻璃棒，轻轻将制胶梳插入两块玻璃板的缝隙间的凝胶溶液内，小心操作，避免产生气泡，如有气泡需排除干净。再将制胶架放置于37℃水浴箱20～40min至溶液凝固。待凝胶凝固完全后，小心垂直向上拔出制胶梳，将凝固的胶随玻璃板置于0.5×TBE缓冲液中保存备用。
(5)上样
按照短玻璃板朝内的方向，将两块凝固的胶随玻璃板小心卡在电极芯上，再将电极芯按照对应的电极固定于电泳槽上，往两块胶之间(内槽)充满0.5×TBE缓冲液，以与厚玻璃板上边缘平齐为宜。按5:1的体积比例，将产物与6×loading buffer充分混匀，小心加入样品孔内，上样总体积约为6μL，并在每块胶中留一个样品孔加入5μL的20bp DNA laddermarker。
(6)电泳
根据所用电极芯的数量，往电泳槽外槽灌入0.5×TBE缓冲溶液至相应刻度线位置。接上电极，打开电源，将电压调至150V，电泳时间约30min，以指示带泳动至全胶2/3位置为宜。电泳至所需位置后，切断电源，回收缓冲液，卸下并揭开玻璃板，小心取出凝胶，用去离子水冲洗干净。电泳缓冲液可回收，且仅适用于作为外槽缓冲液，不可再次用为内槽缓冲液。
(7)核酸染色
将稀释好的3×4S Red Plus核酸染色剂倒入干净的容器中，放入凝胶，用铝箔纸盖住容器使染色剂避光，置于摇床上，60rpm混匀，染色时间约为30min。
(8)显像
将凝胶放置于紫外凝胶成像系统中，打开“TRANS UVI”，选择“Gel Doc XR”扫描器，并采用“Auto Exposure”模式，核酸条带显示清晰时，点击“Freeze”冻结图像，并将结果进行保存及导出。
2.2.10基于磁性分离和DNA自组装的外泌体纳米荧光传感技术可行性验证实验
(1)取2μL浓度为1×105个/μL制备的GPC-1功能化磁珠与10μL浓度为1×108个/μL的MDA-MB-231外泌体，室温条件下孵育1h，置于磁铁上2min，吸弃上清液后用100μL 0.1％BSA PBS洗涤三次，重悬在100μL的PBS中。
(2)加入10μM CD63aptamer-ssDNA 6μL，在室温下孵育30min，然后置于磁铁上2min，吸弃上清液后用100μL 0.1％BSA PBS洗涤三次，重悬在36.5μL的NE buffer中，NEbuffer 购自美国纽英伦生物技术公司NEB New England Biolabs，试剂货号#M0206V，1XBE buffer 成分为：10mM Bis Tris丙烷-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT(pH 7.0@25℃)。
(3)加入10μM H1、H2、H3各6μL，并在室温下孵育45min，后加入浓度为10Unit/μL外切酶Ⅲ，酶切30min后，立即加入3.2nM TPE-TA溶液，避光反应10min，再加入32μg/mL GO充分混匀，1min后进行荧光检测。
表6反应试剂(捕获外泌体)
Figure BDA0002025954900000201
表7反应试剂(信号检测)
Figure BDA0002025954900000202
2.2.11荧光信号响应值检测
打开荧光分光光度计及软件后，在“Application”菜单中选择“Status”，观察仪器状态(包括光源、光路系统、样品池和信号检测)。在仪器处于正确状态的情况下，选择“Validation”，采用配套的皿装满去离子水，对仪器状态进行确认。先用95％酒精将直径为300mm的检测皿清洗干净，再用去离子水反复清洗三次后用氮气吹干。设置荧光信号响应值检测条件：扫描波长范围为370nm-650nm，激发光为350nm，激发光和发射光狭缝为10nm，扫描速度为700nm/min，分析最强发射光480nm处的荧光强度。在此条件下，检测60μL去离子水，扫描范围内荧光强度均小于1时，方可进行标本检测；反之，继续清洗直至检测皿合格为止。
2.2.12条件影响试验
依次对TPE-TA浓度、GO浓度、反应时间、反应温度、Trigger浓度和探针浓度条件进行研究。用本方法依次检测TPE-TA反应浓度分别为1.6nM、3.2nM、4.8nM、6.4nM、9.6nM 条件下的荧光信号响应值；GO反应浓度分别为0μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、 48μg/mL、64μg/mL条件下的荧光信号响应值；反应时间分别为10min、20min、30min、 40min、50min的荧光响应值信噪比；反应温度分别为25℃、37℃、42℃的荧光响应值信噪比；Trigger浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1μM和1.5μM的荧光响应值信噪比；探针浓度分别为1μM、2μM、3μM、4μM和5μM的荧光响应值信噪比，寻找各参数的最佳反应条件。
2.2.13特异性分析
收集乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞培养上清，超高速离心法提取外泌体，用同样方法提取的乳腺癌细胞系MDA-MB-231、宫颈癌细胞系Hela、肝癌细胞系SMMC-7721、前列腺癌细胞系LNCap、肺癌细胞系H1299和A549细胞培养上清来源外泌体作为对照组，用NanoSight观察其粒径分布，将浓度统一至1×108个/μL进行检测。用基于磁性分离和DNA自组装的外泌体纳米荧光传感方法对以上五种外泌体样品进行检测，记录每组的荧光信号响应值，计算出荧光响应值信噪比，对每种外泌体样品重复检测三次，并对本方法的检测特异性进行评价。
2.2.14灵敏度、线性检测范围分析
在研究得出的最佳实验条件下，分别向基于磁性分离和DNA自组装的外泌体纳米荧光传感检测体系中加入3ul不同浓度的MDA-MB-231细胞来源外泌体进行反应，反应结束后用荧光分光光度计检测荧光信号响应值，计算出荧光响应值信噪比。对每个浓度的外泌体样品重复检测三次，记录检测结果，并计算分析得出检测乳腺癌腺癌MDA-MB-231细胞来源 GPC-1(+)外泌体亚群的线性范围和检测下限，以探索出该方法的检测灵敏度。
2.2.15临床标本检测能力评估
在南方医科大学南方医院检验科收集26例乳腺癌患者以及7例健康人血浆标本，取500 μL血浆标本，经10,000g离心10min预处理后，取80μL上清液与2μL浓度为1×105个/μL 的GPC-1功能化磁珠混匀，捕获GPC-1(+)外泌体进行后续试验，在最优反应条件下，用本纳米荧光传感检测方法对乳腺癌患者组与健康人组血浆来源外泌体进行荧光检测，本实验重复进行三次，用以评价基于磁性分离和DNA自组装外泌体纳米荧光传感检测技术临床标本检测能力。
2.3结果分析
1)TEM、NanoSight和Western Blot鉴定超高速离心法提纯细胞上清液中的外泌体
基于本课题组之前的研究，本课题采用超高速离心来提纯乳腺癌细胞系MDA-MB-231 细胞系来源的外泌体。如图2a所示，TEM图像显示经超高速离心提取的外泌体具有完整的膜性脂质双分子层的结构，并且直径在100nm左右，与之前报道的相符；接着本研究又利用 NanoSight分析样品中的外泌体粒径分布与浓度，如图2b显示，外泌体的平均粒径为104.2±3.9 nm，与TEM的结果相符，浓度为6.39×108±4.90×106particles/mL；利用Western blot检测外泌体样本中标志性蛋白CD63与具有乳腺癌诊断价值的检测性蛋白GPC-1的表达情况如图2c，选取提取的MDA-MB-231细胞蛋白作为阳性对照，基于BCA蛋白定量法使得每个样品孔上样量为20μg，我们可以看到MDA-MB-231乳腺癌细胞系来源的外泌体均表达这两种蛋白，为接下来的研究提供了实验依据。
2)超分辨显微镜成像验证CD63和GPC-1在乳腺癌MDA-MB-231细胞系来源外泌体膜上的表达
本课题设计需要用到功能化磁珠捕获样品中的外泌体，因此所选的外泌体蛋白必须为膜蛋白，最近，已有研究报道了CD63与GPC-1为膜蛋白，为进一步证实这一结论，在本课题中，将利用超分辨成像技术表征CD63和GPC-1与外泌体膜的共定位，从而验证CD63和GPC-1在外泌体膜上的表达。如图3(a)、图3(d)所示，绿色荧光基团为经过PKH67处理的外泌体，PHK67可以与外泌体的脂质双分子层膜结合，图中显示(绿色基团)直径在100nm 左右，符合报道的外泌体的直径大小，图3(b)和图3(e)分别用红色荧光染料Alexa Fluor 647对外泌体膜蛋白CD63和GPC-1进行处理，图3(c)和图3(f)是将外泌体膜通道与外泌体膜蛋白通道融合所产生的结果，外泌体膜与外泌体膜蛋白(绿色荧光与红色荧光)的共定位证实了CD63与GPC-1在MDA-MB-231乳腺癌细胞系来源的外泌体膜上的表达。
3)透射电子显微镜验证功能化磁珠捕获GPC-1(+)外泌体的效果
本研究中，为了实现外泌体的快速简便分离，我们首先制备偶联GPC-1抗体的功能化磁珠，然后利用功能化的GPC-1磁珠捕获样本中的GPC-1(+)外泌体，然后利用透射电子显微镜表征磁珠上的外泌体，如图4(a)和(b)是该部分实验的空白对照组，利用PBS溶液代替样本中的外泌体，因此，仅显示单个功能化的GPC-1磁珠在透射电子显微镜下的整体图和局部图，而图4(c)和图4(d)为实验组，是GPC-1(+)外泌体的功能化磁珠在透射电子显微镜下的整体图和局部图，箭头所示是直径为100nm左右的囊泡样结构，即样品中的GPC-1(+) 外泌体。
4)流式细胞技术验证功能化磁珠捕获GPC-1(+)外泌体的CD63表达量
在本实验中，我们用功能化的GPC-1磁珠作为捕获外泌体的载体，成功将MDA-MB-231 细胞分泌的GPC-1(+)外泌体富集，同时加入外泌体膜蛋白CD63的荧光抗体，将外泌体标记成绿色，使用流式细胞仪进行荧光强度检测。同时，以PBS溶液代替荧光抗体孵育磁珠捕获 MDA-MB-231外泌体作为阴性对照组。
从图5中可以看出，加入了MDA-MB-231外泌体和CD63-FITC荧光抗体的实验组平均荧光值比单独加入MDA-MB-231外泌体的对照组要高，从而证明了MDA-MB-231外泌体膜上同时具有GPC-1蛋白和CD63蛋白。由于GPC-1抗体的特异性，仅GPC-1(+)外泌体才能被功能化磁珠识别并捕获，而洗涤过程能很好地将游离的外泌体与杂质成分去除，保证样本的纯度，避免了CD63-FITC荧光抗体的非特异性吸附。加入CD63-FITC荧光抗体后，能与 Beads-exosomes复合物形成“夹心”结构Beads-exosomes-CD63-FITC，在流式细胞仪上呈现出高荧光值的结果。该实验的数据也验证了本发明“基于磁性分离和DNA纳米技术的外泌体纳米荧光传感技术”设计的可行性。
5)非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳验证“Y”字形DNA纳米结构形成
通过12％PAGE对“Y”字形DNA纳米结构反应过程表征(图6)可知，泳道(2)(3)(4)分别是茎环状DNA探针H1、H2和H3；泳道(5)是H1/H2/H3的混合物，因缺少Trigger，DNA纳米结构不能(或较少)形成，H1、H2和H3的条带仍然存在；泳道(6)是加入外切酶Ⅲ的H1/H2/H3 混合物，基本看不到任何DNA条带，证明外切酶Ⅲ可以将未反应生成“Y”字形DNA纳米结构的探针完全酶切；泳道(7)是加入Trigger的H1/H2/H3混合物，因Trigger的存在，生成大量的“Y”字形DNA纳米结构，但是由于基于“Toehold”的CHA探针并未消耗殆尽，部分剩余探针生成了中间分子量的非特异性反应条带；泳道(8)是在泳道(7)的反应物中加入了外切酶Ⅲ，由于高效的酶切作用，剩余探针与非特异性反应条带完全消失。由此可证明“Y”字形DNA纳米结构可以有效生成，并且外切酶Ⅲ可完全酶切未反应的底物探针及非特异性反应序列，而“Y”字形DNA纳米结构不被破坏，此特性可用于乳腺癌外泌体液相生物传感检测信号的放大，以实现不同标本甚至极低丰度乳腺癌外泌体的灵敏检测。
6)基于磁性分离和DNA自组装的外泌体纳米荧光传感技术的检测原理及可行性验证
在功能化磁珠捕获GPC-1(+)外泌体和“Y”字形DNA纳米结构形成过程均得到验证之后，我们对本方法的荧光检测效果进行了初步验证，依照检测示意图对乳腺癌MDA-MB-231细胞系来源外泌体和空白对照进行荧光检测。从荧光检测图7可以看出，不加乳腺癌MDA-MB-231 细胞系来源外泌体的PBS溶液空白对照组(d)的响应值极弱；当溶液中加入低浓度(c)、中浓度(b)和高浓度(a)外泌体时，GPC-1(+)外泌体被功能化磁珠捕获，由于捕获的GPC-1(+) 外泌体膜上表达有CD63蛋白，其可与含有CD63aptamer的Trigger结合进而引发H1/H2/H3 的自组装反应，生成大量游离的“Y”字形DNA纳米结构，这种大分子量的DNA纳米结构上可以聚集大量的TPE-TA分子，同时挣脱GO的吸附作用，抵抗外切酶Ⅲ的酶切作用，在外切酶Ⅲ与TPE-TA/GO组成的免标记“Turn-on”型荧光报告系统中，发出荧光信号，且该信号随着乳腺癌MDA-MB-231细胞系来源外泌体加入量的变化而变化。且不同浓度GPC-1(+)外泌体可被功能化磁珠有效捕获进行后续反应并生成不同浓度的“Y”字形DNA纳米结构，在TPE-TA/GO免标记“Turn-on”型荧光报告系统中，发射出不同强度的荧光，可实现对乳腺癌来源GPC-1(+)外泌体的定量检测，与对照组相比荧光响应值信噪比(S/N)可高达10倍以上。
综合TEM表征结果、PAGE电泳结果及荧光响应情况初步证实基于磁性分离和DNA自组装的外泌体纳米荧光传感技术的可行性，并能通过荧光信号进行GPC-1(+)外泌体的定量分析。
7)最适反应条件研究试验
本实验涉及的重要反应条件主要包括Trigger浓度、探针浓度、TPE-TA浓度、GO浓度、反应时间、反应温度和酶切反应条件等。对此，我们设计了一系列试验以观察该方法在不同反应条件下的检测效果，以摸索能达到最佳检测性能的最适反应条件。
本实验中我们利用连接ssDNA的CD63aptamer作为Trigger启动改良的CHA反应生成大量的“Y”字形DNA纳米结构，从而对CD63aptamer识别GPC-1(+)外泌体的信号进行放大。为探讨Trigger最佳反应浓度，在其他反应条件不变的情况下，观察一系列不同Trigger反应浓度(0.2μM，0.4μM，0.6μM，0.8μM，1μM，1.5μM)对荧光响应值的影响。如图8(a) 所示，随着Trigger浓度的不断增加，结合GPC-1(+)外泌体膜上CD63的Trigger数量随之增加，进而启动茎环状探针自组装反应生成更多“Y”字形DNA纳米结构，所以荧光响应值不断增加。当Trigger浓度为1μM时，荧光响应值达到最大值。说明磁珠捕获的GPC-1(+)外泌体数量有限，当Trigger浓度大于1μM时，GPC-1(+)外泌体膜上CD63结合位点已饱和，本方法的荧光响应值已不能因为Trigger浓度的增加而增加。因此，选择1μM为Trigger最佳反应浓度。
茎环状DNA探针H1、H2、H3作为改良CHA的反应产物用于生成大量的“Y”字形DNA 纳米结构，并以此对CD63aptamer识别GPC-1(+)外泌体的信号进行放大。为探讨探针最佳反应浓度，实验设置空白对照组(未加入外泌体)和实验组(加入108个乳腺癌外泌体)，在其他反应条件不变的情况下，观察一系列不同探针反应浓度(1μM，2μM，3μM，4μM和 5μM)对两组荧光响应值及信噪比的影响。如图8(b)所示，随着探针反应浓度的逐渐增加，对照组和实验组的荧光响应值均增加，这是由于随着加入探针浓度不断增加，实验组三条茎环状DNA探针的自组装反应速度不断增加，离开GO表面的“Y”字形DNA纳米结构也增多。但是因为对照组三条茎环状DNA探针的非特异性反应也随之增加，逐渐超出了外切酶Ⅲ的酶切能力，导致荧光响应值信噪比却不断下降，而荧光响应值信噪比是实验组与对照组荧光响应值之比，反映本方法区别靶外泌体存在与否的能力。因此，选择1μM为探针的最佳反应浓度。
AIE纳米分子TPE-TA作为荧光信号基团，其反应浓度直接影响本纳米荧光生物传感器的荧光响应值信噪比。为探讨TPE-TA最佳反应浓度，实验设置空白对照组(未加入外泌体) 和实验组(加入108个乳腺癌外泌体)，在其他反应条件不变的情况下，观察一系列不同TPE-TA 反应浓度(1.6nM,3.2nM,4.8nM,6.4nM,9.6nM)对两组荧光响应值及信噪比的影响。如图 9(a)所示，随着TPE-TA浓度增加，对照组和实验组的荧光响应值均增加，这是由于TPE-TA 分子具有多重正电荷，可通过静电吸引力与溶液中aptamer结合后发出高强度荧光，其他条件不变的情况下，荧光响应值与溶液中离开GO表面的游离“Y”字形DNA纳米结构上结合的 TPE-TA分子数量成正比，因此对照组和实验组的荧光响应值随着TPE-TA的浓度升高而升高，但当TPE-TA浓度为3.2nM时，荧光响应值信噪比达到最大值。说明当TPE-TA浓度大于3.2 nM，虽然实验组荧光响应值仍然随着TPE-TA的浓度升高而增加，但因为对照组溶液中游离的核酸探针上TPE-TA聚集更多，且高浓度TPE-TA可能导致过量TPE-TA在溶液中团聚而发光，导致背景信号增加更明显，反而使荧光响应值信噪比下降。因此，选择3.2nM为TPE-TA 最佳反应浓度。
GO作为荧光猝灭基团，在本实验中的反应浓度也直接影响本纳米荧光生物传感器的荧光响应值信噪比。为探讨反应最佳GO浓度，实验设置空白对照(未加入外泌体)和实验组 (加入108个乳腺癌外泌体)，在其他反应条件不变的情况下，观察一系列不同GO反应浓度 (0μg/mL,8μg/mL,16μg/mL,32μg/mL,48μg/mL,64μg/mL)对荧光响应值及信噪比的影响。如图9(b)所示，随着GO浓度增加，对照组和实验组的荧光响应值均降低，这是由于GO 对各种荧光团均有非常高的猝灭能力，其他条件不变的情况下，荧光响应值与溶液中GO浓度成反比，因此对照组和实验组的荧光响应值随着GO的浓度升高而降低；但当GO浓度为 32μg/mL时，荧光响应值信噪比达到最大值，说明当GO浓度大于32μg/mL时，虽然实验组荧光响应值仍然随着GO的浓度升高而减小，但对照组GO的猝灭能力已不能随浓度而增加，导致背景信号不能继续减小，反而使荧光响应值信噪比下降。因此，选择32μg/mL为GO最佳反应浓度可进一步降低背景信号并提高测定的灵敏度。
最佳反应时间不仅能够使检测方法对靶标作出有效的应答，最大程度地提升方法的灵敏度，并且能最大程度缩短检测时间。为考察不同反应时间对反应结果的影响，实验设置空白对照(未加入靶外泌体)和实验组(加入108个靶外泌体)，在其他反应条件不变的情况下，观察一系列不同反应时间(10min,15min,20min,30min,45min,60min,75min)对荧光响应值及信噪比的影响。如图10(a)所示，当反应时间为30min时，荧光响应值达到最大值。之后，随着反应时间增加，荧光响应值不升反降，这可能与外泌体在溶液中反应时间过长导致外泌体破坏，内容物释放有关。因此，选择30min作为本方法的最佳反应时间既可保证荧光响应值最大化，又可提高检测效率，实现GPC-1(+)外泌体亚群的快速灵敏检测。
温度可以改变探针的结构、及反应速率，进而对反应的灵敏度和特异性均带来影响。为探究不同反应温度对反应结果的影响，实验设置空白对照(未加入靶外泌体)和实验组(加入108个靶外泌体)，在其他反应条件不变的情况下，观察一系列不同温度(25℃,37℃,42℃) 对荧光响应值及信噪比的影响。如图10(b)所示，当反应时间为37℃时，荧光响应值信噪比达到最大值，这一结果可以表明：在温度过低的环境下，因能量不足而仅有少量的发夹结构被打开形成“Y”字形DNA纳米结构较少；在高温环境时，发夹结构探针容易形成多种不稳定的二级结构，这容易使反应形成大量的非特异产物，影响“Y”字形DNA纳米结构形成。因此，该肿瘤外泌体检测方法的最佳反应温度确定为37℃。
核酸外切酶Ⅲ作为荧光信号的保护剂，可对未反应的DNA原料进行酶切处理，降低背景信号，保护目标信号免受未反应底物的影响。为了提高荧光检测信噪比，本实验中的核酸外切酶Ⅲ要保持过量。为了探讨过量的核酸外切酶Ⅲ是否会对荧光基团TPE-TA的信号造成影响，我们比较纯TPE-TA溶液与加入过量外切酶Ⅲ(0Unit，30Unit，40Unit和50Unit) 的TPE-TA溶液荧光响应值。结果如图11(a)显示，在TPE-TA溶液中分别加入不同单位的外切酶Ⅲ对荧光信号无明显影响。
为探讨核酸外切酶Ⅲ最优酶切时间，实验设置空白对照(未加入外泌体)和实验组(加入108个乳腺癌外泌体)，在其他反应条件不变的情况下，分别观察不同酶切时间(10min,20 min,30min,40min)对荧光响应值及信噪比的影响。如图11(b)所示，随着酶切时间不断增加，荧光响应值信噪比不断增加。但是为了缩短检测时间，提高检测效率，我们选择30min 作为最优酶切时间。
8)特异性试验
在本研究中，对外泌体亚群的分析检测是基于GPC-1抗体和CD63aptamer组成的“三明治”结构对GPC-1(+)外泌体的特异性识别，因此，本方法具有优异的特异性。为了评价本纳米荧光传感技术对乳腺癌GPC-1(+)外泌体亚群检测的特异性，在最优反应条件下，我们用本检测方法对MDA-MB-231exo进行荧光检测，同时记录宫颈癌细胞外泌体(Helaexo)、肝癌细胞外泌体(SMMC-7721exo)、前列腺癌细胞外泌体(LNCapexo)系、肺癌细胞外泌体(H1299 exo和A549exo)五个对照组的荧光响应值信噪比，本实验重复进行三次，用以评价该检测方法对GPC-1(+)外泌体检测的特异性(图12)。在实验之前，使用NTA测得Helaexo,SMMC-7721exo,LNCapexo,H1299exo和A549exo的浓度分别为3.66×108,2.22×108,4.22×108, 2.86×108,1.08×108particles/μL。适当稀释后，使得每个样品中的外泌体浓度为1×108 particles/μL。研究结果显示四组对照组荧光检测响应值信噪比在1左右，而MDA-MB-231exo 外泌体荧光检测响应值信噪比接近10，显著高于另外五组荧光检测信号。该结果证明，基于纳米荧光传感技术建立的外泌体亚群检测方法能够有效区分乳腺癌MDA-MB-231细胞来源 GPC-1(+)外泌体亚群与其他肿瘤细胞来源外泌体，具备良好的特异性。
9)灵敏度试验
为评估该基于纳米荧光传感技术建立的检测方法对于乳腺癌细胞来源的GPC-1(+)外泌体亚群检测的灵敏度，我们用该方法对一系列不同浓度的乳腺癌MDA-MB-231细胞来源 GPC-1(+)外泌体亚群数量进行检测。我们将乳腺癌细胞来源的外泌体进行梯度稀释(3.9×109， 2.34×109，7.8×108，1.56×107，7.8×105，3.12×105，1.56×105，7.8×104particles/μL)，在最佳反应条件下，以该检测方法对以上不同浓度的外泌体标本进行荧光检测，本实验重复进行三次。从所采集的荧光光谱图中可以看出，随着外泌体浓度的增加，最强发射光处所采集到的荧光强度相应增强(图13)，图13(a)中，曲线从下往上，对应的浓度逐渐升高，即在此范围内采集到的荧光强度与外泌体数量呈正相关。根据荧光光谱图13(a)，将各实验组在480nm处采集的荧光信号进行统计分析及线性拟合得到图13(b)：在外泌体浓度为7.8×104-3.9×109/μL 范围内，荧光强度与外泌体数量成正比；通过线性拟合可得到该方法进行乳腺癌MDA-MB-231细胞来源GPC-1(+)外泌体亚群检测的数学模型，其线性方程为 y＝140.592×ln(1.847×ln(x))(y为荧光强度，x为GPC-1(+)外泌体的浓度)，相关系数为0.997；根据空白信号加上3倍标准差所对应的信号值估计检出限，计算得到该方法的最低检测限为 6.56×104particles/μL。
10)临床检测性能评估
在检测方法构建以及方法性能评价试验中，我们使用的外泌体标本均来自于细胞培养上清液，为了进一步验证所构建方法是否具有分析可行性和临床应用潜力，我们在临床上收集了26例乳腺癌患者以及7例健康人血浆标本，取500μL血浆标本，经10,000g离心10min 预处理后，取80μL上清液与2μL浓度为1×105个/μL的GPC-1功能化磁珠混匀，用PBS缓冲液稀释至300μL，捕获GPC-1(+)外泌体进行后续试验，在最优反应条件下，用本纳米荧光传感检测方法对乳腺癌患者组与健康人组血浆来源外泌体进行荧光检测，本实验重复进行三次，用以评价基于磁性分离和DNA自组装外泌体纳米荧光传感检测技术临床标本检测能力。结果显示如图14，根据该检测方法在乳腺癌病人组与健康人组血浆来源外泌体的检测荧光强度对比结果可知乳腺癌患者的GPC-1(+)外泌体浓度显著高于健康人。因此，本实验不仅证实了人体血浆来源外泌体上GPC-1可以作为鉴别健康受试者和乳腺癌患者的生物标志物，而且进一步证明我们的方法只需对临床血浆标本进行简单预处理，即可直接捕获并检测血浆中乳腺癌GPC-1(+)外泌体亚群，避免基质效应的影响，具有良好的抗干扰能力和临床应用价值。
本发明以偶联GPC-1抗体的功能化磁珠作为GPC-1(+)外泌体亚群分离和生物传感检测微载体的基础上，利用GPC-1抗体和CD63aptamer组成的“三明治”结构特异性识别GPC-1(+) 外泌体亚群，并将该识别系统信号通过连接ssDNA的CD63aptamer抗体转换成DNA纳米结构形成信号，通过构建“Y”字形DNA自组装纳米结构放大系统和TPE-TA/GO免标记“Turn-on”型荧光报告系统增加分析灵敏度，构建基于磁性分离和DNA自组装的外泌体纳米荧光传感技术，以实现乳腺癌GPC-1(+)外泌体亚群的定量检测。
实验结果证实了偶联GPC-1抗体的功能化磁珠作为GPC-1(+)外泌体亚群分离微载体、 DNA自组装纳米结构放大系统和TPE-TA/GO免标记“Turn-on”型荧光报告系统的可行性，在加入不同浓度的乳腺癌MDA-MB-231细胞来源外泌体后，该纳米荧光生物传感检测方法可生成不同浓度的“Y”字形DNA纳米结构，在TPE-TA/GO免标记“Turn-on”型荧光报告系统中，发射出不同强度的荧光，可实现对乳腺癌来源GPC-1(+)外泌体的定量检测，与对照组相比荧光响应值信噪比(S/N)可高达10倍以上。
基于此，我们对本方法检测过程中涉及的重要反应条件主要包括Trigger浓度、探针浓度、 TPE-TA浓度、GO浓度、反应时间、反应温度和酶切反应条件进行研究。对此，我们设计了一系列试验以观察该方法在不同反应条件下的检测效果，以摸索能达到最佳检测性能的最适反应条件。根据实验结果分析可以看出，Trigger浓度和探针最佳反应浓度均为1μM，在37℃的温和反应条件下，通过30min的反应后，加入30Unit酶切30min，在TPE-TA最佳反应浓度3.2nM，荧光猝灭基团GO最佳反应浓度32μg/mL条件下，荧光信号即可到达最大值，这一反应虽然步骤较繁琐，但可以免去长达数小时的多次超高速离心外泌体样品分离富集过程，并且可以在便携式恒温仪上完成，有应用于真实临床标本床旁检测的潜力。
进一步，我们对该乳腺癌GPC-1(+)外泌体亚群的定量检测方法进行了初步的方法学评价。首先，我们在最佳反应条件下用本方法对一系列不同浓度的乳腺癌MDA-MB-231细胞来源外泌体进行检测，并分析最强发射光480nm处的荧光强度，以评估基于纳米荧光传感技术建立的检测方法对于乳腺癌细胞来源的GPC-1(+)外泌体亚群检测的线性范围及灵敏度。结果显示，该方法的荧光信号与乳腺癌MDA-MB-231细胞来源外泌体浓度呈正相关，其线性检测范围为 7.8×104-3.9×109/μL，检测下限可达到6.56×104个外泌体/μL，检测范围宽，且该检测下限相较于其他基于核酸适体建立的外泌体检测技术的灵敏度有明显的提升，具有明显的优势。
综上，我们通过偶联GPC-1抗体的功能化磁珠作为GPC-1(+)外泌体亚群分离和生物传感检测微载体的基础上，利用GPC-1抗体和CD63aptamer组成的“三明治”结构特异性识别 GPC-1(+)外泌体亚群，并将该识别系统信号通过连接ssDNA的CD63aptamer抗体转换成DNA纳米结构形成信号，通过构建“Y”字形DNA自组装纳米结构放大系统和TPE-TA/GO免标记“Turn-on”型荧光报告系统增加分析灵敏度，构建基于磁性分离和DNA自组装的外泌体纳米荧光传感技术，实现了乳腺癌GPC-1(+)外泌体亚群的定量检测。在此基础上，研究主要反应条件，对方法的检测性能进行评价，包括特异性、灵敏度、检测范围等，最后通过对临床血浆来源标本中的乳腺癌GPC-1(+)外泌体亚型进行检测以评估该方法的临床应用价值，旨为构建免超离、高敏的乳腺癌液体活检新方法提供实验基础与理论依据。该方法具有普适性，可运用于其它已筛出特异核酸适体的生物标志物。针对不同生物标志物，合成含有不同核酸适配体序列的Trigger，即可用于其它外泌体亚型、蛋白、细胞和金属离子等的检测。同时，该方法全程在恒温液相体系中进行，适合液体微流控芯片平台，有望通过制作对应的微流控芯片构建微型检测体系，开发快速简便高效的POCT检测试剂盒，实现肿瘤外泌体的真正意义上的临床快速检测。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 基于磁性分离和DNA自组装的肿瘤外泌体纳米荧光传感器
<130> PCQNF193199
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD63 aptamer-ssDNA
<400> 1
caccccacct cgctcccgtg acactaatgc tagcactact ccctaacatc tcaagc 56
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> H1
<400> 2
gcttgagatg ttagggagta gtgctccaat cacaacgcac tactccctaa catc 54
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> H2
<400> 3
agggagtagt gcgttgtgat tggaaagatc tcaagctcca atcacaacgc acta 54
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> H3
<400> 4
gttgtgattg gagcttgaga tgttgcacta ctccctaaca tctcaagctc caat 54

Claims (8)

1.一种用于肿瘤外泌体检测的试剂盒，其特征在于：包括偶联有GPC-1抗体的功能化磁珠、触发链、三个茎环状核酸探针，所述三个茎环状核酸探针包括探针H1、H2、H3，所述探针H1含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述探针H2含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述探针H3含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述试剂盒采用聚集诱导发光分子四苯基乙烯的衍生物/氧化石墨烯免标记“开-关”型荧光报告系统；所述触发链包括用于与标志物互补结合的识别区、用于与所述三个茎环状核酸探针互补结合的触发区；所述触发区核苷酸序列为：GCACTACTCCCTAACATCTCAAGC，所述识别区核苷酸序列为：CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述氧化石墨烯厚度为0.8-1.2nm。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括缓冲液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：缓冲液包括PBS buffer。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述PBS buffer中含有0.1% BSA。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液还包括NE Buffer。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括核酸外切酶Ⅲ。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述试剂盒在制备用于诊断和/或预防和/或治疗肿瘤的药剂中的应用。
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