CN114397343B - 肿瘤标志物活性检测试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents

肿瘤标志物活性检测试剂盒、检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤标志物活性检测试剂盒、检测方法及其在检测外泌体活性中的应用，基于ECL电化学检测，通过增加发光体发光信号结合核酸适体循环放大作用，解决现有电化学发光信号弱以及外泌体检测灵敏度低的问题，实现对肿瘤标志物的高灵敏活性检测。

Description

肿瘤标志物活性检测试剂盒、检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测化学分析技术领域，特别是涉及一种肿瘤标志物活性检测试剂盒及非诊断目的的肿瘤标志物活性检测方法及其在外泌体非诊断目的检测中的应用。
背景技术
肿瘤标志物指的是存在于肿瘤细胞或者肿瘤细胞分泌产生的物质，包括外泌体、蛋白和核酸等。其中，外泌体是由细胞分泌的细胞外囊泡，直径在40-150 nm。研究表明，这种纳米尺寸的囊泡携带多种蛋白质、核酸等，在免疫反应、肿瘤生长等生理功能中发挥重要作用。因此，开发适用于外泌体及其他多种肿瘤标志物高灵敏和特异性检测的分析技术非常重要。
尽管现有技术在外泌体等肿瘤标志物检测方面已经取得了很大进展，但高灵敏度和高特异性地测定肿瘤外泌体仍然是一个挑战。目前，已发展多种技术用于外泌体的检测，包括蛋白印迹、流式细胞术、酶联免疫、荧光和表面等离子体共振等等，但是，这些技术需要昂贵的仪器、费时费力，而且需要大量的样本以及特定的抗体，尤其是荧光技术需要在外泌体表面有足够的标记物才能检测到。
电致化学发光（ECL）免疫传感器是电化学传感器中重要组成部分，它以荧光探针标记抗体或者抗原，通过传感元件将荧光探针的光信号转换为电信号，从而对待检物进行定量。ECL免疫传感器具有选择性好、灵敏度高、成本低，所需设备相对简单，适合联机化，容易微型化等优点，目前已经成功应用在医学、环境和食品安全检测等多领域，成为各种生物活性物质快速检测的研究热点和发展前沿，具有广阔而良好的应用前景。
中国发明专利申请CN104655616A公开了一种用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用,该发明中是将氧化石墨烯-磁珠-适配体-电化学发光体复合物滴涂在玻碳电极上，通过适配体与肿瘤标志物MUC1之间的特异性结合将MUC1捕获在电极上，由于MUC1是生物大分子会阻碍电子传递进而引起信号的下降，基于此，实现MUC1的检测。该方法操作简单，但仅依据蛋白质分子引起的阻碍电子传递效应产生发光信号变化，灵敏度有待提高。
中国发明专利申请CN112129819B公开了肿瘤标志物检测的特异性电化学传感器的构建方法及其应用。该发明是利用光照对Ru纳米材料的电化学性能影响，并利用这个特性检测肿瘤标志物。在传感平台构建之后，需要采用波长为550-650 nm的光源对电极进行照射，照射时间为10-40 min。该发明是构建了一种电化学传感器，但检测需要借助光照辅助手段，操作繁琐，灵敏度也有待提高。
发明内容
现有肿瘤标志物检测方法存在仪器昂贵、样本量多、操作复杂以及检测灵敏度低等技术问题。为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了肿瘤标志物活性检测试剂盒、其检测方法及其在检测外泌体活性中的应用，基于电化学检测，通过增加发光体发光信号结合核酸适体循环放大作用，解决现有电化学发光信号弱以及外泌体检测灵敏度低的问题，实现对肿瘤标志物的高灵敏活性检测。
本发明所采用的技术方案是：第一个方面，本发明提供一种肿瘤标志物活性检测试剂盒，其包括：
ECL传感平台、捕获探针、双链特异性核酸酶DNS；
所述ECL传感平台由玻碳电极以及修饰在所述玻碳电极上的发光体、纳米金和信号猝灭探针构成；所述信号猝灭探针为二茂铁标记发夹结构；
所述捕获探针由第一探针和第二探针杂交互补形成，所述第一探针为包含所述核酸适配体即Aptamer的DNA序列，所述第二探针为与所述核酸适配体互补的RNA序列；所述核酸适配体用于识别所述肿瘤标志物表面蛋白，当第一探针中所述核酸适配体与所述肿瘤标志物表面蛋白特异性结合时释放所述第二探针；所述第二探针与所述发夹结构部分互补，能够诱导所述发夹结构打开；
所述双链特异性核酸酶DNS用于剪切所述第二探针与所述发夹结构所形成的双链结构中DNA部分，并释放所述第二探针。
进一步的，所述发光体可以是Ru(bpy)3 2+、鲁米诺、量子点或NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+中的任意一种，且与单独Ru(bpy)3 2+信号相比，采用NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+作为发光体的ECL信号提高了５倍，ECL信号相对标准偏差从22.3％降为4.3％，NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物具有优良的ECL性能；因此，本发明所述发光体优选为NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物。
进一步的，所述发夹结构包括：巯基官能团、二茂铁和DNA片段；巯基官能团可通过Au-S共价键作用修饰在所述纳米金上，二茂铁与所述发光体之间具有信号淬灭作用；其中，DNA片段是由三部分序列组成：两端序列可以碱基配对形成发夹型；中间序列与所述第二探针RNA通过碱基配对作用将发夹结构打开并形成双链结构。
优选的，所述纳米金直径为15 nm。
作为本发明的优选的实施方案，本发明的肿瘤标志物活性检测试剂盒包括：
第一试剂容器，该第一试剂容器包含所述ECL传感平台；
第二试剂容器，该第二试剂容器包含所述捕获探针；
第三试剂容器，该第三试剂容器包含双链特异性核酸酶和DSN buffer；
第四试剂容器，该第四试剂容器包含PBS buffer。
需要说明的是，上述检测试剂盒使用方法：向获取的肿瘤标志物样品中加入第二试剂容器中的试剂，室温条件下反应，将反应后的试剂滴在所述第一试剂容器中的ECL传感平台上，反应后采用第四试剂容器中的PBS清洗所述ECL传感平台，再放置于所述第三试剂容器中的试剂中混合，反应后取出用于ECL检测。
作为上述肿瘤标志物检测试剂盒的同一技术构思，第二方面，本发明提供一种非诊断目的的肿瘤标志物活性检测方法，包括以下步骤：
步骤S1，获取肿瘤标志物样品；
步骤S2，向所述肿瘤标志物样品中加入所述捕获探针进行反应，释放所述第二探针；
步骤S3，将步骤S2反应后的样品滴在所述ECL传感平台上反应；
步骤S4，将步骤S3反应后的ECL传感平台采用PBS清洗后，加入DSN溶液进行反应；
步骤S5，将步骤S4反应后的ECL传感平台置于含有TPrA的PBS溶液中进行电化学信号检测，采用0-1.3V循环伏安扫描模式产生ECL信号。
第三方面，本发明还提供所述检测试剂盒以及检测方法在外泌体非诊断目的检测中的应用，上述检测试剂盒或检测方法用于检测外泌体时，外泌体孵育时间优选1h，这是在保证外泌体与所述捕获探针充分反应前提下所需的最短时间；且优选的，所述第一探针序列如SEQ ID NO：1所示，第二探针序列如SEQ ID NO：2所示，所述发夹结构的DNA序列如SEQID NO：3所示。
如图1c所示，当样品中存在待识别的肿瘤标记物时，所述核酸适配体优先与所述肿瘤标记物结合，诱导第二探针RNA释放，释放的第二探针RNA将所述ECL传感平台电极界面的信号猝灭探针即发夹结构打开并形成互补的双链结构，随后采用DSN剪切双链结构中的DNA部分再次释放出第二探针RNA，释放的第二探针RNA进一步与电极界面的发夹DNA形成双链结构，以此往复循环放大发光信号，实现外泌体的高灵敏检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明构建了一种基于核酸适体诱导循环放大ECL传感平台超灵敏检测肿瘤标志物的方法，相比于如背景技术中所述现有的传感平台灵敏度更高，检测灵敏度的提高归因于多重信号放大：纳米金良好的生物相容性和催化性能进一步增强发光信号，采用DSN特异性剪切双链DNA释放cDNA开启循环放大策略；且应用于外泌体检测中，其最低检测限能够达到5 particles/μL（S/N=3）；
通过采用不同的aptamer序列构建第一探针，可以实现不同肿瘤标志物目标分子的高灵敏检测，为疾病标志物检测提供了一种通用型检测平台。
附图说明
图1a为本发明所述捕获探针的构建过程；
图1b为本发明所述ECL传感平台构建过程；
图1c为本发明所述ECL检测过程示意图；
图2为本发明具体实施方式所述制备的NiFe-LDH和NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物的SEM表征图和相应产物的元素分析图，其中，A图为所述制备的NiFe-LDH的SEM表征图，B图为NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物的SEM表征图，C图为所述制备的NiFe-LDH产物的元素分析图，D图为NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物产物的元素分析图；
图3为本发明具体实施方式所述提取的外泌体的TEM图和颗粒追踪分析表征图，其中A图为外泌体的TEM图，B图为外泌体颗粒追踪分析NTA表征图；
图4为本发明具体实施方式所述传感平台构建过程的ECL曲线表征图；
图5为本发明具体实施方式所述传感平台构建过程CV曲线表征图；
图6为本发明具体实施方式所述传感平台构建过程EIS表征图；
图7为本发明具体实施方式所述发光体制备过程中NiFe材料浓度优化ECL信号对比图；
图8为本发明具体实施方式所述发光体制备过程中Ru(bpy)3 2+的浓度优化ECL信号对比图；
图9为本发明具体实施方式所述传感平台检测外泌体孵育时间的优化ECL信号对比图；
图10为本发明具体实施方式所述不同浓度外泌体的ECL检测曲线；
图11为本发明具体实施方式所述不同浓度外泌体的ECL检测线性曲线；
图12为本发明具体实施方式所述ECL传感平台检测外泌体的特异性测试结果；
图13为本发明具体实施方式所述ECL传感平台检测外泌体的稳定性测试结果。
具体实施方式
下面结合附图，以外泌体为检测样本、采用一种较优的ECL传感平台，具体阐述本发明所述检测过程，其中涉及的试验材料及试验设备如下：
Fe(NO3)3·9H2O, Ni(NO3)2·6H2O购于上海麦克林生化公司；寡核苷酸序列由上海生工合成；Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate (Ru(bpy)3 2+)、Nafion、PDDA和MCH购于sigma；双链特异性剪切酶（DSN）和DSN buffer购于Balb.Biomart；
DSN buffer成分为：500 mM Tris-HCl，50 mM MgCl2，10 mM D,L-dithiothreitol(DTT)，pH 8.0；PBS缓冲盐溶液成分为：0.1 M Na2HPO4，0.1 M KH2PO4 and 0.1 M KCl；
高糖培养基（DMEM），胎牛血清白蛋白（FBS），青霉素/链霉素（PS）购于LifeTechnologies；15nm 纳米金购于BBI solution；
MCF-7、MCF-10A及Hela细胞购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）；电化学发光分析仪MPI-A购于西安瑞迈公司。
关于ECL传感平台的制作
如图1b所示，预先，将玻碳电极经打磨、超声、清洗得到干净的电极表面；将10 μLNiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物滴在电极上，静置，室温晾干；修饰10 μL PDDA，静置10分钟后，用PBS清洗电极，滴加10 μL 的15 nm 纳米金，静置30分钟，利用PDDA和纳米金之间的电荷吸附作用以固定纳米金；接着，将10 μL发夹结构滴在电极上，4 ℃反应12 h，利用Au-S键将二茂铁标记的发夹结构修饰在电极上，PBS清洗后，滴加10 μL巯基乙醇（MCH），静置30 min封闭电极界面的非特异结合位点后，制备获得ECL传感平台。
上述具体采用的发夹结构的DNA序列为SEQ ID NO：3所示，发夹结构具体设计如下：5′-SHCCCCCCGAGGCGCAGTCTACACCCCACCTCGCTCCCGTGACATAGACTGCG-3′Ferrocene；
分别利用ECL、CV和EIS对ECL传感平台的构建过程进行表征，图4为不同修饰过程的ECL曲线，图5为不同修饰过程的CV，图6为不同修饰过程的EIS曲线，从ECL信号变化、CV曲线电流变化和EIS阻抗值变化表明了传感平台的成功制备。
其中，如图1b所示，NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物的一种较优的制备过程如下：根据文献Highly sensitive nonenzymatic H2O2 sensor based on NiFe-layered doublehydroxides nanosheets grown on Ni foam.Surfaces and Interfaces 12 (2018) 102-107报道的方法合成NiFe-LDH，具体的本实施例采用2 mM Fe(NO3)3·9H2O、5 mM Ni(NO3)2·6H2O和2.0 mmol NH4F溶解在超纯水中并搅拌30 min；将混合液转移到反应釜中，120 ℃反应6 h；最后，离心、清洗、干燥后即得到NiFe-LDH产物；将NiFe-LDH分散在0.5 % nafion溶液中，室温搅拌1 h；离心除去上清液后，加入Ru(bpy)3 2+溶液，继续搅拌1 h，再次经离心洗涤出去上清液，便得到NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物，将其分散在PBS中置于4 ℃保存。
如图2所示，其中A图和B图分别是上述制备的NiFe-LDH和NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物的SEM表征图，从A图到B图形貌的变化表明了Ru(bpy)3 2+成功负载在NiFe-LDH上。通过能谱仪EDS分析上述制备的NiFe-LDH和NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物，如图2中的C图和D图，其中C图为NiFe-LDH的EDS分析图，从元素分析结果可以看出，主要由Ni、Fe元素组成；D图为NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物的EDS分析图，从元素分析结果可以看出，主要由Ni、Fe和Ru元素组成，进一步表明了NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物的成功制备。
关于外泌体提取
分别收集MCF-7、Hela、MCF-10A细胞培养液，经过梯度离心500g 10 min、10,000g90 min、100,000g 120 min后得到外泌体，采用不同离心力进行梯度离心的，目的是逐级去掉粒径大的囊泡和破碎细胞裂片，最后离心得到外泌体，随后将外泌体分散在PBS中保存；将所提取的外泌体进行逐级稀释，将所提取的外泌体进行表征，图3中A图为外泌体的TEM图，粒径~130 nm，颗粒追踪分析结果如图3中B图显示，外泌体粒径集中在131 nm，与TEM结果相符。
关于捕获探针构建
如图1a所示，将10 μL含有aptamer的DNA序列作为第一探针和10 μL 第二探针RNA在37 ℃反应1 h使其杂交，获得捕获探针。含有aptamer的DNA序列作为第一探针具体序列为SEQ ID NO：1：5′-CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTATTTTTT-3′，第二探针RNA的序列为SEQ ID NO：2：5′-UGUCACGGGAGCGAGGUGGGGUG-3′。
如图1c所示，外泌体活性检测过程：分别取10 μL上述提取的一系列浓度（23 ~2.3 × 106 particles/μL）外泌体样品加入到上述捕获探针溶液，37 ℃孵育1 h；由于aptamer与外泌体之间的强的特异性结合能力使得第二探针RNA释放出来，取10 μL释放的第二探针RNA溶液滴在所构建的传感平台上继续孵育，经PBS清洗后，置于0.2 U DSN溶液中（含1 × DSN buffer）在37 ℃孵育1.5 h。最后，将修饰电极置于含有10 mM TPrA的0.1 MPBS（pH 7.4）溶液中进行ECL检测。
将所制备的ECL传感平台为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为辅助电极，使用循环伏安扫描电压，电压范围为0-1.3V，扫描速度为0.5 V/s，光电倍增管高压为600 V。
为了实现更好的ECL分析性能，对复合物制备条件进行优化。首先是NiFe材料即NiFe-LDH作为载体的浓度优化，考察浓度分别为：50 μg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL如图7所示，随着NiFe材料浓度的逐渐增加，发光强度逐渐增强，在1 mg/mL时信号达到最大，表明了NiFe浓度在1 mg/mL时，负载Ru(bpy)3 2+的量达到了饱和。随后对Ru(bpy)3 2+的浓度进行优化，考察浓度分别为：0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10mg/mL。如图8所示，随着Ru(bpy)3 2+的浓度逐渐增加，其发光强度逐渐增强，在浓度为5 mg/mL时信号出现平台。因此，选择1 mg/mL NiFe和5 mg/mL Ru(bpy)3 2+的为最佳浓度。此外，还考察了修饰电极在DSN溶液中孵育时间的影响，考察时间分别为15 min、30 min、45 min、1h、1.5 h、2 h，如图9。随着赋予时间增加，发光强度逐渐增强，在1.5 h达到平台，因此，选择1.5 h作为DSN裂解双链反应的时间。不同浓度外泌体的ECL检测曲线如图10所示，随着外泌体浓度增加，ECL信号逐渐增强，表明了随着外泌体浓度的增加，更多的第二探针RNA释放出来参与到循环放大过程中，从而产生更强的ECL信号。
对不同浓度外泌体，分别为23、230、2.3× 103、2.3× 104、2.3× 105、2.3×106particles/μL进行检测，图11展示了线性关系，ECL强度与外泌体浓度在23 - 2.3 ×106 particles/μL具有良好的相关性，相关系数R2 = 0.9966，检测限为5 particles/μL（S/N=3）。
检测灵敏度的提高归因于多重信号放大：1. NiFe-LDH具有特殊的形貌结构以及优良的电催化性能，可以负载大量的发光分子Ru(bpy)3 2+有效提高发光信号；2. 纳米金良好的生物相容性和催化性能进一步增强发光信号；3. DSN特异性剪切双链DNA释放第二探针RNA开启循环放大策略。
为了评估该方法的可靠性，分别选用乳腺正常细胞MCF-10A和宫颈癌Hela细胞衍生的外泌体作为对照，结果如图12所示，与MCF-10A和宫颈癌Hela细胞相比，MCF-7细胞衍生的外泌体产生最强的ECL信号，表明MCF-7细胞衍生的外泌体表面CD 63表达量高于MCF-10A和Hela细胞。
此外，对该方法的稳定性进行了考察，如图13所示，连续扫描圈，其ECL强度的相对标准偏差为3.8%，表明了所制备的ECL传感平台具有良好的稳定性。
此外，为了考察该方法的实用性和准确性，在人血清样本中做了加标回收实验。利用pH 7.4 10 mM PBS将人血清样本稀释100倍。分别取10 μL三个不同浓度外泌体（2.3 ×103、2.3 × 104、2.3 × 105 particles/μL）加入到10 μL人血清样本中，对人血清样本中的外泌体进行检测并记录ECL信号，检测结果为：人血清样本中外泌体的回收率在92.9%-110.7%，相对标准偏差小于5.14%，表明了所构建的传感平台对于外泌体的检测具有良好的特异性和准确性。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 肿瘤标志物活性检测试剂盒、检测方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccccacct cgctcccgtg acactaatgc tatttttt 38
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ugucacggga gcgagguggg gug 23
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccccccgagg cgcagtctac accccacctc gctcccgtga catagactgc g 51

Claims (9)

1.一种肿瘤标志物活性检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括：ECL传感平台、捕获探针、双链特异性核酸酶DNS；
所述ECL传感平台由玻碳电极以及修饰在所述玻碳电极上的发光体、纳米金和信号猝灭探针构成；所述发光体为NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物；所述信号猝灭探针为二茂铁标记发夹结构；
所述捕获探针由第一探针和第二探针杂交互补形成，所述第一探针为包含核酸适配体的DNA序列，所述第二探针为与所述核酸适配体互补的RNA序列；所述核酸适配体用于识别所述肿瘤标志物表面蛋白，当第一探针中所述核酸适配体与所述肿瘤标志物表面蛋白特异性结合时释放所述第二探针；所述第二探针与所述发夹结构部分互补，能够诱导所述发夹结构打开；
所述双链特异性核酸酶用于剪切所述第二探针与所述发夹结构所形成的双链结构中DNA部分，并释放所述第二探针。
2.根据权利要求1所述的肿瘤标志物活性检测试剂盒，其特征在于：所述NiFe-LDH-Ru(bpy)3 2+复合物的制备过程具体包括：将NiFe-LDH分散在0.5 % nafion溶液中，室温搅拌；离心除去上清液后，加入Ru(bpy)32+溶液，继续搅拌，再次经离心洗涤出去上清液，便得到NiFe-LDH-Ru(bpy)32+复合物，将其分散在PBS中置于低温保存。
3.根据权利要求2所述的肿瘤标志物活性检测试剂盒，其特征在于：所述NiFe-LDH浓度为1 mg/mL ，且所述Ru(bpy)3 2+浓度为5 mg/mL。
4.根据权利要求1所述的肿瘤标志物活性检测试剂盒，其特征在于：所述发夹结构包括：巯基官能团、二茂铁和DNA片段；巯基官能团可通过Au-S共价键作用修饰在所述纳米金上，二茂铁与所述发光体之间具有信号淬灭作用；DNA片段是由三部分序列组成：两端序列可以碱基配对形成发夹型；中间序列与所述第二探针RNA通过碱基配对作用将发夹结构打开并形成双链结构。
5.根据权利要求1所述的肿瘤标志物活性检测试剂盒，其特征在于：肿瘤标志物检测试剂盒包括：
第一试剂容器，该第一试剂容器包含所述ECL传感平台；
第二试剂容器，该第二试剂容器包含所述捕获探针；
第三试剂容器，该第三试剂容器包含双链特异性核酸酶和DSN 缓冲液；
第四试剂容器，该第四试剂容器包含PBS缓冲液。
6.一种非诊断目的的肿瘤标志物检测方法，包括以下步骤：
步骤S1，获取肿瘤标志物样品；
步骤S2，向所述肿瘤标志物样品中加入权利要求1所述捕获探针进行反应，释放权利要求1所述第二探针；
步骤S3，将步骤S2反应后的样品滴在权利要求1所述ECL传感平台上反应；
步骤S4，将步骤S3反应后的ECL传感平台采用PBS清洗后，加入DSN进行反应；
步骤S5，将步骤S4反应后的ECL传感平台置于含有TPrA的PBS溶液中进行电化学信号检测，采用0-1.3V循环伏安扫描模式产生ECL信号。
7.权利要求1所述的肿瘤标志物活性检测试剂盒在外泌体非诊断目的检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述第一探针序列如SEQ ID NO：1所示，第二探针序列如SEQ ID NO：2所示，所述发夹结构序列如SEQ ID NO：3所示。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述外泌体孵育时间为1h。
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