CN104480201B - 基于类石墨相碳化氮纳米材料的荧光传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于类石墨相碳化氮纳米材料的荧光传感器的制备方法，将类石墨相碳化氮纳米材料，结合酶切循环信号放大技术，制成荧光传感器。该荧光传感器包括类石墨相碳化氮纳米片（g‑C₃N₄‑NF），Ag⁺，Nb.BsmI切刻内切酶，探针基因、靶标基因（Cerb B‑2相关基因短片段）。该荧光传感器经杂交、酶切水解、再杂交的循环过程，使得一条靶标基因即可释放出多个发夹结构探针基因上的Ag⁺，使得溶液中游离的Ag⁺量增多，导致碳化氮的荧光猝灭程度增强，荧光信号明显减弱。通过这种多次循环信号放大的技术，可实现对靶标基因的高灵敏度检测。

Description

基于类石墨相碳化氮纳米材料的荧光传感器的制备方法

技术领域

本发明属于荧光传感器的制备领域，具体涉及一种基于类石墨相碳化氮纳米材料的荧光传感器的制备方法。

背景技术

乳腺癌是全世界女性发病率最高的恶性肿瘤之一。早期诊断是提高乳腺癌治愈率的关键。到目前为止，乳腺癌诊断的基本方法主要有乳腺钼靶、乳腺B超、动态增强核磁共振等。然而以上检查方法或容易造成漏诊；或操作繁琐、耗时、设备昂贵，难以推广应用于大规模的乳腺癌普查。而作为乳腺癌诊断的金标准—基于穿刺活检的病理组织学诊断法具有创伤性，不仅使病人身体疼痛，还会引起病人因长时间等待检测报告所产生的焦虑和恐惧。因此，研究一种更准确、灵敏、经济、简便、更人性化的无创检测新技术，并将其用于临床乳腺癌的早期诊断无疑具有重要的意义。肿瘤标志物在正常组织或良性疾病中不产生或产生的量极少。

在肿瘤发生的早期，当其他检查还未发现时，血液中肿瘤标志物已有不同程度的升高，因此，具有无创特点的肿瘤标志物检测技术是目前有效的早期发现无症状肿瘤的方法。人类表皮生长因子受体2(Cerb B-2)是一种常见的乳腺癌肿瘤标记物，它是一种原癌基因，又称HER-2或neu, 它是表皮生长因子家族中主要成员，其蛋白产物具有酪氨酸激酶活性，能够启动自身磷酸化过程，可促使乳腺肿瘤细胞向恶性转化，研究表明，Cerb B-2基因的检测在乳腺癌的确诊分期、监测和判断预后中起着重要的作用。可是一般在乳腺癌的早期，Cerb B-2基因的浓度在实际样本中一般较低，直接进行检测的效果差，所以近年来，应用信号放大检测技术来提高检测灵敏度受到越来越多的关注。早期的信号放大是利用聚合酶链反应技术（PCR），此项技术从1985年问世以来被广泛的应用在临床试验中，可是具有易造成假阳性、易被污染等缺点。滚环扩增技术(RCA) 和生物条码技术是近年来发展的通过放大信号来检测DNA的新方法，它们虽然大大的提高了检测的灵敏度，但是仍然存在操作过程复杂、费用高等缺点。因此，我们需要寻找一种简便、准确、灵敏的方法来检测实际样本中的Cerb B-2基因。

近年来，利用切刻内切酶辅助信号放大的方法用在DNA的检测引起越来越多的学者关注。切刻内切酶是一种特殊的限制性核酸内切酶，它能够识别双链DNA中的特异核酸序列，只切割其中的一条DNA链。这类酶被发现后，引起了科研工作者们的广泛关注，近年来，已有一些学者利用切刻内切酶辅助信号放大技术用于DNA的检测，虽然这种技术有效的提高了检测的灵敏度，但是由于这些方法需要使用分子信标技术，因此存在操作复杂、价格昂贵等缺点。因此，在此基础上有必要继续研究一种既简便又经济的生物传感新方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于类石墨相碳化氮纳米材料的荧光传感器的制备方法。本发明利用类石墨相碳化氮纳米片在Ag⁺、DNA探针和目标序列存在下的荧光“关-开-关”的性质，可以实现DNA的灵敏特异性检测，检测限低，经济、简便、实用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

基于类石墨相碳化氮纳米材料的荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）将50 μL 1 μM探针基因与10 μL 10 mM的Ag⁺溶液混合，用Tris-HNO₃缓冲液稀释至100 μL，混匀并反应1 h；

（2）将混合体系加入到900 μL的类石墨相碳化氮纳米片混悬液中，混匀，测其荧光强度；

（3）继续往上述体系中加入含有不同浓度的靶标基因和10 U 的Nb.BsmI切刻切割酶的混合体系，混匀反应1h，检测荧光强度的变化，实验结果见附图4，由图可知，一定范围内，随着目标DNA浓度增加，发夹结构的探针基因因杂交继而酶切作用所释放出的Ag⁺量越多，猝灭碳化氮的荧光程度越强，荧光信号越弱；碳化氮的发射波长为396 nm。测定的条件：测定介质为Tris-HNO₃缓冲溶液，pH =7.9。

依据上述方法得到荧光传感器。

所述的类石墨相碳化氮纳米片的制备方法为：

（1）微波合成类石墨相碳化氮粉末：往微波管中加入2 mL甲酰胺，置于微波合成仪中，180~200 ℃下反应30 min，得到黑色的类石墨相碳化氮，用双蒸水洗净，真空干燥得类石墨相碳化氮黑色粉末；

（2）纳米片的制备：用去离子水溶解类石墨相碳化氮，超声剥离24 h；将超声后的液体转移至离心管中，置于离心机中15000 r/min 离心1 h，取上清液得到类石墨相碳化氮纳米片混悬液。

步骤（1）中所述的探针基因其序列为5'-CCCCCCAACTGCATTCCAACAAGTCTCCCCCC-3'（购于上海生工生物工程技术服务有限公司）。

步骤（3）中所述的靶标基因其序列为5'-AGACTTGTTGGAATGCAGTT-3'（购于上海生工生物工程技术服务有限公司）。

步骤（1）中所述的Tris-HNO₃缓冲液是由25 mM Tris、50 mM NaNO₃和15 mM MgNO₃配制而成的，并用5 mol/L的HNO₃调至pH 7.9。

所述的制备方法制得的荧光传感器用于乳腺癌相关基因片段的检测，荧光分析法测定参数：λ_ex=330 nm，λ_em=396 nm，激发和发射光狭缝值均为5 nm，PMT检测电压为600 V。其线性范围为：5 fM~0.1 pM。回归方程为F=183.97744－1.52594C，线性相关系数r为0.9970，该方法对特定序列DNA的最低检测下限为0.2 fM。具体检测方法为：在含有探针基因、Ag⁺和类石墨相碳化氮纳米片的混合体系中加入含有一定浓度的互补或单碱基错配或不互补DNA 和10 U Nb.BsmI切刻内切酶的混合液，进行杂交反应；上述反应液用荧光分析法检测。

本发明采用微波合成法制备类石墨相碳化氮纳米材料，并结合酶切循环信号放大技术制成荧光传感器，用于乳腺癌Cerb B-2相关基因片段的检测。其具体机理为：Ag⁺可与类石墨相碳化氮纳米片结合并使其荧光猝灭，即荧光处于“关”的状态。探针基因加入后，Ag⁺与探针基因上的胞嘧啶共价结合形成更稳定的C- Ag⁺-C错配结构，导致Ag⁺与类石墨相碳化氮纳米片的结合量减少，荧光猝灭程度低，即荧光处于“开”的状态。当再加入互补靶标基因时，其与探针基因杂交形成双链DNA，经过Nb.BsmI切刻内切酶切割循环，发夹结构探针基因上的Ag⁺完全释放出来，使得Ag⁺与类石墨相碳化氮纳米片的结合量增加，荧光猝灭程度高，即荧光处于“关”的状态，从而成功实现酶切循环信号放大技术的荧光生物传感器的研制。通过这种循环信号放大的技术，可实现对Cerb B-2相关基因的高灵敏度检测，并有望推广应用于其他类型肿瘤的早期诊断及筛选抗肿瘤新药工作中，因而本发明具有巨大的潜在应用价值和深远的意义。

本发明的有益效果在于：

1）本发明采用微波合成法制得的类石墨相碳化氮纳米材料具有较高的水溶性和较强的荧光信号，用于荧光传感器中能增强荧光信号；

2）利用类石墨相碳化氮纳米片在Ag⁺、DNA探针和目标序列存在下的荧光“关-开-关”的性质，可以实现DNA的灵敏特异性检测；

3）在最佳条件下，该荧光传感器的线性范围为5 fM~0.1 pM，检测限达到0.2 fM，且具有良好的选择性。

附图说明

图1是类石墨相碳化氮纳米材料的原子力显微镜图；

图2是类石墨相碳化氮纳米材料的傅里叶变换红外光谱(FTIR)图；

图3为加入Ag⁺或不同的DNA杂交后类石墨相碳化氮荧光信号的变化，图中：（a）碳化氮的荧光信号，（d）碳化氮中加入Ag ⁺ 的荧光信号，（b）碳化氮中加入Ag ⁺ 和探针DNA后的荧光信号，（c）碳化氮中加入Ag ⁺ 和探针DNA后再加入互补靶标DNA的荧光信号；

图4为本发明的荧光信号检测图。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

本发明的荧光传感器包括类石墨相碳化氮纳米片（g-C₃N₄-NF），Ag⁺，Nb.BsmI切刻内切酶，探针基因。在探针基因溶液中加入Ag⁺，Ag⁺与探针基因上的胞嘧啶共价结合形成更稳定的C-Ag⁺-C错配结构，使得探针基因回折形成发夹结构。继续加入类石墨相碳化氮纳米片混悬液，由于溶液中游离的Ag⁺减少甚至几乎为零，导致Ag⁺与碳化氮的结合量减少，所以碳化氮的荧光猝灭程度低，荧光信号较强。当互补靶标基因存在时，其与探针基因杂交形成双链DNA，导致探针基因的发夹结构打开并释放出Ag⁺。同时，杂交所形成的DNA双链可产生Nb.BsmI切刻内切酶的酶切位点，Nb.BsmI切刻内切酶切割双链中含有特殊序列的探针基因链，使得探针基因被酶水解，靶标基因被释放出来并可继续与下一个探针基因杂交。由此所形成的杂交、酶切水解、再杂交的循环过程，使得一条靶标基因即可释放出多个发夹结构探针基因上的Ag⁺，使得溶液中游离的Ag⁺量增多，导致碳化氮的荧光猝灭程度增强，荧光信号明显减弱。通过这种多次循环信号放大的技术，可实现对靶标基因的高灵敏度检测。

实施例1

1) 类石墨相碳化氮纳米片的制备：往微波管中加入2 mL甲酰胺，置于微波合成仪中，190 ℃下反应30 min，得到黑色的类石墨相碳化氮，用双蒸水洗净，真空干燥即得类石墨相碳化氮黑色粉末。用去离子水溶解类石墨相碳化氮，超声剥离24 h；将超声后的液体转移至离心管中，置于离心机中15000 r/min 离心1 h，取上清液即可得到类石墨相碳化氮纳米片（g-C₃N₄-NF）混悬液；

2）探针基因：5'-CCCCCCAACTGCATTCCAACAAGTCTCCCCCC-3'（由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）；靶标基因：5'-AGACTTGTTGGAATGCAGTT-3'为特定序列DNA（由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的Cerb B-2相关基因短片段）；将探针基因和靶标基因分别溶于Tris-HNO₃缓冲液中制成100 µM的探针溶液和100 µM的靶标溶液；

3）50 μL 1 μM探针基因与10 μL 10 mM的Ag⁺溶液混合，用Tris-HNO₃缓冲液稀释至100 μL，混匀并反应1 h。将此混合体系加入到900 μL的类石墨相碳化氮纳米片悬浮液中，混匀，测其荧光强度。继续往上述体系中加入50 μL 1 μM 靶标基因和10 U 的Nb.BsmI切刻切割酶的混合液，混匀反应1h，检测其荧光强度的变化。从实验结果可知（见附图3），当Ag⁺不存在时，碳化氮的荧光信号较强（a）；Ag⁺存在时，与碳化氮的CN_x结合从而使得碳化氮的荧光猝灭，荧光信号明显减弱（d）。当探针基因加入后，荧光信号增强（b），这是由于Ag⁺与探针基因上的胞嘧啶共价结合形成更稳定的C- Ag⁺-C错配结构，使得Ag⁺与碳化氮的结合量减少。当互补靶标基因存在时，荧光信号明显减弱（c），这是由于靶标基因与探针基因互补杂交形成双链DNA，导致探针基因的发夹结构打开并释放出Ag⁺，使得Ag⁺与碳化氮的结合量增多；同时，杂交所形成的DNA双链可产生Nb.BsmI切刻内切酶的酶切位点，Nb.BsmI切刻内切酶切割双链中含有特殊序列的探针基因链，使得探针基因被酶水解，靶标基因被释放出来并可继续与下一个探针基因杂交。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建医科大学

<120> 基于类石墨相碳化氮纳米材料的荧光传感器的制备方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccccccaact gcattccaac aagtctcccc cc 32

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agacttgttg gaatgcagtt 20

Claims (2)

1.基于类石墨相碳化氮纳米材料的荧光传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将50 μL 1 μM探针基因与10 μL 10 mM的Ag⁺溶液混合，用Tris-HNO₃缓冲液稀释至100 μL，混匀并反应1 h；

（2）将混合体系加入到900 μL的类石墨相碳化氮纳米片混悬液中，混匀，测其荧光强度；

（3）继续往上述体系中加入不同浓度的靶标基因和10 U 的Nb.BsmI切刻切割酶的混合体系，混匀反应1h，检测荧光强度的变化，得到荧光传感器；

步骤（1）中所述的探针基因其序列为5'-CCCCCCAACTGCATTCCAACAAGTCTCCCCCC-3'；

步骤（3）中所述的靶标基因其序列为5'-AGACTTGTTGGAATGCAGTT-3'；

所述的类石墨相碳化氮纳米片混悬液的制备方法为：

a. 微波合成类石墨相碳化氮粉末：往微波管中加入2 mL甲酰胺，置于微波合成仪中，180~200 ℃下反应30 min，得到黑色的类石墨相碳化氮，用双蒸水洗净，真空干燥得类石墨相碳化氮黑色粉末；

b. 纳米片混悬液的制备：用去离子水溶解类石墨相碳化氮，超声剥离24 h；将超声后的液体转移至离心管中，置于离心机中15000 r/min 离心1 h，取上清液得到类石墨相碳化氮纳米片混悬液。

2. 根据权利要求1所述的基于类石墨相碳化氮纳米材料的荧光传感器的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的Tris-HNO₃缓冲液是由25 mM Tris、50 mM NaNO₃和15 mM Mg（NO₃）₂配制而成的，并用5 mol/L的HNO₃调至pH 7.9。