CN105274195B - 一种检测癌症标志物微小核糖核酸的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可对癌症标志物MicroRNA及癌细胞内MicroRNA活性进行分析检测的纳米探针及其制备方法。纳米探针是一种新型的四螺旋DNA分子探针,它包含三个功能部分:负载特殊设计的目标物识别区域,引发循环放大反应的触发区域,聚合‑剪切放大反应的模板区域。将这种纳米探针引入到表面增强拉曼(SERS)分析检测技术中,发展了一种四螺旋分子探针‑SERS检测方法,可实现对microRNA的高灵敏度检测，结合适体识别技术，四螺旋分子探针‑SERS的检测方法具有很好的特异性，该方法简化了样品处理过程，选择性好，准确度高，是检测肿瘤细胞标志物microRNA及癌细胞内MicroRNA的理想方法。本检测方法和试剂盒可区分癌症细胞和正常细胞，具有操作简单、高灵敏性和高特异性检测癌症标志物microRNA的优点，因此该发明具有良好的应用前景。

Description

一种检测癌症标志物微小核糖核酸的试剂盒

技术领域

本发明涉及脱氧核糖核酸(简称DNA)循环放大技术，具体地说是利用四螺旋结构DNA的循环放大技术对癌症标志物微小核糖核酸(以下简称MicroRNA)和癌细胞内MicroRNA进行表面增强拉曼散射(SERS)识别和免疫检测的试剂盒及测试方法。

背景技术

MicroRNA是动物和植物中普遍存在的一类最小的功能性编码RNA,内生的、长度约为20-24个核苷酸的单链小分子，其在细胞内具有多种重要的调节作用。它对于深入探讨疾病发生机制及疾病诊断、基因治疗药物的开发都具有重大意义。MicroRNA研究连续被《Science》杂志评为年度十大科技之一、年度重大突破。MicroRNA通过基因沉默机制，调控细胞的增殖、发育、分化及凋亡等关键的生命过程，同时细胞内microRNA的表达水平与人类重大疾病，尤其是癌症，密切相关。因此，对动物和人体内MicroRNA的检测在癌症诊断中起着非常重要的作用。

癌症早期患者血清中肿瘤标志物MicroRNA浓度仅为10^-11M-10^-15M，目前的临床免疫测定法能测定的最低浓度仅为10^-12M，无法满足现代医学早期诊断的要求。目前科研工作者重点研发了基于荧光、电化学和表面等离子共振的生物传感器，已经取得了一些的进展。而SERS检测技术以高灵敏度、光谱选择性、测定快、数据准确、灵敏度高等特点成为癌症疾病分析检测的一个非常有前景的研究领域。此外，表面增强拉曼检测技术具有制样简单、非入侵和无损等独特的优点。拉曼信号分子标记物不会自猝灭和光漂白，这样就可以通过增加探针上染料分子的个数和提高光谱累积时间来增强拉曼信号，提高检测的灵敏度。SERS检测手段具有背景低、有效避免光致褪色、有效增强分子的拉曼强度、灵敏度高的优势，越来越受到了科学界的关注，在癌症疾病分析检测领域中具有很好的应用潜力。

作为一种纳米级别的分子，DNA以其自身的可编程性、结构的多样性和变化的可控性等诸多优点而活跃于纳米科学、生物科学和材料科学。利用碱基的精确配对和序列可设计的特性，可以设计具有信号放大功能的DNA循环网络，将DNA循环放大方法引入试剂盒生物传感分析中，具有消耗样品量少、快速、灵敏的优势，近年来被广泛应用于DNA、细胞、生物分子和胚胎的检测。将DNA反应设计成可以自发循环的过程，从而能够将检测信号的放大，有效提高了对目标物的检测限，同时减少对被样品的消耗量。因此，选择设计合适的信号探针、循环放大反应、信号源是关键。自从2000年发现癌症疾病MicroRNA突变以来，对体内MicroRNA的检测在不断的开展，并取得了一定的进展。然而，操作简单、特异性好、灵敏性高地检测体内MicroRNA的方法一直是人们所关注并不断追求的。

本发明的试剂盒设计成以癌症标志物MicroRNA的适体识别引发，通过与四螺旋结构DNA的杂交以及DNA剪切-聚合反应循环实现对SERS检测信号的放大，进而实现对癌症标志物MicroRNA及癌细胞内MicroRNA高灵敏和高特异选择性的识别和检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测癌症标志物MicroRNA及癌细胞内MicroRNA的试剂盒，该试剂盒操作程序简单、灵敏度高、特异选择性好，可大大地减少假阳性的误诊，适用于各种动物和人体内的MicroRNA的快速检测。

本发明中试剂盒的组成为：四螺旋结构DNA分子探针、聚合酶、切刻内切酶、缓冲液，SERS信号探针。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：1.合成四螺旋结构DNA分子探针：它包含三个功能部分:负载特殊设计的目标物识别区域,引发循环放大反应的触发区域,聚合-剪切放大反应的模板区域。设计三条DNA序列(序列一、二、三)，序列一为含有MicroRNA的杂交互补DNA序列；序列二为与序列三部分互补的序列,为聚合-剪切放大反应的模板；序列三为一端修饰氨基，使其共轭连接在羧基修饰的磁珠上，并且其序列部分可以与序列一和序列二互补；三条DNA序列通过杂交结合在一起，并通过序列三上的氨基与羧基修饰的磁珠结合从而形成四螺旋结构DNA分子探针。

2.SERS信号探针：设计了两条DNA序列(序列四、五)，序列四为一端修饰巯基基团，用来连接金纳米粒子；序列五为一端修饰巯基基团，另一端修饰罗丹明基团(ROX)，连接在金纳米粒子上用作SERS检测信号。适量配比的序列四和序列五连接在金纳米粒子上组成了SERS信号探针。

3.MicroRNA检测：把癌症标志物MicroRNA(或癌细胞粉碎后提取的MicroRNA)和引物1加入到上述合成的探针中，首先MicroRNA通过与四螺旋结构DNA分子探针1上的互补DNA杂交引发，导致四螺旋探针1的构型发生变化，四螺旋结构DNA分子探针的部分序列片段被暴露出来；通过引物，在聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(以下简称dNTPs)作用下引发DNA聚合反应，反应延伸的新链将MicroRNA与序列一杂交的复合体以及序列二替换下来，释放到溶液中；在引物2、聚合酶和dNTPs作用下引发第二个聚合反应，此时MicroRNA被释放下来，可以形成一个DNA循环反应。被替换下来的序列二遇到切刻内切酶、聚合酶和dNTPs，生成大量的DNA-a可以进入下一个反应形成一个循环。DNA-a与连接磁珠的发夹DNA发生杂交反应，导致发夹结构构型变化，形成双链DNA-b并暴露出可以结合SERS信号探针的序列片段，产生放大的检测信号。

4.SERS强度测试：通过磁性分离，去除反应后的上清液，得到连有SERS信号探针的磁珠进行SERS测试。

本发明的主要创新性和优越性为：1.本发明采用四螺旋结构DNA分子探针为识别探针,采用“二步法”，实验操作简单。

2.本发明以特定DNA序列的四螺旋结构分子为识别探针，可以高特异选择性的检测癌症标志物MicroRNA和癌细胞内MicroRNA。

3.通过两个DNA循环放大SERS信号，可以高灵敏的检测癌症标志物MicroRNA和癌细胞内MicroRNA。

附图说明

图1为本发明所使用的四螺旋结构DNA分子探针。

图2为本发明用于SERS检测癌症标志物MicroRNA和癌细胞内MicroRNA的示意图。

图3为空白(a)、正常细胞(b)和乳腺癌细胞内MicroRNA(c)的SERS信号测试对比(以检测细胞内miRNA-21为例)。

图4A为不同浓度癌症标志物MicroRNA的SERS信号响应曲线,B为不同浓度癌症标志物MicroRNA的工作曲线(以检测乳腺癌细胞中miRNA-21为例，粉碎细胞提取总的MicroRNA，检测其中的miRNA-21)。

实施例

以下为实施本发明的具体示例(以miRNA-21为例)，其作用在于进一步阐明本发明的内容，使阅读者更容易理解，但不构成对本发明要求的保护范围的限定或限制。

实验条件：激光共聚焦显微镜拉曼光谱仪(英国Renisaw公司)、所用DNA序列(北京赛百盛生物工程有限公司)、羧基修饰磁性微球(天津倍思乐色谱技术开发中心PSC-3412，粒径0.5-1.0μm,原液磁珠含量50mgmL^-1)、磷酸三氯乙基酯(TCEP，98％，AlfaAesar公司)；咪唑(天津市博迪化工有限公司)、聚合酶、切刻内切酶、缓冲液及dNTPs(大连宝生物工程有限公司)、缓冲液的成分：三羟甲基氨基甲烷-盐酸(以下简称Tris-HCl)和MgCl2溶液。

具体操作过程：1.四螺旋结构DNA分子探针的制备，用0.1M咪唑-盐酸盐溶液(pH7.0)清洗、活化磁珠。将200μL序列三(5'-NH2-T6-GGTCACAGTCGGGATCGTTCCTGAGTTGCTCAGTGACTGAGCACGCACCAGGCTCGAAGCTGCTTTAAGCCTCACGGTTCGCATGACGGGTCAACCTGCGTCGACGTGTCCCTGGACTTTAAGAAATCTCGAGCTTCGAGCCTGCAGCGTGTCCAGACTCAGATGGCGAGTCTAGCTTATC-3')的溶液加入到200μL咪唑溶液活化好的磁珠混合，反应6h后加入200μL序列一(5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGGGAACGATCCCGACTGTGCCA-3')和序列二(5'-AGAAAGGAGGACTTTCATACCTCGAGGACCTCAGCAGCTTCGAGCCTGGTGCGTGCTCAGTCACTGAGCAACTCAACTCGCCATCTGAGTCTGGACACGCTGCAGGCTCGAAGCTGC-3')的溶液，放在体积1L的保温桶里，80℃水浴中随室温缓慢降温12h，磁分离洗涤后，得连有磁珠的四螺旋结构DNA分子探针，稀释至200μL备用。

2.SERS信号探针的制备，将序列五(Rox-DNA，5'-ROX-TTTTTTCCTAGCGAC-SH-3')和序列四(捕获探针DNA，5'-SH-AGAAAGGAGGACGC-3')按50:1的比例均匀混合，然后加入一定量的TCEP活化30min。随后在活化好的DNA混合液中加入1mL新鲜制备的金纳米粒子溶液，轻微振荡避光反应6h，将金纳米粒子溶液与DNA的混合溶液在10mM醋酸盐缓冲液(包含0.2NaCl)中避光放置8h，在经过12000rpm的转速离心30min后，洗涤后得到油状物，即SERS信号探针的制备。

3.循环反应实验：100μL(2×10-7M)四螺旋结构DNA分子探针的悬浮液，加入待测的乳腺癌细胞粉碎提取的MicroRNA,100μL引物1(2×10^-6M，5'-AGAGTTACTTAG-3’)、100μL引物2(2×10^-6M，5'-TGGCACAGTCGGGAT-3’)，20μLdNTP，2μL聚合酶，适量聚合酶缓冲液、在37℃反应2h。然后取上清液，再加入30μLdNTP，2μL聚合酶和2μL切刻内切酶，适量聚合酶和切刻内切酶的缓冲液，200μLSERS信号探针和100μL发夹DNA(2×10^-6M，5’-NH2-T6-AGAAAGGAGGACTTTCATACCTCGAGGACCTCAGCGTCCTCCTTTCT-3’)，反应2小时。

4.SERS强度测试：上述反应完成后，经过磁分离，取磁珠部分稀释到200μL进行SERS测试。

实验结果：如图4A所示，随着MicroRNA(以miRNA-21为例)浓度的升高，SERS信号强度增加。工作曲线见图4B所示,当miRNA-21浓度在6.0×10^-16M到5.0×10^-12M的范围内，SERS强度响应与其呈线性关系，线性回归方程为ΔI＝2.967lgC+3.317(C为miRNA-21的浓度，ΔI＝I–I0，I是miRNA-21作用后的信号强度，I0为miRNA-21作用前的信号强度，R＝0.996)，呈现很好的线性关系。根据信噪比(S/N＝3)规则，该试剂盒对miRNA-21的检测限为1.0×10^{- 16}M。

Claims (1)

1.一种用于检测癌细胞标志物微小核糖核酸的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含四螺旋结构DNA分子探针、引物1、引物2、发夹DNA、聚合酶、切刻内切酶、缓冲液和SERS信号探针；

所述四螺旋结构DNA分子探针的制备方法包括：

用0.1M咪唑-盐酸盐中性溶液清洗、活化磁珠；将200μL序列三的溶液加入到200μL咪唑溶液活化好的磁珠混合，反应6h后加入200μL序列一和序列二的溶液，放在体积1L的保温桶里，80℃水浴中随室温缓慢降温12h，磁分离洗涤后，得连有磁珠的四螺旋结构DNA分子探针，稀释至200μL备用；

所述序列一为：

5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGGGAACGATCCCGACTGTGCCA-3'；

所述序列二为：

5'-AGAAAGGAGGACTTTCATACCTCGAGGACCTCAGCAGCTTCGAGCCTGGTGCGTGCTCAGTCACTGAGCAACTCAACTCGCCATCTGAGTCTGGACACGCTGCAGGCTCGAAGCTGC-3'；

所述序列三为：

5'-NH₂-T₆-GGTCACAGTCGGGATCGTTCCTGAGTTGCTCAGTGACTGAGCACGCACCAGGCTCGAAGCTGCTTTAAGCCTCACGGTTCGCATGACGGGTCAACC-TGCGTCGACGTGTCCCTGGACTTTAAGAAATCTCGAGCTTCGAGCCTGCAGCGTGTCCAGACTCAGATGGCGAGTCTAGCTTATC-3'；

所述引物1的序列为：

5'-AGAGTTACTTAG-3'；

所述引物2的序列为：

5'-TGGCACAGTCGGGAT-3'；

所述发夹DNA的序列为：

5'-NH2-T6-AGAAAGGAGGACTTTCATACCTCGAGGACCTCAGCGTCCTCCTTTCT-3'；

所述SERS探针的制备方法包括：

将序列五的ROX-DNA和序列四的捕获探针DNA按50:1的比例均匀混合，然后加入一定量的TCEP活化30min。随后在活化好的DNA混合液中加入1mL新鲜制备的金纳米粒子溶液，轻微振荡避光反应6h，将金纳米粒子溶液与DNA的混合溶液在10mM醋酸盐缓冲液中避光放置8h，在经过12000rpm的转速离心30min后，洗涤后得到油状物，即SERS信号探针；

所述序列五为5'-ROX-TTTTTTCCTAGCGAC-SH-3'；

所述序列四为5'-SH-AGAAAGGAGGACGC-3'。