CN114438215A - 一种基于dna超支化自组装检测肺癌标志物的sers探针和试剂盒 - Google Patents

一种基于dna超支化自组装检测肺癌标志物的sers探针和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于DNA超支化自组装检测肺癌标志物的SERS探针和试剂盒，属于DNA循环放大于技术领域，所述肺癌标志物包括miRNAs‑21和/或miRNA‑155，将序列F1～F7和序列g1～g7分别制备得到超支化树枝状结构DNA纳米分子，再与金纳米笼制备得到SERS探针。采用本发明提供的SERS探针能够特异性检测肺癌标志物包括miRNAs‑21和/或miRNA‑155，具有较高的灵敏度。

Description

一种基于DNA超支化自组装检测肺癌标志物的SERS探针和试 剂盒
技术领域
本发明属于DNA循环放大于技术领域，尤其涉及一种基于DNA超支化自组装检测肺癌标志物的SERS探针和试剂盒。
背景技术
miRNAs是一种小的内源性、非编码的RNA分子，内生的、长度约为20-24个核苷酸的单链小分子，能在转录和翻译水平调控基因的表达，在哺乳动物的生长发育，以及细胞的增殖分化的调控中发挥重要作用，它的异常表达与肿瘤的相关病理过程密切相关。因此，准确检测细胞内相关的miRNAs的动态变化对临床诊断具有重要意义。根据文献我们所知，现目前已经开发了包括传统Northern印迹分析、原位杂交、微阵列分析、方便有效的实时定量PCR(RT-PCR)以及非常可靠的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)等miRNAs检测方法。然而由于miRNAs具有体积小、易降解、序列高度同源性等特点，两种探针制备的复杂性以及制备过程中一些不可控的实验因素导致的两种探针数量和浓度的差异，使得同时检测两种miRNAs在目前阶段仍然是一个很大的挑战。
癌症早期患者血清中肿瘤标志物miRNAs浓度仅为10-11M-10-15M，目前的临床免疫测定法能测定的最低浓度仅为10-12M，无法满足现代医学早期诊断的要求。目前荧光，电化学和表面增强拉曼散射(SERS)已被开发用于区分miRNA。与其他技术相比，由于丰富的光谱仪指纹信息、良好的生物相容性以及低的信号背景，无损检测，弱水散射和最少的样品制备等优点，SERS在超灵敏检测和定量分析中具有相当大的优势。拉曼信号分子标记物不会自猝灭和光漂白，这样就可以通过增加探针上染料分子的个数和提高光谱累积时间来增强拉曼信号，提高检测的灵敏度。SERS检测手段具有背景低、有效避免光致褪色、有效增强分子的拉曼强度、灵敏度高的优势，越来越受到了科学界的关注，在癌症疾病分析检测领域中具有很好的应用潜力。
各种金纳米结构，例如金纳米棒，金纳米星，金纳米笼(AuNCs)，以增强拉曼活性分子的信号。与其他结构相比，是最具有广泛使用前景的表面增强拉曼散射基底，具有中空内部和多孔壁的AuNCs表现出更高的拉曼增强作用，这归因于其内外表面场之间的耦合从而导致整个电磁场作用增强。整个可见光和近红外光中的可调等离激元能带使AuNC具有很强的光吸收能力。AuNCs的八个顶点是潜在的“热点”，它们对内部和外部表面场之间的变化和局部介电非常敏感。
自从2000年发现癌症疾病miRNAs突变以来，对体内miRNAs的检测在不断的开展，并取得了一定的进展。然而，操作简单、特异性好、灵敏性高地检测体内miRNAs的方法一直是人们所关注并不断追求的。作为一种纳米级别的分子，DNA以其自身的可编程性、优异的生物相容性、结构的多样性和变化的可控性等诸多优点而活跃于纳米科学、生物科学和材料科学。利用碱基的精确配对和序列可设计的特性，可以设计具有信号放大功能的DNA循环网络，将DNA循环放大方法引入试剂盒生物传感分析中，具有消耗样品量少、快速、灵敏的优势，近年来被广泛应用于DNA、细胞、生物分子和胚胎的检测。将DNA反应设计成可以自发循环的过程，从而能够将检测信号放大，有效提高对目标物的检测限，同时减少对被样品的消耗量。因此，选择设计合适的信号探针是关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于DNA超支化自组装检测肺癌标志物的SERS探针和试剂盒，采用本发明提供的SERS探针能够特异性检测肺癌标志物包括miRNAs-21和/或miRNA-155，具有较高的灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种基于DNA超支化自组装检测肺癌标志物的SERS探针，所述肺癌标志物包括miRNAs-21和/或miRNA-155；
当肺癌标志物为miRNAs-21时，所述SERS探针的制备方法包括：
1)将序列F2与序列F3在85℃下反应5min，再与序列F4反应，得到产物A；
2)将序列F5与序列F6在85℃下反应5min，再与序列F7反应，得到产物B；
3)将所述步骤1)得到的产物A、步骤2)得到的产物B和序列F1反应，得到超支化树枝状结构DNA纳米分子；
所述序列F1～F7的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～7所示；
4)将所述步骤3)得到的超支化树枝状结构DNA纳米分子与金纳米笼在37℃下避光反应24h，得到SERS探针；
当肺癌标志物为miRNAs-155时，SERS探针的制备方法包括：
a、将序列g2与序列g3在85℃下反应5min，再与序列g4反应，得到产物I；
b、将序列g5与序列g6在85℃下反应5min，再与序列g7反应，得到产物II；
c、将所述步骤a得到的产物I、步骤b得到的产物II和序列g1反应，得到SERS探针；
所述序列g1～g7的核苷酸序列依次如SEQ ID No.8～14所示；
超支化树枝状结构DNA纳米分子；
d、将所述步骤c得到的超支化树枝状结构DNA纳米分子与金纳米笼在37℃下避光反应24h，得到SERS探针。
优选的，所述步骤1)中序列F2和序列F3的体积比为2:3，所述序列F2和序列F3的浓度均为10-5M；
与序列F4反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
优选的，所述步骤2)中序列F5和序列F6的体积比为2:3，所述序列F5和序列F6的浓度均为10-5M；
与序列F7反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
优选的，所述步骤3)产物A、产物B和序列F1反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为30min。
优选的，所述步骤a中序列g2和序列g3的体积比为2:3，所述序列g2和序列g3的浓度均为10-5M；
与序列g4反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
优选的，所述步骤b中序列g5和序列g6的体积比为2:3，所述序列g5和序列g6的浓度均为10-5M；
与序列g7反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
优选的，所述步骤c产物I、产物II和序列g1反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为30min。
本发明还提供了一种基于DNA超支化自组装检测肺癌标志物的试剂盒，包括上述技术方案所述的SERS探针和磷酸盐缓冲液。
优选的，所述肺癌标志物包括miRNAs-21和/或miRNA-155。
优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。
本发明SERS探针的设计思路为：
1.合成超支化结构DNA纳米分子：它包含三个功能部分：负载特殊设计的目标物识别区域，引发指数循环扩增放大反应的触发区域，带有拉曼检测基团的特殊功能区。每一系列设计七条DNA序列(序列F1-F7，序列g1-g7)，序列F1-F7是用来检测miR-21，序列g1-g7是用来检测miR-155。序列F和序列g的HCR反应过程相同。序列F1为miRNAs的DNA序列；序列F2为与序列F3部分互补的序列；序列F2为一端修饰巯基，使其连接在金纳米笼上，另一端修饰罗丹明(Rox)基团，并且其序列部分可以与序列F1和序列F5互补；序列F4与序列F3部分互补，序列F6与序列F7部分互补杂交；序列F5和序列F6部分互补杂交，序列F5的3’端修饰有罗丹明基团(Rox)，在靶标DNA序列F1的触发下，七条不同的DNA序列之间相互杂交结合形成树枝状结构DNA纳米分子。
2.SERS信号探针：设计的两条DNA序列(序列g2、F2)，序列g2为一端修饰巯基基团，用来连接金纳米笼另一端修饰Cy3荧光基团；序列F2为一端修饰巯基基团，另一端修饰罗丹明基团(ROX)。通过HCR反应生成超支化DNA纳米分子，合成的超支化DNA纳米分子与连接在金纳米粒子上组成了SERS信号探针。
3.miRNAs检测：miR-21和miR-155检测系统具有四个带有荧光团和短脚趾的超双链DNA(f1:F2+F3和f2:F5+F6；f1’:g2+g3和f2’:g5+g6)，四个单链辅助DNA(F4和F7；g4和g7)。在存在癌症标志物miRNA21的情况下，首先f1的暴露的脚趾可以与miRNA21互补以产生P1，然后暴露出新的前额b*。然后，F4与P1的b*的片段互补以产生P2，该P2具有新暴露的长单链DNA段。由于底物产生的P2暴露的长单链DNA片段是由两段相同的序列组成的，因此P2所暴露的长单链片段可以同时与两个带有荧光基团的底物f2进行杂交，该步骤不仅是这个自持可持续链分支过程的开始，也是关键步骤，在辅助单链DNAA2的作用下，解离副产物X，产生P3，使该P3分子上具有更多的荧光基团。两个由于触发DNA相同序列组成的单链区域被暴露并准备进入到新一轮的反应。同样，miR-155也会触发相应的DNA超支化过程。该过程就相当于是一个在每一个原底物的基础上产生了两个新的子模板的聚合酶链反应过程，最初受保护的靶标触发序列将会暴露在每条新生长的分支链中。在不受到空间效应的影响下，该树枝状结构的链分支生长将会成指数增加的方式程序生长，同时，组装的树枝状结构的荧光强度也随时间成一定程度的指数增长。
4.SERS强度测试：通过离心，去除反应后的上清液，得到连有SERS信号探针的金纳米笼进行SERS测试。
本发明验证SERS信号探针对不同miRNA的特异性，选择了多种不同的miRNA对信号探针进行触发，然后通过拉曼信号的变化来评估探针对不同miRNA的特异性。在发明中，通过上述的SERS探针对单碱基错配miRNA、miR-203、miR-let-7a来研究基于自组装DNA多枝化反应的SERS检测方法的特异性。
本发明的有益效果为：
1.本发明采用具有增强拉曼特性的超支化DNA纳米探针(AuNCs@DNA)为两种肿瘤标志物检测识别探针，实验操作简单。
2.本发明以特定DNA序列的AuNCs@DNA为识别探针，可以高特异选择性同时检测两种癌症标志物miRNAs和癌细胞内microRNAs.
3.通过在一定的空间效应下实现的指数循环扩增的树枝状DNA纳米结构，可以高灵敏且同时的检测两种癌症标志物miRNAs。
附图说明
图1为本发明所使用的超支化树枝状结构DNA纳米分子；
图2为合成的金纳米笼的TEM电镜图，尺寸为直径50nm，笼的壁厚约为3nm；
图3中的a图为未有靶标触发的DNA图，b图为在加入靶标后触发自组装形成的超支化树枝状的DNA纳米结构，c图是b图的放大；
图4中的a为不同浓度的两种癌症标志物miRNAs的SERS信号相应曲线，b、c为不同浓度癌症标志物miRNAs的工作曲线(以检测肺癌细胞中miRNA-21和miR-155为例，检测其中的miR-21和miR-155)；
图5中的A、C分别为两种不同的癌症标志物miRNAs的分别在不同的浓度下的SERS信号相应曲线，B、D两图分别为两种不同的肿瘤标志物miRNAs在不同浓度下的工作曲线(以检测肺癌细胞中miR-21和miR-155为例，检测其中的miRNA-21和miR-155)；
图6为不同浓度的非靶向性miRNA的SERS信号强度，在10-14M、10-15M和10-16M浓度下检测到的非互补RNA的miRNA特异性：(a)拉曼位移1499cm-1；(b)拉曼位移1586cm-1。
具体实施方式
本发明提供了一种基于DNA超支化自组装检测肺癌标志物的SERS探针，所述肺癌标志物包括miRNAs-21和/或miRNA-155；
当肺癌标志物为miRNAs-21时，所述SERS探针的制备方法包括：
1)将序列F2与序列F3在85℃下反应5min，再与序列F4反应，得到产物A；
2)将序列F5与序列F6在85℃下反应5min，再与序列F7反应，得到产物B；
3)将所述步骤1)得到的产物A、步骤2)得到的产物B和序列F1反应，得到超支化树枝状结构DNA纳米分子；
所述序列F1～F7的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～7所示；
4)将所述步骤3)得到的超支化树枝状结构DNA纳米分子与金纳米笼在37℃下避光反应24h，得到SERS探针；
当肺癌标志物为miRNAs-155时，SERS探针的制备方法包括：
a、将序列g2与序列g3在85℃下反应5min，再与序列g4反应，得到产物I；
b、将序列g5与序列g6在85℃下反应5min，再与序列g7反应，得到产物II；
c、将所述步骤a得到的产物I、步骤b得到的产物II和序列g1反应，得到超支化树枝状结构DNA纳米分子；
所述序列g1～g7的核苷酸序列依次如SEQ ID No.8～14所示；
d、将所述步骤c得到的超支化树枝状结构DNA纳米分子与金纳米笼在37℃下避光反应24h，得到SERS探针。
在本发明中，所述miRNAs-21的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，具体如下：
UAGCUUAUCAGACUAAUGUUGA；
所述miRNAs-155的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，具体如下：
UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU。
当肺癌标志物为miRNAs-21时，本发明将序列F2与序列F3在85℃下反应5min，再与序列F4反应，得到产物A。在本发明中，所述序列F2和序列F3的体积比优选为2:3，所述序列F2和序列F3的浓度优选均为10-5M。与序列F4反应的条件优选包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
本发明将序列F5与序列F6在85℃下反应5min，再与序列F7反应，得到产物B。在本发明中，所述序列F5和序列F6的体积比优选为2:3，所述序列F5和序列F6的浓度优选均为10-5M。在本发明中，与序列F7反应的条件优选包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
本发明将得到的产物A、产物B和序列F1反应，得到超支化树枝状结构DNA纳米分子。在本发明中，所述产物A、产物B和序列F1反应的条件优选包括：反应温度为25℃，反应时间为30min。
本发明将得到的超支化树枝状结构DNA纳米分子与金纳米笼在37℃下避光反应24h，得到SERS探针。
在本发明中，所述金纳米笼的浓度优选为5nM。在本发明中，所述避光反应优选在轻微振荡下进行。本发明优选在避光反应后，将得到的反应产物离心，得到的紫红色沉淀物为SERS探针。在本发明中，所述离心的条件优选包括：离心转速为15000rpm，离心时间为15min，离心次数为3次。在本发明中，所述SERS探针优选分散在0.01M pH值7.4的磷酸缓冲液中进行保存。
在本发明中，所述序列F1～F7的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～7所示，具体如下：
SEQ ID No.1：TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG A；
SEQ ID No.2：5’Rox-GTG TGC CTA TTA TGT CTC CTC CTG TGT GCC TAT TAT GTCTCC TCC TTC AAC ATC AGT CTG ATA AGC TA-3’Biotin；
SEQ ID No.3：TAT CAG ACT GAT GTT GAG ACA TAA TAG GCA CAC GAC ATA ATAGGC ACA C；
SEQ ID No.4：GTG CCT ATT ATG TCG TGT GCC TAT TAT GTC TCA ACA；
SEQ ID No.5：AGG AGG AGA CAT AAT AGG CAC ACT AGC TTA TCA GAC TGA TGTTGA-3’Rox；
SEQ ID No.6：TCA ACA TCA GTC TGA GTG TGC CTA TTA TGT CTC；
SEQ ID No.7：GCA CAC TGC GAC TGA TGT T。
在本发明中，所述金纳米笼的制备方法优选包括：
金纳米笼(AuNCs)的制备是通过柠檬酸钠还原氯金酸(HAuCl4)的过程。将50mL0.01％氯金酸溶液于100mL的三口烧瓶中加热并搅拌，加入100μL AgNO3(6m mol/L)冷凝回流至沸腾，快速加入0.4mL的1％柠檬酸钠。将生成得反应溶液在持续煮沸20分钟，可以观察到溶液的颜色从浅黄色变为红色、紫色，最后变为浅蓝色，表明AuNCs的形成。得到的AuNCs自然冷却至室温。将制备的金纳米笼转移至棕色瓶中，闭光保存在4℃下备用。
当肺癌标志物为miRNAs-155时，本发明将序列g2与序列g3在85℃下反应5min，再与序列g4反应，得到产物I。在本发明中，所述序列g2和序列g3的体积比优选为2:3，所述序列g2和序列g3的浓度优选均为10-5M。与序列g4反应的条件优选包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
本发明将序列g5与序列g6在85℃下反应5min，再与序列g7反应，得到产物II。在本发明中，所述序列g5和序列g6的体积比优选为2:3，所述序列g5和序列g6的浓度优选均为10-5M。在本发明中，与序列g7反应的条件优选包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
本发明将得到的产物I、产物II和序列g1反应，得到超支化树枝状结构DNA纳米分子。在本发明中，所述产物I、产物II和序列g1反应的条件优选包括：反应温度为25℃，反应时间为30min。
本发明将得到的超支化树枝状结构DNA纳米分子与金纳米笼在37℃下避光反应24h，得到SERS探针。
在本发明中，所述金纳米笼的浓度优选为5nM。金纳米笼的制备方法同上，在此不再赘述。在本发明中，所述避光反应优选在轻微振荡下进行。本发明优选在避光反应后，将得到的反应产物离心，得到的紫红色沉淀物为SERS探针。在本发明中，所述离心的条件优选包括：离心转速为15000rpm，离心时间为15min，离心次数为3次。在本发明中，所述SERS探针优选分散在0.01M pH值7.4的磷酸缓冲液中进行保存。
在本发明中，所述序列g1～g7的核苷酸序列依次如SEQ ID No.8～14所示，具体如下：
SEQ ID No.8：TTA ATG CTA ATC GTG ATA GGG GT；
SEQ ID No.9：5’Cy3-GTG TGC CTA TTA TGT CTC CTC CTG TGT GCC TAT TAT GTCTCC TCC TAC CCC TAT CAC GAT TAG CAT TAA-3’SH C3；
SEQ ID No.10：GCT AAT CGT GAT AGG GGT GAC ATA ATA GGC ACA CGA CAT AATAGG CAC AC；
SEQ ID No.11：GTG CCT ATT ATG TCG TGT GCC TAT TAT GTC ACC CCT；
SEQ ID No.12：AGG AGG AGA CAT AAT AGG CAC ACT TAA TGC TAA TCG TGA TAGGGG T-3’Cy3；
SEQ ID No.13：ACC CCT ATC ACG ATT AGT GTG CCT ATT ATG TCT C；
SEQ ID No.14：GCACACTAATCGTGATAGGG。
本发明还提供了一种基于DNA超支化自组装检测肺癌标志物的试剂盒，包括上述技术方案所述的SERS探针和磷酸盐缓冲液。
在本发明中，所述肺癌标志物优选包括miRNAs-21和/或miRNA-155。在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.01M，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.4。
本发明将得到的SERS探针稀释到10μL进行SERS测试检测肺癌标志物，本发明对SERS测试方法没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下为实施本发明的具体示例(以miRNA-21和miR-155为例)，其作用在于进一步阐明本发明的内容，使阅读者更容易理解，但不构成对本发明要求的保护范围的限定或限制。
实验试剂盒仪器：
激光共聚焦显微镜拉曼光谱仪(英国Renisaw公司)、金纳米笼、磷酸三氯乙基酯(TCEP，98％，Alfa Aesar公司)、所用DNA序列(生工生物工程(上海)股份有限公司)、缓冲液的成分：三羟甲基氨基甲烷-盐酸(以下简称Tris-HCl)和MgCl2溶液。
实施例1
1.超支化树枝状结构DNA纳米分子的制备：将4μL 10-5M的序列F2与6μL 10-5M序列F3混合，85℃反应五分钟，20min冷却到25℃，同样将8μL10-5M序列F5与12μL 10-5M序列F6以相同的反应条件进行反应；将所得的产物分别加入4μL 10-5M序列F4和8μL 10-5M序列F7于25℃下反应4小时；将第二步所得的产物分别取3μL和6μL，并加入1μL 10-5M序列F1(靶标miRNA)于25℃下反应30分钟。
F1：TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG A；
F2：5’Rox-GTG TGC CTA TTA TGT CTC CTC CTG TGT GCC TAT TAT GTC TCC TCCTTC AAC ATC AGT CTG ATA AGC TA-3’Biotin；
F3：TAT CAG ACT GAT GTT GAG ACA TAA TAG GCA CAC GAC ATA ATA GGC ACA C；
F4：GTG CCT ATT ATG TCG TGT GCC TAT TAT GTC TCA ACA；
F5：AGG AGG AGA CAT AAT AGG CAC ACT AGC TTA TCA GAC TGA TGT TGA-3’Rox；
F：TCA ACA TCA GTC TGA GTG TGC CTA TTA TGT CTC；
F7：GCA CAC TGC GAC TGA TGT T。
2.SERS信号探针的制备：将合成的超支化的DNA纳米分子(含有Rox和Cy3)，加入100μL的新鲜制备的5nM金纳米笼溶液中，混合均匀。在37℃下轻微振荡避光反应24h，将反应获得的混合溶液，在经过15000rpm的转速离心15min后，上清液去除后，紫红色沉淀物洗净，离心三次。最后将所得SERS探针分散在0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH7.4)中，并保存在4℃下。
金纳米笼(AuNCs)的制备：金纳米笼的制备是通过柠檬酸钠还原氯金酸(HAuCl4)的过程。将50mL 0.01％氯金酸溶液于100mL的三口烧瓶中加热并搅拌，加入100μL AgNO3(6m mol/L)冷凝回流至沸腾，快速加入0.4mL的1％柠檬酸钠。将生成得反应溶液在持续煮沸20分钟，可以观察到溶液的颜色从浅黄色变为红色、紫色，最后变为浅蓝色，表明AuNCs的形成。得到的AuNCs自然冷却至室温。将制备的金纳米笼转移至棕色瓶中，闭光保存在4℃下备用。
实施例2
1.超支化树枝状结构DNA纳米分子的制备：将4μL 10-5M的序列g2与6μL 10-5M序列g3混合，85℃反应五分钟，20min冷却到25℃，同样将8μL 10-5M序列g5与12μL 10-5M序列gF6以相同的反应条件进行反应；将所得的产物分别加入4μL 10-5M序列g4和8μL 10-5M序列g7于25℃下反应4小时；将第二步所得的产物分别取3μL和6μL，并加入1μL 10-5M序列g1(靶标miRNA)于25℃下反应30分钟。
g1：TTA ATG CTA ATC GTG ATA GGG GT；
g2：5’Cy3-GTG TGC CTA TTA TGT CTC CTC CTG TGT GCC TAT TAT GTC TCC TCCTAC CCC TAT CAC GAT TAG CAT TAA-3’SH C3；
g3：GCT AAT CGT GAT AGG GGT GAC ATA ATA GGC ACA CGA CAT AAT AGG CACAC；
g4：GTG CCT ATT ATG TCG TGT GCC TAT TAT GTC ACC CCT；
g5：AGG AGG AGA CAT AAT AGG CAC ACT TAA TGC TAA TCG TGA TAG GGG T-3’Cy3；
g6：ACC CCT ATC ACG ATT AGT GTG CCT ATT ATG TCT C；
g7：GCACACTAATCGTGATAGGG。
2.SERS信号探针的制备：将合成的超支化的DNA纳米分子(含有Rox和Cy3)，加入100μL的新鲜制备的5nM金纳米笼溶液中，混合均匀。在37℃下轻微振荡避光反应24h，将反应获得的混合溶液，在经过15000rpm的转速离心15min后，上清液去除后，紫红色沉淀物洗净，离心三次。最后将所得SERS探针分散在0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH7.4)中，并保存在4℃下。
金纳米笼(AuNCs)的制备：金纳米笼的制备是通过柠檬酸钠还原氯金酸(HAuCl4)的过程。将50mL 0.01％氯金酸溶液于100mL的三口烧瓶中加热并搅拌，加入100μL AgNO3(6m mol/L)冷凝回流至沸腾，快速加入0.4mL的1％柠檬酸钠。将生成得反应溶液在持续煮沸20分钟，可以观察到溶液的颜色从浅黄色变为红色、紫色，最后变为浅蓝色，表明AuNCs的形成。得到的AuNCs自然冷却至室温。将制备的金纳米笼转移至棕色瓶中，闭光保存在4℃下备用。
实施例3
将实施例1和2得到的SERS探针分别稀释到10μL进行SERS测试，结果如下：
如图4中a所示，随着miRNAs(以miR-21为例)浓度的升高，SERS信号强度增加。工作曲线见图4中c所示，当同时检测到10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、10-11M的miR-21和miR-155(比例为1：1)。miR-155的校准曲线在10-16至10-11M范围内呈线性，检出限为3.5×10-17M(S/N＝3)；校准方程的计算公式为ΔICy3＝2.5816lgCmiR155+42.0271(ΔICy3＝I﹣I0)，其中I是存在miR-155时的拉曼强度，I0是不存在miR-155时的拉曼强度，CmiR-155是miR-155的浓度，以及相应的相关系数(校正曲线的R2为0.9933，n＝10)。
工作曲线见图4中c所示，miR-21的校正曲线在10-16至10-11M范围内呈线性，检出限为3.5×10-17M(S/N＝3)；校准方程的计算公式为ΔIRox＝2.2712lgCmiR-21+37.3817(ΔIRox＝I﹣I0)，其中I是存在miR-21时的拉曼强度，I0是不存在miR-21时的拉曼强度，CmiR-21是miR-21的浓度，以及相应的相关系数(校准曲线的R)为0.9991(n＝10)，呈现很好的线性关系。根据信噪比(S/N＝3)规则，该试剂盒对miR-21的检测限为3.5×10-17M。
综上所述，靶标miRNA的参与是DNA的HCR超支化过程的关键，只有在存在特异性的靶标癌症标志物miRNA的情况下，才会触发接下来一系列相应的HCR反应。该过程就相当于是一个在每一个原底物的基础上产生了两个新的子模板的聚合酶链反应过程，最初受保护的靶标触发序列将会暴露在每条新生长的分支链中。在不受到空间效应的影响下，该树枝状结构的链分支生长将会成指数增加的方式程序生长，同时，组装的树枝状结构的荧光强度也随时间成一定程度的指数增长。
首先，合成了具有增强拉曼特性的SERS信号探针AuNCs@DNA，然后借助目标miRNA响应的HCR实现了ROX/Cy3信号分子的聚集和扩增。最后通过监测AuNCs增强的SERS信号反映目标miRNA的表达水平。AuNCs@DNA良好响应肿瘤细胞内的miRNA-21和miRNA-155并且显示出互不干扰的SERS信号。通过进一步的实验发现，SERS信号的强度与肿瘤细胞内的miRNA的表达水平相关，因此AuNCs@DNA量化活细胞中miRNA表达水平的特性在疾病进程诊断和疗效评估中有巨大的潜力。更重要的是，我们提供了一种非破坏性的超灵敏的SERS方法对不同种类的肿瘤标志物进行检测，这将极大提高疾病诊断和评估的准确性。
只有存在相应的靶标miR-21/miR-155时才会在出现明显的拉曼信号，单碱基错配的miRNA相较于靶标miRNA与捕获探针的互补杂交效率分别有明显的的下降，当使用上述制备的SERS信号探针检测miR-203、miR-let-7a时，只观察到接近背景的响应信号。以上实验结果表明，基于自组装DNA多枝化反应的SERS双信号探针具有出色的选择性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东中医药大学
<120> 一种基于DNA超支化自组装检测肺癌标志物的SERS探针和试剂盒
<141> 2022-03-08
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgtgcctat tatgtctcct cctgtgtgcc tattatgtct cctccttcaa catcagtctg 60
ataagcta 68
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatcagactg atgttgagac ataataggca cacgacataa taggcacac 49
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgcctatta tgtcgtgtgc ctattatgtc tcaaca 36
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggaggagac ataataggca cactagctta tcagactgat gttga 45
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaacatcag tctgagtgtg cctattatgt ctc 33
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcacactgcg actgatgtt 19
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttaatgctaa tcgtgatagg ggt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgtgcctat tatgtctcct cctgtgtgcc tattatgtct cctcctaccc ctatcacgat 60
tagcattaa 69
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctaatcgtg ataggggtga cataataggc acacgacata ataggcacac 50
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgcctatta tgtcgtgtgc ctattatgtc acccct 36
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggaggagac ataataggca cacttaatgc taatcgtgat aggggt 46
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acccctatca cgattagtgt gcctattatg tctc 34
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcacactaat cgtgataggg 20
<210> 15
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uagcuuauca gacuaauguu ga 22
<210> 16
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23

Claims (10)

1.一种基于DNA超支化自组装检测肺癌标志物的SERS探针，其特征在于，所述肺癌标志物包括miRNAs-21和/或miRNA-155；
当肺癌标志物为miRNAs-21时，所述SERS探针的制备方法包括：
1)将序列F2与序列F3在85℃下反应5min，再与序列F4反应，得到产物A；
2)将序列F5与序列F6在85℃下反应5min，再与序列F7反应，得到产物B；
3)将所述步骤1)得到的产物A、步骤2)得到的产物B和序列F1反应，得到超支化树枝状结构DNA纳米分子；
所述序列F1～F7的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～7所示；
4)将所述步骤3)得到的超支化树枝状结构DNA纳米分子与金纳米笼在37℃下避光反应24h，得到SERS探针；
当肺癌标志物为miRNAs-155时，SERS探针的制备方法包括：
a、将序列g2与序列g3在85℃下反应5min，再与序列g4反应，得到产物I；
b、将序列g5与序列g6在85℃下反应5min，再与序列g7反应，得到产物II；
c、将所述步骤a得到的产物I、步骤b得到的产物II和序列g1反应，得到超支化树枝状结构DNA纳米分子；
所述序列g1～g7的核苷酸序列依次如SEQ ID No.8～14所示；
d、将所述步骤c得到的超支化树枝状结构DNA纳米分子与金纳米笼在37℃下避光反应24h，得到SERS探针。
2.根据权利要求1所述的SERS探针，其特征在于，所述步骤1)中序列F2和序列F3的体积比为2:3，所述序列F2和序列F3的浓度均为10-5M；
与序列F4反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
3.根据权利要求1所述的SERS探针，其特征在于，所述步骤2)中序列F5和序列F6的体积比为2:3，所述序列F5和序列F6的浓度均为10-5M；
与序列F7反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
4.根据权利要求1所述的SERS探针，其特征在于，所述步骤3)产物A、产物B和序列F1反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为30min。
5.根据权利要求1所述的SERS探针，其特征在于，所述步骤a中序列g2和序列g3的体积比为2:3，所述序列g2和序列g3的浓度均为10-5M；
与序列g4反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
6.根据权利要求1所述的SERS探针，其特征在于，所述步骤b中序列g5和序列g6的体积比为2:3，所述序列g5和序列g6的浓度均为10-5M；
与序列g7反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为4h。
7.根据权利要求1所述的SERS探针，其特征在于，所述步骤c产物I、产物II和序列g1反应的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为30min。
8.一种基于DNA超支化自组装检测肺癌标志物的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的SERS探针和磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述肺癌标志物包括miRNAs-21和/或miRNA-155。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113082226A (zh) * 2021-04-27 2021-07-09 山东中医药大学 一种载药纳米笼的制备方法与其靶向循环肿瘤细胞释放雷公藤甲素的应用

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102811943A (zh) * 2009-12-11 2012-12-05 韩国化学研究院 拉曼活性分子位于纳米粒子二聚体的结合部的二聚体核壳纳米粒子、其用途及制备方法
US20140038194A1 (en) * 2012-08-03 2014-02-06 The Curators Of The University Of Missouri Method For Early Detection of Lung Cancer
CN105274195A (zh) * 2014-12-11 2016-01-27 临沂大学 一种检测癌症标志物微小核糖核酸的试剂盒
US20160256930A1 (en) * 2015-03-02 2016-09-08 Polyvalor, Société En Commandite Alloy nanoparticles, process for their preparation and use thereof
CN109321635A (zh) * 2018-09-19 2019-02-12 嘉兴学院 一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法及应用
KR20190081363A (ko) * 2017-12-29 2019-07-09 인천대학교 산학협력단 금 나노입자 결합 핵산 나노구조체를 이용한 신호증폭 및 응용 방법
CN110218818A (zh) * 2019-06-13 2019-09-10 南京邮电大学 一种登革病毒基因片段sers检测试剂盒及其制备方法
CN110455764A (zh) * 2019-08-29 2019-11-15 青岛科技大学 肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法
CN110628888A (zh) * 2019-06-12 2019-12-31 长沙理工大学 一组miRNA-21触发组装的核酸探针及细胞荧光成像
RU2717160C1 (ru) * 2019-09-19 2020-03-18 Российская Федерация, от имени которой выступает ФОНД ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Способ определения белков с помощью гигантского комбинационного рассеяния с использованием криозолей плазмонных наночастиц
RU2723160C1 (ru) * 2019-08-15 2020-06-09 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ обнаружения и определения днк с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния
CN113136417A (zh) * 2021-04-22 2021-07-20 扬州大学 用于检测肺癌标志物的金纳米笼sers传感器及其制备方法
CN113308516A (zh) * 2021-04-29 2021-08-27 重庆医科大学 基于DNA树枝结构@Zr-MOF检测HBV-DNA的SPRi传感器的制备与应用

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102811943A (zh) * 2009-12-11 2012-12-05 韩国化学研究院 拉曼活性分子位于纳米粒子二聚体的结合部的二聚体核壳纳米粒子、其用途及制备方法
US20140038194A1 (en) * 2012-08-03 2014-02-06 The Curators Of The University Of Missouri Method For Early Detection of Lung Cancer
CN105274195A (zh) * 2014-12-11 2016-01-27 临沂大学 一种检测癌症标志物微小核糖核酸的试剂盒
US20160256930A1 (en) * 2015-03-02 2016-09-08 Polyvalor, Société En Commandite Alloy nanoparticles, process for their preparation and use thereof
KR20190081363A (ko) * 2017-12-29 2019-07-09 인천대학교 산학협력단 금 나노입자 결합 핵산 나노구조체를 이용한 신호증폭 및 응용 방법
CN109321635A (zh) * 2018-09-19 2019-02-12 嘉兴学院 一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法及应用
CN110628888A (zh) * 2019-06-12 2019-12-31 长沙理工大学 一组miRNA-21触发组装的核酸探针及细胞荧光成像
CN110218818A (zh) * 2019-06-13 2019-09-10 南京邮电大学 一种登革病毒基因片段sers检测试剂盒及其制备方法
RU2723160C1 (ru) * 2019-08-15 2020-06-09 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ обнаружения и определения днк с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния
CN110455764A (zh) * 2019-08-29 2019-11-15 青岛科技大学 肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法
RU2717160C1 (ru) * 2019-09-19 2020-03-18 Российская Федерация, от имени которой выступает ФОНД ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Способ определения белков с помощью гигантского комбинационного рассеяния с использованием криозолей плазмонных наночастиц
CN113136417A (zh) * 2021-04-22 2021-07-20 扬州大学 用于检测肺癌标志物的金纳米笼sers传感器及其制备方法
CN113308516A (zh) * 2021-04-29 2021-08-27 重庆医科大学 基于DNA树枝结构@Zr-MOF检测HBV-DNA的SPRi传感器的制备与应用

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HE Y 等: "Switchable Target-Responsive 3D DNA Hydrogels As a Signal Amplification Strategy Combining with SERS Technique for Ultrasensitive Detection of miRNA 155", 《ANAL CHEM》, vol. 89, no. 16, pages 8538 - 8544 *
SHEN M 等: "Self-assembly of DNA-hyperbranched aggregates catalyzed by a dual-targets recognition probe for miRNAs SERS detection in single cells. Biosens Bioelectron", 《BIOSENS BIOELECTRON》, vol. 222, pages 1 - 7 *
XUAN F等: "Triggering hairpin-free chain-branching growth of fluorescent DNA dendrimers for nonlinear hybridization chain reaction", 《J AM CHEM SOC》, vol. 136, no. 28, pages 9810 - 9813 *
ZENG Z 等: "Nonlinear hybridization chain reaction-based functional DNA nanostructure assembly for biosensing, bioimaging applications", 《BIOSENS BIOELECTRON》, vol. 173, pages 1 - 15 *
ZHENG J 等: "A new enzyme-free quadratic SERS signal amplification approach for circulating microRNA detection in human serum", 《CHEM COMMUN (CAMB)》, vol. 51, no. 90, pages 16271 - 16274 *
刘艳伟 等: "金纳米笼子的可控制备", 《山东工业技术》, vol. 2017, no. 05, pages 205 - 91 *
张有 等: "结合分支杂交链式反应与增强拉曼的DNA传感器", 《化学传感器》, vol. 2016, no. 2, pages 247 *
汤俊琪 等: "纳米金在肿瘤诊断中的应用", 《材料导报》, vol. 26, no. 9, pages 59 - 64 *
翟潇墨: "表面增强拉曼信号放大生物传感方法在生物活性分子检测中的应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)信息科技辑》, no. 8, pages 140 - 274 *
薛谨 等: "纸质空心金纳米笼SERS传感器的制备及对非小细胞肺癌患者痰液中miRNAs的快速高灵敏检测", 《高等学校化学学报》, vol. 42, no. 8, pages 2394 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113082226A (zh) * 2021-04-27 2021-07-09 山东中医药大学 一种载药纳米笼的制备方法与其靶向循环肿瘤细胞释放雷公藤甲素的应用
CN113082226B (zh) * 2021-04-27 2023-12-15 山东中医药大学 一种载药纳米笼的制备方法与其靶向循环肿瘤细胞释放雷公藤甲素的应用

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