CN111808925B - 基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法 - Google Patents
基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供的是基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs‑DNA步行器及制备方法,通过发卡结构的变换,引发AuNPs‑DNA步行器的渐进与行走,实现信号的一次放大;并且置换出的DNA链又能够再次将靶标置换出来,参与下一个循环,实现信号的进一步放大。通过该检测策略,能够实现对靶标信号的双重放大。通过该检测策略,能够实现对靶标信号的双重放大,极大地提高了检测的灵敏度;该体系的放大策略都是基于发卡结构的转换,传感器的检测体系比较简单,易于操作。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法。
背景技术
近年来,基于金属纳米颗粒,尤其是基于金纳米颗粒(gold nanoparticles,AuNPs)的方法已经被广泛用于构建DNA功能化的生物传感器。构建DNA功能化的AuNPs生物传感器的方式多种多样。为了提高灵敏度,可以在AuNPs表面构建三维DNA轨道以及AuNPs-DNA步行器(DNA Walker),通过目标或外在条件的驱动,由AuNPs-DNA步行器来实现信号的放大与目标检测。驱动这种三维轨道运动的动力主要有辅助DNAzymes切割底物的金属离子、核酸杂交、ATP和光活化等。这些DNA Walker纳米机器采用了不同的驱动方式,都能够在生物传感中实现信号放大。但是,这些纳米机器对目标的信号只是单次放大,只能有限地提高灵敏度。并且往往需要外加不同的酶或辅助探针才能实现信号放大,检测体系往往也比较复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法,用于胞内mRNA检测及成像。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明基于发卡结构的转换,设计了一种新型的AuNPs-DNA步行器。通过发卡结构的变换,引发AuNPs-DNA步行器的渐进与行走,实现信号的一次放大;并且置换出的DNA链又能够再次将靶标置换出来,参与下一个循环,实现信号的进一步放大。通过该检测策略,能够实现对靶标信号的双重放大。此外该双重放大的检测体系比较简单。
所述基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器,包括AuNPs-DNA步行器、靶标mRNA序列,Cu2+。
所述AuNPs-DNA步行器,包括:AuNPs、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B。
所述的靶标mRNA序列、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B,其序列分别是:
靶标mRNA序列:5'- AAGTATGCCAAAGACACTCGC -3';
步行链DNA链W:
5'-HS-(T)20GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACGTCAAGG -3',
轨道链DNA链T:
5'-Cy5AAGTATGCCAAAGACACTCGCTTTTTCTTTCTAATACGGCTTACCTATCGGCATACTTTTTT-HS -3',
封闭链DNA链B:
5'-AAAGCGAGTGTCTTTGGCATAAAAAGTCAAGGAAGTATGCCAAAGATTTCCTTGACGTTCTTTCT-3'。
上述基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法,包括以下步骤:
(1)金纳米粒子(AuNPs)的制备;
(2)DNA功能化的金纳米粒子(AuNPs-DNA步行器)的制备;
(3)靶标与AuNPs-DNA步行器反应;
(4)荧光检测。
所述的步骤(1)制备方法如下:首先,将实验室所有用到的玻璃仪器浸泡在王水(新鲜配制,VHCl:V HNO3=3:1)中12小时,再用大量的超纯水将玻璃仪器冲洗干净,放置于烘箱中烘干。然后,将50 mL、0.25 mM的氯金酸加入一个洗净并烘干过的圆底烧瓶,高速搅拌下,150 ºC油浴加热沸腾15 min。接着,将1 mL、质量分数1%新鲜配制的柠檬酸三钠快速地加入到沸腾的氯金酸溶液中。继续加热搅拌30 min,使柠檬酸钠反应完全。该过程可观察到溶液颜色逐渐由黄色变为黑色,紫色,最后变为酒红色。最后,移除加热装置,将圆底烧瓶置于磁力搅拌器下持续搅拌使溶液冷却至室温,之后置于4 ºC冰箱中保存备用。金纳米粒子浓度,根据文献报道的朗姆比尔定律:C=A450/ε450(其中ε450 = 5.41 × 108 M-1 cm-1)进行计算。
所述的步骤(2)DNA功能化的金纳米粒子(AuNPs-DNA步行器)的制备具体步骤:
(1)向1.5 mL的离心管中加入80 μL(10 nM)AuNPs溶液和28 μL的超纯水, 并加入12 μL的1% SDS以提高AuNPs的分散性,室温孵育15 min。
(2)向另一个1.5 mL的离心管中加入4 μL(10 μM)步行链DNA链W、4 μL(100 μM)轨道链DNA链T和46 μL 超纯水混合,并加入6 μL 50mM TCEP以活化DNA链,室温孵育15 min。
(3)将上述两个离心管对应的体系混合,再将40 μL(100 mM,10×,pH 7.4)PBS和180 μL超纯水加入到体系中,孵育15 min。之后将400 μL(2 M)NaCl溶液 加入到混合液中,为防纳米金发生聚集,需要一边逐滴加入NaCl溶液,一边剧烈震荡混合液。之后将混合液孵育过夜。用含有0.01 %吐温-20的1×PBS,12000 rpm离心15 min,吸弃上清液,取沉淀漂洗3次,去除未结合的核酸链。最后回溶到400 μL 含有0.01 %吐温-20的1×PBS中。加入1 μL100 μM的MCH,用于封闭金纳米粒子表面上的非特异性结合位点,并室温孵育60 min。之后再用含有0.01 %吐温-20的1×PBS,12000 rpm离心15 min,去上清液,取沉淀漂洗3次,去除多余的MCH。最后回溶到400 μL不含0.01 %吐温-20的1×PBS中。向体系中加入100 μL(25mM)MgCl2,100 μL(500 mM)NaCl,60 μL 10×PBS和335 μL 超纯水,并加入5 μL(10 μM)封闭链DNA链B混合,以确保步行链DNA链W被完全封闭,然后室温中避光孵育过夜。用含有0.01%吐温-20的1×PBS,12000 rpm, 15 min,去上清液,取沉淀漂洗3次,去除未结合的核酸链。将AuNPs-DNA步行器分为两个部分,一部分回溶到含0.01 %吐温-20的1×PBS,应用于胞外实验;另一部分回溶到不含0.01 %吐温-20的1×PBS,应用于胞内实验。置于4 ºC冰箱中保存备用。
所述靶标与AuNPs-DNA步行器反应方法为:将不同浓度的靶标mRNA、终浓度1 nMAuNPs-DNA步行器以及终浓度0.5 μM Cu2+置于0.01%吐温-20的1×PBS中,反应80 min。
构建流程示意图原理图详述:如图1所示,在AuNP表面修饰一定数量的DNA链T和DNA链W。其中DNA链T(track)作为轨道链,其靠近AuNP表面的5’末端修饰了荧光基团Cy5,因此Cy5能够被AuNP高效淬灭。DNA链W(walker)作为步行链,用DNA链B(block)封闭。DNA链W与DNA链T部分序列杂交形成活性的Cu2+依赖性DNAzyme结构。当向AuNPs - DNA步行器中加入靶标mRNA(TK1)时,DNA链B的末端与靶标结合,DNA链B的发卡结构翻转(虚线框部分),进而被置换出来,生成DNA链B*。DNA链B离开DNA链W之后,DNA链W与DNA链T部分序列杂交,从而形成对Cu2+敏感的DNAzyme结构。在Cu2+存在的条件下,该结构的作用位点被切割。DNA链T中含有Cy5的DNA链R(release)被释放,因此Cy5的荧光恢复。与此同时,DNA链R能够与置换下来的DNA链B*再次杂交,置换出mRNA(TK1)。靶标mRNA继续参与下一个循环。一方面靶标结合DNA链B,DNA链B发卡结构翻转使得DNA链W沿着特定的轨道(DNA链T)逐步切割、释放DNA链R。这实现了对靶标的放大;另一方面释放的DNA链R能够与DNA链B*杂交,进而置换出mRNA(TK1)参与下一个循环。这实现对靶标的进一步放大。如此沿着特定的轨道逐步切割,释放,置换,循环。从而实现对mRNA的荧光信号双重放大检测。
本发明的优点在于:
(1)通过该检测策略,能够实现对靶标信号的双重放大,极大地提高了检测的灵敏度。
(2)该体系的放大策略都是基于发卡结构的转换,传感器的检测体系比较简单,易于操作。
附图说明
图1为本发明的构建流程示意图。
图2为实施例1中不同浓度目标物的荧光图。
图3为实施例2中不同目标物的荧光选择性图。
图4为本方法胞内肿瘤细胞和正常细胞TK1成像的结果,其中:MCF-7细胞中显示的强红色荧光信号,MCF-10A细胞显示微弱的荧光信号。
具体实施方式
所述基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器,包括AuNPs-DNA步行器、靶标mRNA(TK1)序列,Cu2+。
所述AuNPs-DNA步行器,包括:AuNPs、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B。
所述的靶标mRNA(TK1)序列、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B,其序列分别是:
靶标mRNA(TK1)序列:5'- AAGTATGCCAAAGACACTCGC -3';
步行链DNA链W:5'-HS-(T)20GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACGTCAAGG -3',
轨道链DNA链T:
5'-Cy5AAGTATGCCAAAGACACTCGCTTTTTCTTTCTAATACGGCTTACCTATCGGCATACTTTTTT-HS -3',
封闭链DNA链B:
5'-AAAGCGAGTGTCTTTGGCATAAAAAGTCAAGGAAGTATGCCAAAGATTTCCTTGACGTTCTTTCT-3'。
实施例1
一种检测不同浓度靶标mRNA(TK1)的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法,包括以下步骤:
(1)金纳米粒子(AuNPs)的制备
(2)DNA功能化的金纳米粒子(AuNPs-DNA步行器)的制备
(3)不同浓度靶标mRNA(TK1)与AuNPs-DNA步行器反应。
(4)荧光检测。
步骤(1)的具体方法为:首先,将实验室所有用到的玻璃仪器浸泡在王水(新鲜配制,VHCl:V HNO3=3:1)中12小时,再用大量的超纯水将玻璃仪器冲洗干净,放置于烘箱中烘干。然后,将50 mL、0.25 mM的氯金酸加入一个洗净并烘干过的圆底烧瓶,高速搅拌下,150℃油浴加热沸腾15 min。接着,将1 mL、质量分数1%新鲜配制的柠檬酸三钠快速地加入到沸腾的氯金酸溶液中。继续加热搅拌30 min,使柠檬酸钠反应完全。该过程可观察到溶液颜色逐渐由黄色变为黑色,紫色,最后变为酒红色。最后,移除加热装置,将圆底烧瓶置于磁力搅拌器下持续搅拌使溶液冷却至室温,之后置于4 ℃冰箱中保存备用。金纳米粒子浓度,根据文献报道的朗姆比尔定律:C=A450/ε450(其中ε450 = 5.41×108 M-1 cm-1)进行计算。
步骤(2)的具体方法为:向1.5 mL的离心管中加入80 μL(10 nM)AuNPs溶液和28 μL的超纯水, 并加入12 μL的1% SDS以提高AuNPs的分散性,室温孵育15 min。向另一个1.5mL的离心管中加入4 μL(10 μM)DNA链W、4 μL(100 μM)DNA链T和46 μL 超纯水混合,并加入6 μL 50mM TCEP以活化DNA链,室温孵育15 min。将上述两个离心管对应的体系混合,再将40 μL(100 mM,10×,pH 7.4)PBS和180 μL超纯水加入到体系中,孵育15 min。之后将400 μL(2 M)NaCl溶液加入到混合液中,为防纳米金发生聚集,需要一边逐滴加入NaCl溶液,一边剧烈震荡混合液。之后将混合液孵育过夜。用含有0.01 %吐温-20的1×PBS,12000 rpm离心15 min,吸弃上清液,取沉淀漂洗3次,去除未结合的核酸链。最后回溶到400 μL 含有0.01%吐温-20的1×PBS中。加入1 μL 100 μM的MCH,用于封闭金纳米粒子表面上的非特异性结合位点,并室温孵育60 min。之后再用含有0.01 %吐温-20的1×PBS,12000 rpm离心15min,吸弃上清液,取沉淀漂洗3次,去除多余的MCH。最后回溶到400 μL不含0.01 %吐温-20的1×PBS中。向体系中加入100 μL(25 mM)MgCl2,100 μL(500 mM)NaCl,60 μL 10×PBS和335 μL 超纯水,并加入5 μL(10 μM)DNA链B以确保DNA链W被完全封闭,然后室温中避光孵育过夜。用含有0.01%吐温-20的1×PBS,12000 rpm,15 min,吸弃上清液,取沉淀漂洗3次,去除未结合的核酸链。获得AuNPs-DNA步行器,将AuNPs-DNA步行器分为两个部分,一部分回溶到含0.01 %吐温-20的1×PBS,应用于胞外实验;另一部分回溶到不含0.01 %吐温-20的1×PBS,应用于胞内实验。置于4℃冰箱中保存备用。
步骤(3)的具体方法为:将一系列不同浓度(0、 0.02 nM、0.05 nM、0.1 nM、0.2nM、0.5 nM、1 nM、2 nm、5 nm、10 nM、20 nM、100 nM)的靶标mRNA(TK1)、终浓度1 nM的AuNPs-DNA步行器以及终浓度0.5 μM Cu2+置于0.01 %吐温-20的1×PBS中,反应80 min。
步骤(4)的具体方法为:将反应后的混合液用滴管转移至荧光比色皿中,用荧光仪检测。Cy5激发波长640 nm、发射波长664 nm。作对应的荧光光谱,所有实验至少重复三次。
读取荧光信号变化,测定结果如图2所示。随着目标浓度的增加,Cy5的荧光信号增加,该方法的检测下限为49.5 pM。
实施例2
一种检测靶标mRNA(TK1)的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法,包括以下步骤:
(1)金纳米粒子(AuNPs)的制备
(2)DNA功能化的金纳米粒子(AuNPs-DNA步行器)的制备
(3)不同靶标mRNA(TK1)与AuNPs-DNA步行器反应。
(4)荧光检测。
步骤(1)、(2)、(4)同实施例1。
所述的步骤(3)的反应过程的主要步骤如下:分别将10 nM的靶标mRNA(TK1)、三个干扰靶标(c-myc,survivin和c-raf-1)以及空白样品加入到含有1 nM的AuNPs-DNA步行器以及0.5 μM的Cu2+置于0.01 %吐温-20的1×PBS中,反应80 min。干扰靶标c-myc序列:5'-CCTCAACGTTAGCTTCACCAA -3'。干扰靶标survivin序列:5'- CAAGGAGCTGGAAGGCTGGG -3'。干扰靶标c-raf-1序列:5'- AATGCATGTCACAGGCGGGA -3'
读取荧光信号变化,每组数据平行测定三次,测定结果如图3所示。与空白样品的荧光信号值相比,当只有干扰靶标存在的时候,检测结果无明显变化。而对靶标mRNA(TK1)进行检测的时候,可以获得显著增加的荧光信号值。这些结果证明AuNPs-DNA步行器能够特异性地识别靶标,展现了其良好的选择性。
实施例3
一种胞内靶标mRNA(TK1)成像的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法,包括以下步骤:
(1)金纳米粒子(AuNPs)的制备
(2)DNA功能化的金纳米粒子(AuNPs-DNA步行器)的制备
(3)细胞与AuNPs-DNA步行器共孵育。
(4)共聚焦成像。
步骤(1)、(2)同实施例1。
所述的步骤(3)的反应过程的主要步骤如下:将MCF-7细胞和MCF-10A细胞分别接种于荧光板上,使得每个荧光板的细胞数目约为4×104,用1640培养液(含1640培养基、10%FBS、100 U/mL链霉素和100 U/mL青霉素)培养,然后将荧光板置于含有5% CO2和95%空气的37 ℃恒温培养箱中孵育。24 h后。弃去旧的培养液,将细胞与5 μM的Cu 2+(10 μL)在新的培养液(90 μL)中于37 ℃、5%CO2条件下孵育60 min,然后加入新的培养液(90 μL)和10 nMAuNPs-DNA步行器(10 μL),继续孵育4小时后,弃去旧的培养液,用PBS洗涤3次,加入1 mL饥饿液(无血清培养基)。
所述的步骤(4)的反应过程的主要步骤如下:使用荧光共聚焦显微镜在40×的物镜下,对荧光板进行共聚焦成像。
测定结果如图4所示。从MCF-7细胞中观察到了Cy5的强红色荧光信号,而MCF-10A细胞在相同条件下均显示出微弱的荧光信号。这表明该AuNPs-DNA步行器可用于定性分析不同细胞中的TK1表达水平,区别肿瘤细胞和正常细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法
<130> 7
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttttttttt tttttttttt ggtaagcctg ggcctctttc tttttaagaa agaacgtcaa 60
gg 62
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aagtatgcca aagacactcg ctttttcttt ctaatacggc ttacctatcg gcatactttt 60
tt 62
<210> 3
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaagcgagtg tctttggcat aaaaagtcaa ggaagtatgc caaagatttc cttgacgttc 60
tttct 65
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aagtatgcca aagacactcg c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctcaacgtt agcttcacca a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caaggagctg gaaggctggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatgcatgtc acaggcggga 20
Claims (2)
1.基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器,其特征在于:包含AuNPs-DNA步行器、靶标mRNA,Cu2+;
所述AuNPs-DNA步行器,包括:AuNPs、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B;
所述步行链DNA链W:
5’-HS-(T)20GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACGTCAAGG-3’ ;
轨道链DNA链T:
5’-Cy5AAGTATGCCAAAGACACTCGCTTTTTCTTTCTAATACGGCTTACCTATCGGCATACTTTTTT-HS-3’,
封闭链DNA链B:
5’-AAAGCGAGTGTCTTTGGCATAAAAAGTCAAGGAAGTATGCCAAAGATTTCCTTGACGTTCTTTCT-3’ ;
所述靶标mRNA序列为5’- AAGTATGCCAAAGACACTCGC-3’。
2.如权利要求1所述的基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)AuNPs的制备;
(2)AuNPs-DNA步行器的制备;
(3)靶标与AuNPs-DNA步行器反应;
(4)荧光检测;
所述的步骤(2)AuNPs-DNA步行器的制备具体步骤:
①向1.5 mL的离心管中加入80 μL、10 nM AuNPs溶液和28 μL的超纯水,并加入12 μL的1wt .% SDS以提高AuNPs的分散性,室温孵育15 min;
②向另一个1.5 mL的离心管中加入4 μL 10 μM 步行链DNA链W、 4 μL 100 μM 轨道链DNA链T和46 μL 超纯水,混合,并加入6 μL 50mM TCEP以活化DNA链,室温孵育15 min;
③将上述两个离心管对应的体系混合,再将40 μL、100 mM、10×、pH 7.4 PBS和180 μL超纯水加入到体系中,孵育15 min;之后将400 μL 2 M NaCl加入到混合液中,为防纳米金发生聚集,需要一边逐滴加入NaCl,一边剧烈震荡混合液;之后将混合液孵育过夜;用含有0.01wt . %吐温-20的1×PBS,12000 rpm离心15 min,吸弃上清液,取沉淀漂洗3次,去除未结合的核酸链;最后回溶到400 μL 含有0.01 %吐温-20的1×PBS中;加入1 μL 100 μM的MCH,用于封闭金纳米粒子表面上的非特异性结合位点,并室温孵育60 min;之后再用含有0.01 %吐温-20的1×PBS,12000 rpm离心15 min,吸弃上清液,取沉淀漂洗3次,去除多余的MCH;最后回溶到400 μL不含0.01 %吐温-20的1×PBS中;向体系中加入100 μL 25 mMMgCl2,100 μL 500 mM NaCl,60 μL 10×PBS和335 μL 超纯水,并加入5 μL 10 μM 封闭链DNA链B,以确保步行链DNA链W被完全封闭,然后室温中避光孵育过夜;用含有0.01%吐温-20的1×PBS,12000 rpm 15 min,漂洗3次,去除未结合的核酸链,最终获得DNA功能化的AuNPs;置于4 ℃冰箱中保存备用;
所述靶标与AuNPs-DNA步行器反应方法为:将不同浓度的靶标mRNA、终浓度1 nMAuNPs-DNA步行器以及终浓度0.5 μM Cu2+置于0.01%吐温-20的1×PBS中,反应80 min。
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