CN111808925B - 基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法 - Google Patents
基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供的是基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs‑DNA步行器及制备方法，通过发卡结构的变换，引发AuNPs‑DNA步行器的渐进与行走，实现信号的一次放大；并且置换出的DNA链又能够再次将靶标置换出来，参与下一个循环，实现信号的进一步放大。通过该检测策略，能够实现对靶标信号的双重放大。通过该检测策略，能够实现对靶标信号的双重放大，极大地提高了检测的灵敏度；该体系的放大策略都是基于发卡结构的转换，传感器的检测体系比较简单，易于操作。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法。
背景技术
近年来，基于金属纳米颗粒，尤其是基于金纳米颗粒（gold nanoparticles,AuNPs）的方法已经被广泛用于构建DNA功能化的生物传感器。构建DNA功能化的AuNPs生物传感器的方式多种多样。为了提高灵敏度，可以在AuNPs表面构建三维DNA轨道以及AuNPs-DNA步行器（DNA Walker），通过目标或外在条件的驱动，由AuNPs-DNA步行器来实现信号的放大与目标检测。驱动这种三维轨道运动的动力主要有辅助DNAzymes切割底物的金属离子、核酸杂交、ATP和光活化等。这些DNA Walker纳米机器采用了不同的驱动方式，都能够在生物传感中实现信号放大。但是，这些纳米机器对目标的信号只是单次放大，只能有限地提高灵敏度。并且往往需要外加不同的酶或辅助探针才能实现信号放大，检测体系往往也比较复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法，用于胞内mRNA检测及成像。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明基于发卡结构的转换，设计了一种新型的AuNPs-DNA步行器。通过发卡结构的变换，引发AuNPs-DNA步行器的渐进与行走，实现信号的一次放大；并且置换出的DNA链又能够再次将靶标置换出来，参与下一个循环，实现信号的进一步放大。通过该检测策略，能够实现对靶标信号的双重放大。此外该双重放大的检测体系比较简单。
所述基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器，包括AuNPs-DNA步行器、靶标mRNA序列，Cu2+。
所述AuNPs-DNA步行器，包括：AuNPs、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B。
所述的靶标mRNA序列、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B，其序列分别是：
靶标mRNA序列：5'- AAGTATGCCAAAGACACTCGC -3'；
步行链DNA链W：
5'-HS-(T)20GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACGTCAAGG -3'，
轨道链DNA链T：
5'-Cy5AAGTATGCCAAAGACACTCGCTTTTTCTTTCTAATACGGCTTACCTATCGGCATACTTTTTT-HS -3'，
封闭链DNA链B：
5'-AAAGCGAGTGTCTTTGGCATAAAAAGTCAAGGAAGTATGCCAAAGATTTCCTTGACGTTCTTTCT-3'。
上述基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法，包括以下步骤：
（1）金纳米粒子（AuNPs）的制备；
（2）DNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-DNA步行器）的制备；
（3）靶标与AuNPs-DNA步行器反应；
（4）荧光检测。
所述的步骤（1）制备方法如下：首先，将实验室所有用到的玻璃仪器浸泡在王水（新鲜配制，VHCl:V HNO3=3:1）中12小时，再用大量的超纯水将玻璃仪器冲洗干净，放置于烘箱中烘干。然后，将50 mL、0.25 mM的氯金酸加入一个洗净并烘干过的圆底烧瓶，高速搅拌下，150 ºC油浴加热沸腾15 min。接着，将1 mL、质量分数1%新鲜配制的柠檬酸三钠快速地加入到沸腾的氯金酸溶液中。继续加热搅拌30 min，使柠檬酸钠反应完全。该过程可观察到溶液颜色逐渐由黄色变为黑色，紫色，最后变为酒红色。最后，移除加热装置，将圆底烧瓶置于磁力搅拌器下持续搅拌使溶液冷却至室温，之后置于4 ºC冰箱中保存备用。金纳米粒子浓度，根据文献报道的朗姆比尔定律：C=A450/ε450（其中ε450 = 5.41 × 108 M-1 cm-1）进行计算。
所述的步骤（2）DNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-DNA步行器）的制备具体步骤：
（1）向1.5 mL的离心管中加入80 μL（10 nM）AuNPs溶液和28 μL的超纯水， 并加入12 μL的1% SDS以提高AuNPs的分散性，室温孵育15 min。
（2）向另一个1.5 mL的离心管中加入4 μL（10 μM）步行链DNA链W、4 μL（100 μM）轨道链DNA链T和46 μL 超纯水混合，并加入6 μL 50mM TCEP以活化DNA链，室温孵育15 min。
（3）将上述两个离心管对应的体系混合，再将40 μL（100 mM，10×，pH 7.4）PBS和180 μL超纯水加入到体系中，孵育15 min。之后将400 μL（2 M）NaCl溶液 加入到混合液中，为防纳米金发生聚集，需要一边逐滴加入NaCl溶液，一边剧烈震荡混合液。之后将混合液孵育过夜。用含有0.01 %吐温-20的1×PBS，12000 rpm离心15 min，吸弃上清液，取沉淀漂洗3次，去除未结合的核酸链。最后回溶到400 μL 含有0.01 %吐温-20的1×PBS中。加入1 μL100 μM的MCH，用于封闭金纳米粒子表面上的非特异性结合位点，并室温孵育60 min。之后再用含有0.01 %吐温-20的1×PBS，12000 rpm离心15 min，去上清液，取沉淀漂洗3次，去除多余的MCH。最后回溶到400 μL不含0.01 %吐温-20的1×PBS中。向体系中加入100 μL（25mM）MgCl2，100 μL（500 mM）NaCl，60 μL 10×PBS和335 μL 超纯水，并加入5 μL（10 μM）封闭链DNA链B混合，以确保步行链DNA链W被完全封闭，然后室温中避光孵育过夜。用含有0.01%吐温-20的1×PBS，12000 rpm， 15 min，去上清液，取沉淀漂洗3次，去除未结合的核酸链。将AuNPs-DNA步行器分为两个部分，一部分回溶到含0.01 %吐温-20的1×PBS，应用于胞外实验；另一部分回溶到不含0.01 %吐温-20的1×PBS，应用于胞内实验。置于4 ºC冰箱中保存备用。
所述靶标与AuNPs-DNA步行器反应方法为：将不同浓度的靶标mRNA、终浓度1 nMAuNPs-DNA步行器以及终浓度0.5 μM Cu2+置于0.01%吐温-20的1×PBS中，反应80 min。
构建流程示意图原理图详述：如图1所示，在AuNP表面修饰一定数量的DNA链T和DNA链W。其中DNA链T（track）作为轨道链，其靠近AuNP表面的5’末端修饰了荧光基团Cy5，因此Cy5能够被AuNP高效淬灭。DNA链W（walker）作为步行链，用DNA链B（block）封闭。DNA链W与DNA链T部分序列杂交形成活性的Cu2+依赖性DNAzyme结构。当向AuNPs - DNA步行器中加入靶标mRNA（TK1）时，DNA链B的末端与靶标结合，DNA链B的发卡结构翻转（虚线框部分），进而被置换出来，生成DNA链B*。DNA链B离开DNA链W之后，DNA链W与DNA链T部分序列杂交，从而形成对Cu2+敏感的DNAzyme结构。在Cu2+存在的条件下，该结构的作用位点被切割。DNA链T中含有Cy5的DNA链R（release）被释放，因此Cy5的荧光恢复。与此同时，DNA链R能够与置换下来的DNA链B*再次杂交，置换出mRNA（TK1）。靶标mRNA继续参与下一个循环。一方面靶标结合DNA链B，DNA链B发卡结构翻转使得DNA链W沿着特定的轨道（DNA链T）逐步切割、释放DNA链R。这实现了对靶标的放大；另一方面释放的DNA链R能够与DNA链B*杂交，进而置换出mRNA（TK1）参与下一个循环。这实现对靶标的进一步放大。如此沿着特定的轨道逐步切割，释放，置换，循环。从而实现对mRNA的荧光信号双重放大检测。
本发明的优点在于：
（1）通过该检测策略，能够实现对靶标信号的双重放大，极大地提高了检测的灵敏度。
（2）该体系的放大策略都是基于发卡结构的转换，传感器的检测体系比较简单，易于操作。
附图说明
图1为本发明的构建流程示意图。
图2为实施例1中不同浓度目标物的荧光图。
图3为实施例2中不同目标物的荧光选择性图。
图4为本方法胞内肿瘤细胞和正常细胞TK1成像的结果，其中：MCF-7细胞中显示的强红色荧光信号，MCF-10A细胞显示微弱的荧光信号。
具体实施方式
所述基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器，包括AuNPs-DNA步行器、靶标mRNA（TK1）序列，Cu2+。
所述AuNPs-DNA步行器，包括：AuNPs、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B。
所述的靶标mRNA（TK1）序列、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B，其序列分别是：
靶标mRNA（TK1）序列：5'- AAGTATGCCAAAGACACTCGC -3'；
步行链DNA链W：5'-HS-(T)20GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACGTCAAGG -3'，
轨道链DNA链T：
5'-Cy5AAGTATGCCAAAGACACTCGCTTTTTCTTTCTAATACGGCTTACCTATCGGCATACTTTTTT-HS -3'，
封闭链DNA链B：
5'-AAAGCGAGTGTCTTTGGCATAAAAAGTCAAGGAAGTATGCCAAAGATTTCCTTGACGTTCTTTCT-3'。
实施例1
一种检测不同浓度靶标mRNA（TK1）的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法，包括以下步骤：
（1）金纳米粒子（AuNPs）的制备
（2）DNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-DNA步行器）的制备
（3）不同浓度靶标mRNA（TK1）与AuNPs-DNA步行器反应。
（4）荧光检测。
步骤（1）的具体方法为：首先，将实验室所有用到的玻璃仪器浸泡在王水（新鲜配制，VHCl:V HNO3=3:1）中12小时，再用大量的超纯水将玻璃仪器冲洗干净，放置于烘箱中烘干。然后，将50 mL、0.25 mM的氯金酸加入一个洗净并烘干过的圆底烧瓶，高速搅拌下，150℃油浴加热沸腾15 min。接着，将1 mL、质量分数1%新鲜配制的柠檬酸三钠快速地加入到沸腾的氯金酸溶液中。继续加热搅拌30 min，使柠檬酸钠反应完全。该过程可观察到溶液颜色逐渐由黄色变为黑色，紫色，最后变为酒红色。最后，移除加热装置，将圆底烧瓶置于磁力搅拌器下持续搅拌使溶液冷却至室温，之后置于4 ℃冰箱中保存备用。金纳米粒子浓度，根据文献报道的朗姆比尔定律：C=A450/ε450（其中ε450 = 5.41×108 M-1 cm-1）进行计算。
步骤（2）的具体方法为：向1.5 mL的离心管中加入80 μL（10 nM）AuNPs溶液和28 μL的超纯水， 并加入12 μL的1% SDS以提高AuNPs的分散性，室温孵育15 min。向另一个1.5mL的离心管中加入4 μL（10 μM）DNA链W、4 μL（100 μM）DNA链T和46 μL 超纯水混合，并加入6 μL 50mM TCEP以活化DNA链，室温孵育15 min。将上述两个离心管对应的体系混合，再将40 μL（100 mM，10×，pH 7.4）PBS和180 μL超纯水加入到体系中，孵育15 min。之后将400 μL（2 M）NaCl溶液加入到混合液中，为防纳米金发生聚集，需要一边逐滴加入NaCl溶液，一边剧烈震荡混合液。之后将混合液孵育过夜。用含有0.01 %吐温-20的1×PBS，12000 rpm离心15 min，吸弃上清液，取沉淀漂洗3次，去除未结合的核酸链。最后回溶到400 μL 含有0.01%吐温-20的1×PBS中。加入1 μL 100 μM的MCH，用于封闭金纳米粒子表面上的非特异性结合位点，并室温孵育60 min。之后再用含有0.01 %吐温-20的1×PBS，12000 rpm离心15min，吸弃上清液，取沉淀漂洗3次，去除多余的MCH。最后回溶到400 μL不含0.01 %吐温-20的1×PBS中。向体系中加入100 μL（25 mM）MgCl2，100 μL（500 mM）NaCl，60 μL 10×PBS和335 μL 超纯水，并加入5 μL（10 μM）DNA链B以确保DNA链W被完全封闭，然后室温中避光孵育过夜。用含有0.01%吐温-20的1×PBS，12000 rpm，15 min，吸弃上清液，取沉淀漂洗3次，去除未结合的核酸链。获得AuNPs-DNA步行器，将AuNPs-DNA步行器分为两个部分，一部分回溶到含0.01 %吐温-20的1×PBS，应用于胞外实验；另一部分回溶到不含0.01 %吐温-20的1×PBS，应用于胞内实验。置于4℃冰箱中保存备用。
步骤（3）的具体方法为：将一系列不同浓度（0、 0.02 nM、0.05 nM、0.1 nM、0.2nM、0.5 nM、1 nM、2 nm、5 nm、10 nM、20 nM、100 nM）的靶标mRNA（TK1）、终浓度1 nM的AuNPs-DNA步行器以及终浓度0.5 μM Cu2+置于0.01 %吐温-20的1×PBS中，反应80 min。
步骤（4）的具体方法为：将反应后的混合液用滴管转移至荧光比色皿中，用荧光仪检测。Cy5激发波长640 nm、发射波长664 nm。作对应的荧光光谱，所有实验至少重复三次。
读取荧光信号变化，测定结果如图2所示。随着目标浓度的增加，Cy5的荧光信号增加，该方法的检测下限为49.5 pM。
实施例2
一种检测靶标mRNA（TK1）的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法，包括以下步骤：
（1）金纳米粒子（AuNPs）的制备
（2）DNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-DNA步行器）的制备
（3）不同靶标mRNA（TK1）与AuNPs-DNA步行器反应。
（4）荧光检测。
步骤（1）、（2）、（4）同实施例1。
所述的步骤（3）的反应过程的主要步骤如下：分别将10 nM的靶标mRNA（TK1）、三个干扰靶标（c-myc，survivin和c-raf-1）以及空白样品加入到含有1 nM的AuNPs-DNA步行器以及0.5 μM的Cu2+置于0.01 %吐温-20的1×PBS中，反应80 min。干扰靶标c-myc序列：5'-CCTCAACGTTAGCTTCACCAA -3'。干扰靶标survivin序列：5'- CAAGGAGCTGGAAGGCTGGG -3'。干扰靶标c-raf-1序列：5'- AATGCATGTCACAGGCGGGA -3'
读取荧光信号变化，每组数据平行测定三次，测定结果如图3所示。与空白样品的荧光信号值相比，当只有干扰靶标存在的时候，检测结果无明显变化。而对靶标mRNA（TK1）进行检测的时候，可以获得显著增加的荧光信号值。这些结果证明AuNPs-DNA步行器能够特异性地识别靶标，展现了其良好的选择性。
实施例3
一种胞内靶标mRNA（TK1）成像的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法，包括以下步骤：
（1）金纳米粒子（AuNPs）的制备
（2）DNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-DNA步行器）的制备
（3）细胞与AuNPs-DNA步行器共孵育。
（4）共聚焦成像。
步骤（1）、（2）同实施例1。
所述的步骤（3）的反应过程的主要步骤如下：将MCF-7细胞和MCF-10A细胞分别接种于荧光板上，使得每个荧光板的细胞数目约为4×104，用1640培养液（含1640培养基、10%FBS、100 U/mL链霉素和100 U/mL青霉素）培养，然后将荧光板置于含有5% CO2和95%空气的37 ℃恒温培养箱中孵育。24 h后。弃去旧的培养液，将细胞与5 μM的Cu 2+（10 μL）在新的培养液（90 μL）中于37 ℃、5％CO2条件下孵育60 min，然后加入新的培养液（90 μL）和10 nMAuNPs-DNA步行器（10 μL），继续孵育4小时后，弃去旧的培养液，用PBS洗涤3次，加入1 mL饥饿液（无血清培养基）。
所述的步骤（4）的反应过程的主要步骤如下：使用荧光共聚焦显微镜在40×的物镜下，对荧光板进行共聚焦成像。
测定结果如图4所示。从MCF-7细胞中观察到了Cy5的强红色荧光信号，而MCF-10A细胞在相同条件下均显示出微弱的荧光信号。这表明该AuNPs-DNA步行器可用于定性分析不同细胞中的TK1表达水平，区别肿瘤细胞和正常细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法
<130> 7
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttttttttt tttttttttt ggtaagcctg ggcctctttc tttttaagaa agaacgtcaa 60
gg 62
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aagtatgcca aagacactcg ctttttcttt ctaatacggc ttacctatcg gcatactttt 60
tt 62
<210> 3
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaagcgagtg tctttggcat aaaaagtcaa ggaagtatgc caaagatttc cttgacgttc 60
tttct 65
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aagtatgcca aagacactcg c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctcaacgtt agcttcacca a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caaggagctg gaaggctggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatgcatgtc acaggcggga 20
Claims (2)
1.基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器，其特征在于：包含AuNPs-DNA步行器、靶标mRNA，Cu2+；
所述AuNPs-DNA步行器，包括：AuNPs、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B；
所述步行链DNA链W：
5’-HS-(T)20GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACGTCAAGG-3’ ；
轨道链DNA链T：
5’-Cy5AAGTATGCCAAAGACACTCGCTTTTTCTTTCTAATACGGCTTACCTATCGGCATACTTTTTT-HS-3’，
封闭链DNA链B：
5’-AAAGCGAGTGTCTTTGGCATAAAAAGTCAAGGAAGTATGCCAAAGATTTCCTTGACGTTCTTTCT-3’ ；
所述靶标mRNA序列为5’- AAGTATGCCAAAGACACTCGC-3’。
2.如权利要求1所述的基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）AuNPs的制备；
（2）AuNPs-DNA步行器的制备；
（3）靶标与AuNPs-DNA步行器反应；
（4）荧光检测；
所述的步骤（2）AuNPs-DNA步行器的制备具体步骤：
①向1.5 mL的离心管中加入80 μL、10 nM AuNPs溶液和28 μL的超纯水，并加入12 μL的1wt .% SDS以提高AuNPs的分散性，室温孵育15 min；
②向另一个1.5 mL的离心管中加入4 μL 10 μM 步行链DNA链W、 4 μL 100 μM 轨道链DNA链T和46 μL 超纯水，混合，并加入6 μL 50mM TCEP以活化DNA链，室温孵育15 min；
③将上述两个离心管对应的体系混合，再将40 μL、100 mM、10×、pH 7.4 PBS和180 μL超纯水加入到体系中，孵育15 min；之后将400 μL 2 M NaCl加入到混合液中，为防纳米金发生聚集，需要一边逐滴加入NaCl，一边剧烈震荡混合液；之后将混合液孵育过夜；用含有0.01wt . %吐温-20的1×PBS，12000 rpm离心15 min，吸弃上清液，取沉淀漂洗3次，去除未结合的核酸链；最后回溶到400 μL 含有0.01 %吐温-20的1×PBS中；加入1 μL 100 μM的MCH，用于封闭金纳米粒子表面上的非特异性结合位点，并室温孵育60 min；之后再用含有0.01 %吐温-20的1×PBS，12000 rpm离心15 min，吸弃上清液，取沉淀漂洗3次，去除多余的MCH；最后回溶到400 μL不含0.01 %吐温-20的1×PBS中；向体系中加入100 μL 25 mMMgCl2，100 μL 500 mM NaCl，60 μL 10×PBS和335 μL 超纯水，并加入5 μL 10 μM 封闭链DNA链B，以确保步行链DNA链W被完全封闭，然后室温中避光孵育过夜；用含有0.01%吐温-20的1×PBS，12000 rpm 15 min，漂洗3次，去除未结合的核酸链，最终获得DNA功能化的AuNPs；置于4 ℃冰箱中保存备用；
所述靶标与AuNPs-DNA步行器反应方法为：将不同浓度的靶标mRNA、终浓度1 nMAuNPs-DNA步行器以及终浓度0.5 μM Cu2+置于0.01%吐温-20的1×PBS中，反应80 min。
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