CN111205403B - 一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111205403B
CN111205403B CN202010035005.3A CN202010035005A CN111205403B CN 111205403 B CN111205403 B CN 111205403B CN 202010035005 A CN202010035005 A CN 202010035005A CN 111205403 B CN111205403 B CN 111205403B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polyacrylamide
dna
microspheres
nucleic acid
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010035005.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111205403A (zh
Inventor
王进科
王军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southeast University
Original Assignee
Southeast University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southeast University filed Critical Southeast University
Priority to CN202010035005.3A priority Critical patent/CN111205403B/zh
Publication of CN111205403A publication Critical patent/CN111205403A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111205403B publication Critical patent/CN111205403B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F283/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers provided for in subclass C08G
    • C08F283/04—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers provided for in subclass C08G on to polycarbonamides, polyesteramides or polyimides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2/00—Processes of polymerisation
    • C08F2/32—Polymerisation in water-in-oil emulsions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/24—Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules
    • C08J3/246—Intercrosslinking of at least two polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2333/00—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Derivatives of such polymers
    • C08J2333/24—Homopolymers or copolymers of amides or imides
    • C08J2333/26—Homopolymers or copolymers of acrylamide or methacrylamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2377/00—Characterised by the use of polyamides obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain; Derivatives of such polymers
    • C08J2377/04—Polyamides derived from alpha-amino carboxylic acids

Abstract

本发明公开了一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用，该聚丙烯酰胺微球主要由丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、N‑(3‑氨基丙基)甲基丙烯酰胺、过硫酸铵以及多聚赖氨酸构成，并经戊二醛进一步交联得到。本发明通过点样聚合和改进的反相微乳液聚合两种方法制备各种尺寸的聚丙烯酰胺微球，不仅具有可见荧光和近红外荧光、在强酸、强碱和高温等各种严苛条件下形态稳定，而且具有高正电荷，可用于有效捕获核酸分子如DNA。本发明同时提供一种使用聚丙烯酰胺微球从各种生物样品中快速提取DNA(3～5分钟)的新方法，吸附有DNA的聚丙烯酰胺微球可直接加入PCR反应，用于DNA分子的常规及定量PCR扩增检测。

Description

一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于核酸提取及检测生物技术领域，涉及一种基于聚丙烯酰胺微球的DNA快速提取及PCR检测新技术及其应用，具体涉及一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用。
背景技术
聚合酶链反应(PCR)扩增是进行DNA检测的有力工具，已广泛应用于基础生物学研究、医学诊断、法医学和农业科学等各个领域。在这些应用中，DNA提取对于PCR检测是不可避免的。但是，从样品中纯化DNA是一项复杂且限速的任务，需要训练有素的技术人员并涉及许多处理步骤。此外，还需要一些非常专业的材料(例如过滤管)和试剂(例如复杂的组分裂解液、结合液和洗涤液)。对于每天需要检测许多样本的临床技术人员而言，DNA纯化是一项繁琐的工作。因此，需要更简单和快速的DNA提取方法。
最近的已经报道了基于不同类型的固体基质的快速核酸提取方法，这些固体基质包括纸、氧化铝膜、二氧化硅和纤维素。这些方法直接从固体基质中扩增核酸而无需单独的核酸洗脱步骤，从而简化了核酸提取过程。然而，尽管简化了提取过程，所有这些方法仍然需要相对复杂的制备或实验程序，例如加热，这限制了它们的实用性。最近，开发了一种使用未经处理的纤维素纸快速提取DNA的新方法，其中整个DNA提取可在不到30秒的时间内完成。可以将附着在纸上的DNA快速洗入PCR溶液中进行PCR检测。尽管这是一种无需设备的核酸提取试纸法，具有简单，快速且成本低廉的优点，但其低的DNA吸收和洗脱效率可能会挑战其广泛的应用。而且，除非使用多重PCR，否则一个DNA吸附条只能用于检测一个靶标。此外，该方法也无法改进为机器自动化进行。
聚丙烯酰胺微球(PAMMP)由于其出色的生物相容性，易于控制的化学性质和物理性质而被广泛用于生物医学各领域。已有研究报道了基于PAMMP结合PCR扩增的单核苷酸多态性基因分型平台的构建。Shapero等将引物固定在制备的PAMMP上，通过PCR方法检测扩增的信号，实现高通量基因分型。此外，还合成了各种复合微球以用于不同用途。制备了具有双网状结构的聚丙烯酰胺/海藻酸钠复合微球，并测试了其对染料的吸收能力。聚丙烯酰胺/壳聚糖复合微球已用于消炎药的可控递送。功能改良的聚丙烯酰胺-接枝胶-karaya pH敏感复合微球已用于实现结肠靶向药物的输送。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球，使用该聚丙烯酰胺微球可在短短数分钟内完成从各种生物样品中提取核酸如DNA，带有核酸的聚丙烯酰胺微球可直接加入PCR反应液，用于目标核酸分子的PCR扩增检测。本发明的聚丙烯酰胺微球具有可见及近红外荧光性能；具有大量正电荷；具有酸、碱及高温等严苛处理下的稳定性，同时可高效静电吸附核酸分子，如DNA分子。
本发明还提供该用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球的制备方法和应用，重点还包括利用该聚丙烯酰胺微球提取快速提取核酸的方法。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球，所述聚丙烯酰胺微球主要由丙烯酰胺(AM)、甲叉双丙烯酰胺(MBA)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APMA)、过硫酸铵(APS)以及多聚赖氨酸(ε-PL)构成，并经戊二醛(GTA)进一步交联得到。
进一步地，所述聚丙烯酰胺微球具有可见及近红外荧光性能；具有大量正电荷；具有酸、碱及高温等严苛处理下的稳定性，同时可高效静电吸附核酸分子，如DNA分子。
本发明所述的用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球的制备方法，包括如下步骤：
聚丙烯酰胺微球经点样聚合法合成：将AM、MBA及APMA溶于去离子水中，获得均匀的丙烯酰胺单体溶液，将丙烯酰胺单体溶液、ε-PL和APS混合制备成混合液，将混合液点到附有聚乙烯的平皿上形成液滴，然后用含四甲基乙二胺(TEMED)的矿物油覆盖大量液滴，进行聚合形成聚丙烯酰胺微球；除去矿物油后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球并重悬于水中；在聚丙烯酰胺微球水溶液中加入戊二醛并孵育后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球除去过量的戊二醛，获得最终的可用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球。
本发明所述的用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球的制备方法，包括如下步骤：
聚丙烯酰胺微球经改进的反相微乳液聚合法合成：将Span 80和己烷加入到容器中，将混合物在氮气吹送下搅拌直至表面活性剂Span 80均匀分散，制成油相溶液；同时将丙烯酰胺、APMA和MBA溶解在去离子水中，以获得均匀的丙烯酰胺单体液体，然后将其与ε-PL和APS混合制备成水相溶液；将水相溶液加入到油相溶液中，然后将混合物在氮气吹送下搅拌；最后通过添加促进剂TEMED引发聚合反应，并将混合物充分搅拌，聚合形成聚丙烯酰胺微球；除去油相后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球并重悬于水中；在聚丙烯酰胺微球水溶液中加入戊二醛并孵育后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球除去过量的戊二醛，获得最终的可用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球。
本发明中将ε-PL包含在聚丙烯酰胺微球中，ε-PL富含大量氨基，经戊二醛交联后不仅可与聚丙烯酰胺发生共价交联，而且产生大量的C＝N键，赋予聚丙烯酰胺微球终产品显著的可见及红外荧光性能；此外，ε-PL的加入可显著改善聚丙烯酰胺微球的生物相容性。
进一步地，本发明中将APS直接加入水相溶液是本发明的主要创新；常规聚丙烯酰胺微球制备中，将APS加入油相，本发明发现这种方式下，形貌与荧光均匀稳定的聚丙烯酰胺微球。本发明通过将APS直接水相溶液，发现APS的加入不仅未显著影响乳浊液的形成，而且有利于形成形貌与荧光均匀稳定的聚丙烯酰胺微球。
本发明所述的用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球在核酸快速提取中的应用。
作为优选，所述核酸快速提取为使用裂解液裂解生物样品，之后将聚丙烯酰胺微球加入裂解物中，使核酸吸附在聚丙烯酰胺微球上，微球经洗涤液简单洗涤后，即可完成核酸的提取。
其中，所述裂解液包括各种组分的裂解液，尤其是单一组分的各种浓度氢氧化钠溶液。
作为优选，氢氧化钠溶液的浓度为0.4M。使用氢氧化钠溶液裂解各种生物样品，用于聚丙烯酰胺微球提取DNA，是本发明的最重要的创新之处。氢氧化钠溶液成分单一、环境友好、成本低廉。氢氧化钠溶液之所以可用于聚丙烯酰胺微球提取DNA方法中裂解样品，是因为如上所述本发明制备的聚丙烯酰胺微球在强酸及强碱条件下，性能非常稳定，不会发生解聚。此外，将聚丙烯酰胺微球直接加入氢氧化钠溶液裂解的样品裂解物中，并不影响核酸物质快速大量吸附到聚丙烯酰胺微球上。
其中，所述洗涤液包括各种组分的洗涤液；
作为优选，所述洗涤液是单一组分的洗涤液如水或乙醇溶液；
作为优选，所述洗涤液是水。水作为洗涤液是一种环境最友好、成本最低廉的洗涤液。我们发现由于本发明制备的聚丙烯酰胺微球富含大量正电荷，核酸物质如DNA一旦与聚丙烯酰胺微球结合，即使使用水洗涤，DNA也不会从聚丙烯酰胺微球上被洗脱。
其中，所述核酸吸附在聚丙烯酰胺微球上后可直接将带有核酸的聚丙烯酰胺微球加入常规PCR或定量PCR反应液中用于PCR扩增检测目标核酸分子。将带有DNA的聚丙烯酰胺微球直接加入常规PCR或定量PCR反应液中进行PCR检测是本发明的重要特点之一。本发明发现，聚丙烯酰胺微球吸附DNA不仅可以作为模板被PCR扩增，而且扩增产物可以以游离的方式存在于PCR反应溶液中，这极大地方便了常规PCR产物的凝胶电泳检测，以及定量PCR的实时动态检测。此外，这也说明，聚丙烯酰胺微球本身由于在高温下的高度稳定性，不会抑制或影响PCR反应。
其中，所述聚丙烯酰胺微球可经硼氢化钠处理后，消除其可见及近红外荧光，并不影响其DNA提取性能，但可改善后续用于定量PCR检测的灵敏性。
作为优选，所述核酸快速提取的具体过程为：(1)向样品如菌液、细胞液、液氮研磨的组织、血浆等中加入等体积裂解液如NaOH溶液，吹打或颠倒试管，混匀以便充分裂解细胞；(2)向裂解物中直接加入聚丙烯酰胺微球，移液器吹打或颠倒试管，混匀以便微球充分吸附DNA；(3)用去离子水洗涤微球，将微球重悬于水，完成DNA提取。
进一步地，基于聚丙烯酰胺微球的核酸快速提取方法，其优选程序如图1：(1)向样品(菌液、细胞液、液氮研磨的组织、血浆等)中加入等体积0.4M NaOH溶液，移液器吹打或颠倒试管数次，混匀以便充分裂解细胞；若需增加DNA收获量，此步可在置旋转混合器中旋转混合数分钟；(2)向裂解物中直接加入聚丙烯酰胺微球，移液器吹打或颠倒试管数次，混匀以便微球充分吸附DNA；若需增加DNA收获量，此步可在置旋转混合器中旋转混合数分钟；(3)用去离子水洗涤微球3次，将微球重悬于水，完成DNA提取。该提取程序为中的各各步反应时间为优选时间，但可对其进行调整以满足不同需求。
其中，在提取植物DNA时，上述步骤(1)中的0.4M NaOH溶液也可替换为另一种裂解缓冲液，其组分为：20mM Tris、25mM NaCl、2.5mM EDTA、0.05％SDS；步骤(3)中的洗涤液去离子水也可替换为另一种洗涤缓冲液，其组分为10mM Tris，pH 8.0，0.1％Tween 20％。
本发明所述的用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球在荷载生物分子领域、生物检测领域中的应用。
本发明所述的聚丙烯酰胺微球在生物分子载体中的应用。本发明实验发现，由于本发明制备的聚丙烯酰胺微球是一种具有亲水性、多孔性、正电荷特性的高分子聚合物，特别适合荷载生物分子，如本发明证明聚丙烯酰胺微球可高效荷载荧光标记的链霉亲和素及DNA分子。
本发明所述的基于聚丙烯酰胺微球的核酸快速提取方法在生物检测，特别PCR检测中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明通过点样聚合法和反相微乳液聚合合成了带有自发荧光的、带正电的聚丙烯酰胺微球(fluorescent PAMMP，fPAMMP)。自发荧光包括可见荧光(VF)和近红外荧光(NIRF)。制成的fPAMMP在各种苛刻条件下(例如酸，碱和高温)均具有高稳定性。依靠这些出色的性能，本发明开发了一种基于fPAMMP的简单、快速的DNA提取方法，该方法可从多种样品中提取DNA，包括微生物，动物，人类和植物。整个提取过程仅需约30秒，不需要任何复杂的仪器和程序。更重要的是，可以通过常规PCR和定量PCR直接检测静电吸附在fPAMMP上的DNA(将带有DNA的fPAMMP称为fPAMMP@DNA)。这种基于fPAMMP的DNA提取方法与随后的fPAMMP@DNA的PCR检测相结合，提供了一种很有前途的DNA快速检测方法。
在典型的反相微乳液聚合中，通过搅拌将单体溶液添加至油相以形成水相的液滴，然后将引发剂APS和催化剂TEMED同时添加至油相以引发聚合以合成聚丙烯酰胺微球。然而，本发明发现该方法条件下制备的聚丙烯酰胺微球的其形貌非常不均匀，在油相中，不同水相液滴之间的不同聚合度会导致聚丙烯酰胺微球中所含氨基的数量差异很大，从而导致GTA交联产生的荧光差异很大。为了获得具有尺寸较均匀且荧光均匀稳定的fPAMMP，本发明对典型的反相微乳液聚合进行了改进，将引发剂APS与单体溶液混合，然后通过搅拌将含APS的单体溶液添加至油相中以形成水相液滴。此过程可确保每个微球包含相同浓度的APS，在没有TEMED的情况下，APS将引发聚合反应，但是聚合速度非常慢，而不会影响反相微乳液，通过添加TEMED引发更进一步的聚合反应，以更完全的聚合度合成fPAMMP，然后在GTA交联后获得具有均匀荧光性质的fPAMMP。
通过反相微乳液聚合制备的fPAMMP的尺寸分布通常不是很均匀，因为在油相中搅拌形成的微球的尺寸不一定相同。为了获得尺寸更可控的fPAMMP，本发明还开发了一种基于点样聚合法方法来制备fPAMMP。将等体积的含APS单体溶液点到聚苯乙烯薄膜表面上，由于表面张力，溶液将形成液滴。然后，通过用一层含TEMED的油覆盖这些液滴来引发聚合反应。可以通过这种方式制备尺寸更均匀的fPAMMP。可以通过改变点样体积来合成不同直径的fPAMMP。利用BioDot点样平台将点样体积从10nL连续更改为1μL，相应的PAMMP的直径范围为180μm至780μm。因此，本发明使用反相微乳液聚合法和点样聚合法合成了直径可以在20μm至780μm之间连续变化的fPAMMP。对于不同的应用要求，可以准备相应直径的fPAMMP。
为了确保fPAMMP可用于DNA提取，然后直接进行PCR扩增，对fPAMMP在各种极端环境下的稳定性进行了研究。结果表明，fPAMMP在高温(95℃)，强酸(0.2M HCl)和强碱(0.2MNaOH)下均不分解，保持稳定且不影响荧光，表明PAMMP是稳定的微球，可以承受相对恶劣的物化环境的材料。
细菌细胞壁会在高pH值的溶液中破裂，释放出DNA和蛋白质，这使得通过静电相互作用将DNA结合到fPAMMP上成为可能。游离DNA与fPAMMP的初步结合试验表明，两者确实可以结合，这使得fPAMMP可直接用于DNA提取和纯化。本发明首先选择实验室中最常用的两种细菌BL21和DH5α作为细菌样本。在确保fPAMMP和细胞裂解液充分混合(混合30分钟)的情况下，电泳结果表明DNA确实与fPAMMP结合，表明了这种基于fPAMMP的DNA提取方法的可行性。本发明还进行了一些缩短DNA提取时间的实验。最后，在添加了fPAMMP之后，只需简单地将fPAMMP和细胞裂解液在Eppendorf管中上下颠倒混合几次，即可完成DNA提取。尽管时间缩短导致提取的DNA数量减少，但吸附在fPAMMP表面的DNA仍足以进行PCR扩增。
此外，与当前的DNA提取方法相比，本发明的方法比传统的和当前的DNA提取方法具有许多优势。在传统方法中，DNA通常通过苯酚/氯仿提取进行纯化。该方法不仅费时，而且使用有害的试剂，例如苯酚和氯仿。在当前使用最广泛的典型DNA提取方法中，通常使用各种具有相似机理的试剂盒来提取DNA。在这些试剂盒中，需要使用多种组分复杂的溶液，例如裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，其中许多组分对环境不利，操作者不友好。此外，这些试剂盒中还包含带有吸附膜的特殊旋转柱(Spin Columns)，用于吸收DNA。这些试剂盒使用类似的“裂解-结合-洗涤-洗脱”方案提取DNA，可手动或自动提取DNA，提取DNA至少需要半小时。此外，需要多次溶液和试管转移(通常四次)。在这种情况下，当同时从多个样品中手动提取DNA时，容易发生试管转移错误和样品之间的交叉污染。总而言之，当前的DNA提取方法需要许多溶液和试管转移，并且操作很费时。但是，在我们的方法中，除植物组织外，仅需要一种溶液(0.4M NaOH)、一只试管、无需转移试管，以及两步操作。这极大地简化了试剂、材料和操作，使样品之间的交叉污染降到最低。最后，在当前的DNA提取中，需要多次高速离心或真空过滤。但是，本发明的方法不需要高速离心，使用掌上离心机进行两次瞬时离心就足够了。重要的是，本发明发现fPAMMP@DNA以在不同温度(4℃、-20℃和-80℃)下长时间(测试到一个月)保存，而不会影响PCR检测。
综上，本发明制备出了一种新型的具有优异自发荧光的PAMMP(fPAMMP)。通过点样聚合法(大尺寸但产量低)和反相微乳液聚合法(小尺寸但产量高)均可成功制备各种尺寸的fPAMMP。制成的fPAMMP具有强大而稳定的自动VF和NIRF，所制备的fPAMMP在各种严苛条件下(如碱、酸和高温)也具有高稳定性。最后，制备的fPAMMP具有高正电荷，可用于有效捕获各种生物分子，例如链霉亲和素和DNA。基于这些特征，本发明开发了一种新方法，可以在几分钟内用fPAMMP从各种样品中提取DNA。此外，可以通过常规PCR和定量PCR直接检测fPAMMP@DNA。而且，可以容易地通过硼氢化钠处理消除fPAMMP的自发荧光，获得不具有荧光的聚丙烯酰胺微球(PAMMP)。PAMMP同样可以用于有效地提取DNA及qPCR检测。总而言之，本发明制备了新型的fPAMMP和PAMMP，开发了一种新的快速DNA提取方法，并证明了它们在PCR检测中有用价值。
附图说明
图1为基于聚丙烯酰胺微球的核酸快速提取及PCR检测的示意图；
图2为通过点样聚合法制备fPAMMP；A.fPAMMP的可见荧光(VF)图像，比例尺为200μm；B.fPAMMP的直径分析；C.fPAMMP的NIRF图像，通过改变点样体积可合成不同直径的fPAMMP；
图3为通过改进的反相微乳液聚合法制备fPAMMP；A.fPAMMP的荧光分析：(a)fPAMMP的显微镜和VF图像，比例尺为200μm，fPAMMP的红色(b)和绿色(c)VF激发和发射曲线，(d)720和820nm发射波长的NIRF图像；B.fPAMMP的大小分析：(a)fPAMMP的数量和fPAMMP的大小分布，(b)fPAMMP的VF稳定性，在VF显微镜下用激发光对fPAMMP照射不同的时间，分析平均光密度以代表VF稳定性；(c)fPAMMP和fPAMMP@IRDye 800CW-链霉亲和素的NIRF图像，1：IRDye 800CW-链霉亲和素；2-7：第一至第六洗涤液；8：fPAMMP；9：fPAMMP@IRDye800CW-Streptavdin；
图4为fPAMMP用激发光照射不同时间的荧光显微镜图像，比例尺为200μm；
图5为检测fPAMMP在各种条件中的稳定性示意图；A.用酸、碱和加热处理不同时间后，fPAMMP的可见荧光成像；B.酸、碱和加热处理不同时间后的fPAMMP的NIRF成像；C.fPAMMP@DNABL21的可见荧光成像；比例尺为200μm；
图6为fPAMMP@IRDye800CW-链霉亲和素在室温下放置1天、30天和60天后的NIRF图像；
图7为使用fPAMMP进行DNA提取和直接PCR扩增的示意图；A.DNA结合测定：(a)fPAMMP与纯化的游离DNA结合，1：fPAMMP@SiHa gDNA；2：fPAMMP；3：游离的SiHa gDNA；(b)用fPAMMP从大肠杆菌BL21和DH5α中提取gDNA；(c)随后PCR扩增165bp的T7 RNA聚合酶基因片段，T7 RNA聚合酶基因包含在BL21中但不包含在DH5α中；各种fPAMMP(b)用作PCR扩增模板，1：fPAMMP；2：fPAMMP@DH5αDNA；3：fPAMMP@BL21 DNA；B.用fPAMMP从更多的样品中提取gDNA，并用PCR检测fPAMMP@DNA，(a)小鼠肝脏组织，从中扩增RELA和GAPDH基因的片段，1：NTC(用于GAPDH)；2：NTC(用于RELA)；3：GAPDH；4：RELA，(b)人细胞(左)、固体组织(中)和血浆(右)，分别从中扩增出5个STR和GAPDH基因，1：NTC；2：GAPDH；3：GATA193H05；4：D11S4951；5：D2S2951；6：D6S2421；7：D11S4957，(c)人血浆，从中扩增了TERT启动子的片段，1：NTC；2：TERT，(d)植物叶片组织，从中扩增NOS和zSSllb基因，NOS基因包含在GMP中，但不包含在NGMP中，而zSSllb基因是植物持家基因，1：NGMP中的zSSllb；2：GMP中的zSSllb；3：NGMP中的NOS；4：GMP中的NOS。NTC：无模板对照(即只有fPAMMP)。GMP：遗传修饰的植物(即转基因植物)。NGMP：非遗传修饰的植物(即非转基因植物)；
图8为用fPAMMP优化DNA提取；A.通过将fPAMMP与大肠杆菌BL21裂解液孵育不同时间来提取DNA，(a)fPAMMP的电泳，(b)T7 RNA聚合酶基因的PCR扩增，1：仅fPAMMP；2–6：将fPAMMP与大肠杆菌BL21裂解物孵育1分钟(2)、2分钟(3)、5分钟(4)、10分钟(5)和20分钟(6)；B.通过仅将fPAMMP与大肠杆菌BL21裂解液孵育30秒(a和b)和15秒(c和d)进行DNA提取；(a和c)fPAMMP的电泳；(b和d)T7 RNA聚合酶基因的PCR扩增，1：fPAMMP；2：fPAMMP@BL21DNA；C.从不同数量的细胞中提取DNA并进行PCR扩增；测定细菌培养物的OD 600，并分别使用2×109、1×109、5×108、2.5×108和1.25×108cfu的细胞(从右到左)进行DNA提取，(a)fPAMMP@DNA的电泳，(b)用fPAMMP@DNA PCR扩增大肠杆菌16S rDNA，(c)用fPAMMP@DNA PCR扩增大肠杆菌T7 RNA聚合酶基因；D.将fPAMMP@DNA保持在不同条件下(-80℃，-20℃和-4℃)不同的时间，从中PCR扩增靶基因16S rDNA和T7 RNA聚合酶基因；
图9为用fPAMMP@BL21 DNA PCR扩增16S rDNA，产物的测序结果示意图；
图10为用fPAMMP@DH5αDNA PCR扩增16S rDNA，产物的测序结果示意图；
图11为用fPAMMP@BL21 DNA PCR扩增T7 RNA聚合酶，产物的测序结果示意图；
图12为无荧光fPAMMP(称为PAMMP)的制备；A.硼氢化钠还原之前和之后的fPAMMP的显微成像，从右到左依次是明场、绿色VF、红色VF和蓝色VF；B.用SEM对fPAMMP和PAMMP成像，从左到右的比例尺为100μm、20μm、20μm和10μm；C.硼氢化钠还原前后fPAMMP的NIRF图像；D.用PAMMP提取DNA和PCR检测，(a)使用PAMMP进行DNA提取，1：PAMMP；2-4：PAMMP@BL21DNA，在DNA提取中，分别使用1.25×108(2)、2.5×108(3)和5×108(4)cfu的细胞，(b)使用PAMMP@DNA进行PCR检测，1：PAMMP；2：用5×108cfu细胞提取的PAMMP@DH5αDNA；3-5：分别以1.25×108(3)、2.5×108(4)和5×108(5)cfu的细胞提取的PAMMP@BL21 DNA；
图13为用PAMMP@DNA和fPAMMP@DNA对T7 RNA聚合酶基因进行qPCR检测；A和B使用PAMMP@DNA(A)和fPAMMP@DNA(B)进行qPCR检测，图中分别提供了标准品和样品的扩增曲线和熔解曲线，用标准曲线计算不同样品的拷贝数，1：用50μL BL21培养物提取DNA的PAMMP/fPAMMP@BL21DNA；2：用稀释10倍的50μL BL21培养液提取DNA的PAMMP/fPAMMP@BL21DNA；3：用100倍稀释的50μL BL21培养物提取DNA的PAMMP/fPAMMP@BL21 DNA；4：用50μL DH5α培养物提取DNA的PAMMP/fPAMMP@DH5αDNA；5：PAMMP/fPAMMP。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 fPAMMP的合成与表征
方法：
1、材料：丙烯酰胺(AM)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(APMA)购自SigmaAldrich(美国)。戊二醛(GTA)、Span 80和NaOH购自国药控股化学试剂有限公司(中国上海)。矿物油、过硫酸铵(APS)、N,N,N',N'-四甲基乙烷-1,2-二胺(TEMED)和N,N'-亚甲基二丙烯酰胺(MBA)购自Biosharp(中国合肥)。聚赖氨酸(ε-PL)购自上海世峰生物技术有限公司(中国上海)。2×Premix PrimerStar HS(货号：R040A)购自Takara(大连)。
Figure BDA0002364505600000091
qPCR Master Mix(2x)购自Promega。寡核苷酸由上海生工(Sangon Biotech)生产。
2、通过点样聚合法合成fPAMMP：PAMMP的制备方案如下：将264mg AM、80mg MBA及12mg APMA在超声下溶于1mL去离子(DI)水中，获得均匀的丙烯酰胺单体液体。将80μL丙烯酰胺单体液体、80μL 10％(g/mL)ε-PL水溶液和5μL 20％(g/mL)APS水溶液混合制备成混合液。用移液器吸取将0.5μL混合液点到附有聚乙烯的平皿上形成液滴，然后将用含0.4％(g/mL)TEMED的矿物油覆盖大量液滴，在37℃下聚合1分钟获得微球。旋蒸法除去矿物油后，将制备的PAAMP用去离子水洗涤3次。可以通过改变混合液的点样体积来获得不同直径的PAMMP。使用BioDot AD1500点样仪平台点样200nL、100nL、50nL、30nL、20nL及10nL的混合液，制备不同粒径的PAMMP。在PAMMP水溶液中加入25％(g/mL)戊二醛，使其终浓度为0.1％，并在37℃下孵育30分钟。用去离子水洗涤微球3次，以去除过量的戊二醛。应戊二醛处理后的PAMMP具有荧光，因此称为fPAMMP。
3、通过改进的反相微乳液聚合法合成fPAMMP：通过改进的反相微乳液聚合方法合成fPAMMP。经优化的合成反应及操作如下：将1mL Span 80和70mL己烷添加到配备有磁力搅拌器和氮气入口的250mL三颈烧瓶中；将混合物在氮气吹送下搅拌直至表面活性剂Span 80均匀分散，制成油相；同时，在超声下将264mg丙烯酰胺、25mg APMA和80mg MBA溶解在1mL去离子水中，以获得均匀的丙烯酰胺单体液体，然后将其与1ml 10％ε-PL和80μL 20％APS混合，制成水相。将水相溶液加入到油相溶液中，然后将混合物在氮气吹送下以380转/分钟(rpm)连续搅拌2小时。最后，通过添加280μL促进剂TEMED引发反应，并将混合物充分搅拌2小时。收集PAMMP，并用去离子水和无水酒精交替洗涤，或仅用去离子水或无水酒精洗涤三遍，微球最后用去离子水洗涤并重悬于去离子水中。向微球溶液中添加25％的戊二醛，使其最终浓度为0.1％，并在37℃下孵育4小时。用去离子水将制备的fPAMMP洗涤5次以除去过量的戊二醛。最终的fPAMMP溶液通过补水保持10mL，在室温下避光保存。下述DNA提取及PCR检测中均使用该fPAMMP溶液，此外下述DNA提取及PCR检测实验中采用点样聚合法合成fPAMMP与通过改进的反相微乳液聚合法合成fPAMMP效果类似。
4、fPAMMP的表征：用扫描电子显微镜(SEM)评估fPAMMP的大小和形态。用荧光显微镜(IX51-DP71 CCD；Olympus)拍照检测VF及其稳定性。用Hitachif-7000荧光光谱仪(Hitachi High-Technologies)检测荧光发射光谱。使用NIRF成像仪Odyssey红外成像系统(LI-COR Bioscience)检测发射波长为720和820nm的NIRF。为了研究多孔性，将1mL fPAMMP水溶液与200μL IRDye800CW-链霉亲和素混合，然后孵育4小时。将微球用去离子水洗涤6次以除去过量的IRDye 800CW-链霉亲和素。保留洗涤液，并用Odyssey红外成像系统检测NIRF。为了检查fPAMMP的稳定性，将200μL fPAMMP水溶液与等体积的0.4M NaOH或HCl混合，在室温下分别孵育30分钟和60分钟。此外，也将200μL fPAMMP水溶液分别在95℃下孵育30分钟和60分钟。然后用显微镜和NIRF成像仪检测VF和NIRF。
结果：
由GTA交联产生的荧光已经用于制备自发荧光的有机纳米颗粒，它来自两种不同的双键，即C＝N和C＝C。另外，ε-PL是一种富含氨基的化学物质，在GTA交联时通过生成丰富的C＝N来增强NIRF。基于这些研究，通过点样聚合法合成了具有自发荧光的聚丙烯酰胺微球(fPAMMP)，自发荧光包括VF和NIRF。通过改变点体积可以合成不同大小的fPAMMP(图2)，这表明可以合成具有自发荧光的PAM微球。此外，为了获得直径较小的大量fPAMMP，选择了已广泛用于合成各种有机微球的反相微乳液聚合法，以合成fPAMMP。在文献报道的PAMMP制备方法中，在添加单体溶液和APS的混合物后，立即将TEMED添加到反应中。然而，通过这种方法合成的fPAMMP表现出不稳定的荧光和尺寸不均匀性。本发明改进的方法是在添加TEMED之前继续搅拌2小时。该方法可以在己烷中形成更多的单分散水微球，这有益于制备出具有相似尺寸和较强荧光的PAMMP。荧光显微镜显示，fPAMMP具有三种不同的VF：绿色、红色和蓝色(图3A，a)。但是，蓝色荧光比绿色和红色荧光弱得多。荧光光谱法也表明，fPAMMP具有两个激发/发射峰，分别为450nm/509nm和459nm/671nm(图3A，b和c)。另外，fPAMMP在700nm和800nm的发射波长下均显示NIRF。然而，发射波长为700nm的NIRF比800nm的发射强度要强得多(图3A，d)。
通过对约2000个微球进行直径分析获得的尺寸分布表明，约95％的fPAMMP直径在10～60μm之间(图3B，b)，而绝大多数fPAMMP直径在30～40μm之间，约占31％(图3B，c)，表明fPAMMP具有良好的单分散性。通过在荧光显微镜下用激发光照射不同的时间然后拍照来测量fPAMMP的荧光稳定性，结果表明微球的荧光非常稳定，耐漂白(图4)。通过Image Pro分析平均荧光密度，结果表明fPAMMP的VF可以持续几分钟(图3B，b)，表明fPAMMP的荧光稳定性非常好。fPAMMP的形态和自发荧光(VF和NIRF)在各种严苛的处理下(包括强酸(0.4M HCl)，碱(0.4M NaOH)和高温(95℃)可以长时间(高达60分钟)保持稳定(图5)。
由于APMA和ε-PL都是氨基丰富的化学物质，因此fPAMMP应该具有很强的正电荷，就像聚丙烯酰胺纳米颗粒(PAMNPs)一样。多孔结构和正电荷这两个特性使fPAMMP成为不同生物分子、纳米颗粒或药物的理想载体。为了研究作为载体的潜在用途，对IRDye 800CW-链霉亲和素(LI-COR Bioscience)进行了后装。在800nm发射波长处明显增强的NIRF表明，IRDye 800CW-链霉亲和素已成功加载到fPAMMP上(图3B，c)。此外，在60天后，NIRF仍未降低(图6)，表明IRDye 800CW-链霉亲和素仍保留在fPAMMP上。
实施例2 fPAMMP捕获DNA的能力
方法：
将纯化的2μg SiHa细胞基因组DNA与80μL fPAMMP水溶液混合并颠倒几次。然后洗涤fPAMMP以除去过量的gDNA。将fPAMMP@SiHa DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。
结果：
为了开发一种快速、简单的DNA提取方法，本发明首先考察了fPAMMP与DNA结合的能力。将SiHa细胞的基因组DNA与fPAMMP混合并颠倒几次。然后洗涤fPAMMP以除去过量的gDNA。凝胶电泳结果表明，fPAMMP由于具有正电荷，可以在数秒内有效结合或至少捕获DNA(图7A，a)。带负电荷的DNA通过静电相互作用与fPAMMP结合，由于fPAMMP的微尺度尺寸，它无法通过凝胶，因此凝胶加样孔中显示DNA染色的阳性结果，说明DNA牢牢地吸附在fPAMMP上。
实施例3 用fPAMMP进行DNA提取和直接PCR扩增
方法：
1、用fPAMMP提取DNA
细菌DNA提取：将甘油储存液中的大肠杆菌BL21和DH5α划线到Luria Bertani(LB)琼脂平板上，并分别在37℃下孵育16小时。将充分分离的大肠杆菌单菌落接种到装有2mLLB液体培养基的试管中，并在37℃，220rpm剧烈振摇下孵育8小时。然后将培养物以12000rpm(5415D，Eppendorf)离心5分钟，弃去上清液。将获得的沉淀物重悬于200μL去离子水中，并与等体积的0.4M NaOH混合。通过轻轻颠倒数次裂解细胞。然后将100μL fPAMMP水溶液添加到混合物中，并在室温下于旋转器中孵育5～30分钟。收集已捕获细菌基因组DNA的fPAMMP(fPAMMP@DNA)，并用去离子水洗涤3次。使用不同数量的细菌来探索DNA提取的灵敏性。简而言之，测量细菌培养物的OD 600，并将2×109、1×109、5×108、2.5×108和1.25×108菌落形成单位(cfu)的细菌分别用于DNA提取。为了缩短DNA提取时间，分别尝试了20、10、5、2、1分钟和30s的孵育时间。最后，加入fPAMMP后，将混合物轻轻倒置5～8次以完成DNA提取。
小鼠DNA提取：为了从动物组织中提取基因组DNA(gDNA)，将小鼠肝组织在液氮中研磨，然后滴入200μL的0.4M NaOH。加入100μL fPAMMP水溶液后，将混合物在旋转器上孵育5～20分钟。将fPAMMP@DNA用去离子水洗涤3次，然后重悬在去离子水中。
人DNA提取：(1)为了从人细胞系中提取gDNA，将HL-7702细胞与含有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM在5％的二氧化碳培养箱中37℃培养。将细胞以5×104细胞/孔的密度接种在24孔板中，并培养24小时。通过胰蛋白酶消化收集细胞，并重悬于200μL PBS中。将细胞重悬于200μL的0.4M NaOH中，轻轻颠倒几次使其裂解。(2)为了从人体组织中提取gDNA，将食道癌组织在研钵中用液氮研磨。然后向组织中加入200μL的0.4M NaOH，然后转移到1.5mL试管中。通过轻轻地颠倒几次来裂解细胞。(3)为了从人血液中提取无细胞DNA(cfDNA)，将全血在4℃下以1600g离心15分钟。将上清液转移至新的离心管中，加入等体积0.4M NaOH，并轻轻颠倒几次充分混合。将100μL fPAMMP水溶液添加到上述各种NaOH裂解的样品溶液中。将混合物在旋转器上孵育5～20分钟。将fPAMMP@DNA用去离子水洗涤3次，然后重悬在去离子水中。
植物DNA提取：要从植物组织中提取gDNA，将10～20mg的叶片组织加入有200μL细胞裂解缓冲液(20mM Tris、25mM NaCl、2.5mM EDTA、0.05％SDS)的1.5mL管中，用玻璃杵研磨。然后添加100μL fPAMMP水溶液，并在转子上孵育20分钟。将fPAMMP@DNA用洗涤缓冲液(10mM Tris，pH 8.0，0.1％Tween20％)洗涤3次。将fPAMMP@DNA重悬于去离子水中。
2.PCR扩增
细菌DNA PCR扩增：用大肠杆菌BL21和DH5α的fPAMMP@DNA检测T7 RNA聚合酶基因和16S rDNA。PCR反应在50μL体积中进行，其中包含1μL fPAMMP@DNA、0.5μM每种引物(T7RNA Pol-F&R或16S rDNA-27-F&16S rDNA-1492-R)和1×Premix PrimerStar HS。PCR程序为：(i)98℃3分钟；(ii)35个循环：98℃ 10秒、68℃ 40秒；(iii)72℃ 3分钟。DNA提取和扩增反应的结果通过1.2％琼脂糖凝胶电泳可视化检测。引物序列分别为：T7 RNA Pol-F：5'-TGC GGG TGT CGA TAA GGT TC-3'；T7 RNA Pol-R：5'-CCC AGC GTA CTC AAA GCA GA-3'；16S rDNA-27-F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；16S rDNA-1492-R：5'-TAC GGY TACCTT GTT ACG ACT T-3'。
小鼠DNA PCR扩增：通过fPAMMP@DNA检测到GAPDH和RELA基因。PCR反应在50μL体积中进行，其中包含3μLfPAMMP@DNA，0.5μM每种引物(mGAPDH-F&R或RELA-F&R)和1×PremixPrimerStar HS。PCR程序如下：(i)95℃3分钟；(ii)35个循环：95℃ 15秒、58℃ 30秒、72℃30秒；(iii)72℃ 3分钟。引物序列分别为：mGAPDH-F：5'-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3'；mGAPDH-R：5'-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3'；RELA-F：5'-TGC GAT TCC GCTATA AAT GCG-3'；RELA-R：5'-ACA AGT TCA TGT GGA TGA GGC-3'；
人DNA PCR扩增：用fPAMMP@DNA检测5个短串联重复序列(STR)和TERT基因。PCR反应在50μL体积中进行，其中包含3μL fPAMMP@DNA、0.5μM每种引物(hGAPDH-F&R，TERT-F&R，D11S4951-F&R，D11S4957-F&R，GATA193H05-F&R，D2S2951-F&R或D6S2421-F&R)和1×PremixPrimerStar HS。对于STR和GAPDH，PCR程序如下：(i)95℃ 3分钟；(ii)35个循环：95℃ 15秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒；(iii)72℃持续3分钟。对于TERT基因，PCR程序如下：(i)98℃ 3分钟；(ii)35个循环：98℃ 15秒、68℃45秒；(iii)72℃ 3分钟。引物序列分别为：hGAPDH-F：5'-CAG GAG GCA TTG CTG ATG AT-3'；hGAPDH-R：5'-GAA GGC TGG GGC TCA TTT-3'；D11S4951-F：5'-ATG GGT ATA CAC CCA GCA AA-3'；D11S4951-R：5'-AAC TGT GAT TTT AAAAGA TAA TGC C-3'；D11S4957-F：5'-TTT GTT TTC CTA AGA AAG ATA AAG C-3'；D11S4957-R：5'-CTG GAC AAA ATA AAG ACC AGC-3'；GATA193H05-F：5'-CCT TTA CAA GTC TTT CTCCAG C-3'；GATA193H05-R：5'-CCC TGT AGC CTT CCT GTG TA-3'；D2S2951-F：5'-AGT GGAGAA CAC AAG AAC ACT G-3'；D2S2951-R：5'-TGA CTT CCA TAA TTG TGT GAG C-3'；D6S2421-F：5'-TTT AGA GAA CCC TGA CTA ATA CCG-3'；D6S2421-R：5'-ACA GGA CTT TTCAGC CTT CA-3'；TERT-F：5'-CAC CCG TCC TGC CCC TTC ACC TT-3'；TERT-R：5'-GGC TTCCCA CGT GCG CAG CAG GA-3'。
植物DNA PCR扩增：用fPAMMP@DNA检测到两个转基因NOS和zSSllb。PCR反应以50μL体积进行，其中包含3μL fPAMMP@DNA、0.5μM每种引物(zSSIIb-F&R或NOS-F.R)和1×GoTagProbe qPCR Master Mix。PCR程序如下：(i)95℃5分钟；(ii)35个循环：95℃ 30秒、58℃ 30秒，72℃ 40秒；(iii)72℃ 7分钟。引物序列分别为：zSSIIb-F：5'-CTC CCA ATC CTT TGACAT CTG C-3'；zSSIIb-R：5'-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3'；NOS-F：5'-ATC GTTCAA ACA TTT GGC A-3'；NOS-R：5'-ATT GCG GGA CTC TAA TCA TA-3'；
结果：
由于fPAMMP可以通过静电相互作用结合DNA，因此fPAMMP无需现代生化试剂盒就可以完成从细胞或组织中提取DNA。首先，本发明进行了微生物DNA提取实验。培养大肠杆菌BL21和DH5α，然后用NaOH裂解。fPAMMP可以在NaOH存在下直接结合DNA，因为fPAMMP可以保持稳定并且不溶于酸或碱。结合结果表明，fPAMMP无需复杂的程序即可完成DNA提取(图7A，b)。为了进一步研究，将DNA结合的fPAMMP(fPAMMP@DNA)直接用作PCR模板进行PCR反应。PCR中使用的引物被设计为扩增T7 RNA聚合酶基因的165bp片段，该片段存在于BL21 gDNA中，但不存在于DH5α gDNA中。结果显示，目标片段被成功扩增(图7A，c)。这些结果表明，使用fPAMMP可以简单地从细菌细胞中提取DNA，然后直接进行PCR扩增。
尽管该方法已成功应用于细菌，但本发明的目标是进一步开发它，使其适用于从各种物种中提取DNA。本发明成功地将基于fPAMMP的DNA提取和直接PCR扩增应用于许多不同的样品，包括动物组织、人体细胞、组织、血液和植物叶片组织。对于小鼠肝组织，PCR中使用的引物经设计可扩增165bp的GAPDH基因(持家基因)片段、165bp的RELA基因片段(图7B，a)。对于人体样品，检测三种样品(细胞、组织和血液)。五个STR(D11S4951的120～140bp片段、D11S4957的201～229bp片段、GATA193H05的218～253bp片段、D2S2951的215～231bp片段、D6S2421的174～202bp片段)，以及人GAPDH基因的138bp片段(持家基因)(图7B，b)。尤其是，对于人体血液(血浆)样品，由于其含有无细胞DNA(cfDNA)，因此在临床上最有意义。本发明用cfDNA扩增了193bp的TERT启动子片段，该片段基因序列对癌症诊断具有特殊意义(图7B，c)。对于植物组织，根据文献，使用细胞裂解缓冲液代替NaOH，用洗涤缓冲液代替去离子水以去除植物粗提物中存在的抑制PCR的化学及生物污染物。本发明用植物DNA扩增了NOS基因的165bp片段和zSSllb基因的151bp片段(持家基因)(图7B，d)。这些结果表明，本发明的基于聚丙烯酰胺微球的快速DNA提取和直接PCR扩增方法可广泛应用于各种常见样品，包括细菌、培养的人细胞、动植物组织以及人血浆。
实施例4 用fPAMMP提取DNA的进一步优化
方法：
1、用fPAMMP和PAMMP提取DNA：细菌：将甘油储存液中的大肠杆菌BL21和DH5α划线到Luria Bertani(LB)琼脂平板上，并分别在37℃下孵育16小时。将充分分离的大肠杆菌单菌落接种到装有2mL LB液体培养基的试管中，并在37℃，220rpm剧烈振摇下孵育8小时。然后将培养物以12000rpm(5415D，Eppendorf)离心5分钟，弃去上清液。将获得的沉淀物重悬于200μL去离子水中，并与等体积的0.4M NaOH混合。通过轻轻颠倒数次裂解细胞。然后将100μLfPAMMP水溶液添加到混合物中，并在室温下于旋转器中孵育30分钟。收集已捕获细菌基因组DNA的fPAMMP(fPAMMP@DNA)，并用去离子水洗涤3次。使用不同数量的细菌来探索DNA提取的灵敏性。简而言之，测量细菌培养物的OD600，并将2×109、1×109、5×108、2.5×108和1.25×108菌落形成单位(cfu)的细菌分别用于DNA提取。为了缩短DNA提取时间，分别尝试了20、10、5、2、1分钟和30s的孵育时间。最后，加入fPAMMP后，将混合物轻轻倒置5～8次以完成DNA提取。
2、PCR扩增：根据制造商的说明，使用2×Fast SYBR Green Master Mix(AppliedBiosystems)通过qPCR检测fPAMMP@BL21 DNA(即吸附BL21菌株的DNA的fPAMMP)的拷贝数。用游离T7 RNA聚合酶基因片段的系列稀释液作为标准样品以绘制标准曲线。PCR反应在20μL体积中进行，其中包含1μL样品(fPAMMP@BL21/DH5αDNA)或标准样品，0.25μM每种引物(T7RNA Pol-F&R)和1×Premix Fast SYBR-Green。PCR引物序列同上。qPCR程序在实时PCR机StepOne Plus(Applied Biosystems)上运行。每个qPCR检测均至少进行三个技术重复。进行熔解曲线分析。使用Applied Biosystems StepOne软件v2.3进行数据分析，并根据标准曲线计算出拷贝数。引物序列分别为：T7 RNA Pol-F：5'-TGC GGG TGT CGA TAA GGT TC-3'；T7 RNA Pol-R：5'-CCC AGC GTA CTC AAA GCA GA-3'。
结果：
为了进一步缩短提取时间，研究了不同的fPAMMP孵育时间。首先，将fPAMMP与细菌的NaOH裂解液分别孵育20、10、5、2和1分钟。结果表明，DNA在不同的孵育时间均被有效地捕获在fPAMMP上(图8A，a)。即使仅孵育1分钟的fPAMMP，也可以通过PCR有效地扩增目标DNAT7 RNA聚合酶基因(图8A，b)，这表明NaOH裂解物中的DNA可以被fPAMMP快速吸收。实际上，孵育时间甚至可以缩短至30s，而不会影响PCR扩增(图8B，a)。在这种条件下，尽管捕获到fPAMMP的DNA量显著减少，但fPAMMP仍捕获了足够的用于PCR扩增的DNA(图8B，b)。最终，在将fPAMMP加到NaOH裂解物中后，轻轻地颠倒试管5～8次，即可将DNA迅速地被fPAMMP捕获，该过程仅花费约15s(图8B，c)。在这种非常快速的条件下，捕获的DNA也足以进行PCR检测(图8B，d)。但是，本发明发现随着孵育时间的减少，捕获到fPAMMP的DNA的量显著减少(图8A，a；图8B，a；图8B，c)。整个DNA提取过程只需要一种溶液，即NaOH溶液，时间仅约需30秒。通过这种快速方案，我们使用不同数量的细胞来检查这种DNA提取方法的灵敏性。结果表明，这种基于NaOH/fPAMMP的DNA提取方法具有很高的灵敏度(图8C，a)。PCR检测表明，可以从用各种细胞用量的fPAMMP@DNA中特异性扩增两个靶DNA片段，即16S rDNA和T7 RNA聚合酶基因(图8C，b和c)。而且，可以通过Sanger测序对PCR产物进行直接测序(图9、图10、图11)，这不仅说明微球吸附DNA进行PCR扩增的特异性很高，而且对于通过PCR产物测序进一步鉴定菌种非常重要。重要的是，本发明发现fPAMMP@DNA可以在不同的条件下(-80℃，-20℃和-4℃)长时间(从一周到一个月)保存，而不会影响目标基因的PCR检测(16S rDNA和T7RNA聚合酶基因)(图8D)。
实施例5 用fPAMMP/PAMMP提取DNA和qPCR检测
方法：
1、还原fPAMMP：向1mL fPAMMP水溶液中加入50μL硼氢化钠溶液(1％(g/mL))。将混合物在室温下孵育过夜。用去离子水洗涤3次后，获得无荧光的fPAMMP(称为PAMMP)。然后用显微镜和NIRF成像仪检测VF和NIRF。用表征fPAMMP的方法表征PAMMP。
2、DNA提取：为了进行qPCR检测，将大肠杆菌BL21和DH5α在装有2mL LB肉汤的试管中于37℃在220rpm剧烈振摇下孵育8小时，并测量细菌培养物的OD600。然后将BL21的细菌培养物分别稀释至10倍和100倍。用50μL PAMMP和fPAMMP水溶液分别从50μL BL21细菌培养物，稀释至10倍的50μL BL21细菌培养物，稀释100倍的50μL BL21细菌培养物，以及50μLDH5α细菌培养物中提取DNA。DNA提取方法同上。
3、qPCR检测：据制造商的说明，使用2x Fast SYBR Green Master Mix(AppliedBiosystems)通过qPCR检测fPAMMP@BL21 DNA的拷贝数。用游离T7 RNA聚合酶基因片段的系列稀释液作为标准样品以绘制标准曲线。PCR反应在20μL体积中进行，其中包含1μL样品(fPAMMP/PAMMP@BL21/DH5αDNA)或标准样品，0.25μM每种引物(T7 RNA Pol-F&R)和1×Premix Fast SYBR-Green。PCR引物序列同上。qPCR程序在实时PCR机StepOne Plus(Applied Biosystems)上运行。每个qPCR检测均至少进行三个技术重复。进行熔解曲线分析。使用Applied Biosystems StepOne软件v2.3进行数据分析，并根据标准曲线计算出拷贝数。
结果：
尽管fPAMMP@DNA可以通过常规PCR进行检测，但是用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物非常耗时。为了更广泛地应用fPAMMP@DNA，接下来探讨fPAMMP@DNA可否用qPCR检测。由于考虑到自体荧光可能对qPCR检测存在潜在的干扰，本发明用硼氢化钠还原消除了fPAMMP自发荧光。结果表明，硼氢化钠处理去除了绿色和红色VF(图12A)。然而，这种处理并没有影响fPAMMP的单分散性、形态和大小(图12A和12B)。没有自发荧光的fPAMMP被称为PAMMP。NIRF成像显示硼氢化钠处理也去除了fPAMMP的NIRF(图12C)。从机理上讲，硼氢化钠处理也不会改变fPAMMP的电荷。因此，和fPAMMP一样，PAMMP也可用于提取DNA。本发明将PAMMP用于捕获DNA，并通过qPCR检测PAMMP@DNA。结果表明，用PAMMP仍然可以有效地提取DNA(图12D，a)。常规PCR检测表明，可以从PAMMP@DNA中成功扩增出目标DNA(16S rDNA)(图12D，b)。重要的是，可以使用qPCR从PAMMP@DNA中定量检测目标基因(T7 RNA聚合酶基因)(图13A)。最后，本发明发现通过qPCR也可以从fPAMMP@DNA灵敏地检测到目标基因(T7 RNA聚合酶基因)，而自发荧光并没有显著影响qPCR检测(图13B)。

Claims (9)

1.一种聚丙烯酰胺微球在制备核酸快速提取的试剂中的应用，所述聚丙烯酰胺微球主要由丙烯酰胺AM、甲叉双丙烯酰胺MBA、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺APMA、过硫酸铵APS以及多聚赖氨酸ε-PL构成，并经戊二醛进一步交联得到。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚丙烯酰胺微球具有可见及近红外荧光性能；具有大量正电荷；具有酸、碱及高温严苛处理下的稳定性，同时可高效静电吸附核酸分子。
3.根据权利要求1所述的应用，所述聚丙烯酰胺微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
聚丙烯酰胺微球经点样聚合法合成：将AM、MBA及APMA溶于去离子水中，获得均匀的丙烯酰胺单体溶液，将丙烯酰胺单体溶液、ε-PL和APS混合制备成混合液，将混合液点到附有聚乙烯的平皿上形成液滴，然后用含四甲基乙二胺TEMED的矿物油覆盖液滴，进行聚合形成聚丙烯酰胺微球；除去矿物油后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球并重悬于水中；在聚丙烯酰胺微球水溶液中加入戊二醛并孵育后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球除去过量的戊二醛，获得最终的可用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球。
4.根据权利要求1所述的应用，所述聚丙烯酰胺微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
聚丙烯酰胺微球经改进的反相微乳液聚合法合成：将Span 80和己烷加入到容器中，将混合物在氮气吹送下搅拌直至表面活性剂Span 80均匀分散，制成油相溶液；同时将丙烯酰胺、APMA和MBA溶解在去离子水中，以获得均匀的丙烯酰胺单体液体，然后将其与ε-PL和APS混合制备成水相溶液；将水相溶液加入到油相溶液中，然后将混合物在氮气吹送下搅拌；最后通过添加促进剂TEMED引发聚合反应，并将混合物充分搅拌，聚合形成聚丙烯酰胺微球；除去油相后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球并重悬于水中；在聚丙烯酰胺微球水溶液中加入戊二醛并孵育后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球除去过量的戊二醛，获得最终的可用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核酸快速提取为使用裂解液裂解生物样品，之后将聚丙烯酰胺微球加入裂解物中，使核酸吸附在聚丙烯酰胺微球上，微球经洗涤液简单洗涤后，即可完成核酸的提取。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述裂解液包括单一组分的各种浓度氢氧化钠溶液。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸吸附在聚丙烯酰胺微球上后可直接将带有核酸的聚丙烯酰胺微球加入常规PCR或定量PCR反应液中用于PCR扩增检测目标核酸分子。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核酸快速提取的具体过程为：（1）向菌液、细胞液、液氮研磨的组织、或血浆中加入等体积裂解液，吹打或颠倒试管，混匀以便充分裂解细胞；（2）向裂解物中直接加入聚丙烯酰胺微球，移液器吹打或颠倒试管，混匀以便微球充分吸附DNA；（3）用去离子水洗涤微球，将微球重悬于水，完成DNA提取。
9.一种无荧光聚丙烯酰胺微球在制备核酸快速提取及PCR检测的试剂中的应用，其特征在于，所述无荧光聚丙烯酰胺微球由权利要求1所述的聚丙烯酰胺微球经硼氢化钠处理后，消除其荧光，产生的无荧光聚丙烯酰胺微球。
CN202010035005.3A 2020-01-13 2020-01-13 一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用 Active CN111205403B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010035005.3A CN111205403B (zh) 2020-01-13 2020-01-13 一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010035005.3A CN111205403B (zh) 2020-01-13 2020-01-13 一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111205403A CN111205403A (zh) 2020-05-29
CN111205403B true CN111205403B (zh) 2021-07-27

Family

ID=70780698

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010035005.3A Active CN111205403B (zh) 2020-01-13 2020-01-13 一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111205403B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112982012B (zh) * 2021-02-09 2022-05-10 杭州梓晶生物有限公司 一种聚丙烯酰胺衍生物修饰滤纸及其在核酸分离富集中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100535649C (zh) * 2006-03-30 2009-09-02 中国科学院电子学研究所 三维纳隙网格阵列微电极生物传感芯片
CN101760736B (zh) * 2008-12-26 2013-11-20 汉高（中国）投资有限公司 一种镀锌钢板表面处理剂和一种镀锌钢板及其制备方法
CN107652967B (zh) * 2017-08-28 2020-04-24 东南大学 一种自荧光聚丙烯酰胺纳米粒子及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111205403A (zh) 2020-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9297006B2 (en) Methods of nucleic acid amplification and sequencing
US20070148690A1 (en) Analysis of gene expression profiles using sequential hybridization
JP2012152219A (ja) 固定化捕捉プローブを用いる遺伝子発現分析法の最適化
EP3212792B1 (en) Nucleic acid modifying agents and uses thereof
JP2012509078A (ja) 二本鎖核酸特異色素を用いる固体表面でのリアルタイムマルチプレックスｐｃｒ検出
CN103228785A (zh) 扩增核酸的检测方法和检测装置
US20170051338A1 (en) Self-assembly of dna origami: a new diagnostic tool
EP1727910A1 (en) Method of detecting nucleic acid using amplification on an array
JP3872762B2 (ja) Ｄｎａチップの品質管理方法
CN107760763B (zh) 一种用于茎环引物-滚环扩增反应的茎环引物以及茎环引物-滚环扩增的应用
CN107447031B (zh) 一种乳液中进行环介导等温扩增的突变核酸数字分析方法
CN113304700A (zh) 一种制备磁性聚合物微球的方法及其应用
CN111205403B (zh) 一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用
CN111808925B (zh) 基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法
US6620586B2 (en) Methods and compositions for analyzing nucleic acids
CN111965148B (zh) 一种基于硅纳米粒子荧光传感的microRNA检测方法及其应用
WO2013132700A1 (ja) 標的核酸の検出方法
JPH03206899A (ja) クリプトコックス・ネオホルマンスの検出に用いる核酸プローブおよび方法
CN105112506B (zh) 一种对样品中大肠埃希氏菌10种k抗原分型的基因液相芯片及其检测方法
RU2809092C1 (ru) Способ получения аффинного носителя в виде суспензии частиц гидрогеля на основе модифицированного нерастворимого полисахарида для выделения специфической РНК/ДНК, необходимой для проведения ОТ-ПЦР- и/или ПЦР-диагностики
JP2009207418A (ja) 核酸の選択的分離方法
JP2010136657A (ja) ハイブリダイゼーション用カバー及びそれを用いた標的核酸の検出方法
DE10215367B4 (de) Verbessertes Verfahren zur Bestimmung von Nukleotidsequenzen
Sumner et al. Fluorescence Hybridization Assay Based On Chitosan-Linked Softarrays
JP2013153706A (ja) イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との検出チップ及びそれを用いた検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant