Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt daher darin, die Probleme
des Standes der Technik zu überwinden
und ein Verfahren bereitzustellen, mit dem ohne großen Aufwand
eine Vielzahl unterschiedlicher Proben untersucht werden kann und
auch zahlenmässig
geringe Änderungen,
wie SNPs ("single
nucleotide polymorphisms"/"Einzel-Nukleotid-Polymorphismus") oder zwei oder
drei Änderungen
in einer Nukleotidsequenz erfasst werden können.
Diese
Aufgabe wird gelöst
durch ein Verfahren zur Bestimmung von Nukleotidsequenzen, bei dem mindestens
ein erstes Oligo-/Polynukleotid auf einer vorbestimmten Stelle auf
einem Träger
aufgebracht wird und der Träger
mit mindestens einem zweiten Oligo-/Polynukleotid unter Bedingungen
in Kontakt gebracht wird, die eine Hybridisierung komplementärer Stränge ermöglicht,
wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die Hybridisierung
in Gegenwart eines p53-Polypeptids durchgeführt wird.
Während der
Studien, die zu der vorliegenden Erfindung führten, wurde übenaschenderweise
gefunden, dass p53 die in vitro DNA-DNA-Hybridisierung auch bei
DNA, die immobilisiert auf einer Trägeroberfläche vorliegt, beschleunigt
bzw. begünstigt.
Auf der Grundlage dieser Erkenntnis wurde ein neuartiges und schnelles
DNA-Microanay-Erfassungssytem entwickelt, mit dem sogar SNPs oder
einige wenige Änderungen
in einer Nukleotidsequenz von Interesse erfasst werden können.
p53
selbst ist als Tumor-Suppressor-Protein wohlbekannt. Dessen Hauptfunktion
besteht bekanntermassen darin, den Ablauf der Zellteilung zu steuern,
wobei das p53-Protein als Transkriptionsfaktor an DNA bindet und
dadurch die Synthese von anderen Eiweißmolekülen einleitet, die den Zellzyklus
anhalten oder dazu beitragen, die Zelle in die Apoptose zu treiben.
Die ebenfalls vorhandene Annealing-Aktivität des p53 Proteins ermöglicht offensichtlich
eine Verbesserung der Hybridisierung komplementärer Nukleotidsequenzen auch
in vitro.
In
den Figuren:
1 zeigt
eine photographische Darstellung der erhaltenen Fluoreszenz bei
dem Mikroarray;
2 zeigt
einen Vergleich der erhaltenen Fluoreszenz-Intensitäten gemäß Stand
der Technik und gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren;
und
3 zeigt
ein Diagram mit Fluoreszenzintensitäten.
4 zeigt
ein Druckschema der Mikroarrays mit aminomodifizierten PCR-Produkten;
jeder Schritt erfolgte in einem Volumen von 200 ml/10 Arrays. Nach
Immobilisierung konnten die geblockten Arrays in dunkler, trockener
und kühler
Atmosphäre
für 3 Wochen
gelagert werden. Der Blockschritt wurde in grossen Petrischalen
im Hybridisierungsofen ausgeführt.
Es wurden immer 4 Mikroarrays zusammen in einer Schale geblockt. Denaturierungs-
und Auswaschschritt erfolgten erst direkt vor der Hybridisierung.
5 zeigt
ein Layout aller Varianten einfach aminomodifizierter/beidseitig
aminomodifzierter PCR-Produkte in 3x SSC und 1,5 mol/l Betain. Sequenzübereinstimmungen
mit dem TEM-1 β-Lactamase-Gen sind
markiert. Alle Sonden wurden doppelt gedruckt, um Hintergrundeffekte
zu vermeiden. Als Positiv-Druckkontrolle wurde ein sense aminomodifiziertes
und Cy5-markiertes PCR-Produkt verwendet.
6 zeigt
Diagramme zur Auswertung der Hybridisierung der PCR-Produkte. Die
Konzentrationen 10 ng/μl
und 15 ng/μl
wurden ausgewertet. Die Experimente wurden bei 37°C durchgeführt, die
Hybridisierungszeiten variierten. Die ersten Balken repräsentieren
Experimente mit p53 Zusatz, die dritten und vierten Balken die mit
unspezifischem Proteinzusatz und bei den zweiten Balken handelt
es sich um die Negativkontrolle, das heißt ohne jegliches Protein.
7 zeigt
Diagramme zur Auswertung der Hybridisierung der PCR-Produkte. Es
wurden die Konzentrationen 15 ng/μl
für drei
verschiedene Aminomodifikationen ausgewertet. Die Experimente wurden
bei 37°C für 1 Std.
durchgeführt.
Die ersten Balken sind die Experimente mit p53 Zusatz, die dritten
und vierten Balken die mit unspezifischem Proteinzusatz und bei
den zweiten Balken, handelt es sich um die Negativkontrolle ohne
jegliches Protein.
Im
Kontext dieser Anmeldung umfasst der Begriff " Oligo-/Polynukleotid" DNA und RNA, wobei
diese bekanntermassen Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil
als Basen-, sowie Desoxyribose und Ribose als Zucker-Bauelemente
aufweisen können.
Darüber
hinaus kann ein Oligo-/Polynukleotid jedoch auch jede, im Stand
der Technik bekannte modifizierte Base enthalten, die zu einer Basenpaarung
mit mindestens einer der vorstehend aufgeführten Basen beflähigt ist.
Weiterhin fallen unter den Begriff "Oligo-/Polynukleotid" auch Derivate der vorstehend aufgeführten Verbindungen,
insbesondere Derivate die Farbstoffe oder radioaktive Markierungen
aufweisen.
Im
Sinne der Erfindung weisen als Sonde verwendete Oligo-/Polynukleotide
eine Länge
von bis zu etwa 2000 Nukleotiden auf, vorzugsweise bis zu 100 Nukleotiden,
mehr bevorzugt 50 Nukleotiden, noch mehr bevorzugt zwischen 15 und
30 Nukleotiden auf. Als Ziel-Oligo-/Polynukleotide im Sinne der vorliegenden
Erfindung sind alle Oligo-/Polynukleotide mit beliebiger Länge zu verstehen,
d.h. bis zu der genomischen Sequenz eines Individuums.
Der
erfindungsgemäß eingesetzte
Träger
kann jeder im Handel erhältliche
und für
den Zweck der Hybridisierung gebräuchliche Träger sein, einschließlich Membranen,
Metallträgern,
Kunststoffmaterialien, Kügelchen
oder Glas. Ein Träger
mit einer größeren Anzahl
von aufgebrachten Oligo-/Polynukleotiden wird generell als Biochip/Mikroarray
bezeichnet.
Zum
Aufbringen von Oligo-/Polynukleotiden auf den Träger kann jedes im Stand der
Technik bekannte Verfahren verwendet werden, das zeitweilig oder
dauerhaft eine Immobilisierung, ein Fixieren oder ein Anhaften des
Proben-Oligo-/Polynukleotids an einer Stelle oder in einem Bereich
des Trägers
bewirkt, beispielsweise unter Ausbildung kovalenter, ionischer,
metallorganischer Bindungen, von Bindungen auf Basis von van-der-Waals-Kräften oder
von Enzym-Substrat-Wechselwirkungen oder von sog. "Affmitäts-Bindungen". Natürlich können zwischen
dem Träger
und dem auf dem Träger
aufgebrachten Oligo-/Polynukleotid beliebige Spacer-Moleküle, beispielsweise
Spacer auf Polymer-Basis, angeordnet werden. Darüber hinaus eignen sich für die Durchführung der
vorliegenden Erfindung auch Träger
auf der Basis selbst-organisierender ("self-assembling") Schicht-Systeme. Das Auftragen kann gegenwärtig auch
unter Verwendung automatisierter Verfahren erreicht werden.
Das
in der Erfindung zum Einsatz kommende p53 kann jedes bekannte p53-Protein
sein, das ein Annealen von Oligo-/Polynukleotidsträngen fördert. Neben
nativem und rekombinant hergestelltem p53 aus unterschiedlichen
Organismen können
auch beliebige Komplexe oder Verbindungen davon verwendet werden, die
p53 oder den für
die Annealaktivität
verantwortlichen Bereich von p53 umfassen. Insbesondere kommen auch
Holoenzyme auf der Basis von p53 in Betracht, die mit weiteren Proteinen
ausgebildet sein können.
Von der vorliegenden Erfindung sind auch thermostabile p53-Varianten
erfasst, die über
ein Randommutation-Verfahren erzeugt werden können. Diese Verbindung, die
eine größere thermische
Toleranz aufweist, ist bei der Herstellung von thermisch stabileren
Systemen von Nutzen.
Eine
Hybridisierung unter Verwendung von p53 kann im Vergleich zum Stand
der Technik unter etwas geänderten
Bedingungen hinsichtlich der Salz-Konzentrationen erfolgen, beispielsweise
in einen Puffer, der weniger als 100 mmol/l an Salz, beispielsweise
NaCl oder SSC, enthält.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann bei jedem bis dato im Stand der Technik bekannten Nachweisverfahren
eingesetzt werden, das auf der Methodik der Hybridisierung komplementärer Oligo-/Polynukleotidstränge gründet. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
kann das erfindungsgemäße Verfahren
zur Bestimmung von genetischen Mutationen in Organismen eingesetzt
werden, da damit einige wenige und sogar nur eine einzige Änderung
in der Sequenzabfolge eines Oligo-/Polynukleotids schnell und mit
hoher Spezifität nachgewiesen
werden können.
Eines von zahlreichen Beispielen hierfür ist die Bestimmung von genetischen Mutationen,
die in verschiedenen Bakterien, beispielsweise im TEM-1 β-Lactamase-Gen auftreten
können. Darüber hinaus
eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren
auch zur Bestimmung genetischer Mutationen, die in beliebigen Organismen,
einschließlich
Säugetieren
und Menschen, auftreten. Genauso können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
beispielsweise auch synthetisch hergestellte Oligo-/Polynukleotidsequenzen untersucht
werden.
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird das erfindungsgemäße Verfahren
bei der Untersuchung eines Oligo-/Polynukleotids auf das Vorliegen
eines "single nucleotide
polymorphisms" SNP
eingesetzt. Unter SNP versteht man jeglichen Polymorphismus zwischen
zwei Genomen, der auf einem einzelnen Nukleotidaustausch, einer
geringfügigen
Deletion oder Insertion basiert. Spezifische SNPs konelieren mit
einem erhöhten
Risiko für
das Auftreten einer bestimmten Erkrankung und sind somit von diagnostischem
Interesse.
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird das erfindungsgemäße Verfahren
zur Bestimmung von Antibiotika-Resistenzen verwendet, da Antibiotika-Resistenzen
bestimmter Bakterien durch genetische Veränderungen des Genoms der Bakterien,
beispielsweise am Wildtyp TEM-1 β-Lactamase-Gen, hervorgerufen
werden. Ungefähr
70 Mutanten dieses Gens wurden bereits in der Literatur beschrieben
und insgesamt 28 potentielle Mutationspunkte wurden in der Wildtyp
TEM-1 β-Lactamase-Nukleotidsequenz
aufgefunden. Häufig
führten
bereits eine einzige oder einige wenige Nukleinsäuremutationen auf der Basis
von SNPs zu einer veränderten
Substrat-Spezifität
und Inhibitor-Spezifität
der β-Lactamase,
was wiederum zu einem beschleunigten Abbau zahlreicher Antibiotika
und folglich zum Auftreten von Antibiotika-Resistenzen führen kann.
Durch
das erfindungsgemäße Verfahren
wird somit ermöglicht,
eine Resistenz beispielsweise von Bakterien auf β-Laktam-Antibiotika, Penicilline,
Cephalosporine und insbesondere auf Ampicillin festzustellen.
Um
einen Nachweis einer Hybridisierung zwischen einem auf dem Träger aufgebrachten
Oligo-/Polynukleotid und einem zweiten, eine komplementäre Sequenz
aufweisenden Oligo-/Polynukleotid
zu ermöglichen,
weist mindestens eines dieser Moleküle eine oder mehrere detektierbare
Markierungen, beispielsweise Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe
oder radioaktive Markierungen auf.
p53
kann offensichtlich auch in vitro besser an einzelsträngige DNA
als an doppelsträngige
DNA binden, so daß sich
p53 nach Ausbildung eines Doppelstranges auf einzelsträngige DNA
zu bewegt. Diese Eigenschaft stellt einen großen Vorteil bei Hybridisierungen
dar, bei denen beispielsweise aus geräte- oder reaktionstechnischen
Gründen
lediglich eine Durchmischung durch Diffusion oder schwaches Rühren oder
Pumpen der Lösungen
erfolgt.
Eine
Verwendung von p53 ist außerdem
dann von Vorteil, wenn nur geringe Mengen an einem zu untersuchendem
Oligo-/Polynukleotid vorliegen.
Die
vorliegende Erfindung umfasst weiterhin auch einen Kit zur Durchführung eines
in den Ansprüchen dargelegten
Verfahrens, der ein p53 Polypeptid enthält. Dabei können verschiedenste Ausführungsformen
eines derartigen Kits verwirklicht werden, derart wie beispielsweise
in medizinischen Labors einsetzbare Mikroarrays/Biochips, die eine
routinemäßige Erfassung
von genetischen Mutationen, sei es zur Bestimmung von Erkrankungen
oder zur Feststellung von Antibiotikaresistenzen, ermöglichen,
oder vorbereitete Reaktionsgefäße, die
p53 und ein Farbstoff-markiertes Nukleotid enthalten, wodurch reihenmäßig durchgeführte, spektroskopische
Messungen erleichtert werden.
Insbesondere
eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren
für Schnelltests
zur Erfassung von Antibiotika-Resistenz-Genen. Dies ermöglicht,
daß Patienten
schneller, bereits nach 30–60
Minuten, mit einem, mit hoher Wahrscheinlichkeit wirksamen, Antibiotikum
versorgt werden können.
Derartige
Schnelltests dienen beispielsweise dazu festzustellen, ob am Gen
für die
TEM-1 (3-Lactamase
Mutationen vorliegen. Als Folge dieser Mutationen weisen einige
TEM-Derivate auch Aktivität
gegen neuere Antibiotika auf und werden als "extended-spectrum-beta-lactamases" (ESBL) bezeichnet.
ESBL-Enzyme wurden beispielsweise bei Klebsiella pneumoniae, aber
auch bei Enterobacteriaceae, Citrobacter und Salmonellen-Spezies
beobachtet. In der Folge ist der Gebrauch verschiedener, seit langem
bekannter Antibiotika nur nach vorheriger Resistenztestung angebracht.
Die
erfindungsgemäßen Testverfahren
ermöglichen
somit, daß kostengünstige Standard-Antibiotika häufiger eingesetzt
werden können
und neu entwickelte, hochwirksame Antibiotika weniger häufig verwendet werden
müssen
und somit der Öffentlichkeit
länger
für Patienten
mit multiresistenten, bakteriellen Erkrankungen zur Verfügung stehen.
Die
folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung ohne diese zu begrenzen. Insbesondere sollten die dort
beschriebenen Sequenzlängen
des ersten und zweiten Oligo-/Polynukleotids und die Farbstoffinarkierung des
zweiten Oligo-/Polynukleotids die vorliegende Erfindung nicht einschränken.
Beispiel 1: Untersuchung
von SNPs im TEM-1 β-Lactamase-Gen
Allgemeiner Aufbau der
Mikroarray-Anordnung
Für die bekannte
Mutanten-Positionen S28, 537, S102, 5162, S180, 5236, 5237, 5241,
5261 und S272 in der DNA des TEM-1 (3-Lactamase-Gens werden 4 Sätze von
Sonden, entsprechend der vier in DNA vorkommenden Nukleotiden A,
G, C und T bereitgestellt und jeweils an einer bestimmten Stelle
des Mikroarrays angeordnet (siehe nachstehend).
Die
Sequenzen sind in nachstehender Tabelle I angegeben: Tabelle
I
Die
Nukleotisequenz der Sonde wurde von dem TEM-1 Typ β-Lactamase-Gen
abgeleitet (Gen Bank, AF309824). Die unterstrichenen Nukleotide
zeigen Punktmutationen.
Unter
Bezugnahme auf
1 befindet sich somit in der
ersten Spalte der Sondensatz für
die Mutation 528, welche die folgenden vier Sequenzen aufweist:
Eine
dieser Sonden des Sondensatzes S28 (S28_pg) entspricht dem entsprechenden
Abschnitt der Wildtyp TEM-1 (3-Lactamase-DNA, während die anderen für Punktmutationen
an der betreffenden Stelle stehen.
Herstellung der Trägervorrchtungen
Die
jeweiligen Oligo-/Polynukleotide wurden in einer Lösung (45
mmol/l Natriumcitrat, 450 mmol/l NaCl, 1,5 mol/l Betain) aufgenommen.
So wurde eine Konzentration von 20 pmol/μl an Oligo-/Polynukleotiden/Sonden-DNA
erhalten. Die Lösung
(30 μl)
wurde unter Verwendung der GMS 417-Anayer-Vorrichtung (Affimetrix)
auf Poly-L-Lysin beschichtete Glasträger (Poly PREP Träger) in
Form von Spots aufgetragen.
Nach
Trocknung über
Nacht bei Raumtemperatur wurden die Träger während 5 s auf einem Metallblock
auf 80 °C
erhitzt. Eine Bindung ("cross
linking") der DNA
an die Trägeroberfläche wurde
durch eine UV-Bestrahlung mit einer Gesamtenergie von 100 mJ unter
Verwendung einer BLX 254 UV crosslinker-Vorrichtung (Biometra) erreicht.
Die so erhaltenen Träger
wurden anschließend
während
einer Stunde in eine Blockierungs-Lösung (1 g Bernsteinsäureanhydrid,
200 ml 1,2-Dichlorethan (DCE), 2,5 ml 1-Methylimidazol) eingebracht
und danach mit DCE gewaschen. Nach einem kurzen Spülvorgang
mit 95% Ethanol wurden die Träger
bei Raumtemperatur getrocknet. Für
einen zweiten Blockierungs-Vorgang wurden jeweils 12 μl mit Ultraschall
behandelte Lachssperma-DNA (0,01 μg/μl) auf die
Träger
aufgebracht, die anschließend
während
30 min mit einer Glasabdeckung bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer
inkubiert wurden. Nach Abnahme der Glasabdeckung wurden die Träger mit
Hilfe von Stickstoffgas getrocknet.
Herstellung
der Ziel-DNA
Die
Ziel-DNA (Teil des β-Lactamase-Gens)
wurde mittels einer PCR (polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion)
mit Fluoreszenzfarbstoff-markiertem Nukleotid hergestellt.
Das
Reaktionsgemisch enthielt 10 μl
PCR-Puffers (10 × PCR-Puffer),
10 μl 25
mmol/l MgCl2-Lösung, 2 μl "forward and reverse primer" (20 pmol/μl) (atgagtattcaacatttccg:
Forward primer; ttaatcagtgaggcacctat: Reverse primer), jeweils 1 μl 25 mmol/l
dNTPs (2'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphate), 0,5 μl 25 nmol/l CyTM5-dCTP (-Desoxycytidin-5'-triphosphat (FluoroLinkTM Cy5-dCTP,
5-Amino-propargyl-2'-deoxycytidin
5'-triphosphate
gekoppelt an Cy5 Fluoreszenzfarbstoff (Cy5-AP3-dCTP)), 1 μl Taq DNA
Polymerase (1 E/μl
und 1 μl
der Template-DNA (0,1 μg/μl) (plasmid
pUC19).
Die
PCR-Reaktion wurde in einer Master-Cycler-Vorrichtung mit folgendem
Programm durchgeführt: 95 °C, 1 min;
25 Zyklen mit 94 °C
30 s, 55 °C
30 s, 72 °C
60 s und 72 °C
4 min.
Das
PCR-Produkt wurde nach Aufreinigen durch Ethanol-Ausfällung (0,3
mol/l Natriumacetat, 2 × Volumen
95 % Ethanol; 20 min. bei –21 °C), Zentrifugation
bei 20 000 g, und Auflösen
des Pellets in Wasser während
5 min bei RT inkubiert (45 μl
PCR-Produkt, 5 μl
Puffer (RQ1 Reaktionspuffer), 1 μl
RQ1 DNase-Lösung (1
E/μl). Die
Reaktion wurde durch Zugabe von 5 μl einer Stop-Lösung (RQ1
Stop-Puffer) gestoppt und anschließend während 10 min bei 65 °C inkubiert.
Hybridisierung
a) Stand der Technik
Die
Ziel-DNA wurde mit der Hybridisierungslösung (x6 SSPE ("saline sodium Phosphate
EDTA"); x20, 3,6
mol/l NaCl, 0,2 mol/l Natriumphosphat, 20 mmol/l EDTA (Ethylen-diamintetraacetat)
0,1 % Formamid als Endkonzentration (v/v %) bis zum Erreichen eines
Endvolumens von 12 μl
versetzt und vermischt.
Die
Hybridisierung wurde bei 45 °C
während
6–12 Std.
durchgeführt.
Anschließend
wurden die Träger einmal
mit einer 0,1 % (w/v %) SDS (Natriumdodecylsulfat) enthaltender
X2 SSC ("saline
sodium citrate")
Pufferlösung
während
5 min gewaschen, dann einmal mit einer X0,2 SSC-Pufferlösung während 3
min bei RT gewaschen und anschließend unter Stickstoffatmosphäre getrocknet.
b) p53 vermittelte Hybridisierung
0,5 μl p53 (1 μg/μl, Santa
Cruz) wurde mit 11,5 μl
Annealing-Puffer (5 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l
KCl, 5 mmol/l Phosphatpuffer, 0,5 mmol/l EDTA, 3,5 % (v/v %) Glycerin)
vermischt und anschließend
zu dem Mikroarray mit Glasabdeckung gegeben. Nach Inkubation bei
Raumtemperatur für
10 min wurde die Glasabdeckung entfernt und 1 μl Ziel-DNA (Ziel-DNA mit DNAse I inkubiert;
siehe vorstehend), die mit 12 μl
Annealing-Puffer (vorstehend) vermischt worden waren, wurden auf
das Micro-Array aufgebracht. Nach Hybridisierung für 30 min
bei 37 °C
wurden die Träger
mit X2 SSC (0,03 mol/l Natriumcitrat, 0,3 mol/l Natriumchlorid pH
70), 0,1% SDS für
10 min gewaschen und mit I, X0,2 SSC für 3 min bei Raumtemperatur
gespült.
Die Glasträger
wurden anschließend
mit Stickstoffgas getrocknet und mittels eines Laserscanners auf
Fluoreszenz untersucht.
c) Quantifizierung positiver
Spots
Zur
Feststellung des Vorliegens einer Hybridisierung auf den jeweiligen
Spots des Mikro-Arrays
wurde das Mikro-Array mit einem Laser-Scanner gescannt (GMS 418,
Genetic Microsystems). Eine Berechnung der Intensität der von
einem Spot emittierten Fluoreszenz wurde unter Verwendung von bildgebender
Software durchgeführt
(Imagene Ver. 3, BioDiscovery Inc.). Jedes Experiment wurde sechsmal
wiederholt.
3 zeigt
graphisch die erhaltenen Ergebnisse, wobei die weißen Balken
die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhaltenen Ergebnisse zeigen und die schwarzen Balken die mit dem
Verfahren des Standes der Technik erhaltenen Intensitäten.
Beispiel 2: PCR-Produkt
Mikroarrays
Präparation der Mikroarrays
a) Entwurf von PCR-Produkt
Sonden
Bei
den PCR-Produkt-Sonden für
den Nachweis von Antibiotikaresistenzen im allgemeinen handelte es
sich um das ganze TEM-1 β-Lactamase
Gen (861 bp), das zur Detektion von Resistenz gegen Ampicillin (amp)
eingesetzt wird. Als Negativ-Kontrolle verwendete man das Tetrazyklin-Resistenz
Gen (tet) (1500 bp). Zur Überprüfung von
unspezifischen Hybridisierungen kam das Gen von p53 (ca. 1000 bp)
und das hu AchE-Gen (1400 bp) zum Einsatz.
b) DNA Isolierung mittels
QIAprep Spin Miniprep Kit
Mittels
QIAamp®Kits
von Qiagen wurde die DNA aus einer ÜN-Kultur (2 ml steriles LB-Medium versetzt mit
2 μl 100
mmol/l Ampicillin und 100 μl
Glycerolstock ÜN
inkubiert bei 37°C)
isoliert. Die Durchführung
erfolgte laut Herstellerangaben, die dazu benötigten Puffer waren im Lieferumfang
enthalten.
Das
durch Zentrifugation (20,000g für
30 s) geerntete Zellpellet wurde sorgfältig in 250 μl Puffer
P1 resuspendiert und durch vorsichtiges dreimaliges Schütteln mit
Puffer P2 gemischt. Dann erfolgte die Zugabe von 350 μl Puffer-N3.
Anschließend
wurde zentrifugiert (10 min bei 20,000g und 4°C). Die extrahierte DNA im Überstand
wurde nun auf eine QIAamp®-Minisäule aufgetragen, die bereits
in ein Auffangröhrchen
eingesetzt worden war und für
30 s bei 20,000g zentrifugiert. Nach dem darauffolgenden Waschschritt
mit 750 μl
PE-Puffer und anschließender
Zentrifugation (20,000g für
1 min) konnte die DNA mit TE-Puffer oder HPLC-H2O
in ein 1,5 ml Mikrogefäß eluiert
werden. Diese Minipreps dienten als template für die Amplifikation.
c) Bestimmung von DNA-Konzentrationen
Die
DNA-Konzentration eines DNA-Minipreps wurde nach einer 1:50 Verdünnung mit
1×TE photometrisch
im BioPhotometer von Eppendorf gegen einen Blindwert von 1×TE bei
260 nm bestimmt.
d) Sondenvorbereitung
mittels Polymerasekettenreaktion
Bei
der in dieser Arbeit eingesetzten DNA zur Sondenherstellung für PCR-Produkt-Mikroarrays
handelte es sich um die in Tabelle II aufgeführten Proben.
Sie
wurden durch Amplifikation mit den vorgesehenen Primern (Tabelle
) hergestellt.
e) Amplifikation
Die
vollständigen
PCR-Produkte wurden mit dem entsprechenden Primerpaar aus den DNA
Extrakten mittels einer PCR im Master Cycler amplifiziert. Es wurden
sowohl die normalen Frimer verwendet als auch die aminomodifizierten
Primer um die Sonden herzustellen. Ein Ansatz von 100 μl enthielt
folgende Komponenten: Tabelle
III:
PCR-Ansatz
einer Amplifikation zur Sondenherstellung
Die PCR erfolgte nach
folgendem Programm:
Tabelle IV:
PCR
Programm zur Amplifikation jeglicher in dieser Arbeit verwendeter
DNA
f) Targetvorbereitung
mittels Polymerasekettenreaktion
Bei
der in dieser Arbeit eingesetzten Target-DNA zur Hybridisierung
der Mikroarrays handelt es sich ausschließlich um das kommerziell in
puc 19 enthaltene erhältliche
TEM-1 β-Lactamase Gen.
g) Amplifikation und Fluoreszenzmarkierung
Das
vollständige
TEM-1 β-Lactamase-Gen
mit einer Länge
von 652 by wurde mit dem entsprechenden Primerpaar aus DNA- Extrakten
mittels einer PCR im RoboCycler
TM von Stratagene
amplifiziert und mit Cy5-dCTP fluoreszenzmarkiert. Ein Ansatz von
100 μl enthielt
folgende Komponenten: Tabelle
V
Hier
wurde das gleiche Programm wie bei der normalen Amplifikation (vorstehend)
verwendet.
h) Aufreinigung von DNA
Die
Aufreinigung von fluoreszenzmarkiertem PCR-Produkt und nicht markiertem
PCR-Produkt erfolgte mittels
QIAquick®-Minisäulen von
Qiagen. Die Durchführung
erfolgte gemäß Herstellerprotokollen,
die Puffer waren im Lieferumfang enthalten. Die Zentrifugierparameter
waren bei jedem Schritt 1 min und 20.000g. Ein 100 μl PCR-Ansatz
wurde mit 500 μl
PB-Puffer auf eine QIAamp®-Minisäule gegeben, die in ein Auffangröhrchen gesetzt
worden war, und zentrifugiert. Nach einem Waschschritt mit 750 μl PE-Puffer
und erneuter Zentrifugation wurde aus dem Auffangröhrchen sämtliche
Flüssigkeit
entfernt und ein abschließender
Zentrifugationsschritt zur kompletten Entfernung des Waschpuffers
durchgeführt.
Die DNA wurde dann mittels Zentrifugation in 32 μl TE-Puffer in ein 1,5 ml Mikrogefäß eluiert.
Die Kontrolle erfolgte über
1% Agarosegele.
i) Hybridisierung bei
aminomodifizierten PCR-Produkten
Experiment mit p53
140
ng aufgereinigte, fluoreszenzmarkierte Ziel-DNA wurden mit entsprechender
Menge an 20x SSPE gemischt und auf ein Hybridisierungsvolumen von
13,5 μl
mit HPLC-H2O verdünnt. Die Endkonzentration an SSPE
betrug somit im Experiment 1x SSPE bzw. 165 mmol/l. Diese Lösung wurde
sofort nach dreiminütiger Denaturierung
bei 95°C
und sofortigem Abkühlen
auf Eis mit 0,5 μl
p53 von Santa Cruz (c = 1 μg/μl) versetzt, auf
die Mikroarrays pipettiert, und mit einem Deckglas (18 × 18mm)
luftblasenfrei bedeckt. Die Arrays wurden dann in feuchtigkeitsdichten
Hybridisierungskammern von Corning verschlossen, die mit je 10 μl HPLC-H2O in den zwei Vorratsgefäßchen befällt waren. Danach wurde sofort
bei 37°C
in einem Hybridisierungsofen hybridisiert. Die Hybridisierungszeiten
betrugen 1 Stunde, 30 min und 10 nun.
Experiment mit BSA und
Casein
Zur
Kontrolle auf unspezifische Proteineffekte wurde das Experiment
wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Anstatt p53 wurde genau
die gleiche Konzentration an BSA bzw. Casein zugegeben. Beide Proteine
waren in dem gleichen Aufbewahrungspuffer gelöst, wie das von Santa Cruz
gelieferte Protein p53.
Experiment mit Aufbewahrungspuffer
Als
Negativkontrolle der Experimente wurde zur Hybridisierungslösung nur
der hergestellte Aufbewahrungspuffer des Proteins p53 verwendet.
Die folgenden Puffer und Lösungen
wurden verwendet:
k) Waschen und Trocknen
aminomodifizierter PCR-Produkt-Arrays
Nach
der Hybridisierung wurden je 10 Arrays in Waschpuffer I (2 × SSC +
0,1%SDS in ddH2O) und dann für weitere
10 min in Waschpuffer Ia (2x SSC) und abschließend noch 10 min in Waschpuffer
II (0,2 × SSC
in ddH2O) durch Schütteln gewaschen. Die Arrays
wurden sofort im N2-Strom getrocknet und
anschließend
zur Detektion in den GMS 418 Array Scanner gelegt.
l) Ergebnisse
Für jedes
Experiment wurden drei Mikroarrays verwendet. D.h., jeder Balken
steht allgemein für
insgesamt 18 Werte, da Duplikate auf einen Subarray gedruckt wurden
und sich drei Subarrays auf jedem Träger befanden. Es wurde hier
auch nur die sense Aminomodifizierung ausgewertet, da man für antisense
und sense im wesentlichen die gleiche Werte erhielt.
In 6 wurden
die Signalintensitäten
für 10
und 15 ng/μl
ausgewertet. Es ist ersichtlich, dass die Werte für die p53
Experimente deutlich höher
ausfielen, als für
die Negativkontrolle oder bei Verwendung von BSA und Casein. Die
normalerweise benötigte
Hybridisierungszeit für
PCR-Produkte beträgt
im allgemeinen 6–10
Stunden. Erfindungsgemäß wurden
bereits nach 10 min Hybridisierungszeit auswertbare Signale erhalten.
