DE102004034343A1

DE102004034343A1 - Verfahren und Mittel zum Nachweis von Spuren genomischer Varianten mittels Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen

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Publication number: DE102004034343A1
Application number: DE200410034343
Authority: DE
Inventors: Olfert Landt
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-07-10
Filing date: 2004-07-10
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2024-07-11
Also published as: DE102004034343B4

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuresequenzen, die in geringer Zahl in einer Probe zusammen mit einer großen Zahl sehr ähnlicher Sequenzen vorhanden sind, von denen die zu detektierenden Sequenzen unterschieden werden sollen. DOLLAR A Erfindungsgemäß werden Oligomere aus "Locked Nucleic Acids" (LNA) oder gemischte Oligomere aus LNA und DNA oder RNA eingesetzt, die unter den gewählten Bedingungen auf den den Hintergrund bildenden Sequenzen hybridisieren, nicht aber auf den zu detektierenden. Die LNA-Oligomere können zur Erhöhung der Wirksamkeit mit Farbstoffen, insbesondere Methylenblau, kovalent verbunden sein. Die Detektion erfolgt vorzugsweise über fluoreszent markierte Sonden, insbesondere Sondenpaare mit Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer, wobei das erfindungsgemäße LNA-Oligomer im Bereich der Bindungsstellen der fluoreszent markierten Senden eine homologe Bindungsstelle hat. DOLLAR A Die Erfindung ist auf dem Gebiet der molekularen Diagnostik, insbesondere auf dem Gebiet der Onkologie, der pränatalen Diagnostik und der Mikrobiologie anwendbar.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der molekularen Diagnostik, im Speziellen Verfahren und Mittel zur Detektion bestimmter Nukleinsäuresequenzen, die in geringer Zahl in einer Probe zusammen mit einer großen Zahl sehr ähnlicher Sequenzen vorhanden sind, von denen die zu detektierenden Sequenzen unterschieden werden sollen.
Beschreibung

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erlaubt es, sehr geringe Mengen nahezu beliebiger Nukleinsäuresequenzen zu vervielfältigen und der Untersuchung zugänglich zu machen. Damit ist sie die Grundlage vieler Verfahren zur molekularen Diagnostik. Anwendungen umfassen forensische Fragestellungen (Gill, (2002) Biotechniques 32, 366-372), vererbbare Erkrankungen oder die Prädisposition dazu, Krebserkrankungen (Raj, (1998) Cancer 82, 1419-1442), mikrobiologische (Daxboeck (2003) Clinical Microbiology and Infection 9, 263-273) sowie Lebensmitteluntersuchungen (Malorne (2003) International Journal of Food Microbiology 83, 39-48).

Der Nachweis von Nukleinsäuren, die sich in nur einer oder sehr wenigen Basen voneinander unterscheiden, und die in einer Mischung vorliegen, bei der die gesuchte bzw. zu untersuchende Variante extrem unterrepräsentiert ist, kann sehr schwierig sein. Typische Fälle für diese Fragestellung sind die minimale Resterkrankung nach Therapie einer Leukämie, bei der die für die Krebserkrankung spezifische mutierte Nukleinsäuresequenz einiger weniger überlebender Zellen vor einem großen Hintergrund nativer „normaler" Zellen aufgespürt werden muss. Andere Fragestellungen umfassen den Nachweis von auf eine Erkrankung des Foetus hinweisenden Sequenzen aus wenigen foetalen Zellen im Blutkreislauf der Mutter, oder die Früherkennung von gegen Antibiotika resistenten mikrobiellen Erregern.

Typische Mengenverhältnisse, aus denen der Nachweis zu erbringen ist, liegen bei 1:100 bis 1:1.000.000.

Wenn ein Fragment aus einer Mischung ähnlicher Nukleinsäuresequenzen durch PCR vermehrt wird, entspricht das Mischungsverhältnis der Produkte dem in der Ausgangsmischung, sofern die vorliegende Variation keinen drastischen Einfluß auf die Vermehrungsreaktion hat. Für den Fall, dass die Variation Einfluss hat, sind Abweichungen bis zum Faktor zehn beschrieben worden. Der Nachweis einer unterrepräsentierten Variante ist daher nicht durch einfache Amplifikation des variierten Bereiches möglich.

Verfahren, die spezifische Primer verwenden, die genau der unterrepräsentierten Variante entsprechen, können diese Variante selektiv amplifizieren. Allerdings ist bekannt, dass auch Primeroligomere, die nur unvollkommen auf die Zielsequenz passen, mit einer viel kleineren, aber endlich großen Initiationsrate von der Polymerase verlängert werden. Die Produkte dieser ersten Runde von PCR, die am „falschen" Templat initiiert wurde, werden in allen weiteren Runden vermehrt, so dass Spezifität durch die Wahl der Primer allein kaum erreicht werden kann.

Aus dem Stand der Technik sind „Peptid-Nukleinsäuren" (Peptide Nucleic Acids, PNA), bekannt. PNA ist ein Polymer von über eine 2-Aminoethyl-Glycinbrücke verbundenen Purin- und Pyrimidinbasen und bindet mit hoher Affinität und sequenzspezifisch an DNA und RNA ( US 6,451,968 ). Eine bestimmte Basensequenz wird stärker von ihrem PNA-Komplement gebunden als von dem entsprechenden DNA- oder RNA-Komplement. PNA-Oligomere werden von Polymerasen nicht verlängert.

Orum et al. (1993, Nucleic Acids Research Vol. 21, 5332 – 5336) beschreiben eine Methode, bei der ein Oligomer aus PNA als spezifischer Inhibitor der Amplifizierung einer Sequenzvariante benutzt wird ( US 5,891,625 ). Diese Technik wird als „Clamp" bezeichnet. Es sind unterschiedliche Varianten der Clamp-Technik offenbart worden, die entweder eine PNA-Oligomersequenz, die der Sequenz des zu unterdrückenden Wildtyps genau komplementär ist, auf die Hybridisierungsstelle eines der DNA-Primer der PCR-Reaktion legen, um mit der Initiation der Polymerasereaktion zu kompetieren, oder mitten in die Sequenz.

Thiede et al. (1996, Nucleic Acids Research Vol. 24, 983-984) beschreiben die Anwendung von PNA-Clamps zur Detektion von verschiedenen Punktmutationen des Onkogens K-ras durch PCR. Ebenso wurde diese Technik in der Mikrobiologie angewandt (von Wintzingerode et al. (2000), Applied and Environmental Microbiology 66, 549-557).

Sotlar et al. (2003, American J. Pathology 162, 737-46) sowie Kreuzer et al. (2003, Ann. Hematol. 82, 284-289) beschreiben den Gebrauch von PNA-Clamps in Zusammenhang mit der Detektion von Amplifikaten mittels Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Sonden.

Die Methode, PCR-Amplifikate der den Hintergrund bildenden, nicht zu detektierenden Sequenzvariante mittels PNA-Clamp zu unterdrücken, ist erfolgreich, weist aber wesentliche Nachteile auf. Neben dem hohen Preis und der schwierigen chemischen Handhabbarkeit der PNA-Oligomere sowie der Tatsache, dass mit der derzeitigen Synthesechemie keine gemischten PNA-DNA-Oligomere zugänglich sind, ist dabei vor allem bedeutsam, dass die Verwendung von PNA-Clamps im Verlauf der PCR-Reaktion in jedem Zyklus eine Vorhybridisierungsstufe erforderlich macht, die für jeden Ansatz neu eingestellt werden muß, und außerdem die die PCR-Reaktion verlangsamt. Ursache dieses zusätzlichen Schrittes ist die gegenüber DNA und RNA andere Hybridisierungskinetik des PNA-Oligomers auf seiner Komplementärsequenz, welches sowohl eine langsamere Hybridisierung bei Abkühlung (on-rate) als auch ein langsameres Abschmelzen bei Temperaturerhöhung (off-rate) zeigt. Offenbar bewirkt die veränderte sterische Beweglichkeit des Peptidrückgrates diese Veränderung der Geschwindigkeiten.

Weiterhin ist PNA sensibel im Hinblick auf die Basenkomposition. Insbesondere purinreiche Sequenzen lassen sich nicht herstellen, d.h. dass nicht alle wünschenswerten Sequenzen auch tatsächlich darstellbar sind. Selbstähnliche PNA Oligomere können starke intramolekulare Strukturen ausbilden. In der Praxis funktionieren bei weitem nicht alle konzipierten PNA-Oligomere als brauchbare Kompetitoren.

Vor kurzem wurde ein weiteres Nukleinsäureanalogon offenbart, welches strukturell ein RNA-Polymer ist, bei dem die 2'Hydroxy-Sauerstoff der Ribose mit dem Kohlenstoffatom C4 der selben Riboseeinheit über eine Methylengruppe verbunden ist (Koshkin et al. (1998), J. Am. Chem. Soc. 120, 13252-13253; US 6,670,461 ). Diese Molekülform wird als „Locked Nucleic Acid" (LNA) bezeichnet. Es sind auch homologe LNA-Nukleoside mit anderen Verbrückungen beschrieben worden. Die durch die Verbrückung entstehende konformationelle Beschränkung schafft offenbar eine höhere Bindungsaffinität der LNA-Oligomere auf vollkommen passende Komplementärstränge aus DNA oder RNA. Gleichzeitig werden LNA-DNA-Duplexe durch nicht gepaarte Basen ungleich stärker destabilisiert als vergleichbare DNA-DNA oder DNA-RNA Duplexe. Oligomere aus DNA oder RNA und LNA mit einem 3'terminalen LNA-Baustein werden schlechter von Polymerasen verlängert.

Simeonov und Nikiforov (2002, Nucleic Acids Research 30, No. 17 e91) verwenden sehr kurze, fünf bis sechs Basen umfassende LNA-Oligomere, die mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt sind, als Bibliothek zur Genotypisierung von PCR- Fragmenten. Die Messmethode, mit der das Hybridisieren der Oligomere erfasst wurde, war Fluoreszenzpolarisation.

Weiterhin ist die Anwendung von LNA als „antisense"-Reagenz bekannt (Wahlestedt (2000), Proc. Nat. Acad. USA 97, 5633-5638; WO03085110).

Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, bessere Verfahren und Mittel zur Detektion und Unterscheidung von Nukleinsäuresequenzen zur Verfügung zu stellen, die vor einem Hintergrund einer großen Zahl sehr ähnlicher Sequenzen zu detektieren sind.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale der Ansprüche gelöst.

Kern der Erfindung ist die differentielle Unterdrückung der Nukleinsäureamplifkation einer Zielsequenz durch Verwendung eines komplementären Oligomers aus LNA oder aus einem gemischten Oligomer aus LNA und DNA- oder RNA-Monomeren, während die sequenzvariierte und typischerweise in geringerer Konzentration vorliegende Zielsequenz unter den gewählten Reaktionsbedingungen amplifiziert werden kann, vorzugsweise in Kombination mit einer fluoreszenzbasierten Detektionsmethode durch Verwendung einer markierten Oligonukleotidsonde, die die Stelle der Sequenzvariation überdeckt und die zur Detektion verwendet wird.

Die erfindungsgemäßen LNA-Oligomere sind nicht auf die kommerziell erhältlichen, mit einer zwischen O2 und C4 Methylen-verbrückten Ribose versehenen LNA-Oligomere beschränkt, sondern sollen auch bekannte Analoga mit gleichen oder im wesentlichen ähnlichen sterischen Eigenschaften umfassen, wie sie z.B. durch Verbrückung des O2 zum C4 der Ribose durch ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine sekundäre Aminfunktion bekannt sind (siehe dazu die LNA-Produktinformation der Firma Exiqon oder Sing, et al., (1998) J Org Chem. 63(18):6078-6079) Als Fluoreszenzdetektion können alle bekannten Verfahren und die dazu bekannten Mittel eingesetzt werden. Insbesondere sind dazu zu zählen:

– Induzierter Fluoreszenzenergietransfer (iFRET) (Howell et al. 2002, Genome Res. 12 (9): 1401-1407);
– DNA-Oligomere oder Nukleosidoligomeranaloga mit kovalent verbundenem Interkalationsfarbstoff („simpleProbe", Roche Produktinformation „Biochemica" 2, 2004; „light-up-probes"; Svanik et al. (2000), Analytical Biochemistry 281, 26-35);
– gepaarte Sonden, in denen eine „Anker"-Sonde mit dem einen und eine Probensonde mit dem anderen Partner eines Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Paares kovalent verbunden nebeneinander auf der zu detektierenden Sequenz hybridisieren und durch ihre räumliche Nähe den Energietransfer erlauben, der als Lichtemission detektiert wird („Light-Cycler", siehe als Beispiel Schröter et al. (2001), J. Clin. Microbiol. 39, 765-768);
– 5'-Nukleasesonden, die ein Fluoreszenz-Quencher-Paar in räumlicher Nähe auf der Oligomersonde tragen, und wobei deren räumliche Kopplung im Falle der Hybridisierung auf einem Templat durch die 5-Hydrolysefunktion der Polymerase zerstört wird, so dass mit wachsender Anzahl Templatmoleküle auch die Fluoreszenzintensität der Probe zunimmt („TagMan" ( US 6,214,979 ));
– Molecular beacons (Tyagi und Kramer (1996), Nat Biotechnol 14, 303-308; US 5,118,801 )

Alle diese Prinzipien sind mit der vorliegenden Erfindung kompatibel. Im Folgenden werden die Details der Erfindung an der Methode der gepaarten FRET-Sonden (Fluoreszenzresonanzenergietransfer-„Hybridisierungssonden für den LightCycler") näher erläutert, sie sind jedoch äquivalent auf alle anderen Prinzipien anwendbar.

Erfindungsgemäß wird mit einer Mischung von DNA-Sequenzen, die sich einander sehr ähnlich sind, typischerweise sich in einer zu diskriminierenden Region nur durch eine oder sehr wenige Basenpaare unterscheiden, und von denen eine Sequenz in einem großen Überschuß, typischerweise einem hundert- bis millionenfachen Überschuß vorliegt, und die andere die gesuchte Sequenz darstellt, eine PCR-Reaktion mit Primern durchgeführt, die sowohl auf der gesuchten als auch auf der im Überschuß vorhandenen Sequenz hybridisieren können.

Die Amplifikation der gesuchten, im Unterschuss vorhandenen Sequenz kann durch Hybridisierung zweier Oligonukleotidsequenzen oder Sonden, einer „Anker-Sonde" und einer Sensor-Sonde nachgewiesen werden. Anker und Sensor haben direkt nebeneinander liegende Hybridisierungsstellen auf der gesuchten Sequenz und tragen Farbstoffmoleküle, die kovalent an die Oligomere gekoppelt sind. Bei benachbarter Hybridisierung findet bei Anregung des Fluoreszenzdonors ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) zum Akzeptor statt, und Photonen längerer Wellenlänge werden emittiert. Typischerweise ist die Ankersonde länger, jedenfalls bindet sie stärker und hat eine höhere Schmelztemperatur als die Sensorsonde. Typischerweise liegt in der der Sensorsonde komplementären Sequenz die zu unterscheidende Basensequenz, in der die nachzuweisende und die im Überschuss vorhandene Sequenz sich unterscheiden.

Erfindungsgemäß wird der Reaktion eine Menge eines LNA-Oligonukleotides hinzugefügt, welches mit der im Überschuss vorhandenen Sequenz, die der vom Sensor erkannten Sequenz der zu detektierenden Sequenz homolog ist, perfekt hybridisiert. Die Sequenz des LNA-Oligomers (im Folgenden LNA-Clamp) wird dabei so gewählt, dass es unter den während der PCR-Reaktion gewählten Hybridisierungsbedingungen an seine häufig vorhandene Zielsequenz bindet, nicht jedoch an die zu detektierende Sequenz, von deren Komplementärsequenz sich das Oligomer in mindestens einer Basenpaarung unterscheidet.

Überraschend wurde gefunden, dass bei der erfindungsgemäßen Durchführung der PCR-Reaktion nicht nur der Vorhybridisierungsschritt weglassen lässt, sondern auch im Vergleich zum PNA-Clamp die Detektion eines noch geringeren Anteils der Zielsequenz vor einem größeren Hintergrund möglich ist (siehe Beispiel 4).

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen LNA-Oligornere mit einem Molekül verbunden, welches nicht aus der Gruppe der Nukleoside oder Nukleosidanaloga stammt, vorzugsweise positiv geladen ist und mit Nukleinsäuren interagiert. Als Beispiel wurde hier die Verbindung von Methylenblau mit LNA gewählt.

Die Kopplung von Methylenblau mit DNA-Oligomeren ist bekannt ( DE 4403779 und DE 4403780 ). Der Mechanismus der Wechselwirkung des Farbstoffes mit DNA ist aus diesen Offenbarungen oder den Veröffentlichungen (Möller et al. (1995), Bioconjugate Biochemistry 6, 174- 178; Schubert et al. (1995), Nucleosides & Nucleotides 14, 1437-1443) nicht bekannt. Die Autoren der genannten Publikationen benutzen die Kopplung zur Sequenz-ortsspezifischen Generation von aktivierten Sauerstoffmolekülen.

Überraschend wurde nun gefunden, dass die Verbindung von Methylenblau mit LNA-Clamps deren Effektivität weiter erhöht, d.h. die notwendige Menge des eingesetzten Clamps zur Unterdrückung der im Übergewicht vorhandenen Sequenz um die Hälfte erniedrigt (siehe Tabelle in Beispiel 4). Alternativ kann die Verbesserung auch dahingehend interpretiert und benutzt werden, dass bei besserer Bindung des substituierten LNA-Oligomers kürzere Sequenzen verwendet werden können, was einerseits eine noch höhere Selektivität in Bezug auf die zu diskriminierende Sequenz erlaubt und andererseits den Herstellungsaufwand der Sonde erniedrigt.

Das erfindungsgemäß mit dem LNA-Oligomer gekoppelte Molekül, welches nicht aus der Gruppe der Nukleoside oder Nukleosidanaloga stammt und mit DNA interagiert, ist nicht auf Methylenblau beschränkt. In Beispiel 4 wird deutlich, dass bereits die Einfügung einer alkylischen Aminofunktion über ein Brückenmolekül die Wirkung der LNA-Oligomere signifikant erhöht. Es ist zu erwarten, dass viele unspezifisch (nicht auf Basenpaarung beruhende) Bindungspartner für DNA-Einzelstränge oder Doppelstränge oder DNA-LNA-Hybride die erfindungsgemäße Wirkung der LNA-Oligomere verstärken. Somit soll dieser Aspekt der Erfindung nicht auf die Kopplung von Methylenblau beschränkt sein, sondern alle genannten Bindungspartner umfassen.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen LNA-Oligomere können in allen auf der selektiven Vermehrung von Nukleinsäuren beruhenden Nachweisverfahren angewendet werden; insbesondere gilt dies für die Verwendung in PCR-Verfahren zum Nachweis von Tumor-assoziierten Sequenzen (c-kit, K-ras). Andere beispielhafte Anwendungsgebiete innerhalb der Humanmedizin sind der Nachweis von foetalen Sequenzen, die spezifisch für mitochondriale Mutationen (MELAS Syndrom) oder andere Krankheits-assoziierte Genotypen sind (HPA-1).

Mikrobiologisch von Interesse ist der Nachweis von Resistenzgenen in mikrobiellen Erregern oder bei persistierenden viralen Infektionen (HIV).

Vorzugsweise wird eine erfindungsgemäße LNA-Oligomersequenz bereits in einem für eine entsprechende Anwendung konzipierten Kit, also einer Zusammenstellung der benötigten Reagenzien und Enzyme sowie Gerätschaften, bereitgestellt.

Die Erfindung ist nicht auf den Einsatz in der „klassischen" PCR oder deren Adaptionen zum Nachweis von PCR-Produkten mit Fluoreszenzdetektion beschränkt. Andere Amplifikations- und Nachweismechanismen sind bekannt, auf welche die Erfindung vorteilhaft angewendet werden kann (siehe z.B. Schweitzer und Kingsmore, Current Opinions Biotechnology (2001) 12, 21-27). Strand displacement amplification (SDA; Little et al., Clin. Chem. (1999), 45:777-784) ist eine solche Methode. Ebenfalls ist die Anwendung des Prinzips der vorliegenden Erfindung auf die Ligase-Kettenreaktion (Barany (1991), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88, 189-193) möglich.

Die in den Beispielen gezeigte Wirkung der erfindungsgemäßen LNA-Oligomere kann in zwei Schritte gegliedert werden, die im Falle der Detektion durch Fluoreszenzsonden beide zu der observierten Diskriminierung zwischen einer in großer Menge vorhandenen, zu reprimierenden und nicht zu detektierenden und einer in geringerer Menge vorhandenen, zu amplifizierenden und zu detektierenden Sequenz beitragen. Dies ist zum einen die Unterdrückung der Amplifikation der zu reprimierenden Sequenz, vermutlich durch Blockade der DNA-Polymerase, sowie zum anderen die Konkurrenz um den Gegenstrang der Sensorsonde. Im Falle der gepaarten Sonden oder Light-Cycler-Technologie kann vermutet werden, dass diese Komponenten in der Folge dieser Aufzählung wirken; im Falle der 5-Nuklease-(TagMan) Technologie wäre zu vermuten, dass beide Wirkungskomponenten in umgekehrter Reihenfolge zur gleichen Wirkung führen.

Die nachfolgenden Beispiele und Abbildungen illustrieren die Erfindung weiter. Im Einzelnen zeigt
1 die Wirkung verschiedener LNA-Oligomere auf die Amplifikation der K-ras Wildtypsequenz. Auf der Abszisse sind die Zyklen bzw. der Reaktionsfortschritt, auf der Ordinate die Fluoreszenzintensität durch entstehendes Produkt aufgetragen. Reaktionsbedingungen siehe Beispiel 4.

Im Einzelnen ist die Kurvenzuordnung:

Lang unterbrochen, (untere Linie rechts)	0.05 μM 5-MB-LNA
Durchgezogene Linie mit gefüllten Punkten	0.04 μM 5-MB-LNA
Durchgezogen Linie mit leeren Quadraten	0.03 μM 5-MB-LNA
Gestrichelte Line	0.05 μM 5-NH-LNA
Strich-Punkt-Linie (oberste Linie rechts)	0.04 μM 5-NH-LNA

2 die Wirkung verschiedener LNA-Oligomere auf die Amplifikation der K-ras Wildtyps.
Auf der Abszisse ist die Temperatur (T), auf der Ordinate die Fluoreszenzänderung pro Temperatur dF/dT d.h. (1. Ableitung der Schmelzkurve) aufgetragen. Der Hauptpeak entspricht Schmelzkurve des aus der Wildtypsequenz entstandenen PCR-Produkts, der „Kamelhöcker" rechts daneben dem Schmelzverhalten des zu diskriminierenden Produktes der mutierten, zu detektierenden Sequenz.

Im Einzelnen ist die Kurvenzuordnung:

Lang unterbrochen, (untere Linie rechts)	0.05 μM 5-MB-LNA
Durchgezogene Linie mit gefüllten Punkten	0.04 μM 5-MB-LNA
Durchgezogen Linie mit leeren Quadraten	0.03 μM 5-MB-LNA
Gestrichelte Line	0.05 μM 5-NH-LNA
Strich-Punkt-Linie (oberste Linie im Peak)	0.04 μM 5-NH-LNA

3 die Wirkung verschiedener LNA-Oligomere auf die Amplifikation der K-ras Wildtyps.
Die Achsenbezeichnungen sind wie bei 2.

Im Einzelnen ist die Kurvenzuordnung:

Durchgezogene Linie mit leeren Quadraten	0.2 μM 5-MB-LNA
Durchgezogene Linie mit gefüllten Punkten	0.05 μM 5-MB-LNA
Gestrichelte Line	1.0 μM 5-NH-LNA
Strich-Punkt-Linie	0.2 μM 5-NH-LNA
Durchgezogene Linie (oberste Linie im Peak)	0.01 μM 5-NH-LNA

Beispiel 1: Synthese des LNA-Clamps für K-ras
Die Synthese des 17mer LNA Oligomers K-ras-Wildtyp mit der Nukleotidsequenz 5'-CCTACGCCAC CAGCTCC-p-3' (SEQ ID NO 1) erfolgte unter Verwendung der LNA Phosphoramidite von Exiqon A/S (DK-2950 Vedbaek, Dänemark) und Standard RNA Synthesezyklen auf einem Expedite 8900 Nukleinsäure Syntheseautomaten und einem Phosphat-CPG in der Startsäule (Produkt 20-2900, Glen Research, Sterling, VA 20164, USA). Die Entschützung erfolgte für 16 Std. bei 55°C in 32% Ammoniak. Das Rohprodukt wurde über eine Sephadex Säule (NAP-10, Amersham, SE-751 84 Uppsala, Schweden) isoliert, per Säulenchromatographie mit einer MonoQ 16/10 Säule (Amersham) in einem Natriumchloridgradienten in 10 mM Natronlauge und eine anschließende Gelfiltration (NAP-10) isoliert.
Beispiel 2: Synthese des 5' Methylenblau-gekoppelten LNA-Clamps für K-ras
Die Synthese des 5'-aminoalklyierten 17mer LNA Oligomers K-ras-Wildtyp mit der Nukleotidsequenz 5'-NH2-CCTACGCCAC CAGCTCC-p-3' (SEQ ID NO 2) erfolgte wie zuvor beschrieben. Im letzten Schritt wurde ein Monomethoxytrityl (MMT)-geschützter C6 Aminolinker gekoppelt (Glen 10-1906). Nach der Entschützung (wie vorstehend) wurde das Rohprodukt auf eine Oligo R3 Säule (Perspetive) geladen. Die MMT Tritylgruppe wurde durch Spülen mit 3% Trifluoressigsäure abgespalten, das Produkt wurde mit 10% Acetonitrol eluiert und mittels einer Gelfiltration (NAP-10) isoliert.
Die Synthese des 5'-Methylenblau (MB) markierten 17mer LNA Oligomers K-ras-Wildtyp mit der Nukleotidsequenz 5'-MB-CCTACGCCAC CAGCTCC-p-3' (SEQ ID NO 3) erfolgte durch 10 stündige Reaktion des 5'-aminoalklyierten Produktes mit 3-[N-Methyl-N-(4-succinimidoxy-carbonylbutyl)amino]-7-dimethylaminophenaza thionium Chlorid (MB Succinimidester, EMP) in 10 mM Natriumcarbonatlösung, pH 9,1 bei 22°C, fortwährender Mischung und unter Lichtabschluß. Nicht reagiertes Methylenblau wurde über eine Gelfiltration (NAP-10) abgetrennt. Markierte und nicht markierte Produkte wurden über eine Säulenchromatographie über eine Oligo R3 Säule (Perspetive) im Laufmittel 10 mM TEAA Puffer, pH 7.0 und einem Acetonitrilgradienten voneinander getrennt. Die Produkte wurden abschließend einer weiteren Gelfiltration unterzogen.
Beispiel 3: Synthese des 3' Methylenblau-gekoppelten LNA-Clamps für K-ras
Alternativ erfolgte die Synthese des 17mer LNA Oligomers K-ras-Wildtyp mit der Nukleotidsequenz 5'-CCTACGCCAC CAGCTCC-NH-3' (SEQ ID NO 4) wie zuvor beschrieben, aber mit einem Amino-CPG mit C7 Linker als Startsäule (Glen 20-2957). Die Entschützung und Reinigung erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben. Das Oligomer wurde mit dem MB Succinimidester wie in Beispiel 2 beschrieben umgesetzt und gereinigt.
Beispiel 4: Nachweis von Mutationen im Kodon 12 des humanen K-ras Gen (OMIM*190070) zum Nachweis minimaler Mengen mutierter Zellen aus genomischen DNA Extrakten
Als Templat wurde genomische DNA von der Zell-Linie SW480 (Mutation 12 Valin, zu detektierende DNA) verdünnt in Placenta DNA (Sigma, Wildtpy 12 Glycin, zu unterdrückende DNA) verwendet. Das Verhältnis betrug 1:10 (Val:GIy). Die Gesamtkonzentration betrug 1 μg genomische DNA in 20 μl Reaktionsvolumen. In der PCR-Amplifikation des Exons 1 des humanen K-ras Gens wurden jeweils 0,5 μM Primer F 5'-AAggCCTgCT gAAAATgACT (SEQ ID NO 5) und R 5'-AGAATGGTCC TGCACCAGTAA (SEQ ID NO 6) und 0,3 μM Hybridisierungssonden Sensor 12Cys 5'-LC-TTGCCTACGC CACAAGCTCCAA-p (SEQ ID NO 7; LC bezeichnet hier und in den folgenden Hybridisierungssonden den Farbstoff LightCycler-Red 640) und 5'-CGTCCACAAA ATGATTCTGA ATTAGCTGTA TCGTCAAGGC ACT-Fluorescein (SEQ ID NO 8) als Anker sowie 0,05 bis 0,2 μM LNA Oligomer (SEQ ID NO 1), amino-alkylierte (SEQ ID NO 2) und MB-markierte (SEQ ID NO 3) Varianten verwendet. Das Reaktionsvolumen war 20 μl. Es wurde das FastStart Hybridization Probes Master Reagenz von Roche Diagnostics mit 3 mM Mg²⁺ verwendet. Im LightCycler 1.0 (Roche) waren die Laufkonditionen 40 Zyklen je 10 sec. Denaturierung bei 95°C, 5 sec. Bindung bei 58°C und 10 sec. Polymerase Reaktion bei 72°C.
Die Schmelzanalyse wurde durch gleichmäßiges Heizen von 45°C bis 90°C mit 0,2°C/sec. und permanenter Messung der Fluoreszenzänderung durchgeführt.
Beispielhaft ist die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung von mit DNA interagierenden Liganden, hier Methylenblau, an LNA-Clamps in den Figuren gezeigt. 1 zeigt die Fluoreszenzerhöhung als Funktion des Reaktionsfortschritts (Zyklen bzw. Zeit) für mehrere Reaktionen (siehe Beispiel 4). Mutanten-spezifischer Sensor und LNA-Clamp unterscheiden sich im homologen Bereich nur in einer Base (Position 11 ist C im LNA Clamp, die entsprechende Base ist A im Sensor). Man erkennt in 1, dass 0,05 μM des MB-gekoppelten LNA-Clamps die als Fluoreszenzerhöhung detektierte Produktbildung vollkommen unterdrückt, während bei einer gleichen Menge nicht mit Methylenblau gekoppeltem Clamp bereits deutlich Produktbildung zu erkennen ist.
In gleicher Weise wurden verschiedene, jeweils gleich lange Modifikationen der Clamp-Sequenz in ihrer Wirkung verglichen. In der mittleren Spalte der folgenden Tabelle ist angegeben, bei welcher Konzentration der Clamp-Sequenz, bei ansonsten gleichbleibenden Reaktionsbedingungen wie oben angegeben, die Bildung des Wildtyp-Produkts unterdrückt wurde. In der zweiten Spalte wurde für zwei Konzentrationen beispielhaft ermittelt, bei welcher Konzentration auch die Bildung des zu unterscheidenden mutierten Produktes unterdrückt wurde. Für die gewählte Sequenzvariante bezeichnet somit der Konzentrationsunterschied zwischen erster und zweiter Spalte die in vorteilhafter Weise diskriminierend wirkende Clamp-Sequenzkonzentration, bei welcher eine Unterdrückung der Wildtyp-Sequenz gegenüber der zu detektierenden Mutantensequenz optimal erfolgt.
Überraschenderweise zeigt sich bei der Untersuchung der als Kontrolle eingefügten LNA-Clampvariante mit Aminomodifikation, das heißt ohne daran gekoppeltes Methylenblau, dass bereits lediglich die Funktionalisierung mit einer alkylischen Aminogruppe die Wirkung des LNA-Clamps erheblich verstärkt (Nr. 4 gegenüber Nr. 3 in der Tabelle). Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen könnte sein, dass die nicht-sequenzspezifische ionische Wechselwirkung der teilweise protonierten Aminogruppen mit den negativ geladenen Phosphatresten der DNA eine Änderung der on/off-Reaktionsraten der Hybridisierung bewirkt, mit der Folge, dass die Bindung stärker wird.
Die Angaben in Nr. 1 sind den Publikationen von *Thiede et al. (Nucleic Acids Res. (1996) 24, 983-984) und ^§Behn et al. (J Pathol. 2000 Jan;190(1):69-75) entnommen.
LNA wirkt bei einer 10-fach geringeren Konzentration als ein PNA Oligomer der selben Sequenz. Eine terminale Aminogruppe erniedrigt die effektiv benötigte Wirkkonzentration um bis zur Hälfte, eine terminale Methylenblaugruppe senkt die effektive Wirkkonzentration zur Unterdrückung der PCR-Amplifikation der komplementärem Sequenz auf die Hälfte bis zu einem Fünftel der entsprechenden Konzentration für die unmodifizierte LNA, oder ein Fünfzigstel der notwendigen PNA-Konzentration. Die Wirkkonzentration zur Unterdrückung der Amplifikation einer komplementären Sequenz mit einer Fehlbase wird gegenüber einer Aminogruppenmodifizierten Sequenz durch die terminate Methylenblaugruppe ebenfalls auf die Hälfte reduziert, und der Unterschied der Wirkkonzentration gegenüber der identischen und der variierten Sequenz steigt durch die Methylenblau Modifikation von 1:4 auf 1:5, das heißt die differenzielle Bindung der komplementären Sequenz wird noch verbessert.
Eine weitere vorteilhafte Wirkung der erfindungsgemäßen LNA-Clamps ist in 2 und 3 dargestellt. In den 2 und 3 ist die erste Ableitung der Fluoreszenz über die Temperatur aufgetragen. Während der Schmelzanalyse des PCR-Produktes konkurrieren LNA Oligomer und die Fluoreszenzsonde um die Zielsequenz, so daß die Detektion der LNA komplentären Wildtyp-Sequenz ebenfalls unterdrückt wird.
Beispiel 5: Nachweis einer A/T Mutation im Exon 17 des humanen c-kit Genes (OMIM*164920) zum Nachweis minimaler Mengen mutierter Zellen aus genomischen DNA Extrakten.
Als Templat wurde genomische DNA einer die entsprechende Mutation tragenden Zell-Linie (zu detektierende DNA), verdünnt in Placenta DNA (Sigma, zu unterdrückende DNA) verwendet. Das Verhältnis betrug 1:10. Die Gesamtkonzentration betrug 1 μg in 20 μl PCR Mix. Die Durchführung der Analyse erfolgte analog der Publikation von Sotlar et al. (Am. J. Pathology (2003) 162(3):737-46) mit 0,5 μM Primern F 5'-CAgCCAgAAA TATCCTCCTT ACT (SEQ ID NO 9) und R 5'-TTgCAggACT gTCAAgCAgAg, (SEQ ID NO 10) je 0,15 μM der Detektionssonde 5'-TTgCAggACT gTCAAgCAgA g-Fluorescein (SEQ ID NO 11) und der Ankersonde LC-ATgTggTTAA AggAAACgT gAgTACCCA-p (SEQ ID NO 12) und 0,75 μM des LNA Oligomer 5'-gCCAgAgACA TCAAgAATg-p (SEQ ID NO 13).
Beispiel 6: Nachweis einer fötalen T/C Mutation (dbSNP:5918) im humanen GPIIIa (HPA-1) Gen (OMIM*192974) aus DNA Extrakten gewonnen aus dem Serum der Mutter.
Als Templat wurde genomische DNA einer die entsprechende Mutation tragenden Zell-Linie (zu detektierende DNA), verdünnt in humaner Placenta DNA (Sigma, zu unterdrückende DNA) oder Extrakte aus maternalem Serum verwendet. Das Verhältnis der gemischten Proben betrug 1:100. Die Gesamtkonzentration betrug 1 μg in 20 μl PCR Mix. Die Mutation C12548T verursacht eine Aminosäure-Substitution Leu33Pro. Die Durchführung erfolgte mit 0,5 μM Primern F 5'-TgCTCCAATg TACggggTAAAC (SEQ ID NO 14) und R 5'-CgATggATTC TggggCACAg TTA (SEQ ID NO 15), je 0,23 μM der Detektionssonde 5'-gTgAgCCCAg AggCAgg-Fluorescein (SEQ ID NO 16) und der Ankersonde 5'-LC-CCTgTAAgAC AggAgCCCAA AgAgAAgTC-p, (SEQ ID NO 17) sowie 0,05 μM LNA der Sequenz 5'-gTgAgCCCgg AggCAg-p (SEQ ID NO 18). Das Reaktionsvolumen war 20 μl. Es wurde das FastStart Hybridization Probes Master Reagenz von Roche Diagnostics mit 3 mM Mg²⁺ verwendet. Im LightCycler 1.0 (Roche) waren die Laufkonditionen 60 Zyklen je 5 sec. Die Denaturierung erfolgte bei 95°C, 8 sec; Bindung bei 58°C und 8 sec und die Polymerase-Reaktion bei 72°C. Die Schmelzanalyse wurde durch gleichmäßiges Heizen von 40°C bis 85°C mit 0,2°C/sec. und permanenter Messung der Fluoreszenzänderung durchgeführt.
Das Produkt für das Allel 1b wird unterdrückt.

Claims

Verfahren zur Amplifikation von zu detektierenden Nukleinsäuresequenzen in einer Probe, die neben anderen, zu unterdrückenden Nukleinsäuresequenzen in der Probe vorhanden sind, wobei die zu detektierenden Nukleinsäuresequenzen und die zu unterdrückenden Nukleinsäuresequenzen sich in mindestens einer Base unterscheiden, aber in einer Vielzahl von Basen übereinstimmen, wobei ein diskriminierendes Oligomer aus Monomeren, die durch ihre chemische Beschaffenheit und die Sequenz des diskriminierenden Oligomers eine Basenpaarung zu den Basenbausteinen der zu unterdrückenden Nukleinsäuresequenzen eingehen können, und welches bei einer geeignet zu wählenden Reaktionstemperatur der Amplifikationsreaktion an die zu unterdrückenden, nicht aber an die zu detektierenden Nukleinsäuresequenzen bindet, ausgewählt und in einer geeigneten Konzentration zu der Amplifikationsreaktion zugegeben wird, so dass bei dieser geeignet zu wählenden Konzentration das zugegebene Oligomer an die zu unterdrückenden, nicht aber an die zu detektierenden Nukleinsäuresequenzen bindet, eine Amplifikationsreaktion enzymatisch oder chemisch mit Hilfe der dafür notwendigen Reagenzien und Enzyme durchgeführt wird und die Anwesenheit von Amplifikationsprodukten der zu detektierenden Sequenz bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet dass das diskriminierende Oligomer teilweise oder vollständig aus Ribonukleosidresten besteht, bei welchen das Sauerstoffatom am Kohlenstoffatom C2 der Ribose mit dem Kohlenstoffatom C4 der Ribose über eine Methylengruppe, ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder eine sekundäre Aminfunktion kovalent verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zusätzlich ein Molekülrest, welcher auf Grund seiner chemischen Beschaffenheit über ionische oder nicht-ionische Wechselwirkungen, die nicht der Basenpaarung der natürlichen RNA oder DNA entsprechen, mit den zu unterdrückenden Nukleinsäuresequenzen wechselwirkt, mit dem diskriminierenden Oligomer kovalent verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das diskriminierende Oligomer zusätzlich mit mindestens einem Molekülrest Methylenblau kovalent verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die Amplifikationsreaktion eine Polymerase-Kettenreaktion ist und die Detektion des Amplifikationsproduktes durch Änderung der Fluoreszenzintensität von in der der Amplifikationsreaktion enthaltenen, Fluoreszenz emittierenden Farbstoffmolekülen erfolgt.
Verfahren zur Detektion von zu detektierenden Nukleinsäuresequenzen in einer Probe, die neben anderen, zu unterdrückenden Nukleinsäuresequenzen in der Probe vorhanden sind, wobei die zu detektierenden Nukleinsäuresequenzen und die zu unterdrückenden Nukleinsäuresequenzen sich in mindestens einer Base unterscheiden, aber in einer Vielzahl von Basen übereinstimmen, wobei ein diskriminierendes Oligomer aus Monomeren, die durch ihre chemische Beschaffenheit und die Sequenz des diskriminierenden Oligomers eine Basenpaarung zu den Basenbausteinen der zu unterdrückenden Nukleinsäuresequenzen eingehen können, und welches bei einer geeignet zu wählenden Detektionstemperatur an die zu unterdrückenden, nicht aber an die zu detektierenden Nukleinsäuresequenzen bindet, ausgewählt und in einer geeigneten Konzentration zu der dem Gemisch an Nukleinsäuren der Probe zugegeben wird, so dass bei dieser geeignet zu wählenden Konzentration das zugegebene Oligomer an die zu unterdrückenden, nicht aber an die zu detektierenden Nukleinsäuresequenzen bindet, und die Detektion der zu detektierenden Nukleinsäuren dadurch erfolgt, dass mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Nukleinsäurebaustein-Oligomere an die zu detektierende Sequenz gebunden werden und durch die Bindung oder eine durch die Bindung ausgelöste oder ermöglichte Reaktion eine Änderung der Fluoreszenzintensität der Probe bewirkt wird, dadurch gekennzeichnet dass das diskriminierende Oligomer teilweise oder vollständig aus Ribonukleosidresten besteht, bei welchen das Sauerstoffatom am Kohlenstoffatom C2 der Ribose mit dem Kohlenstoffatom C4 der Ribose über eine Methylengruppe, ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder eine sekundäre Aminfunktion kovalent verbunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei wobei das diskriminierende Oligomer zusätzlich mit mindestens einem Molekülrest Methylenblau kovalent verbunden ist.
Oligomer aus Monomeren, welche alle oder teilweise Ribonukleosidreste sind, bei denen das Sauerstoffatom am Kohlenstoffatom C2 der Ribose mit dem Kohlenstoffatom C4 der Ribose über eine Methylengruppe kovalent verbunden ist, dadurch gekennzeichnet dass das Oligomer zusätzlich mit einem Molekülrest, welcher auf Grund seiner chemischen Beschaffenheit über ionische oder nicht-ionische Wechselwirkungen, die nicht der Basenpaarung der natürlichen RNA oder DNA entsprechen, mit DNA oder RNA oder Doppelstranghybriden aus DNA und RNA wechselwirkt, kovalent verbunden ist.
Oligomer gemäß Anspruch 7, wobei das Oligomer mit einem Molekülrest Methylenblau kovalent verbunden ist.
Kit, enthaltend Komponenten zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion zur Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen, dadurch gekennzeichnet dass das Kit ein Oligomer aus Monomeren, welche alle oder teilweise Ribonukleosidreste sind, bei denen das Sauerstoffatom am Kohlenstoffatom C2 der Ribose mit dem Kohlenstoffatom C4 der Ribose über eine Methylengruppe kovalent verbunden ist, enthält.
Kit gemäß Anspruch 9, wobei das Oligomer zusätzlich mit einem Molekülrest, welcher auf Grund seiner chemischen Beschaffenheit über ionische oder nichtionische Wechselwirkungen, die nicht der Basenpaarung der natürlichen RNA oder DNA entsprechen, mit DNA oder RNA oder Doppelstranghybriden aus DNA und RNA wechselwirkt, kovalent verbunden ist.
Kit gemäß Anspruch 9, wobei das Oligomer mit einem Molekülrest Methylenblau kovalent verbunden ist.