DE60108897T2 - Methoden für externe kontrollen zur nukleinsäure amplifizierung - Google Patents

Methoden für externe kontrollen zur nukleinsäure amplifizierung Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Description

  • I. GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Nukleinsäureamplifikation, einschließlich Verfahren von externen Kontrollen, die das Fehlen oder das Vorhandensein von spezifischen Zielsequenzen während der Polymerase-Kettenreaktion durch Nachweis von Ampliconen verifizieren.
  • II. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Nukleinsäureamplifikation und insbesondere Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein wichtiges Forschungswerkzeug mit Anwendungen beim Klonieren, bei der Analyse von genetischer Expression, beim DNA-Sequenzieren, genetischem Kartieren, beim Auffinden von Arzneimitteln und dergleichen (Gilliland et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2725-2729, Bevan et al., (1992) PCR Methods and Applications, 1:222-228, Green et al., (1991) PCR Methods and Applications, 1:77-90). Beschreibungen von und ein Leitfaden zum Durchführen von PCR werden in umfangreicher Literatur bereitgestellt (Innis et al., (1989) in PCR Protocols, Academic Press, NY, McPherson et al., (1991) in PCR: A Practical Approach, Band 1, Oxford University Press, Oxford, Seiten 46, 199, McPherson et al., (1995) in PCR 2: A Practical Approach Oxford University Press, Oxford; Seiten 7, 19).
  • PCR-Tests, die Allele unterscheiden und identifizieren, sind wichtig zum Genotypisieren von DNA-Proben hinsichtlich spezifischer Mutationen (Livak (1999) Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, 14:143-49, Mein et al. (2000) Genome Research, 10:330-43). PCR-Tests stellen auch eine relative Quantifizierung einer Genexpression bereit (Gibson et al. (1996) Genome Research, 6:995-1001, Heid et al. (1996) Genome Research, 6:986-94, Yang et al. (1993) Anal. Biochem. 208:110-16, Germer et al. (1999) Genome Research, 9:72-78).
  • Auf Fluoreszenz basierende Ansätze, Endpunkts- oder Echtzeitmessungen von PCR-Amplifikationsprodukten (Amplicons) bereitzustellen (Holland et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., 88:7276-80), verwendeten entweder interkalierende Farbstoffe, z. B. Ethidiumbromid, um die Menge an vorhandener doppelsträngiger DNA anzuzeigen (Gelfand et al., US-PS 5,210,015), oder Sonden mit Reporter-Löscher-Paaren („TagMan®"-5'-Nukleasetest), die während einer Amplifikation gespalten werden, um ein Fluoreszenzsignal proportional zu der Menge an vorhandener doppelsträngiger DNA freizusetzen (Livak et al., US-PS 5,538,848, Gelfand et al., US-PS 5,804,375).
  • Parallele Kontrolltests, die Bedingungen für eine Amplifikation des Ziels bestätigen, sind erwünscht. Eine PCR wird oft durch falsch Positive aufgrund einer Matrizenkontamination aus benachbarten Wells, Pipettierfehlern oder einer Aerosolübertragung, insbesondere in Formaten mit hoher Dichte oder hohem Durchsatz wie Mikrotiterplatten mit 96, 384 Wells oder höherer Dichte oder anderen Anordnungskonfigurationen, gestört. Zusätzlich leidet eine PCR unter falsch negativen Ergebnissen, wenn Enzyminhibitoren in den Zielproben vorhanden sind oder wenn Reagenzien fehlen oder abgebaut werden. Kontrollamplifikationsreaktionen sind erwünscht (i) für eine Normalisierung von Quantifizierungsergebnissen, (ii) für einen Nachweis von Amplifikationsinhibitoren in dem Ziel oder anderen Reagenzien und (iii) zum Etablieren von Hintergrundssignalniveaus. Positive Amplifikationskontrolltests für eine PCR ergeben ein nachweisbares Amplicon, das von einer Kontrollmatrize abstammt, die von dem Ziel getrennt und verschieden ist. Ein Nachweis des positiven Kontrollamplicons zeigt an, dass eine Amplifikation innerhalb der Reaktionskammer realisierbar und funktionsfähig ist. Positive Amplifikationskontrolltests, die kein nachweisbares Produkt aus den Kontrollkomponenten ergeben, zeigen Bedingungen innerhalb der Reaktionskammer an, die keine Amplifikation erlauben, wie Kontaminierungen, die eine PCR hemmen.
  • Eine PCR mit interner Kontrolle erfolgt in dem gleichen Gefäß gleichzeitig mit einer PCR des Zielprobenpolynukleotids (Coen, D. „Quantification of DNAs by the Polymerase Chain Reaction Using an Internal Control" in The Polymerase Chain Reaction (1994) Mullis et al., Hrsg., Birkhauser, Boston, MA, Seiten 89–96, Coen, D. „Quantitation of rare DNAs by polymerase chain reaction" in Current Protocols in Molecular Biology (1990), Ausubel et al., Hrsg. Greene Publ. Assoc. and Wiley-Interscience, und US-PS 5,952,202). Eine Amplifikation eines internen Kontrollpolynukleotids (ICP) mit Primern, die dem Zielpolynukleotid und dem internen Kontroll polynukleotid gemeinsam sind, ergibt eine Verifikation von tatsächlich oder falsch Negativen, d.h. falls ein Ziel nicht nachgewiesen wird (Gibson et al. (1996) Genome Research 6:995-1001). Ein ICP ist oft ein endogener Bereich der Zielpolynukleotidprobe, d.h. von der gleichen Quelle, dem gleichen Genom, Chromosom, Gen, Plasmid oder Fragment wie das Ziel, was folglich eine Änderung hinsichtlich der Menge an Zielpolynukleotid normalisiert. Ein ICP kann eine endogene RNA- oder DNA-Sequenz sein, die in jeder experimenteller Probe, wie isoliert, vorhanden ist. Ein ICP kann eine exogene oder Fremdsequenz von RNA oder DNA sein, die in die Zielprobe bei einer bekannten Konzentration gegeben wird. Das exogene ICP kann ein in vitro-Konstrukt sein, das dazu verwendet wird, echte Zielnegative von einer PCR-Hemmung zu unterscheiden und Unterschiede hinsichtlich der Wirksamkeit einer Probenextraktions-cDNA-Synthese zu normalisieren (Aoyagi, US-PS 5,952,202).
  • Eine überall vorhandene Schwierigkeit mit internen Kontrollen besteht darin, eine Amplifikation des Kontrollpolynukleotids davon abzuhalten, mit einer Zielamplifikation oder einem Nachweis des Produkts wechselzuwirken (Reischl et al. (1995) „Quantitative PCR" in Molecular Biotechnology, Band 3, Humana Press Inc., Seiten 55–71). Endogene ICP sind Gegenstand von Amplifikationsinhibitoren und können folglich ein falsch negatives Signal ergeben. Endogene ICP können auch Primeranlagerungsstellen für Zielprimer aufweisen und folglich ein falsch positives Signal ergeben. In dem Fall, dass sich endogene ICP-Systeme einen oder mehrere Primer mit dem Ziel teilen, kann eine Erschöpfung der geteilten Primer zu einer ungenauen PCR-Quantifizierung und zu einem begrenzten dynamischen Bereich führen. Im Hinblick auf die Begrenzungen und Mängel von herkömmlichen Kontrollen für die Quantifizierung und den Nachweis von Nukleinsäureamplifikationsprodukten sind nicht auf einem Gel basierende, externe Kontroll-PCR-Verfahren, die positive Anzeichen einer Amplifikation bereitstellen, wünschenswert.
  • III. ZUSAMMENFASSUNG
  • Die Erfindung betrifft neue Verfahren, Zusammensetzungen und Kits an Reagenzien zum Nachweis einer Nukleinsäureamplifikation eines einzelsträngigen, externen Kontrollpolynukleotids (ECP) gleichzeitig mit einer Nukleinsäureamplifikation eines bekannten oder nicht bekannten Zielpolynukleotids.
  • In einem ersten Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Nachweis einer Zielpolynukleotidsequenz durch Amplifizierung eines Zielpolynukleotids mit Primer verlängerungsreagenzien in einem ersten Satz von einem oder mehreren Gefäßen (1A) und Amplifizieren eines einzelsträngigen, externen Kontrollpolynukleotids mit einer Länge von 30 bis 110 Nukleotiden mit den Primerverlängerungsreagenzien in einem zweiten Satz von einem oder mehreren Gefäßen (1B) bereitgestellt. Die Primerverlängerungsreagenzien beinhalten einen Vorwärtsprimer, einen reversen Primer, eine oder mehrere nachweisbare Sonden, eine Polymerase und ein oder mehrere Desoxynukleotid-5'-triphosphate (dNTP). Das Zielpolynukleotid und das ECP und sein Komplement enthalten zu den Primern komplementäre Sequenzen und werden durch die gleichen Vorwärts- und reversen Primer während eines PCR-Tests amplifiziert.
  • Der Vorwärtsprimer und die nachweisbare Sonde sind benachbart oder im Wesentlichen benachbart, wenn sie an das einzelsträngige, externe Kontrollpolynukleotid oder sein Komplement hybridisiert sind. Auch sind der reverse Primer und die nachweisbare Sonde benachbart oder im Wesentlichen benachbart, wenn sie an das einzelsträngige, externe Kontrollpolynukleotid oder sein Komplement hybridisiert sind. Signale wie Fluoreszenz werden sodann von den nachweisbaren Sonden nachgewiesen.
  • In einer Ausführungsform sind die nachweisbaren Sonden selbstlöschende Fluoreszenzsonden (SQP), die jeweils einen Reporterfarbstoff und Löschergruppen umfassen.
  • Das Primerverlängerungsreagenz des zweiten Satzes von Gefäßen kann eine erste nachweisbare Sonde und eine zweite nachweisbare Sonde beinhalten. Die Sequenz der ersten Sonde unterscheidet sich von der zweiten Sonde durch eine oder mehrere Fehlpaarungen, Insertionen oder Deletionen. Das Signal von der ersten Sonde ist von dem Signal der zweiten Sonde auflösbar.
  • In einer weiteren Ausführungsform beinhaltet ein dritter Satz von einem oder mehrere Gefäßen ein zweites einzelsträngiges ECP und Primerverlängerungsreagenzien. Die Sequenz des ersten einzelsträngigen ECP unterscheidet sich von dem zweiten einzelsträngigen ECP durch eine oder mehrere Fehlpaarungen, Insertionen oder Deletionen. Der Sequenzanteil des ersten einzelsträngigen ECP, der komplementär zu einer nachweisbaren Sonde ist, unterscheidet sich um ein einziges Nukleotid von dem Sequenzanteil des zweiten einzelsträngigen ECP, der komplementär zu der nachweisbaren Sonde ist.
  • In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Kits an Reagenzien für eine Nukleinsäureamplifikation bereitgestellt, die umfassen: ein einzelsträngiges, externes Kontrollpolynukleotid mit einer Länge von 30 bis 110 Nukleotiden, einen Vorwärtsprimer, einen reversen Primer, eine Nukleinsäurepolymerase mit 5'-Nuklease-Aktivität, eine nachweisbare Sonde, ein oder mehrere Nukleotid-5'-triphosphate und andere Primerverlängerungsreagenzien, die für eine Nukleinsäureamplifikation erforderlich sind. In einer Ausführungsform werden die Primer, selbstlöschenden Fluoreszenzsonden und Primerverlängerungsreagenzien zweckmäßigerweise als ein Kit an Reagenzien bereitgestellt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A zeigt ein Schema für die Hybridisierung von Primern und einer nachweisbaren Sonde an ein Zielpolynukleotid. In dieser beispielhaften Ausführungsform ist die Sonde an den Sense-Strang hybridisiert.
  • 1B zeigt ein Schema für die Hybridisierung von Primern und einer Sonde an ein externes Kontrollpolynukleotid (ECP). In dieser beispielhaften Ausführungsform ist die nachweisbare Sonde an den Sense-Strang hybridisiert. Lücken zwischen Primern und Sonde sind durch n bezeichnet. Überhänge über Primerbindungsstellen hinaus auf dem ECP sind durch o bezeichnet.
  • 2 zeigt ein Schema für die Hybridisierung von allelspezifischen selbstlöschenden Fluoreszenzsonden (SQP1 und SQP2) an externe Kontrollpolynukleotide (ECP1 und ECP2).
  • 3 zeigt ein Schema einer Hybridisierung von SQP1 an ECP1 über ein G/C-Basenpaar und eine Hybridisierung von SQP2 an ECP2 über ein A/T-Basenpaar an einer Stelle eines Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP).
  • 4A zeigt die Strukturen von beispielhaften Fluoreszenzreporterfarbstoffmarkierungen in selbstlöschenden Sonden. X ist eine Anbindungsstelle an die Sonde.
  • 4B zeigt die Struktur von beispielhaften Löschermarkierungen in selbstlöschenden Sonden. X ist eine Anbindungsstelle an die Sonde.
  • 5 zeigt ein Plattendiagramm mit einer Platzierung von vier Sätzen von Gefäßen für PCR-Reaktionen in einem 96-Well-Format: zuerst – Probe (UNK), zweitens – (ECP1), drittens – (ECP2) und viertens – Kontrolle, Kontrolle ohne Matrize (NTC).
  • 6 zeigt ein Amplifikationsdiagramm von Rn gegenüber der Zykluszahl CT.
  • 7 zeigt ein Clustern von Daten in dem allelischen Unterscheidungstest von Beispiel 1. Die Fluoreszenzsignale von FAM- und TET-markierten selbstlöschenden Fluoreszenzsonden in jeder Reaktion sind aufgetragen.
  • V. GENAUE BESCHREIBUNG VON BEISPIELHAFTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es wird nun genau auf bestimmte erfindungsgemäße Ausführungsformen Bezug genommen, wobei Beispiele davon in den angefügten Zeichnungen veranschaulicht sind. Obwohl die Erfindung in Zusammenhang mit den veranschaulichten Ausführungsformen beschrieben werden wird, wird verstanden werden, dass sie nicht die Erfindung auf diese Ausführungsformen begrenzen sollen. Im Gegensatz dazu soll die Erfindung alle Alternativen, Modifikationen und Äquivalente umfassen, die innerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung eingeschlossen sein können.
  • V.1 DEFINITIONEN
  • „Nukleobase" betrifft eine stickstoffhaltige heterocyclische Gruppe, die fähig ist, Watson-Crick-Wasserstoffbindungen beim Paaren mit einer komplementären Nukleobase oder einem Nukleobasenanalogon zu bilden, z.B. ein Purin, ein 7-Deazapurin oder ein Pyrimidin. Typische Nukleobasen sind die natürlich vorkommenden Nukleobasen Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin und Analoga der natürlich auftretenden Nukleobasen, z.B. 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, 7-Deaza-8-azaguanin, 7-Deaza-8-azaadenin (Kutyavin et al., US-PS 5,912,340 ), Inosin, Nebularin, Nitropyrrol, Nitroindol, 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin, Pseudouridin, Pseudocytosin, Pseudoisocytosin, 5-Propinylcytosin, Isocytosin, Isoguanin, 7-Deazaguanin, 2-Thiopyrimidin, 6-Thioguanin, 4-Thiothymin, 4-Thiouracil, O6-Methylguanin, N6-Methyladenin, O4-Methylthymin, 5,6-Dihydrothymin, 5,6-Dihydrouracil, 4-Methylindol und Ethenoadenin (Fasman (1989) Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Seiten 385–394, CRC Press, Boca Raton, F1).
  • „Nukleosid" betrifft eine Verbindung, die aus einer Nukleobase besteht, die an das C-1'-Kohlenstoffatom eines Ribosezuckers gebunden ist. Die Ribose kann substituiert oder nicht substituiert sein. Substituierte Ribosezucker beinhalten in nicht begrenzender Weise diejenigen Ribosen, in denen ein oder mehrere der Kohlenstoffatome, z.B. das 3'-Kohlenstoffatom, durch ein oder mehrere dergleichen oder verschiedenen -R-, -OR-, -NRR- oder Halogengruppen substituiert sind, wobei jede R-Gruppe unabhängig -H, eine C1-C6-Alkyl- oder C5-C14-Arylgruppe ist. Ribosen beinhalten Ribose, 2'-Desoxyribose, 2',3'-Didesoxyribose, 3'-Halogenribose, 3'-Fluorribose, 3'-Chlorribose, 3'-Alkylribose, z.B. mit einer 2'-O-Methylgruppe, 4'-α-anomerische Nukleotide, 1'-α-anomerische Nukleotide und 2',4'-verbundene und andere „geschlossene" bicyclische Zuckermodifikationen (Wengel et al. WO 99/14226). Wenn die Nukleobase ein Purin, z.B. A oder G, ist, ist der Ribosezucker an die N9-Position der Nukleobase gebunden. Wenn die Nukleobase ein Pyrimidin, z.B. C, T oder U, ist, ist der Pentosezucker an die N1-Position der Nukleobase gebunden (Kornberg und Baker, (1992) DNA Replication, 2. Ausgabe, Freeman, San Francisco, CA).
  • „Nukleotid" betrifft einen Phosphatester eines Nukleosids als eine Monomereinheit oder innerhalb einer Nukleinsäure. Nukleotide werden manchmal als „NTP" oder „dNTP" und „ddNTP" bezeichnet, um besonders die strukturellen Merkmale des Ribosezuckers darzulegen. „Nukleotid-5'-triphosphat" betrifft ein Nukleotid mit einer Triphosphatestergruppe an der 5'-Position. Die Triphosphatestergruppe kann Schwefelsubstitutionen für die verschiedenen Sauerstoffatome beinhalten, z.B. α-Thionukleotid-5'-triphosphate.
  • Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „Oligonukleotid" und „Polynukleotid" austauschbar verwendet und betreffen einzelsträngige und doppelsträngige Polymere von Nukleotidmonomeren, einschließlich 2'-Desoxyribonukleotiden (DNA) und Ribonukleotiden (RNA), die durch Internukleotidphosphordiesterbindungsbindungen verbunden sind, oder Internukleotidanaloga und dazugehöriger Gegenionen, z.B. H+, NH4 +, Trialkylammonium, Mg2+, Na+ und dergleichen. Ein Polynukleotid kann vollständig aus Desoxyribonukleotiden, vollständig aus Ribonukleotiden oder chimerischen Gemischen davon bestehen. Polynukleotide können aus Internukleotid-, Nukleobasen- und Zuckeranaloga aufgebaut sein. Polynukleotide weisen typischerweise eine Größe von wenigen monomerischen Einheiten, z.B. 5–40, wenn sie häufig als Oligonukleotide bezeichnet werden, bis zu mehreren Tausend monomerischen Nukleotideinheiten auf. Wenn nicht anders angegeben, wird, wann immer eine Polynukleotidsequenz dargestellt ist, verstanden werden, dass die Nukleotide in 5'- zu 3'-Richtung von links nach rechts angegeben sind und dass „A" Desoxyadenosin bezeichnet, „C" Desoxycytidin bezeichnet, „G" Desoxyguanosin bezeichnet und „T" Thymidin bezeichnet, wenn nicht anders angegeben.
  • „Anbindungsstelle" betrifft eine Stelle auf einer Gruppe, z.B. einer Markierung oder einem Oligonukleotid, die kovalent an einen Linker gebunden ist.
  • „Linker" betrifft eine chemische Gruppe, die eine kovalente Bindung oder eine Kette von Atomen umfasst, die kovalent eine Markierung mit einem Polynukleotid oder eine Markierung mit einer anderen verbindet.
  • „Alkylgruppe" betrifft einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten, geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest, der sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom eines Stammalkans, -alkens oder -alkins ableitet. Typische Alkylgruppen bestehen aus 1–12 gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenstoffatomen, einschließlich in nicht begrenzender Weise Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butylgruppen und dergleichen.
  • „Alkyldiylgruppe" betrifft einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest mit 1–20 Kohlenstoffatomen und mit zwei monovalenten Radikalzentren, die sich durch die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von dem gleichen oder zwei unterschiedlichen Kohlenstoffatomen eines Stammalkans, -alkens oder -alkins ableiten. Typische Alkyldiylreste beinhalten in nicht begrenzender Weise 1,2-Ethyldiyl-, 1,3-Propyldiyl-, 1,4-Butyldiylgruppen und dergleichen.
  • „Aryldiylgruppe" betrifft einen ungesättigten cyclischen oder polycyclischen Kohlenwasserstoffrest mit 6–20 Kohlenstoffatomen mit einem konjugierten Resonanzelektronensystem und mindestens zwei monovalenten Radikalzentren, die sich von der Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von zwei unterschiedlichen Kohlenstoffatomen einer Stammarylverbindung ableiten. Typische Aryldiylgruppen beinhalten in nicht begrenzender Weise Reste, die sich von Benzol, substituiertem Benzol, Naphthalen, Anthracen, Biphenyl und dergleichen ableiten.
  • „Reaktive verbindende Gruppe" betrifft einen chemisch reaktiven Substituenten oder eine chemisch reaktive Gruppe, z.B. ein Nukleophil oder Elektrophil, der/die fähig ist, sich mit einem weiteren Molekül umzusetzen, um eine kovalente Bindung in einem Linker zu bilden.
  • „Heterocyclus" betrifft ein Molekül mit einem Ringsystem, in dem ein oder mehrere Ringatome ein Heteroatom, z.B. ein Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatom (im Gegensatz zu einem Kohlenstoffatom), sind.
  • „Internukleotidanalogon" betrifft ein Phosphatesteranalogon eines Oligonukleotids wie: (i) Alkylphosphonat, z.B. C1-C4-Alkylphosphonat, insbesondere Methylphosphonat, (ii) Phosphoramidat, (iii) Alkylphosphotriester, z.B. C1-C4-Alkylphosphotriester, (iv) Phosphorothioat und (v) Phosphorodithioat. Internukleotidanaloga beinhalten auch Nichtphosphatanaloga, worin die Zucker/Phosphat-Untereinheit durch einen nichtphosphathaltige Rückgratstruktur ersetzt ist. Eine Art von Nichtphosphatoligonukleotidanaloga weist eine Amidbindung wie eine 2-Aminoethylglycin-Einheit auf und wird herkömmlicherweise als PNA bezeichnet (Nielsen, et al. (1991) „Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymidinesubstituted polyamide", Science 254:1497-1500).
  • Der Ausdruck „benachbart" betrifft die Anordnung von zwei Oligonukleotiden, die jeweils an ein drittes Polynukleotid hybridisiert sind, wobei keine) Nukleotid(e) oder keine Lücke zwischen den zwei Oligonukleotiden liegt/liegen. Wenn die zwei Oligonukleotide nebeneinander ohne Lücke hybridisiert sind, sind sie benachbart.
  • Der Begriff „im Wesentlichen benachbart" betrifft die Anordnung von zwei Oligonukleotiden, die jeweils an ein drittes Polynukleotid hybridisiert sind, wobei 1 bis 5 dazwischenliegende Nukleotide als eine Lücke zwischen den zwei Oligonukleotiden liegen.
  • Die Begriffe „Zielsequenz" und „Zielpolynukleotid" betreffen eine Polynukleotidsequenz, die Gegenstand einer Hybridisierung mit einem komplementären Polynukleotid, z.B. einem Primer oder einer Sonde, sind. Die Sequenz kann aus DNA, RNA, einem Analogon davon, einschließlich Kombinationen davon, zusammengesetzt sein.
  • Der Begriff „Amplicon" betrifft eine Polynukleotidsequenz, die innerhalb einer Zielsequenz amplifiziert wird und durch die distalen Enden von zwei Primerbindungsstellen definiert wird.
  • Der Begriff „nachweisbare Sonde" betrifft ein Oligonukleotid, das eine Duplexstruktur oder eine Struktur höherer Ordnung, z.B. eine Tripelhelix, durch komplementäre Basenpaarung mit einer Sequenz einer Zielnukleinsäure bildet und fähig ist, ein nachweisbares Signal zu emittieren. Eine nachweisbare Sonde kann mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sein. Eine „selbstlöschende Fluoreszenzsonde" (SQP) ist mit einem Paar von Markierungen markiert, was einen Fluoreszenzreporterfarbstoff und einen Löscher beinhaltet, die durch Energieübertragung (FRET) wechselwirken.
  • Der Begriff „Markierung", wie hierin verwendet, betrifft eine jegliche Gruppe, die an ein Oligonukleotid, Nukleotid oder Nukleotid-5'-triphosphat gebunden werden kann und fungiert, um (i) ein nachweisbares Signal bereitzustellen, (ii) mit einer zweiten Markierung wechselzuwirken, um das durch die erste oder zweite Markierung bereitgestellte Signal zu modifizieren, z.B. FRET, (iii) eine Hybridisierung, d.h. Duplexbildung, zu stabilisieren, (iv) die Mobilität, z.B. elektrophoretische Mobilität oder Zellpermeabilität, durch Ladung, Hydrophobizität, Form oder andere physikalische Parameter zu beeinflussen oder (v) eine Einfanggruppe bereitzustellen, z.B. Affinität, Antikörper/Antigen oder ionische Komplexierung.
  • Der Begriff „löschen" betrifft eine Fluoreszenzabnahme einer ersten Gruppe (Reporterfarbstoff), die durch eine zweite Gruppe (Löscher) verursacht wird, ungeachtet des Mechanismus. Der Begriff „selbstlöschend" betrifft eine intramolekulare Energieübertragungswirkung, z.B. FRET (Fluoreszenzresonanzenergieübertragung), wobei ein Fluoreszenzreporterfarbstoff und ein Löscher an einer Sonde in einer Konfiguration verbunden sind, die eine Energieübertragung von dem Fluorophor auf den Löscher ermöglicht, was zu einer Verringerung der Fluoreszenz durch den Fluoreszenzfarbstoff führt. Die selbstlöschende Wirkung kann nach Hybridisierung der Sonde an ihr Komplement oder nach 5'-Nukleasespaltung vermindert oder verloren gehen, worauf der Fluoreszenzreporter und der Löscher getrennt werden.
  • Der Begriff „5'-Nuklease-Aktivität" betrifft eine Enzymaktivität, die eine Nukleinsäure an Phosphodiesterbindungen spaltet. Diese Aktivität kann entweder endo (spaltet bei internen Phosphodiesterbindungen) oder exo (spaltet bei der Phosphodiesterbindung, die dem 5'-Ende des Nukleinsäurestrangs am nächsten liegt) sein.
  • Der Begriff „Endpunktsanalyse" betrifft ein Verfahren, wobei eine Datensammlung lediglich dann auftritt, wenn eine Reaktion abgeschlossen ist. Ein Endpunktsana lyse einer PCR bedingt eine Messung des Fluoreszenzfarbstoffsignals, wenn das thermische Zyklisieren und die Amplifikation abgeschlossen sind. Ergebnisse können in Form der Veränderung der Fluoreszenz, d.h. Fluoreszenzintensitätseinheiten, des Fluoreszenzfarbstoffsignals vom Start bis zum Ende des thermischen Zyklisierens in einer PCR, vorzugsweise vermindert um jegliche interne Kontrollsignale, angegeben werden.
  • Der Begriff „Echtzeitanalyse" betrifft ein periodisches Überwachen während einer PCR. Bestimmte Systeme wie das ABI 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) führen ein Überwachen während eines jeden thermischen Zyklus an einem vorbestimmten oder benutzerdefinierten Zeitpunkt durch. Eine Echtzeitanalyse des 5'-Nukleasetests misst Fluoreszenzfarbstoffsignalveränderungen von Zyklus zu Zyklus, vorzugsweise vermindert um die Fluoreszenzänderung von einer passiven internen Referenz.
  • V.2 PRIMER SONDEN UND EXTERNE KONTROLLPOLYNUKLEOTIDE
  • Es wurde festgestellt, dass ein einzelsträngiges, externes Kontrollpolynukleotid (ECP) eine Amplifikation in Gefäßen (z.B. Reaktionsstellen, Spots, Röhrchen, Kammern, Wells) auf einer Platte, einem Satz von Röhrchen, einer Mikrotiterschale, Anordnungskonfiguration oder einer anderen Anordnung für PCR-Reaktionen durchläuft. Die ECP-haltigen Gefäße sind von den Gefäßen, die ein bekanntes oder unbekanntes Zielpolynukleotid enthalten, getrennt. Alle Gefäße durchlaufen ein gleichzeitiges thermisches Zyklisieren. Die erfindungsgemäßen Kontrollverfahren vereinfachen die Herstellung und Verteilung von Reagenzien in ein Kitformat und ein Messen von Ergebnissen.
  • Das ECP und Zielpolynukleotid werden in getrennten Reaktionsstellen (d.h. Gefäßen, Kammern, Wells) mit gemeinsamen Primern und Sonden amplifiziert. Die ECP-Sequenz ist ausgewählt („entworfen"), um durch die Vorwärts- und reversen Primer amplifiziert zu werden und die nachweisbare Sondensequenz oder das Komplement zu der nachweisbaren Sondensequenz zu umfassen. Das ECP umfasst Sequenzen, die komplementär zu Sequenzen von Vorwärts- und reversem Primer und Sondensequenzen sind, wobei, wenn überhaupt, wenige dazwischenliegende Sequenzen vorhanden sind. Dazwischenliegende Sequenzen sind einzelsträngige Bereiche oder Lücken in dem Hybridisierungskomplex (1 bis 3), die durch n, die Anzahl von Nukleotiden des ECP, die nicht an Primer oder Sonde hybridisiert sind, be zeichnet sind. Wie in der 1 dargestellt, sollten Primer benachbart (n=0) oder im Wesentlichen benachbart (n=1 bis etwa 5) zu der Sonde auf dem ECP hybridisieren. Lückennukleotide können willkürlich ausgewählt sein. Folglich ist im Allgemeinen das ECP gegenüber dem Zielamplicon kurz.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens sind der Vorwärtsprimer und die nachweisbare Sonde benachbart, wenn sie an das einzelsträngige, externe Kontrollpolynukleotid oder sein Komplement hybridisiert sind, und der reverse Primer und die nachweisbare Sonde sind benachbart (n=0, 1B, 2, 3), wenn sie an das einzelsträngige, externe Kontrollpolynukleotid oder sein Komplement hybridisiert sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform sind der Vorwärtsprimer und die nachweisbare Sonde im Wesentlichen benachbart, d.h. durch eine Lücke von 1 bis etwa 5 Nukleotiden getrennt, wenn sie an das einzelsträngige, externe Kontrollpolynukleotid hybridisiert sind, und der reverse Primer und die nachweisbare Sonde sind durch eine Lücke von 1 bis 5 Nukleotiden getrennt, wenn sie an das einzelsträngige, externe Kontrollpolynukleotid hybridisiert sind (n=1–5, 1B, 2, 3). Das einzelsträngige, externe Kontrollpolynukleotid bildet einzelsträngige Überhänge (in den 1B, 2, 3 als o bezeichnet) von 1 bis etwa 10 Nukleotiden, wenn es an den Vorwärtsprimer und den reversen Primer hybridisiert ist. Alternativ dazu können das ECP und ein Primer ein stumpfes Ende bilden (o=0).
  • Der Vorwärtsprimer, reverse Primer und die nachweisbare Sonde sind DNA-Oligonukleotide und können jeweils eine Länge von 10 bis 40 Nukleotiden aufweisen. Die Primer, Sonden und das ECP können Nukleotidanaloga, einschließlich Modifikationen an einem Zucker, einer Nukleobase oder einer Internukleotidbindung, enthalten.
  • Ein zusätzlicher erfindungsgemäßer Aspekt besteht darin, dass das ECP das Amplifikationsverfahren als ein einzelsträngiges Polynukleotid beginnt. Während einer PCR wird der komplementäre Strang des ECP gebildet und das ECP nimmt sodann wie eine jegliche doppelsträngige DNA in den Schritten eines Aufschmelzens, einer Anlagerung und einer Primerverlängerung teil. Ein Primer, vorwärts oder revers, hybridisiert an das einzelsträngige, externe Kontrollpolynukleotid und der andere hybridisiert an sein Komplement in einer Weise, die ermöglicht, dass eine Amplifikation auftritt. Das Komplement des einzelsträngigen ECP wird während einer PCR gebildet. Die vereinigten Aspekte einer kurzen Länge und einer Ein zelsträngigkeit ermöglicht dem ECP, durch automatisierte Synthese in einer wirtschaftlichen Weise mit einem großen Wirkungsgrad, Genauigkeit und minimalem Laboraufwand synthetisiert zu werden, da kürzere Oligonukleotide in höherer Ausbeute und höherer Reinheit hergestellt werden. Zusätzlich werden kurze Amplicons in dem Bereich von 50–150 bp mit hohem Wirkungsgrad amplifiziert. Das ECP weist 30–110 nt auf, einschließlich der Sequenzen der Vorwärts- und reversen Primer und der nachweisbaren Sonde.
  • Nachweisbare Sonden können mit einem G-C-Gehalt von 20–80% entworfen werden. Zusammenhängende Sequenzen in der Sonde von 4 oder mehreren G-Nukleotiden werden vorzugsweise vermieden, um Nicht-Watson/Crick-Basenpaarungswechselwirkungen wie Basenstapelungsstrukturen zu minimieren. Das Vorhandensein von G an dem 5'-Ende wird vorzugsweise vermieden, um ein Selbstlöschen eines 5'-Fluoreszenzfarbstoffs mit einem 5'-G zu verhindern. Der Strang (sense oder antisense) der Sonde kann auf der Basis ausgewählt werden, welche Sequenz mehr C- als G-Nukleotide aufweist. Unter Verwendung der Primer ExpressTM-Software (Applied Biosystems) werden Sondensequenzen für den 5'-Nukleasetest derart ausgewählt, dass sie Schmelztemperaturen (Tm) von 65–67°C aufweisen, aber Sondensequenzen mit anderen Tm-Werten können wie geeignet verwendet werden. Eine nachweisbare Sonde kann derart entworfen werden, dass sie komplementär zu dem Sense-Strang des Zielpolynukleotids oder ECP ist, der auch an den Vorwärtsprimer hybridisiert, vergleiche z.B. die 1A und 1B. Alternativ dazu kann die Sonde derart entworfen sein, dass sie komplementär zu dem Antisense-Strang des Zielpolynukleotids oder ECP ist.
  • Die Nukleinsäureamplifikation des Zielpolynukleotids und des externen Kontrollpolynukleotids kann durch Fluoreszenznachweis von Reporterfarbstoffen von einer selbstlöschenden Fluoreszenzsonde (SQP) gemessen werden, die einen Reporterfarbstoff und eine Löschergruppe beinhaltet. Der Reporterfarbstoff kann ein Xanthen-Farbstoff wie ein Fluorescein-Farbstoff sein. Der Reporterfarbstoff wird typischerweise von dem Löscher durch mindestens 12 Nukleotide (nt) getrennt sein. Der Reporterfarbstoff kann an das 5'-Ende oder 3'-Ende der selbstlöschenden Fluoreszenzsonde gebunden sein und der Löscher kann an dem gegenüberliegenden Ende der selbstlöschenden Fluoreszenzsonde gebunden sein. Zum Beispiel kann die SQP an dem 5'-Nukleotid mit einem Fluoreszenzreporterfarbstoff und an dem 3'-Nukleotid mit einem Löscher markiert sein. Der Löscher kann nicht fluoreszierend sein, um die spektrale Auflösung der Reporterfarbstoffe zu unterstützen. Alternativ dazu kann der Löscher fluoreszierend sein, um nachweisbar zu sein. Die selbstlöschende Fluoreszenzsonde kann auch mit einem Kleine-Furche-Binder markiert sein. In dem Fall, dass die Sonde mit einem Kleine-Furche-Binder markiert ist oder aus Nukleotidanaloga aufgebaut ist, die die Spezifität (höherer Tm-Wert) im Verhältnis zu DNA-Sonden erhöhen, kann die Sonde kürzer sein, z.B. weniger als 12 nt. Vorzugsweise werden die Sequenzen von zwei oder mehreren allelischen selbstlöschenden Sonden (SQP) derart ausgewählt, dass sie den gleichen oder nahezu den gleichen Tm-Wert aufweisen.
  • Eine SQP kann einen Bereich einer Selbstkomplementarität aufweisen, der der Sonde ermöglicht, in einer gelöschten Haarnadel-Konformation auszutreten, wenn sie nicht an ein komplementäres Zielpolynukleotid oder ECP gebunden ist (siehe z.B. Tyagi et al. US-PS 5,925,517). Wenn selbstlöschende Haarnadelfluoreszenzsonden eine Duplexstruktur mit einem Zielpolynukleotid oder ECP bilden, werden der Fluoreszenzfarbstoff und der Löscher räumlich getrennt und ein Löschen ausgeschlossen oder signifikant minimiert, was zu einer Fluoreszenzerhöhung führt.
  • Primersequenzen können derart ausgewählt werden, um einen Tm-Wert von 58–60°C aufzuweisen, aber Primersequenzen mit anderen Tm-Werten können wie geeignet verwendet werden. Abhängig von den Reaktionsbedingungen kann der Tm-Wert des Primers höher oder niedriger sein. Wie bei der Sondenauswahl werden aufeinander folgende Sequenzen in der Sonde von vier oder mehreren Gs vorzugsweise vermieden. Die fünf Nukleotide an dem 3'-Ende sollten nicht mehr als zwei G- und/oder C-Basen aufweisen. Die Länge von Primern und Sonden beträgt typischerweise 12–40 nt.
  • Für bestimmte Anwendungen, z.B. allelischer Nachweis, wird das Amplicon des Zielpolynukleotids derart entworfen, dass es eine polymorphe Stelle etwa in der Mitte des Sondenbereichs aufweist, und ist am sensitivsten, d.h. höchste Spezifität, für eine Unterscheidung durch nachweisbare Sonden.
  • V.2A Oligonukleotidsynthese
  • Oligonukleotide werden herkömmlicher Weise auf Festträgern durch das Phosphoramiditverfahren (US-PSen 4,415,732, 4,973,679, 4,458,066, Beaucage, S. und Iyer, R. (1992) Tetrahedron 48:2223-2311) unter Verwendung von käuflich erhältlichen Phosphoramiditnukleosiden, Trägern, z.B. Silica, kontrolliertem Porenglas (US-PS 4,458,066) und Polystyrol (US-PSen 5,047,524 und 5,262,530) und automatisierten Synthesizern (Modelle 392, 394, 3948 DNA/RNA Synthesizer, Applied Biosystems) synthetisiert.
  • V.2B Oligonukleotidmarkieren
  • Eine Markierung kann unter Verwendung einer jeglichen einer großen Anzahl von bekannten Techniken erreicht werden, die bekannte Markierungen, Bindungen, verbindende Gruppen, Reagenzien, Reaktionsbedingungen und Analyse- und Aufreinigungsverfahren verwenden. Im Allgemeinen und abhängig von der spezifischen Anwendung sollte die Bindung, die eine Markierung und ein Oligonukleotid oder Nukleotid verbindet, (i) mit einer Primerverlängerung nicht wechselwirken, (ii) die Polymeraseaktivität nicht hemmen oder (iii) die Fluoreszenzeigenschaften eines Farbstoffs nicht nachteilig beeinflussen, z.B. Löschen oder Bleichen. Beispielhafte Markierungen beinhalten Licht emittierende Verbindungen, die ein nachweisbares Signal durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Biolumineszenz erzeugen (Kricka, L. in Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992), Academic Press, San Diego, Seiten 3–28). Eine weitere Klasse von Markierungen sind hybridisierungsstabilisierende Gruppen, die dazu dienen, eine Hybridisierung von Duplexstrukturen zu verbessern, zu stabilisieren oder zu beeinflussen, z.B. Interkalatoren, Kleine-Furche-Binder und vernetzende funktionelle Gruppen (Blackburn, G. und Gait, M. Hrsg. „DNA and RNA structure" in Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 2. Auflage, (1996) Oxford University Press, Seiten 15–81). Eine noch weitere geeignete Klasse von Markierungen dient dazu, die Auftrennung oder Immobilisierung eines Moleküls durch spezifische oder nicht spezifische Einfangmittel zu bewirken (Andrus, A. „Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" (1995) in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, Seiten 39–54).
  • Ein Markieren rührt typischerweise von Mischen einer geeigneten reaktiven Markierung und eines Oligonukleotids in einem geeigneten Lösungsmittel, in dem beide löslich sind, unter Verwendung von Verfahren her, die bekannt sind, um eine Bildungsreaktion für eine kovalente Bindung zu bewirken (Hermanson, Bioconjugate Techniques, (1996) Academic Press, San Diego, CA, Seiten 40–55, 643–71), gefolgt von einer Abtrennung des markierten Oligonukleotids von jeglichen Ausgangsmaterialien oder nicht gewünschten Nebenprodukten. Das markierte Oligonukleotid kann trocken oder in Lösung für eine spätere Verwendung, vorzugsweise bei niedriger Temperatur, gelagert werden.
  • Die reaktive Markierung kann eine reaktive verbindende Gruppe an einer der Substituentenpositionen, z.B. 5- oder 6-Carboxylgruppe von Fluorescein oder Rhodamin, für eine kovalente Anbindung an ein Oligonukleotid beinhalten. Reaktive verbindende Gruppen können elektrophile funktionelle Gruppen sein, die fähig sind, sich mit nukleophilen Gruppen auf einem Oligonukleotid wie einer Hydroxyl-, Amin- oder Thiolgruppe umzusetzen. Beispiele für reaktive verbindende Gruppen beinhalten Succinimidylester-, Isothiocyanat-, Sufonylchlorid-, Sulfonatester-, Silylhalogenid-, 2,6-Dichlortriazinyl-, Pentafluorphenylester-, Phosphoramidit-, Maleimid-, Halogenacetyl-, Epoxid-, Alkylhalogenid-, Allylhalogenid-, Aldehyd-, Keton-, Acylazid-, Anhydrid- und Iodacetamidgruppen.
  • Eine reaktive verbindende Gruppe einer Markierung ist ein N-Hydroxysuccinimidylester (NHS), z.B. die NHS-Gruppe eines Carboxylgruppensubstituenten eines Fluoreszenzfarbstoffs. Die NHS-Estergruppe des Farbstoffs kann vorgeformt, isoliert, aufgereinigt und/oder charakterisiert sein oder kann in situ gebildet werden und mit einer nukleophilen Gruppe eines Oligonukleotids umgesetzt werden. Typischerweise wird eine Carboxylform des Farbstoffs durch Umsetzen mit einer gewissen Kombination der nachstehenden Reagenzien aktiviert, um den NHS-Ester des Farbstoffs zu ergeben: (i) ein Carbodiimidreagenz, z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid oder ein Uroniumreagenz, z.B. TSTU (O-(N-Succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluoroborat, HBTU (O-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat) oder HATU (O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat), (ii) ein Aktivator wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und (iii) N-Hydroxysuccinimid.
  • Eine weitere reaktive verbindende Gruppe einer Markierung ist eine Phosphoramiditform von Fluoreszenzfarbstoffen, Löschern, Kleine-Furche-Bindern und Mobilitätsmodifizierungsmitteln. Phosphoramiditfarbstoffreagenzien sind besonders für die automatisierte Synthese von markierten Oligonukleotiden geeignet. Die Phosphoramiditreagenzien können nukleosidisch und nicht nukleosidisch sein. Phosphoramiditfarbstoffreagenzien, nukleosidisch und nicht nukleosidisch, erlauben ein Markieren an anderen Stellen eines Oligonukleotids, z.B. 5'- und 3'-Enden, Nukleobase, Internukleotidbindung, Zucker (US-PSen 5,736,626, 5,141,813). Ein Markieren an den Nukleobasen-, Internukleotidbindungs- und Zuckerstellen ermöglicht interne und mehrfache Markierungen auf dem Oligonukleotid. In manchen Fällen kann die Markierung funktionelle Gruppen enthalten, die ein Schützen entweder während der Synthese des Phosphoramiditreagenzes oder während seiner anschließenden Verwendung zur Markierung von Molekülen wie Oligonukleotiden erfordern, z.B. phenolische Sauerstoffatome von Fluorescein-Farbstoffen. Die verwendete(n) Schutzgruppe(n) wird/werden von der Art der funktionellen Gruppen abhängen und wird/werden dem Fachmann ersichtlich sein (Greene, T. und Wuts, P. Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York, 1991).
  • Erfindungsgemäße Oligonukleotidprimer und Sonden können mit Gruppen markiert werden, die die Geschwindigkeit einer elektrophoretischen Migration beeinflussen, d.h. mobilitätsmodifizierenden Markierungen. Mobilitätsmodifizierende Markierungen beinhalten in nicht begrenzender Weise Biotin, Cholesterin und Polyethylenoxyeinheiten, -(CH2CH2O)n-, worin n einen Wert von 1 bis 100 und typischerweise 2 bis 20 aufweisen kann (z.B. US-PS 5,624,800). Die Polyethylenoxy (PEO)-Einheiten können durch Phosphatgruppen unterbrochen sein. Ein spezifisches Markieren von Fluoreszenz-markierten Primern mit zusätzlichen Markierungen von Polyethylenoxygruppen von bestimmter und bekannter Größe ermöglicht eine Auftrennung durch Elektrophorese von Ampliconen im Wesentlichen unabhängig von der Größe, d.h. Anzahl von Nukleotiden des Amplicons. Das heißt, Polynukleotide der gleichen Länge können aufgrund der Basen von spektral auflösbaren Farbstoffmarkierungen und mobilitätsmodifizierenden Markierungen unterschieden werden. Polynukleotide, die sowohl Farbstoffmarkierungen als auch mobilitätsmodifizierende Markierungen tragen, können enzymatisch durch Ligation oder Polymeraseverlängerung der einfach markierten Oligonukleotid- oder Nukleotidbestandteile gebildet werden. Die PEO-Markierung kann geladene Gruppen wie Phosphodiester beinhalten, um Ladung zu verleihen und die elektrophoretische Mobilität (Geschwindigkeit) zu erhöhen. Die PEO-Markierung kann ungeladen sein und dazu dienen, die elektrophoretische Mobilität zu verlangsamen. Solche Modifizierungsmittel können dazu dienen, die elektrophoretische Geschwindigkeit eines Satzes von Ampliconen während einer Analyse, z.B. durch Fluoreszenznachweis, zu beeinflussen oder zu normalisieren, um eine Auflösung und Auftrennung zu verbessern (US-PS 5,470,705).
  • Eine Klasse von Markierungen stellt ein Signal für einen Nachweis von markierten Verlängerungsprodukten durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz und elektrochemischer Lumineszenz bereit (Kricka, L. in Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992), Academic Press, San Diego, Seiten 3–28). Chemilumineszierende Markierungen beinhalten 1,2-Dioxetan-Verbindungen (US-PS 4,931,223, Bronstein et al. (1994) „Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays", Anal. Biochemistry 219:169-81).
  • Fluoreszenzfarbstoffe, die zum Markieren von Sonden, Primern und Nukleotid-5'-triphosphaten geeignet sind, beinhalten Fluoresceine, Rhodamine (z.B. US-PSen 5,366,860, 5,936,087, 6,051,719), Cyanine (US-PS 6,080,868 und WO 97/45539) und Metallporphyrin-Komplexe (WO 88/04777). Beispiele für Fluorescein-Farbstoffe beinhalten 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) 1,2',4',1,4-Tetrachlorfluorescein (TET) 2 und 2',4',5',7',1,4-Hexachlorfluorescein (HEX) 3 (US-PS 5,654,442), 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyrhodamin (JOE) 4, 2'-Chlor-5'-fluor-7',8'-kondensierte Phenylgruppe-1,4-dichlor-6-carboxyfluorescein 5 (US-PSen 5,188,934 und 5,885,778), 2'-Chlor-7'-phenyl-1,4-dichlor-6-carboxyfluorescein 6 (US-PS 6,008,379 (4A)). Das 5-Carboxyl- und andere Regioisomere können auch geeignete Nachweiseigenschaften aufweisen. Fluorescein- und Rhodamin-Farbstoffe können 1,4-Dichlor-Substituenten (unterer Ring, wie gezeigt, 4A) aufweisen.
  • Eine weitere Klasse von Sondenmarkierungen beinhaltet Fluoreszenzlöschergruppen. Die Emissionsspektren eines Löschers überlappen mit einem intermolekularen Fluoreszenzfarbstoff derart, dass die Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs durch das Phänomen einer Fluoreszenzresonanzenergieübertragung „FRET" wesentlich vermindert oder gelöscht wird (Clegg, R., (1992) Meth. Enzymol., 211:353-388). Löscher beinhalten in nicht begrenzender Weise (i) Rhodamin-Fluoreszenzfarbstoffe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA) 7, Tetrapropano-6-carboxyrhodamin (ROX) 8 und (ii) Diazoverbindungen, z.B. 9–11 und (iii) Cyanin-Farbstoffe, einschließlich 11, Anthraquinon, Malachitgrün, Nitrothiazol- und Nitroimidazolverbindungen und dergleichen (4B). Einige nitrosubstituierte Formen von Löschern sind wirksame Löscher (Lee et al., US-PS 6,080,868). Nicht fluoreszierende Löschergruppen können eine bessere spektrale Unterscheidung zwischen den Reporterfarbstoffen ermöglichen.
  • Eine weitere Klasse von Markierungen dient dazu, die Auftrennung oder Immobilisierung von markierten Primerverlängerungsprodukten durch spezifische oder nicht spezifische Einfangmittel, z.B. Biotin, 2,4-Dinitrophenylgruppe (DNP) und Digoxigenin, zu bewirken (Andrus, A. „Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" (1995) in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, Seiten 39–54).
  • Eine weitere Klasse von Sonden- und Primermarkierungen, die hierin als Hybridisierungsstabilisierungsmittel bezeichnet werden, beinhaltet in nicht begrenzender Weise Kleine-Furche-Binder (MGB), Interkalatoren, Polykationen wie Polylysin und Spermin und vernetzende funktionelle Gruppen. Hybridisierungsstabilisierungsmittel können die Stabilität einer Basenpaarung, d.h. Affinität, oder die Geschwindigkeit einer Hybridisierung (Corey, (1995) J. Amer. Chem. Soc. 117:9373-74) des Primers oder der Sonde und des Zielpolynukleotids erhöhen. Hybridisierungsstabilisierungsmittel dienen dazu, die Spezifität einer Basenpaarung, veranschaulicht durch große Unterschiede in Tm-Werten (ΔTm) zwischen perfekt komplementären Sequenzen und den Fällen, bei denen die sich ergebende Duplexstruktur ein oder mehrere Fehlpaarungen einer Watson/Crick-Basenpaarung enthält, zu erhöhen (Blackburn, G. und Gait, M. Hrsg. „DNA and RNA structure" in Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 2. Auflage, (1996) Oxford University Press, Seiten 15–81 und 337–46). Kleine-Furche-Binder beinhalten in nicht begrenzender Weise Hoechst 33258 (Rajur et al. (1997) J. Organic Chem. 62:523-29), CDPI1-3 (Kutyavin et al., US-PSen 5,801,155 und 6,084,102) und MGB 1 (Gong et al. (1997) Biochem. and Biophys. Res. Comm. 240:557-60). Die MGB-Markierung verleiht oft eine größere Affinität (höherer Tm-Wert) und ermöglicht folglich die Verwendung von kürzeren Sonden.
  • Nukleobasen-markierte Oligonukleotide können mehrfache Markierungen, z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, tragen, die über die Nukleobasen gebunden sind. Nukleobasenmarkierte Oligonukleotide können gebildet werden durch: (i) enzymatischen Einbau von enzymatisch einbaubaren Nukleotidreagenzien, worin R19 ein Triphosphat ist, durch eine DNA-Polymerase oder Ligase und (ii) Koppeln eines Nukleosidphosphoramiditreagenzes durch automatisierte Synthese. Während Nukleobasen-markierte Oligonukleotide durch Einbau von mehr als einem einbaubarem Nukleotid mehrfach markiert sein können, führt ein Markieren mit einem Phosphoramiditfarbstoffmarkierungsreagenz zu einfach 5'-markierten Oligonukleotiden gemäß der nachstehenden Formel:
    Figure 00200001
    worin X eine O-, NH- oder S-Gruppe ist, R21 H, eine OH-, Halogenid-, Azid-, Amin-, C1-C6-Aminoalkyl-, C1-C6-Alkyl-, Allyl-, C1-C6-Alkoxy-, OCH3- oder OCH2CH=CH2-Gruppe ist, R22 H, eine Phosphat-, Internukleotidphosphodiestergruppe oder ein Internukleotidanalogon ist und R23 H, eine Phosphat-, Internukleotidphosphodiestergruppe oder ein Internukleotidanalogon ist. L ist eine Alkyldiylgruppe, z.B. 1,6-Hexyldiylgruppe, Aryldiyl- oder Polyethylenoxygruppe (Andrus, (1995) „Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, Seiten 39–54, Hermanson, Bioconjugate Techniques, (1996) Academic Press, San Diego, CA, Seiten 40–55, 643–71, Mullah (1998) Nucl. Acids Res. 26:1026-1031).
  • V.2D Nukleotidmarkieren
  • Nukleotid-5'-triphosphate können für eine Verwendung in erfindungsgemäßen Verfahren markiert werden. Ein mehrfacher Einbau von Fluoreszenz-markierten Nukleotiden während einer PCR führt zu Ampliconen mit einem hohen Grad an Fluoreszenzintensität, was die Empfindlichkeit von Zielpolynukleotiden mit einer niedrigen Kopieanzahl erhöht. Die Zucker- oder Nukleobasengruppen der Nukleotide können markiert sein. Nukleobasenmarkierungsstellen beinhalten in nicht begrenzender Weise das 8-C-Atom einer Purinnukleobase, das 7-C- oder 8-C-Atom einer 7-Deazapurinnukleobase und die 5-Position einer Pyrimidinnukleobase. Das markierte Nukleotid kann enzymatisch einbaubar und enzymatisch verlängerbar sein. Markierte Nukleotid-5'-triphosphate können die nachstehende Formel aufweisen:
    Figure 00200002
    worin MARKIERUNG eine geschützte oder nicht geschützte Markierung, einschließlich eines Fluoreszenzfarbstoffs, Löschers oder Energieübertragungsfarbstoffs und dergleichen, ist. B ist eine Nukleobase, z.B. Uracil, Thymin, Cytosin, Adenin, 7-Deazaadenin, Guanin und 8-Deazaguanosin. R19 ist eine Triphosphat-, Thiophosphat gruppe oder ein Phosphatesteranalogon. R20 und R21, wenn für sich genommen, sind jeweils unabhängig voneinander H, HO und F. L ist ein Linker, z.B. eine Bindung, eine Alkyldiyl-(C1-C12), Alkenyldiyl-(C1-C12) oder Alkinyldiylgruppe (C1-C12). Ein beispielhafter Linker ist L der Struktur:
    Figure 00210001
    worin n 0,1 oder 2 ist (Khan et al., US-PS 4,757,141).
  • V.3 AUTOMATISIERTE PCR-ANALYSE
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können auf einer automatisierten Instrumentation durchgeführt werden, die zum Durchführen von Nukleinsäureamplifikationen entworfen ist, z.B. Thermocyclern und dergleichen. Die Instrumentation kann eine Datensammlungs- und Nach-PCR-Analysensoftware beinhalten, die ermöglicht, dass die PCR in Echtzeit überwacht oder durch Endpunktsnachweis quantifiziert wird. Erfindungsgemäße Verfahren beinhalten homogene PCR-Tests, wobei Reaktionskammern während einer Amplifikation und Analyse zum Verhindern einer Kreuzkontaminierung geschlossen verbleiben (Higuchi et al., (1992) Biotechnology, 10:413-17, Higuchi et al., (1993) Biotechnology, 11:1026-30, Holland et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., 88:7276-80).
  • Die Erfindung kann gemäß dem 5'-Nukleasetest erfolgen. Die Polymerase, die eine Primerverlängerung durchführt und das Polynukleotid amplifiziert, weist auch eine 5'-Nuklease-Aktivität auf, die zum Spalten der Sonde dient. Ein Fluoreszenz-„Reporter"-Farbstoff und ein „Löscher" können an den 5'- und 3'-Enden an die SQP gebunden sein, die komplementär zu der Ziel-DNA ist (Livak et al., US-PS 5,723,591). Die Farbstoffe werden derart ausgewählt und angeordnet, dass sie über ein Verfahren einer Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) wechselwirken (Clegg, R., (1992) Meth. Enzymol., 211:353-388). Alternativ dazu können der Reporterfarbstoff und der Löscher an internen Positionen auf der Sonde wie Nukleobasen, Zuckern oder Internukleotidbindungen gebunden sein. Der Reporter ist eine lumineszierende Gruppe, die entweder durch chemische Reaktion, was Chemilumineszenz erzeugt, oder durch Lichtabsorption, was Fluoreszenz erzeugt, angeregt werden kann (Livak et al., US-PS 5,876,930). Eine Quantifizierung des Amplicons führt zur Ableitung der Anzahl von Zielpolynukleotidmolekülen, die in der Probe vor einer Amplifikation vorhanden sind. Das Zielpolynukleotid kann ein Plasmid, eine cDNA, ein PCR-Produkt, eine genomische DNA, ein Restriktionsverdau oder ein Li gationsprodukt sein. Das Zielpolynukleotid kann ein Gemisch sein, das aus einzelnen Nukleotidpolymorphismen besteht. Das ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection System führt den 5'-Nukleasetest, Hybridisierungs-basierende Tests und andere auf Fluoreszenz basierende Quantifizierungstests durch (Applied Biosystems, Foster City, CA).
  • Wenn die Polymerase thermostabil ist und eine 5'-Nuklease-Aktivität aufweist, können die selbstlöschenden Fluoreszenzsonden während einer Amplifikation gespalten, d.h. verdaut, werden, um den Reporterfarbstoff von dem Löscher abzutrennen. Der 5'-Nukleasetest einer Nukleinsäureamplifikation unter Verwendung von Reporter-Löscher-Sonden (Lee et al., (1993) Nucl. Acids Res., 21:3761-66, Livak et al., (1995) PCR Methods and Applications, 4:357-362) ergibt einen direkten Nachweis von Produkten der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Der Löscher wird aus seiner engen räumlichen Nähe zu dem Reporter nach Spaltung freigesetzt, so dass das Signal von dem Reporter nicht länger gelöscht wird. Eine Zunahme der Fluoreszenz tritt auf, die direkt und proportional mit der Zunahme der Kopien des PCR-Produkts korreliert. Die Produkte der Nukleinsäureamplifikation des Zielpolynukleotids und des externen Kontrollpolynukleotids können durch Endpunktsanalyse oder durch Echtzeitanalyse gemessen und quantifiziert werden.
  • Erfindungsgemäß werden Reporter-Löscher-Sondentests mit externen Fluoreszenzerzeugenden Kontrollen bereitgestellt, um Fluoreszenzänderungen zu messen. Erfindungsgemäße Ausführungsformen sind zum Nachweis von Expressionsprodukten mit niedriger Kopienanzahl oder für allelische Unterscheidungstests mit geringer Häufigkeit geeignet. Unter Verwendung einer Echtzeit- oder Endpunktsanalyse können ein Nachweis und eine Quantifizierung von PCR-Produkten durch Messen der Fluoreszenzzunahme von gespaltenen, selbstlöschenden Fluoreszenzsonden oder einfach nach Hybridisierung erhalten werden.
  • Positive Amplifikationskontrollen sind von passiven internen Referenzmolekülen (Livak et al., US-PS 5,736,333) zu unterscheiden, die zu einer PCR zugegeben werden, um eine Signal- und Nachweiskalibrierung und -normalisierung bereitzustellen. Passive interne Referenzen wie nicht komplementäre Reporter-Löscher-Moleküle hybridisieren nicht an ein Ziel- oder andere Polynukleotide, werden nicht amplifiziert, verbraucht oder fungieren als Substrate von Enzymen und unterlaufen keine chemischen oder enzymatischen Reaktionen einer jeglichen Art. Folglich stel len passive interne Referenzen keine Überprüfung oder Anzeige von Bedingungen für eine Amplifikation bereit.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch in Hybridisierungs-basierenden Tests erfolgen, worin eine Fluoreszenzzunahme nach Hybridisierung einer selbstlöschenden Fluoreszenzsonde an ein Ziel nachgewiesen wird (Tyagi et al., US-PS 5,925,517, Bagwell, EP 601889 , Heller, et al. EP 229943 ). Im Allgemeinen ist eine Fluoreszenzzunahme proportional zu dem Ausmaß einer Amplifikation, d.h. der Menge an während einer PCR hergestelltem Amplicon. Eine Spaltung der Sonde durch 5'-Nuklease-Aktivität der Polymerase muss nicht auftreten. Die Erfindung kann in einigen Ausführungsformen ausgeführt werden, in denen die Polymerase keine 5'-Nuklease-Aktivität aufweist.
  • Erfindungsgemäße Verfahren können durch eine Datensammlungsroutine mit hohem Durchsatz während des Verlaufs eines thermischen Zyklisierens in einer PCR (Echtzeitanalyse) oder an dem Ende einer PCR (Endpunktsanalyse) erfolgen. Das Probenformat kann in einem Mikrotiter-, Mikrowellformat mit 6 bis 1536 Wells vorliegen. Jedes Well kann ein Volumen von 1 bis 500 μl aufweisen. Die Wells sind in gleichmäßig beabstandeten Dimensionen wie der herkömmlichen 96-Well-Platte oder -schale mit 8 Reihen an 12 Wells mit einer Abmessung von etwa 3" × 4,5" angeordnet. Industrie-standardisierte Dimensionen erleichtern ein Verteilen von Flüssigkeiten mit Pipettoren mit mehrfachen Spitzen oder programmierten Flüssigkeitszulieferungsrobotern. Die Erfindung kann auch durch Spotten der Reagenzien auf ein absorbierendes oder poröses Material, Fritten, Filter oder Fasern erfolgen, die aus Nylon, Cellulose, Polystyrol etc. bestehen. Alternativ dazu können die Reagenzien auf nicht absorbierende, ebene Oberflächen wie Glas oder ein Polymer gespottet werden (Gilles, P. et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:365-70).
  • Mit kalibrierten externen Kontrollen, z.B. ECP1, ECP2, NTC (5), können die relativen Werte von eng aneinander liegenden Konzentrationen dadurch aufgelöst werden, dass die Geschichte der relativen Konzentrationswerte während der PCR faktorisiert wird. Ein Genotypisieren durch Endpunktsanalyse des 5'-Nukleasetests erfolgt auf automatisierten Systemen, z.B. einem ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems), wobei die Freisetzung von Fluoreszenz durch Laser-induzierte Fluoreszenz mit einer optischen Fasersonde in einer nicht invasiven geschlossenen Reaktionskammer nachgewiesen und gemessen wird (Woudenberg et al., US-PSen 5,928,907 und 6,015,674). Alternativ dazu können Mehr fachthermocycler (z.B. die Modelle 9700, 9600, Applied Biosystems) die DNA amplifizieren, bevor die zyklisierten Reaktionen analysiert werden, wobei ein Endpunktsnachweis die Fluoreszenz misst. Die Fluoreszenzänderung, ΔRn, ist die Differenz zwischen der Reporterfluoreszenz in der Probe und derjenigen in der Kontrolle ohne Matrize (NTC). Rn ist die Emissionsintensität eines Fluoreszenzreporters, normalisiert auf die Emission einer passiven Referenz (Rn = Emissionsintensität : Emissionsintensität einer passiven Referenz).
  • Während einer Echtzeitanalyse wird der ΔRn-Wert während jedes PCR-Zyklus berechnet. Der Grenzwertzyklus oder CT-Wert ist derjenige PCR-Zyklus, bei dem eine statistisch signifikante ΔRn-Zunahme zuerst nachgewiesen wird, d.h. wenn das Fluoreszenzverhältnis von dem Hintergrund unterscheidbar ist. Die Optimalbedingungen sind diejenigen, die den niedrigsten CT-Wert ergeben (6). Für einen bestimmten Reporterfarbstoff und eine bestimmte Konzentration an Ziel spiegeln sowohl der Rn-Wert als auch der CT-Wert die Wirksamkeit des Löschers wider.
  • V.4 ALLELISCHE UNTERSCHEIDUNGSTESTS
  • Allelische Unterscheidung ist der Nachweis von verschiedenen Formen des gleichen Gens, die sich durch Nukleotidsubstitution, -insertion oder -deletion unterscheiden. Erfindungsgemäß werden neue Verfahren zum Erstellen von externen positiven Kontrolldaten bereitgestellt, während Allele, einschließlich Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP), während allelspezifischer PCR nachgewiesen und unterschieden werden (Newton et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2503-16, Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-48, TaqMan Allelic Discrimination Demonstration Kit Protocol, (1998) Applied Biosystems). In dem 5'-Nukleasetest werden DNA-Proben hinsichtlich spezifischer Mutationen, z.B. zwei Allele von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP), genotypisiert. In diesem Test enthält jede Reaktion zwei unterschiedliche selbstlöschende Fluoreszenzsonden und jede Sonde ist mit einem einzigartigen Fluoreszenzfarbstoff markiert.
  • Typischerweise wird für allelische Unterscheidungstests in einem ersten Satz von Gefäßen ein Zielpolynukleotid mit Primerverlängerungsreagenzien amplifiziert, die einen Vorwärtsprimer, einen reversen Primer, ein oder mehrere nachweisbare Sonden, eine Polymerase und ein oder mehrere Nukleotid-5'-triphosphate enthalten. In einem zweiten Satz von Gefäßen wird ein einzelsträngiges, externes Kontrollpolynukleotid, ECP1, mit den Primerverlängerungsreagenzien amplifiziert. In einem dritten Satz von Gefäßen wird ein zweites einzelsträngiges, externes Kontrollpolynukleotid, ECP2, mit den Primerverlängerungsreagenzien amplifiziert. Die ECP werden mit den gleichen Primern wie das Zielpolynukleotid amplifiziert, was nachweisbare Amplicons ergibt. Ein vierter Satz von Gefäßen kann lediglich Primerverlängerungsreagenzien enthalten, was folglich als eine Negativkontrolle fungiert, in der keine Amplifikation auftritt. Ein jegliches Signal von dem vierten Satz von Gefäßen macht ein Hintergrundsignal aus.
  • In allelischen Unterscheidungstests, die das 5'-Nukleaseverfahren und selbstlöschende Sonden verwenden, ist jede SQP komplementär zu einem Allel und hybridisiert vorzugsweise und mit Spezifität an eines der Allele (2 und 3). In anderen Worten weist für eine allelische Unterscheidung jedes Allel, das mit einem Ziel assoziiert ist, eine Sonde auf, die mit ihrem eigenen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Zum Beispiel zeigt 2, dass SQP1 mit F1-Reporterfarbstoff an ECP1 hybridisiert und SQP2 mit F2-Reporterfarbstoff an ECP2 hybridisiert. Die selbstlöschenden Fluoreszenzsonden können zwei zusätzliche Merkmale enthalten, die eine bessere allelische Unterscheidung bereitstellen: (i) Kleine-Furche-Binder (MGB)-Markierungen verbessern die Unterscheidung zwischen Paarung und Fehlpaarung, d.h. bessere Spezifität (ΔTm), und ermöglichen daher die Verwendung von kürzeren Sonden, und (ii) nicht fluoreszierende Löscher ermöglichen eine bessere spektrale Unterscheidung zwischen den Reporterfarbstoffen und vermindern die Hintergrundfluoreszenz (User Bulletin, „Primer Express Version 1.5 and TaqMan MGB Probes for Allelic Discrimination", Applied Biosystems, Mai 2000).
  • V.5 GENEXPRESSIONSTESTS
  • Genexpressionstests können durch die erfindungsgemäßen Verfahren und Kits mit quantitativem Echtzeitnachweis von nachweisbaren Sonden erfolgen. Genomische DNA-Zielpolynukleotide können von Menschen, Drosophila, Maus oder anderen Organismen stammen. Muster einer Genexpression können in Reaktion auf verschiedene Stimuli beobachtet werden. Typischerweise enthält ein erster Satz von Gefäßen die Zielpolynukleotidproben und Primerverlängerungsreagenzien. Die Primerverlängerungsreagenzien können einen Vorwärtsprimer, einen reversen Primer, eine nachweisbare Sonde, eine Polymerase und ein oder mehrere Nukleotid-5'-triphosphate enthalten. Ein zweiter Satz von Gefäßen beinhaltet ein einzelsträngiges ECP und die gleichen Primerverlängerungsreagenzien wie der erste Satz von Gefäßen. Ein weiterer Satz von Gefäßen enthält lediglich Primerverlängerungsreagenzien und dient als Negativkontrolle.
  • V.6 KITS
  • Eine Begrenzung der Anzahl von automatisierten Pipettier- und Verteilungsschritten minimiert Fehler und unklare Ergebnisse wie falsch Positive und falsch Negative, die ernsthaft den Wert des PCR-basierenden Verfahrens vermindern können. Um einige erfindungsgemäße Ausführungsformen durchzuführen, kann ein Kit an Reagenzien für eine Nukleinsäureamplifikation konfiguriert werden. Ein beispielhafter Kit kann beinhalten: ein einzelsträngiges, externes Kontrollpolynukleotid mit einer Länge von 30 bis 110 Nukleotiden, einen Vorwärtsprimer, einen reversen Primer, eine Nukleinsäurepolymerase mit 5'-Nuklease-Aktivität, eine nachweisbare Sonde, wie eine SQP, ein oder mehrere Nukleotid-5'-triphosphate und andere Primerverlängerungsreagenzien, die für eine Nukleinsäureamplifikation erforderlich sind, wie ein Puffer. Ein Beispiel eines geeigneten Nukleinsäureamplifikationspuffers für eine Auflösung von Kitreagenzien ist: 10 mM Tris (pH-Wert von 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine, 0,01% NP40 und 0,01% TweenTM.
  • In einer Ausführungsform werden die Primer, Sonden und Primerverlängerungsreagenzien zweckmäßigerweise als ein Kit an Reagenzien bereitgestellt. Eine Amplifikation eines ECP mit einem Kit, der Primer und Sonden enthält, verifiziert positiv, dass die Primer und Sonden richtig hergestellt und verteilt (gemischt) wurden. Folglich ermöglichen bestimmte Ausführungsformen von Kits eine Qualitätskontrolle für PCR-Tests. Eine Qualitätskontrolle stellt sicher, dass die Primerverlängerungsreagenzien fähig sind, das Zielpolynukleotid nachzuweisen. Ein Verteilen beinhaltet eine automatisierte, durch einen Roboter durchgeführte Zufuhr an Wells, Spots und andere Arten von Gefäßen. Viele erfindungsgemäße Kits können dadurch angeordnet und verteilt werden, dass sie auf eine Verteilungskonfiguration für eine Amplifikation verteilt werden. Jeder Kit kann unterschiedliche nachweisbare Sonden und Primer beinhalten. Zielpolynukleotide und ECP können getrennt auf verschiedene Gefäße in der Anordnung verteilt werden, um viele mögliche Amplifikationstests zu erreichen, einschließlich positiver und negativer Kontrollen. Negative Kontrollen werden durch Vorenthalten eines jeglichen Ziels oder ECP erreicht. Eine Amplifikation eines ECP wird eine Verifikation der korrekten Zufuhr der korrekten Kitreagenzien zu dem korrekten Platz, d.h. Gefäß, bereitstellen.
  • Reagenzien in einem Kitformat können bei optimalen Konzentrationen und bereit für ein wirksames und automatisiertes Verteilen in eine große Anzahl von Probengefäßen oder Wells formuliert werden. Eine Kitausführungsform kann ein Gemisch eines Satzes von Vorwärtsprimer, reversem Primer und zwei SQP sein. Ein solcher Kit kann spezifisch für eine Amplifikation einer bekannten Allelstelle oder SNP sein. Jede SQP kann ein perfektes Komplement hinsichtlich einer allelischen Form sein.
  • V.7 BEISPIELE
  • Die Erfindung wird durch eine Betrachtung der nachstehenden Beispiele weiter verdeutlicht, die rein beispielhaft für die Erfindung sein sollen und in keiner Weise deren Umfang begrenzen sollen.
  • Beispiel 1 Herstellung von selbstlöschenden Fluoreszenzsonden
  • Selbstlöschende Sonden wurden durch automatisierte Synthese (Modell 394 DNA/RNA Synthesizer, Applied Biosystems) gemäß den allgemeinen Verfahren hergestellt, die in der Gebrauchsanleitung beschrieben sind. Eine 5'-FAM-3'-TAMRA-Sonde kann bei einem 0,2-μmol-Maßstab unter Verwendung von TAMRA-markierten CPG-Festträgern für ein 3'-Markieren (Mullah et al., (1997) Tetrahedron Letters, 38:5751-5754, Mullah et al., (1998) Nucl. Acids Res. 26:1026-1031), dem Satz an Phosphoramiditnukleosiden Abz, Gdmf, Cbz, T, anderen Reagenzien, die vom Hersteller (Applied Biosystems) empfohlen sind, und FAM-Farbstoff-markiertem Phosphoramidit für ein 5'-Markieren (Theisen et al. (1992) „Fluorescent dye phosphoramidite labelling of oligonucleotides", in Nucleic Acid Symposium Series No. 27, Oxford University Press, Oxford, Seiten 99–100) synthetisiert werden. Der Standard-0,2-μmol-Synthesezyklus wurde leicht durch Verlängern der Kopplungszeitspanne von FAM-Amidit um zusätzliche 120 Sekunden modifiziert.
  • Nach Abschluss der Synthese wurden Oligonukleotide, die mit einem an einem 5'-Ende gebundenen Reporter-Farbstoff und einem an einem 3'-Ende gelegenen Löscher markiert waren, von dem Träger auf dem DNA-Synthesizer durch Behandeln mit einem Gemisch aus MeOH:t-BuNH2:H2O (1:1:2) (Woo et al., US-PS 5,231,191) für ein einstündiges automatisches Abspaltungsverfahren automatisch abgespalten, wie in der Gebrauchsanleitung für den Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA-Synthesizer beschrieben. Basenschutzgruppen wurden durch Erhitzen des Gemisches bei 85°C für eine Stunde oder bei 65°C für 3 Stunden entfernt. Die Oligo nukleotide können durch HPLC mit reverser Phase, Anionenaustausch-HPLC, Kapillargelelektrophorese, Polyacrylamidgelelektrophorese und andere herkömmliche Techniken analysiert und aufgereinigt werden (Andrus (1992) in Evaluating and Isolating Synthetic Oligonucleotides, Applied Biosystems, Inc.).
  • Beispiel 2 Allelischer Unterscheidungstest
  • Experimente erfolgten mit dem ABI PRISM® 7700 Sequence Detector bei einem Endreaktionsvolumen von 25 μl pro Probe. Der nachstehende Kit an Reagenzien wurde entwickelt, um 200 Reaktionen von jeweils 50 μl bereitzustellen:
    • • TagMan® Universal PCR Mastermix – insgesamt 5,75 ml, ausreichend für 200 Reaktionen von jeweils 50 μl, mit dem Nachstehenden: Tris-HCl pH-Wert von 8,0, 100 mM, 16% Glycerin, 0,1% Gelatine, 0,02% Tween 20TM, 10 mM MgCl2, 400 μM jeweils von dATP, dCTP, 7-Deaza-dGTP und 800 μM von dUTP, 0,1 U/μl AmpliTaqGold DNA-Polymerase, 0,02 U/μl Amperase UNG und 120 nM passive Referenz (Applied Biosystems)
    • • Sonden- und Primergemisch – insgesamt 3,45 ml, ausreichend für 200 Reaktionen von jeweils 50 μl, mit dem Nachstehenden: Vorwärtsprimer, 20 μM: 5'-CAG TGG TGC CAG CTC AGC A-3' SEQ. ID NO. 1 Reverser Primer, 20 μM: 5'-GGT GAG GCT GTG GCT GAA CA-3' SEQ. ID NO. 2 Selbstlöschende Fluoreszenzsonde 1, 10 μM: 5'-TET-CCA GCA ACC AAT GAT GCC CGT T-TAMRA-3' SEQ. ID NO. 3 Selbstlöschende Fluoreszenzsonde 2, 10 μM: 5'-FAM-CCA GCA AGC ACT GAT GCC TGT TC-TAMRA-3' SEQ. ID NO. 4
    • • ECP1 250 μl (10 fg/μl), ausreichend für 100 Reaktionen: 5' TAG GTG AGG CTG TGG CTG AAC AAT AAC GGG CAT CAT TGG TTG CTG GGC TGC TGA GCT GGC ACC ACT GCC 3' SEQ. ID NO. 5
    • • ECP2 250 μl (10 fg/μl), ausreichend für 100 Reaktionen: 5' TAG GTG AGG CTG TGG CTG AAC AAT GAA CAG GCA TCA GTG CTT GCT GGG CTG CTG AGC TGG CAC CAC TGC C 3' SEQ. ID NO. 6
    • • Genomische Kontroll-DNA 1,0 ml (10 ng/μl), ausreichend für 200 Reaktionen:
    Kontroll- und Probenreaktionen wurden gemäß dem Plattendiagramm von 5 in einer Standard-96-Well-Reaktionsplatte mit den nachstehenden Volumina an Reagenzien hergestellt:
  • Figure 00290001
  • Die Platte der hergestellten Proben wurde thermisch zyklisiert, um eine PCR in einem Thermocycler (GeneAmp PCR System 9600, 9700 und ABI Prism 7700 Sequence Detector, Applied Biosystems) gemäß dem nachstehenden Programm durchzuführen: (a) 2-minütiges Halten bei 50°C, (b) 10-minütiges Halten bei 95°C und (c) 40 Zyklen von 15 Sekunden bei 95°C zum Schmelzen, sodann eine Minute bei 62°C zum Anlagern und Verlängern.
  • Daten wurden durch Echtzeitnachweis auf dem ABI Prism 7700 gesammelt und für jedes Allel normalisiert. Fluoreszenzwerte bei dem Emissionsmaxium für FAM 1 und TET 2 wurden für jede Probe in jedem Well gemessen. Ein Gentypisierungsabruf aus den genomischen Kontroll-DNA-Proben (UNK) erfolgte für Allel 1 (homozygot 1), Allel 2 (homozygot 2) oder Allel 1/2 (heterozygot). Der Fluoreszenzreporterfarbstoff (TET, Emissionsmaximum 538 nm) auf der Probe für das Allel 1 ist von dem Farbstoff (FAM, Emissionsmaximum 518 nm) auf der Sonde für Allel 2 spektral aufgelöst (7).
  • Obwohl lediglich einige Ausführungsformen vorstehend genau beschrieben wurden, wird der Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie eindeutig verstehen, dass viele Modifikationen hinsichtlich der veranschaulichten Ausführungsformen möglich sind, ohne von der Lehre davon abzuweichen. Alle solche Modifikationen sollen innerhalb der nachstehenden Ansprüche umfasst sein.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001

Claims (42)

  1. Verfahren zum Nachweisen einer Zielpolynukleotidsequenz, das die Schritte umfasst: (a) Amplifizieren eines Zielpolynukleotids mit Primerverlängerungsreagenzien in einem ersten Satz von einem oder mehreren Gefäßen und Amplifizieren eines externen Kentrollpolynukleotids mit der Frimerverlängerungsreagenzien in einem zweiten Satz von einem oder mehreren Gefäßen, wobei die Primerverlängerungsreagenzien einen Vorwärtsprimer, einen reversen Primer, eine oder mehrere nachweisbare Sonden, eine Polymerase und ein oder mehrere Nukleotid-5'-triphosphate enthalten, der Vorwärtsprimer und die nachweisbare Sonde um 0 bis 5 Nukleotide getrennt sind, wenn sie an das externe Kontrollpolynukleotid oder sein Komplement hybridisiert sind, und der reverse Primer und die nachweisbare Sonde durch 0 bis 5 Nukleotide getrennt sind, wenn sie an das externe Kontrollpolynukleotid oder sein Komplement hybridisiert sind, das externe Kontrollpolynukleotid ein einzelsträngiges Polynukleotid mit einer Länge von 30 bis 110 Nukleotiden ist und das externe Kontrollpolynukleotid kürzer als das Zielpolynukleotid ist, und (b) Nachweisen eines Signals von der einen oder den mehreren nachweisbaren Sonden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nachweisbare Sonde eine selbstlöschende Fluoreszenzsonde ist, die einen Reporterfarbstoff und einen Löscher umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Polymerase die selbstlöschenden Fluoreszenzsonden während einer Amplifikation spaltet, um den Reporterfarbstoff von dem Löscher zu trennen.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Primerverlängerungsreagenz des zweiten Satzes von Gefäßen eine erste nachweisbare Sonde und eine zweite nachweisbare Sonde umfasst, sich die Sequenz der ersten Sonde von der der zweiten Sonde durch eine oder mehrere Fehlpaarungen, Insertionen oder Deletionen unterscheidet und das Signal der ersten Sonde von dem Signal der zweiten Sonde auflösbar ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Primerverlängerungsreagenz des zweiten Satzes von Gefäßen eine erste selbstlöschende Fluoreszenzsonde und eine zweite selbstlöschende Fluoreszenzsonde umfasst, sich die Sequenz der ersten Sonde von der der zweiten Sonde durch eine oder mehrere Fehlpaarungen, Insertionen oder Deletionen unterscheidet und der Reporterfarbstoff der ersten Sonde von dem Reporterfarbstoff der zweiten Sonde spektral auflösbar ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei sich die Sequenzen der ersten selbstlöschenden Fluoreszenzsonde und zweiten selbstlöschenden Fluoreszenzsonde durch eine einzige Nukleotidfehlpaarung unterscheiden.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner ein Amplifizieren eines zweiten einzelsträngigen externen Kontrollpolynukleotids mit Primerverlängerungsreagenzien in einem dritten Satz von einem oder mehreren Gefäßen umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei sich die Sequenz des ersten einzelsträngigen externen Kontrollpolynukleotids von der des zweiten einzelsträngigen externen Kontrollpolynukleotids durch eine oder mehrere Fehlpaarungen, Insertionen oder Deletionen unterscheidet.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei sich der Sequenzanteil des ersten einzelsträngigen exteren Kontrollpolynukleotids, der komplementär zu einer nachweisbaren Sonde ist, um ein einziges Nukleotid von dem Sequenzanteil des zweiten einzelsträngigen externen Kontrollpolynukleotids, das komplementär zu einer nachweisbaren Sonde ist, unterscheidet.
  10. Verfahren nach Anspruch 7, das ferner einen vierten Satz von einem oder mehreren Gefäßen, die Primerverlängerungsreagenzien enthalten, umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielpolynukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Plasmid, einer cDNA, einem PCR-Produkt, genomischer DNA, einem Restriktionsverdau und einem Ligationsprodukt.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vorwärtsprimer oder der reverse Primer und die nachweisbare Sonde benachbart sind, wenn sie an das einzelsträngige externe Kontrollpolynukleotid oder sein Komplement hybridisiert sind.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das externe Kontrollpolynukleotid oder sein Komplement einzelsträngige Überhänge, die aus 0 bis etwa 10 Nukleotiden bestehen, bildet, wenn es an den Vorwärtsprimer oder an den reversen Primer hybridisiert ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vorwärtsprimer und der reverse Primer jeweils eine Länge von 10 bis 40 Nukleotiden aufweisen.
  15. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die selbstlöschende Fluoreszenzsonde eine Länge von 10 bis 40 Nukleotiden aufweist.
  16. Verfahren nach Ansprach 1, wobei das einzelsträngige externe Kontrollpolynukleotid eine Länge von 50 bis 70 Nukleotiden aufweist.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Fluoreszenzintensitätsveränderung als ein Hinweis auf das Vorhandensein der Zielsequenz nachgewiesen wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Produkte der Nukleinsäureamplifikation des Zielpolynukleotids und des externen Kontrollpolynukleotids durch Endpunktsanalyse nachgewiesen werden.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Produkte der Nukleinsäureamplifikation des Zielpolynukleotids und des externen Kontrollpolynukleotids während einer Echtzeitanalyse nachgewiesen werden.
  20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Produkte der Nukleinsäureamplifikation des Zielpolynukleotids und des externen Kontrollpolynukleotids durch Fluoreszenz nachgewiesen werden.
  21. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäurepolymerase eine thermostabile Polymerase mit einer 5'-Nuklease-Aktivität ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Reporter ein Xanthen-Farbstoff ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Xanthen-Farbstoff ein Fluorescein-Farbstoff ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Fluorescein-Farbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
    Figure 00360001
    worin X eine an die Sonde gebundene Stelle ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Löscher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
    Figure 00370001
    worin X eine Anbindungsstelle an die Sonde ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Reporterfarbstoff von dem Löscher durch mindestens 12 Nukleotide getrennt ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Reporterfarbstoff an das 5'-Ende oder 3'-Ende der selbstlöschenden Fluoreszenzsonde gebunden ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Löscher an das 5'-Ende oder 3'-Ende der selbstlöschenden Fluoreszenzsonde gebunden ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Löscher nicht fluoreszierend ist.
  30. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nachweisbare Sonde mit einem Kleine-Furche-Binder markiert ist.
  31. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die selbstlöschende Fluoreszenzsonde mit einem Kleine-Furche-Binder maskiert ist.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die selbstlöschende Fluoreszenzsonde mit einem Kleine-Furche-Binder an dem 3'-terminalen Nukleotid markiert ist.
  33. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Kleine-Furche-Binder die Struktur:
    Figure 00380001
    aufweist, worin X eine Anbindungsstelle an die Sonde ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein oder mehrere Nukleotid-5'-triphosphate markiert sind.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Löscher, Biotin oder ein Kleine-Furche-Binder ist.
  36. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Gefäße in einer Mikrowell-Schale vorliegen.
  37. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Primerverlängerungsreagenzien den Gefäßen durch Robotermittel zugeführt werden.
  38. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Amplifikation durch einen Thermocycler erfolgt.
  39. Kit an Reagenzien für eine Nukleinsäureamplifikation, der umfasst: ein einzelsträngiges externes Kontrollpolynukleotid mit einer Länge von 30 bis 110 Nukleotiden, einen Vorwärtsprimer, einen reversen Primer, eine Polymerase, eine nachweisbare Sonde, ein oder mehrere Nukleotid-5'-triphosphate und andere Reagenzien, die für eine Nukleinsäureamplifikation erforderlich sind.
  40. Kit nach Anspruch 39, wobei die nachweisbare Sonde eine selbstlöschende Fluoreszenzsonde ist, die einen Reporterfarbstoff und einen Löscher umfasst.
  41. Kit nach Anspruch 39, wobei die Konzentration des Vorwärtsprimers und des reversen Primers etwa 10 bis 100 μM beträgt, die Konzentration jedes Nukleotid-5'-triphosphats etwa 100 bis 1 000 μM beträgt und die Konzentration der selbstlöschenden Fluoreszenzsonde etwa 1 bis 100 μM beträgt.
  42. Kit nach Anspruch 39, der durch Robotermittel einem Gefäß zugeführt wird.
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