DE69919875T2

DE69919875T2 - Methoden für exogene, interne kontrollen während der amplifizierung von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69919875T2
Application number: DE69919875T
Authority: DE
Inventors: Kazuko Aoyagi; J. Kenneth LIVAK
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1999-03-27
Filing date: 1999-03-27
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2019-03-28
Also published as: CA2329061C; CA2329061A1; JP2003508064A; JP3942079B2; DE69919875D1; ATE275208T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Nukleinsäureamplifikation, und insbesondere auf Verfahren interner Kontrollen, die die Ab- oder Anwesenheit spezifischer Zielsequenzen während der Polymerase-Kettenreaktion verifizieren.
LITERATURHINWEISE

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HINTERGRUND
Nukleinsäureamplifikation und insbesondere die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sind zu einem wichtigen Forschungswerkzeug geworden, mit Anwendungen in der Klonierung, der Analyse von Genexpression, der DNA-Sequenzierung, der genetischen Kartierung, der Arzneistoffaufklärung und Ähnlichem (Gilliland et al, 1990; Bevan et al., 1992; Green et al., 1991). Beschreibungen und Anleitungen zur Durchführung der PCR werden in ausführlicher Literatur zum Thema bereitgestellt (Innis et al., 1989; McPherson et al., 1991; McPherson et al., 1995).
Automatisierte Geräte wurden zur Durchführung von Nukleinsäureamplifikationen entwickelt, hauptsächlich Wärmezyklusgeräte zur Durchführung von PCR und Ähnlichem. Wichtige Designziele, die für die Entwicklung von PCR-Geräten grundlegend sind, waren Feinkontrolle von Temperatur, Minimierung von Probe-zu-Probe Variabilität bei hohem Durchsatz, Wärmezyklusbehandlung von Multiplex-Proben, Automatisierung von Prä- und Post-PCR-Arbeitsschritten, Zyklusdurchführung mit hoher Geschwindigkeit, Minimierung von Probenvolumen, Minimierung von Kreuz-Kontamination oder Proben-Übertrag, und Ähnliches.
Insbesondere das Design von Geräten, die die Durchführung und Überwachung von PCR in Echtzeit erlauben, ist wünschenswert. Reaktionskammern, die während der Amplifikation und der Analyse geschlossen bleiben, sind zur Vermeidung von Kreuzkontamination wünschenswert (Higuchi et al., 1992; Higuchi et al., 1993; Holland et al., 1991).
Verfahren, Reagenzien und Reagenzkits, die Multikanal-Pipettierung oder Verteilung mittels Roboter erlauben, sind wünschenswert. Eine begrenzte Zahl von automatisierten Pipettier- und Verteilschritten minimiert Fehler und zweideutige Ergebnisse. Die erfolgreiche Realisierung dieser Designziele wäre insbesondere wünschenswert bei der Analyse diagnostischer Proben, wobei eine hohe Frequenz von Falschpositiven und Falschnegativen den Wert einer auf PCR basierenden Methode ernsthaft reduzieren würde.
Auf Fluoreszenz basierende Ansätze zur Bereitstellung von Echtzeitmessungen von Amplifikationsprodukten während einer PCR (Holland et al., 1991) verwendeten entweder interkalierende Farbstoffe (wie Ethidiumbromid), um die Menge an anwesender doppelsträngiger DNA anzuzeigen (Higuchi 1992; Higuchi, 1993; Gelfand et al., 1993) oder Sonden, die Reporter-Quencher-Paare enthalten („Taqman^®", Exonuklease Test), die während der Amplifikation gespalten werden, um ein Fluoreszenzsignal freizusetzen, das zur Menge der vorhandenen doppelsträngigen DNA proportional ist (Livak 1996). Die Polymerase, die die Primerverlängerung durchführt und die das Polynukleotid amplifiziert, besitzt auch 5'→3' Exonukleaseaktivität, die dazu dient, die Sonde zu spalten. Im Exonuklease-Test werden ein „Reporter"-Farbstoff und ein „Quencher"-Farbstoff an eine Oligonukleotid-Sonde angehängt, die komplementär zur Ziel-DNA ist. Die Farbstoffe werden ausgewählt und arrangiert, um durch einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Prozess (FRET) zu interagieren (Clegg, R., 1992). Der Reporter ist eine lumineszierende Verbindung, die entweder durch chemische Reaktion angeregt werden kann, wodurch Chemilumineszenz erzeugt wird, oder durch Lichtadsorption, wodurch Fluoreszenz erzeugt wird (1). Der Quencher kann mit dem Reporter interagieren, um seine Lichtemission zu verändern, was gewöhnlicherweise zur verminderten Emissionseffizienz des Reporters führt. Dieses Phänomen wird Quenching genannt. Die Effizienz des Quenching ist eine starke Funktion der Distanz zwischen dem Reportermolekül und dem Quenchermolekül. Somit wird in einem Nukleinsäurehybridisierungsassay der Nachweis eines Hybridisierungsereignisses durch Design eines Energietransfersystems erzielt, in dem der Abstand zwischen einem Reporter und einem Quencher als Ergebnis der Hybridisierung wechselt. Zwei Beispiele der Systeme, die den Exonuklease-Test und andere auf Fluoreszenz basierende Arrays zur Quantifizierung durchführen, sind die ABI PRISM^TM 7700 und ABI PRISM^TM 7200 Sequenz-Nachweissysteme (Perkin-Elmer).
Der Exonuklease-Test von Nukleinsäureamplifikation mit Reporter-Quencher-Sonden (Lee et al., 1993; Livak et al., 1995) ermöglicht einen direkten Nachweis von Produkten der Polymerasekettenreaktion (PCR) ohne nachfolgende Probenbearbeitung. Der Quencher wird nach Spaltung aus der engen räumlichen Nähe zum Reporter entlassen, so dass das Signal vom Reporter nicht länger unterdrückt wird. Es kommt zu einem Anstieg der Fluoreszenz, die direkt und proportional mit der Zunahme der Kopien des PCR-Produkts korreliert. Durch Verwendung von Echtzeit- oder Endpunkt-Analyse kann der Nachweis und die Quantifizierung von PCR-Produkten durch Messung der Zunahme der Fluoreszenz von gespaltenen, selbst-quenchenden Fluoreszenzsonden erhalten werden.
Die Freisetzung von Fluoreszenz kann durch Laser-induzierte Fluoreszenz mit einer optischen Faser-Sonde in einer nicht-invasiven, geschlossenen Reaktionskammer nachgewiesen und gemessen werden. Der Test wird mit einer Datenerfassungsroutine mit hohem Durchsatz während des Verlaufs der Wärmezyklen der PCR (Echtzeitanalyse) oder am Ende der PCR (Endpunktanalyse) durchgeführt. Automatisierte Quantifizierung mittels PCR ist sehr wünschenswert. Manuelle Verfahren beruhen auf Endpunkt-Elektrophorese eines Aliquots der PCR und spektroskopischer oder densitometrischer Quantifizierung. Echtzeit-Überwachung der PCR erlaubt eine weit genauere Quantifizierung der Ausgangskonzentrationen der Ziel-DNA in Vielfach-Ziel-Amplifikationen als manuelle Endpunkt-Verfahren. Mit kalibrierten internen Kontrollen können die relativen Werte nahe beieinanderliegender Konzentrationen durch Faktorierung der Geschichte der relativen Konzentrationen während der PCR aufgelöst werden. Echtzeit-Überwachung des Ziels mit internen Kontrollen ist wünschenswert.
Interne und/oder parallele Tests, die die Bedingungen der Amplifikation für das Ziel bestätigen, sind als Kontrolltests wünschenswert. Bei Verwendung in einem Format mit hohem Durchsatz, wie 96-Loch Mikrotiterplattenkonfigurationen, wird die PCR häufig durch Falschpositive aufgrund von Matrizen-Kontamination aus benachbarten Vertiefungen, Pipettierfehler, oder Aerosoltransmission belastet. Zusätzlich leidet die PCR an falschnegativen Ergebnissen, wenn in den Zielproben Enzyminhibitoren anwesend sind oder wenn Reagenzien fehlen oder abgebaut werden. Deshalb sind Kontrollamplifikationstests wünschenswert.
Positive Amplifikationskontrolltests ergeben ein nachweisbares Produkt, abgeleitet von einem Bestandteil, der vom Ziel getrennt und unterschiedlich ist. Nachweis des positiven Kontrollproduktes zeigt, dass die Amplifikation innerhalb der Reaktionskammer fortschreitet. Positive Amplifikationskontrolltests, bei denen kein nachweisbares Produkt aus den Kontrollkomponenten erzeugt wird, weisen auf Bedingungen innerhalb der Reaktionskammer hin, die keine Amplifikation erlauben. US-PS 5,219,727 beschreibt die simultane Amplifikation des Ziel-Nukleinsäuresegments und eines internen Standard-Nukleinsäuresegments zur Bestimmung der Menge eines Zielsäuresegmentes in einer Probe durch Polymerasekettenreaktion. Weiterhin wurde eine interne Kontrolle unter Verwendung der gleichen Primersequenzen wie das Zielamplikon, aber einer anderen internen Sequenz in Gibson et al., (1996), Genome Research 6: 995–1001 beschrieben. Ein weiteres wünschenswertes Ziel der Amplifikationskontrolle besteht darin, das positive Kontrollsignal mit der Zugabe eines negativen Elements oder eines Blockierungselements in andere Reaktionskammern während des Tests abzuschalten, wodurch die Messung von Hintergrund ermöglicht wird.
Interne Amplifikationskontrollen müssen von passiven internen Referenzmolekülen (Livak, WO 97/46708) unterschieden werden, die Signal- und Nachweiskorrekturen erlauben. Passive interne Referenzen, wie nicht-komplementäre, Reporter-Quencher-Moleküle hybridisieren nicht an Ziel- oder andere Polynukleotide, werden nicht verbraucht und wirken nicht als Substrate für Enzyme, und gehen keine irgendwie gearteten chemischen oder enzymatischen Reaktionen ein. Somit stellen passive interne Referenzen keine Verifizierung oder Anzeige von Bedingungen für die Amplifikation innerhalb der Reaktionskammer bereit.
Zusätzlich zu den vorstehend genannten Beschränkungen und Problemen, die mit dem Signal und dem Nachweis assoziiert sind, behandelt eine passive interne Referenz nicht die häufigen Themen wie (i) Kontamination von Ziel- oder anderen Reagenzien mit fremder DNA, (ii) Hemmung der PCR, und (iii) Bestätigung der Amplifikationseffizienz innerhalb der Reaktionskammer. Es werden Reporter-Quencher-Tests mit internen Fluoreszenz-erzeugenden Kontrollen benötigt, um akkurate, präzise und empfindliche Messungen von Veränderungen der Fluoreszenz, die auf die Bildung des Amplifkationsproduktes zurückzuführen sind, bereitzustellen.
Kontrollamplifikationsreaktionen sind nötig zur (i) Normalisierung der Quantifizierungsergebnisse, (ii) zum Nachweis von Amplifikationshemmern in den Ziel- und anderen Reagenzien, und (iii) zur Etablierung von Hintergrundsignal-Konzentrationen. Eine Schwierigkeit besteht darin, zu gewährleisten, dass die Amplifikation des Kontrollpolynukleotids nicht die Amplifikation des Ziels oder den Nachweis des Produktes stört. Interne Kontrollpolynukleotide (ICP) werden innerhalb der gleichen Reaktionskammer wie das bekannte oder unbekannte Zielpolynukleotid amplifiziert, was zur Herstellung der Proben und Messung der Ergebnisse angenehm ist. Das ICP kann endogen, d.h. vom selben Ursprung, Genom, Chromosom, Gen, Plasmid oder Fragment wie das Ziel abstammen. Endogene ICPs unterliegen Amplifikationsinhibitoren und können daher zu einem falsch negativen Signal führen. Endogene ICP können ebenfalls Primingstellen für Zielprimer haben und daher ein falsch positives Signal geben. Endogene ICP Systeme können in der Tat einen oder mehrere Primer mit dem Ziel teilen. Verbrauch von gemeinsamen Primern führt zu ungenauer PCR-Quantifizierung und beschränktem dynamischen Bereich. Eine weitere negative Eigenschaft von endogenen ICP ist die Notwendigkeit, ICP, ICP Primer und ICP selbst-quenchende Sonde für jedes Ziel zu selektieren, zu entwerfen und aufzureinigen, um Kompatibilität und Amplifikation zu gewährleisten. Daher ist ein universelles exogenes ICP, das nicht vom selben Ursprung etc. wie das Ziel abgeleitet ist, wünschenswert, um diese Nachteile zu vermeiden.
Zusätzlich zur positiven Kontrollamplifikation ist es wünschenswert, getrennte, parallele negative Kontrolltests zu haben, um eine Hintergrundsignal-Konzentration für quantitative Systeme wie den Exonuklease-Test zu etablieren. Durch „Abschalten" der Kontrollamplifikation kann die Fluoreszenz der intakten selbst-quenchenden Sonde des ICP überwacht und als Grundwert von Proben abgezogen werden, die eine normale Amplifikation durchlaufen. Frühere Versuche hinsichtlich der Messung von Negativkontroll-Hintergrund umfassten: (i) Deletion essentieller Komponenten der Amplifikation, wie Magnesium, dNTP und Enzym, oder (ii) Zugabe von Amplifikationsinhibitoren wie Natriumdodecylsulfat (SDS) oder EDTA. Alle diese Versuche leiden an dem Nachteil der Veränderung, Störung oder Verschleierung der Erzeugung oder des Nachweises des Fluoreszenz-Signals.
Die meisten Techniken, die zur Isolierung von Gesamt-RNA verwendet werden führen zu RNA, die durch signifikante Mengen genomischer DNA verunreinigt ist (Ambion). Reverse Transkription, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein beliebtes Verfahren zur Analyse von mRNA, die in niedrigen Konzentrationen vorkommt, aus beschränkenden Mengen an Gewebe und für die quantitative Analyse von Genexpression. Da der PCR-Schritt eine exponentielle Amplifikation beinhaltet, können sich kleine Röhrchen-zu-Röhrchen-Variationen der Amplifikationseffizienz in dramatischen Unterschiede im Ertrag des Endprodukts äußern und zu großen Fehlern bei der Abschätzung der anfänglichen Menge führen. Eine häufige Ursache für Bedenken bei Forschern, die quantitative PCR durchführen, besteht in ungenauen Daten, die durch DNA-Kontamination in RNA-Präparationen hervorgerufen werden. PCR kann nicht zwischen cDNA-Zielen unterscheiden, die durch reverse Transkription synthetisiert wurden und zwischen Kontaminationen mit genomischer DNA. Obwohl DNA-Kontamination leicht durch Durchführung einer „no-RT" Negativkontrolle nachgewiesen wird, gibt es keine zufriedenstellende und vollständige Lösung für die Kontamination und Inhibition. Die herkömmlichen Verfahren der RT-PCR quantitativen Analyse (Wang et al., 1989; Tsai et al., 1996; Zimmermann et al., 1996) basieren alle auf Gelen, die auf unpräzisen und subjektiven Techniken zur Sichtbarmachung beruhen.
Angesichts der Beschränkungen und Defizienzen herkömmlicher Kontrollen zur Quantifizierung und zum Nachweis von Nukleinsäureamplifikationsprodukten, ist es von Interesse, nicht auf Gel basierende interne Kontrollverfahren zu entwickeln, die sowohl negative als auch positive Anzeichen für Amplifikation bereitstellen. Die hier beschriebene Offenbarung stellt solche internen Kontrollreagenzien, Kits und Verfahren bereit.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegender Erfindung ist auf neue Verfahren und auf einen Kit von Reagenzien zur Quantifizierung von Nukleinsäureamplifikation von Kontroll-DNA in Anwesenheit von, und gleichzeitig mit Nukleinsäureamplifikation von bekannten und unbekannten Ziel-DNAs gerichtet.
Es ist ein Ziel bestimmter Ausführungsformen der Erfindung, Verfahren zur Durchführung von Nukleinsäureamplifikationsreaktionen in einer einzelnen Reaktionskammer bereitzustellen, wobei interne Kontrollprimer an ein internes Kontrollpolynukleotid hybridisieren und Zielprimer an ein Zielpolynukleotid hybridisieren, und wobei die Amplifikation durch Polymerase-Kettenverlängerung, Wärmeschmelzen und Hybridisierung erfolgt. Interne Kontrollpolynukleotide bestehen aus DNA oder RNA und sind nicht sequenzhomolog zu Zielpolynukleotiden. Interne Kontrollpolynukleotide erlauben keine Amplifikation durch Zielprimer oder Hybridisierung mit Zielsonden. Das Amplifikationsprodukt, dass aus der Amplifikation des internen Kontrollpolynukleotids mit internen Kontrollpolynukleotiden resultiert, wird typischerweise 50–500 by lang sein. Das Amplikon wird eine interne Stelle enthalten, die für die Hybridisierung der internen Kontrollsonde komplementär ist. Ein internes Kontrollpolynukleotid, dass aus RNA besteht, kann ein Substrat für die reverse Transkriptase sein und führt zur Herstellung einer cDNA Kopie.
Es ist ein weiteres Ziel bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung, interne Kontrollreagenzien und Verfahren bereitzustellen, die die Anwesenheit von PCR-Inhibitoren in dem Ziel und in anderen Komponenten des PCR-Gemisches nachweisen. Die internen Kontrollen haben die Eigenschaft, leicht zu verteilen zu sein, d.h. ein Minimum von Pipettiervorgängen und die Möglichkeit zur Automation durch Roboter im herkömmlichen 96-Loch Mikrotiterplattenformat. Die internen Kontrollreagenzien sollten die PCR-Amplifikationseffizienz des Zielpolynukleotids nicht vermindern. Sowohl negative als auch positive Kontrollsignale sollten unterscheidbare und operative Ergebnisse ergeben. Ein positives internes Kontrollsignal kann ein wahres negatives Zielsignal von einem falsch negativen Signal unterscheiden. Die Messung eines negativen internen Kontrollsignals ergibt den Hintergrund, der von dem positiven internen Kontrollsignal abgezogen wird. Die Fluoreszenz des Reporters auf der internen Kontrollsonde wird gemessen, um die Reaktion hinsichtlich von solchen Amplifikationsfaktoren zu normalisieren, die von Reaktion zu Reaktion variieren. Somit werden durch Untersuchung des Fluoreszenzsignals von der internen Kontrollsonde die Auswirkungen der meisten Quellen der Hemmung von PCR identifiziert.
Reporter-Quencher-Tests, einschließlich der vorliegenden internen Kontrollreagenzien können zusammen mit einer Vielzahl von Systemen zur Nukleinsäureamplifikation verwendet werden. Im allgemeinen erfordern die Tests entweder die Verwendung einer Nukleinsäurepolymerase mit Exonuklease-Aktivität oder eine Population doppelsträngiger DNA, die sich während des Verlaufs der überwachten Reaktion steigert. Beispielhafte Amplifikationsschemata, die mit dem erfindungsgemäßen System verwendet werden können PCR, auf Ligase basierende Amplifikationsschemata, wie Ligase-Kettenreaktion, LCR (Barany, 1991), Q-beta Replicase-basierte Amplifikationsschemata, Strang-Verdrängungs-Amplifikationsschemata (SDA) (Walker et al., 1992, Keller, 1993) umfassen.
Ein exogenes ICP wird so ausgewählt und entworfen, dass es keine Sequenzhomologie mit irgendeinem bekannten Ziel nach Inspektion von Sequenzdatenbanken hat. Das exogene ICP ist DNA oder RNA mit einer Länge von 50–500 bp. Das exogene ICP wird zum Amplifikations-Reagenzkit zugegeben, zusammen mit ICP Primern und selbst-quenchender Sonde, in bekannten Mengen, die konsistent eine bekannte Menge eines Fluoreszenzsignals erzeugen. Das exogene ICP kann Amplifikationsbedingungen innerhalb einer Reaktionskammer verifizieren, um ein wahres Negativsignal für die Anwesenheit von Ziel-DNA zu etablieren.
Es ist ein weiteres Ziel bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung, selbst-quenchende Fluoreszenzsonden mit verschiedenen und nicht-homologen Sequenzen für die Hybridisierung an interne Teile der Ziel- und Kontrollpolynukleotide bereitzustellen. Da das interne Kontrollpolynukleotid (ICP) dazu entworfen oder ausgewählt ist, minimale Homologie mit irgendeinem bekannten Zielpolynukleotid zu haben, wird die interne Kontrollsonde nur an das ICP und nicht an das Zielpolynukleotid hybridisieren. Selbst-quenchende Sonden existieren in wenigstens einer einzelsträngigen Konformation in unhybridisierter Form, so dass der Quencher-Farbstoff die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs quencht. Bei Hybridisierung an Polynukleotide kommen die Sonden in wenigstens einer Konformation vor, wobei die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs nicht gequencht ist und die Fluoreszenzintensität des Reporterfarbstoffs größer ist als die Fluoreszenzintensität des Quencher-Farbstoffs, wenn die Sonde an Polynukleotid hybridisiert ist. Nukleinsäurepolymerase kann die Sonden während der Amplifikation im wesentlichen verdauen, um den Reporterfarbstoff von dem Quencherfarbstoff zu trennen. Fluoreszenz vom gespaltenen Reporterfarbstoff entspricht dem Auftreten einer Nukleinsäureamplifikation. Fluoreszenz kann auch basierend auf der Hybridisierung der Sonde an komplementäres Ziel oder ICP auftreten. Die Ziel- und internen Kontrollsonden sind mit unterschiedlichen und spektral auftrennbaren Reporterresten markiert, wenn sie in der gleichen Reaktionskammer verwendet werden. Die jeweiligen Emissionsspektren von den Reporterresten innerhalb einer Reaktionskammer müssen ausreichend nicht-überlappend sein, so dass getrennte Emissionsbeiträge aufgelöst werden können. Die getrennten Peaks können quantifiziert, mit den relativen Mengen der Amplifikationsprodukte in Korrelation gebracht werden, d.h., mit Ziel- und internen Kontrollpolynukleotiden.
Es ist klar, dass das System generalisiert werden kann, um eine Vielzahl von Fluoreszenzreportern zu umfassen, z.B. zur Überwachung der gleichzeitigen Amplifikation von mehreren Zielnukleinsäuren in einer einzelnen Reaktion, so dass eine Vielzahl von Fluoreszenz-Intensitätsverhältnissen überwacht wird. Solche Multi-Reportersysteme sind vorteilhaft in Anwendungen, die die Analyse multipler Amplifikationen, die in einer einzelnen Reaktionskammer auftreten, erfordern. In solchen Systemen erzeugt jedes der Reportermoleküle Emissionen, die von den Emissionen der anderen Reporter spektral abtrennbar sind. Der jeweilige Quencher, der mit jedem Reporter verwendet wird, kann der selbe oder unterschiedlich sein, abhängig von den Spektraleigenschaften des Quencher und Reporters. Mehrere spektral auftrennbare Farbstoffe, die zur Verwendung in solchen Ausführungsformen geeignet sind, sind in Fung et al., Menchen et al., Bergot et al., und ähnlichen Referenzen offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform der selbst-quenchenden Fluoreszenzsonde wird der Reporterfarbstoff vom Quencherfarbstoff durch wenigstens 12 Nukleotide getrennt, der Reporterfarbstoff ist an den 5'- oder 3'- Terminus der selbst-quenchenden Fluoreszenzsonde angeheftet, und der Quencherfarbstoff ist an den 5'-Terminus oder 3'- Terminus angeheftet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine erste selbst-quenchende Fluoreszenzsonde komplementär zum ersten internen Kontrollpolynukleotid und eine zweite selbst-quenchende Fluoreszenzsonde ist komplementär zum Zielpolynukleotid. Zusätzlich ist der Reporterfarbstoff der ersten selbst-quenchenden Fluoreszenzsonde spektral abtrennbar von der zweiten selbst-quenchenden Fluoreszenzsonde. Vorzugsweise wird in dieser Ausführungsform ein Anregungsstrahl von der 488 nm Anregungslinie eines Argon-Ionenlaser zur Induktion der Fluoreszenz in dem Reporterfarbstoff erzeugt. Fluoreszenzemission von den Reportern und Quenchern kann von 500 bis 650 nm nachgewiesen werden. Fluorophore in einer Reaktionskammer können unterschieden werden, wenn die Emissionsmaxima ausreichend unterschiedlich sind und die Emissionsbandbreite ausreichend eng sind.
Bevorzugte Ausführungsformern der Reporterreste sind Fluoresceinfarbstoffe mit der nachgestehend genannten allgemeinen Struktur und dem Nummerierungssystem, wobei L ein Linker ist.
Bevorzugte Ausführungsformern der Fluorescein-Reporterfarbstoffe sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 5-Carboxyfluorescein (5-FAM), 6-Carbocyfluorescein (6-FAM), 2',4'-1,4,-Tetrachlor, 5/6-carboxyfluorescein (TET), 2',4',5',7',1,4-hexachlor, 5/6-carboxyfluorescein (HEX) und 2',7'-dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyrhodamin (JOE) (2). Andere Ausführungsformen der Reporterreste sind Cyaninfarbstoffe, Dansylderivate und Ähnliche.
Bevorzugte Ausführungsformen der Quencherreste sind; (i) Rhodaminfarbstoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA) und Tetrapropan-6-carboxyrhodamin (ROX) und (ii) DABSYL, DABCYL, Cyanin, Anthroquinon, Nitrothiazol und Nitroimidazol-Verbindungen und Ähnliches (3). Rhodaminfarbstoffe können die nachstehend genannte allgemeine Struktur und das Nummerierungssystem aufweisen, wobei L ein Linker ist.
Fluoreszein- und Rhodaminderivate können an einer oder mehrerer der vorstehend nummerierten Positionen substituiert sein.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, ein Oligonukleotid oder Nukleinsäureanalog bereitzustellen, das hier als „Block" bezeichnet wird, das zum ICP komplementär ist und während der Nukleinsäureamplifikation nicht verlängerbar ist. Der Block kann an irgendeinen Teil des ICP mit einer identischen oder größeren Affinität als die internen Kontrollprimer hybridisieren und kann die Amplifikation des ICP verhindern. Zugabe des Block zu PCR wird ein negatives Ergebnis der internen Kontrolle erzeugen. Es wird kein Amplifikationsprodukt des ICP entstehen, wie durch ein Fehlen oder nur minimalen Hintergrund an Fluoreszenz von der internen Kontrollsonde nachgewiesen wird. Fluoreszenz von der internen Kontrollsonde wird am Emissionsmaximum gemessen, z.B. zwischen 500–650 nm des internen Kontrollreporters. Der Reporter auf der Zielsonde wird so ausgewählt, dass er mit dem Reporter der internen Kontrollsonde nur geringe oder keine spektrale Überlappung hat. Deshalb kann der Reporter auf der Zielsonde unabhängig von und gleichzeitig mit dem Reporter auf der internen Kontrollsonde innerhalb einer einzelnen Reaktionskammer gemessen werden.
Der Block kann aus Modifikation an der Internukleotidverknüpfung, dem Zucker, oder den Nukleobaseresten eines DNA-Primer bestehen, die ihn nicht-verlängerbar machen. Ein Beispiel einer geeigneten Modifikation ist eine 3'-Phosphatgruppe. Analoga von DNA können als Block verwendet werden, wie 2-Aminoethylglycin, Peptid-Nukleinsäure (PNA) und andere Amid-gekoppelten Oligomere; 2'-O-Methyl- und andere 2'-O-Alkyl Oligoribonukleotide; Phosphorthioat und andere Phosphatanaloga; und Ähnliche. Der Block wird nach mehreren Eigenschaften ausgewählt, einschließlich (i) hohe Spezifität, (ii) hohe Affinität, (iii) nicht-Verlängerbarkeit, (iv) chemische Stabilität, (v) keine Störung der Amplifikation. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Block ein PNA (Peptid-Nukleinsäure) Oligomer (Nielsen, P.E. et al.). Zur Verbesserung der Löslichkeit und niedriger Aggregationseffekte kann der PNA-Block an hydrophile Markierungen gekoppelt sein, wie Polyethylenoxy, Peptide, Nukleinsäuren, Nukleinsäureanaloga und Ähnliche.
PNA wurde in der PCR als ein „Klammerelement" für die Einzel-Basenpaar-Mutationsanalyse (Orum et al.) verwendet. In diesem Bericht unterdrückt PNA die Amplifikation von komplementären Zielsequenzen, die typischerweise Wildtyp sind, und ermöglicht die selektive Amplifikation von Zielsequenzen in geringer Kopiezahl oder von mutierten Zielsequenzen mit kompetitierenden DNA-Primern.
Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Verfahren für Endpunkt- und Echtzeit-Messungen der Bildung des Amplifikationsprodukts. In dem Endpunkt-Modus wird die Fluoreszenzmessung durchgeführt, nachdem die Amplifikationsreaktion abgeschlossen ist, d.h., nachdem alle oder im wesentlich alle Amplifikationszyklen der PCR abgeschlossen wurden. Im Echtzeit-Modus werden die Fluoreszenzmessungen mehrere Male während der Amplifikationsreaktion durchgeführt, d.h. nach jedem Wärmezyklus eines PCR-Prozesses. Der Echtzeit-Modus wird bevorzugt, wenn ein quantitatives Maß der anfänglichen Menge an Zielnukleinsäure erforderlich ist, z.B. die Kopiezahl einer Nukleinsäure eines Pathogens, die in einer Blutprobe anwesend ist.
Fluoreszenzmessungen können dazu verwendet werden, die Funktionsfähigkeit der PCR in dem Zielgefäß zu verifizieren. Die Verwendung erfindungsgemäßer interner Kontrollreagenzien erlaubt die Zuordnung eines nahezu den Wert „Null" betragenden Hintergrundlevels an Fluoreszenz für Test mit hoher Sensitivität, z.B. Gene in niedriger Kopiezahl oder seltene Gene. Die Verwendung interner Kontrollreagenzien ermöglicht die gleichzeitige Verwendung multipler Reporter-Quencher-Sonden in Reporter-Quencher-Sondentests.
Es ist ein Ziel der Offenbarung, ein Verfahren für die akkurate Echtzeitüberwachung von Nukleinsäureamplifikationsreaktionen bereitzustellen durch Bereitstellung einer Vorrichtung und von Fluoreszenzreagenzien zur Erzeugung eines stabilen Fluoreszenzsignals, das proportional zur Menge des Amplifikationsproduktes ist. Die Erhältlichkeit von Daten, die den Fortschritt der Amplifikationsreaktionen zeigen, führt zu genaueren Abschätzungen von relativen Ausgangskonzentrationen von Zielnukleinsäuren, zur schneller Bewertung der Wirksamkeit der Amplifikationsreaktionen, und eröffnet die Möglichkeit der Verwendung von weniger Reagenz und Feedback-Reaktionskontrolle.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Kit bereitzustellen, das aus Reagenzien besteht, die für Nukleinsäureamplifikationsreaktionen benötigt werden, zur Durchführung der erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren. Kits machen die Umsetzung der beanspruchten Verfahren reproduzierbarer und leichter durchführbar. Kits können Reagenzien und vorab abgemessene Mengen liefern, um die Durchführung des jeweiligen Verfahrens zu erleichtern. Weiterhin enthalten Kits typischerweise ausführliche Anweisungen zur Durchführung des erfindungsgemäßem Verfahren. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der Kit ein internes Kontrollpolynukleotid, interne Kontrollprimer, ein nicht verlängerbares Polynukleotid, Zielprimer, eine Nukleinsäurepolymerase mit 5'→3' Nuklease-Aktivität, selbst-quenchende Fluoreszenzsonden einschließlich Reporter- und Quencherresten, Nukleotid 5'-Triphosphate. Die erfindungsgemäßen Kits können weiterhin zusätzliche Reagenzien umfassen, die zur Durchführung der betreffenden Verfahren nötig sind, wobei solche Reagenzien in nicht beschränkender Weise Uracil-N-Glykosylase (UNG), Puffer, Molekulargewichtsmarker, Wachskügelchen und Ähnliches umfassen.
Es ist ein Ziel, die Verfahren der Offenbarung dazu zu verwenden, die Nachweis- und Signalkalibrierung zum Zeitpunkt der Probenextraktion, Isolierung oder Aufreinigung zu erproben. Zu diesem Zweck können interne Kontrollreagenzien, die ICP, interne Kontrollprimer und Sonde umfassen, den Roh-Probenzubereitungen zugegeben werden.
Es ist ein Ziel, die Verfahren der Offenbarung bei reverse Transkriptase/PCR an mRNA-Proben, insbesondere für Gene in niedriger Kopiezahl anzuwenden.
Es ist ein Ziel, die Verfahren der Offenbarung auf die Allelunterscheidung von polymorphen Proben anzuwenden. Variationen eines Gens können auf der Basis von Einzel-Basenpaarenunterscheidungen von vererbten Allelen durch den Exonuklease-Test (Lee et al., 1993) unterschieden werden.
Es ist ein Ziel, die Verfahren der Offenbarung auf plus/minus zielspezifische Tests für den Nachweis von Pathogenen zu verwenden, wobei ein Paar, oder eine begrenzte Vielzahl von Paaren von Primern und eine einzelne Reporter-Quencher-Sonde Bestandteile eines Amplifikationskits sind. Der Kit enthält auch die internen Kontrollreagenzien und andere Komponenten, die für die Amplifikation nötig sind. Gemessene Aliquots aus dem Kit können mit hohem Durchsatz oder auf automatisierte Weise in Positionen in einer räumlich addressierbaren Testhalterund gegeben werden. Positionen können Vertiefungen, Stellen oder Oberflächenarrays sein. Die bevorzugte Ausführungsform der Positionen sind Vertiefungen in einem Mikrotitervertiefungstablett. Die typische Positionsdichte sind 96 Vertiefungen in einer 8 × 12 Konfiguration von Vertiefungen, die den industriell akzeptierbaren Standards genügen. Materialien für die Positionen können polymerisch, metallisch, glas oder keramisch sein. Zielproben können mit hohem Durchsatz oder in automatisierter Weise auf die Positionen aufgetragen werden, bevor oder nachdem die Bestandteile des Kits zugegeben werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 Exonuklease-Test Zielpolynukleotid mit selbst-quenchender Sonde
2 Fluorescein-Reporter-Strukturen: FAM, TET, HEX, JOE
3 Quencher-Strukturen: TAMRA, ROX, DABCYL, DABSYL
4 Exonuklease-Test von internem Kontrollpolynukleotid; positive und negative Kontrollaspekte
5 Aufstellung von Spektraleigenschaften von Reporter und Quencher: Emissions- und Absorptionsmaxima
6 Struktur der selbst-quenchenden Sonde: 5' FAM Reporter und 3' TAMRA Quencher
7 Exonuklease-Test-Ergebnisse und Probenzuordnung in 96-Lochformat, mit internen negativen (A1–A6) und positiven (A7–A12) Kontrollvertiefungen.
8 Nachweis von E. coli 0157:H7. Ergebnisse des Exonuklease-Tests aus Beispiel 4.
9 Nachweis von DNA von Mycoplasma synoviae. Ergebnisse des Exonuklease-Tests aus Beispiel 5.

• Vertiefung: Position im 96-Loch-Format (7)
• Typ: NAC – keine Amplifikationskontrolle, NTC – keine Matrizenkontrolle, unbekannt
• Probe: Zielkopiezahl nach Verdünnung, oder negativ
• PCR: positive (+) oder negative (–) Ergebnisse
• Rn: Reporter minus NTC (A7–A12)
• Ct: Schwellenzykluszahl; PCR-Zykluszahl, bei der die Fluoreszenz vom Hintergrund unterscheidbar ist

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es wird nun Bezug genommen auf die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Beispiele davon werden in den begleitenden Zeichnungen veranschaulicht.
I. DEFINITIONEN
Die folgenden Begriffe und Ausdrücke haben die folgende Bedeutung, außer ausdrücklich anders angegeben:
„Polynukleotid" oder „Oligonukleotid" beziehen sich auf lineare Polymere von natürlichen Nukleotidmonomeren oder Analoga davon, einschließlich doppel- und einzelsträngigen Desoxyribonukleotiden „DNA", Ribonukleotiden (RNA), α-anomeren Formen davon und Ähnliches. In anderen Worten, ein „Oligonukleotid" ist eine Kette von Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden, die die strukturellen Einheiten darstellen, die Desoxyribonukleinsäure (DNA) bzw. Ribonukleinsäure (RNA) umfassen.
Ein „Nukleotid" ist eine Monomereinheit in Biopolymer-Nukleinsäuren wie DNA oder RNA. Ein Nukleotid besteht aus drei Resten: Zucker, Phosphat und Nukleobase (Blackburn, M., 1996). Sind sie Teil einer Duplex, dann werden Nukleotide auch als „Basen" oder „Basenpaare" bezeichnet. Die gewöhnlichsten natürlicherweise auftretenden Nukleobasen, Adenin (A), Guanin (G), Uracil (U), Cytosin (C) und Thymin (T) tragen die Wasserstoffbrücken-bildende Funktionalität, die einen Nukleinsäurestrang in sequenz-spezifischer Weise an einen anderen bindet. „Nukleosid" bezeichnet ein Nukleotid, dem ein Phosphatfarbstoff fehlt. Gewöhnlich sind die Nukleosidmonomere durch Phosphodiesterverknüpfungen verbunden, wobei sich hier der Begriff „Phosphodiesterverknüpfung" auf Phosphodiesterbindungen oder Bindungen bezieht, der Phosphatanaloga davon einschließt, einschließlich assoziierten Gegenionen, z.B., H+, NH₄+, Na+ und Ähnliche. Polynukleotide sind typischerweise von einigen monomeren Einheiten, z.B. 8–40 bis zu mehreren tausend monomeren Einheiten groß. Die meisten Anwendungen in der Molekularbiologie für Polynukleotide erfordern einzelne Sequenzen von 15–30 Nukleotiden Länge. Wann immer ein Polynukleotid durch eine Abfolge von Buchstaben dargestellt ist, wie z.B. „ATGCCTG", so ist dies so zu verstehen, das die Nukleotide von links nach rechts in 5'→3'-Richtung vorliegen und dass „A" für Desoxyadenosin, „C" für Desoxycytosin, „G" für Desoxyguanosin und „T" für Thymidin steht, sofern nichts anderes angegeben ist.
„Watson-Crick-Basenpaarung" und „Watson-Crick Komplementarität" beziehen sich auf das Muster spezifischer Paare von Nukleotiden, und Analoga davon, die durch Wasserstoffbindungen aneinander binden, z.B. paart A mit T und U, und G paart mit C.
„Oligonukleotidanaloga" sind polymere Analoga von DNA und RNA, die durch chemische Synthese aus monomeren Nukleotidanaloga-Einheiten hergestellt werden, und besitzen einige der Qualitäten und Eigenschaften, die mit Nukleinsäuren assoziiert werden.
„Anheftungsstelle" bezieht sich auf das Atom auf einem Oligonukleotid, an das der Linker angeheftet ist.
„Linker" bezieht sich auf ein oder mehrere Atome, die eine Kette umfassen, die ein Oligonukleotid und eine Markierung verbinden.
Der hier verwendete Begriff „Chimäre" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, einschließlich eines oder mehrere Nukleotide und eine oder mehrere Nukleotidanaloga-Einheiten. Die Monomer-Einheiten sind durch Phosphodiester- und Phosphodiesteranalog-Verknüpfungen gekoppelt.
„Phosphodiesteranalog" bezieht sich auf Analoga natürlicher Phosphodiester-3',5'-Internukleotidverknüpfungen, die sich in ihrer Zusammensetzung und/oder der Position der Anheftung an ein Nukleotid unterscheiden, die in nicht beschränkender Weise 2',5'-Verknüpfung, 3',3'-Verknüpfung, 5',5'-Verknüpfung, Methylphosphonat, alkylierten Phosphotriester, 3'-N-Phosphoramidat und PNA einschließen.
„Niederalkyl", „Niederalkylen", und „substituiertes Niederalkylen" bezieht sich auf geradkettige, verzweigte oder zyklische Gruppen bestehend aus 1–12 Kohlenstoffatomen.
„Markierung" bezieht sich auf eine Gruppe, die an einen oder beiden Enden des Nukleobasenoligomers kovalent angeheftet ist. Die Markierung kann eine Funktion haben, wie das Geben eines Signals zum Nachweis des Moleküls durch solche Mittel wie Fluoreszenz, Chemilumineszenz und elektrochemische Lumineszenz (Kricka, L.). Alternativ dazu ermöglicht die Markierung die Trennung oder Immobilisierung des Moleküls durch eine spezifische oder unspezifische Capture-Methode (Andrus, A. 1995).
„Energietransfer" und „Fluoreszenz-Quenching" beziehen sich auf einen Vorgang, wobei Energie von einem elektronisch angeregten lumineszierenden „Reporter"-Molekül durch ein „Quencher"-Molekül entfernt wird, wobei das Reportermolekül in seinen ursprünglichen Zustand zurückversetzt wird, ohne Lichtemission vom Reportermolekül. Das Reportermolekül kann durch eine Vielzahl von Vorgängen, Lichtadsorption und chemische Reaktion eingeschlossen, auf eine seiner höheren Energiestufen angeregt werden.
„Spektrale Auflösung" und „spektral auflösbar", bezogen auf eine Vielzahl von Farbstoffen bedeutet, dass die Fluoreszenzemissionen der Farbstoffe ausreichend unterschiedlich sind, d.h. ausreichend nicht-überlappend, so dass Reagenzien, an die die jeweiligen Farbstoffe angeheftet sind, z.B. Polynukleotide, auf Basis ein Fluoreszenzsignals, das durch die jeweiligen Farbstoffe erzeugt wird, mit üblichen Photo-Nachweissystemen aufgelöst werden können.
„Nachweis" bezieht sich auf das Nachweisen, Beobachten oder Messen eines Nukleobasen-Oligomers auf Basis der Eigenschaften einer kovalent angehefteten Nachweismarkierung. Nachweismarkierungen umfassen in nicht beschränkender Weise Fluoreszenzfarbstoffe, wie Fluoreszein und Rhodaminderivate, Cyanin-Farbstoffe, und Energietransfer-Farbstoffe (Clegg, R., 1992; Cardullo, 1988).
„Primer" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, das selektiv an eine spezifische Zielnukleinsäure anlagern kann und danach als Startpunkt für eine Primerverlängerungsreaktion dienen kann, wobei der Primer in einer 5'→3'-Richtung verlängert wird.
„Primerverlängerungsreaktion" bezieht sich auf eine Reaktion zwischen einer Ziel/Primer-Duplex und einem Nukleotid, die in der Addition eines Nukleotids an ein 3'-Ende des Primers resultiert, so dass das hinzugefügte Nukleotid komplementär zum entsprechenden Nukleotid der Zielnukleinsäure ist.
Der Begriff „5'→3' Nuklease-Aktivität" bezieht sich auf eine Enzymaktivität, die Nukleinsäuren an Phosphodiester-Brücken spaltet. Diese Aktivität kann entweder endo (spaltet an internen Phosphodiester-Brücken) oder exo (spaltet an der Phosphodiester-Brücke, die am nächsten entweder zum 5' oder 3'-Ende des Nukleinsäurestrangs ist) sein.
Der Begriff „Block" bezieht sich auf ein nicht-verlängerbares Oligonukleotid oder Nukleinsäureanalog, das zum internen Kontrollpolynukleotid komplementär ist. Ein Block führt keine Polymerisation oder Verlängerung auf normale Weise durch Verlängerung des 3'-Ende eines DNA-Primers mit Polymerase und Desoxynukleotid-5'-Triphosphaten durch. Ein Block funktioniert als negatives Kontrollelement, und schaltet im wesentlichen die Amplifikation des internen Kontrollpolynukleotids ab, wodurch eine Zunahme der Fluoreszenz, die von der internen Kontrollsonde abgeleitet ist, verhindert wird.
Der Begriff „selbst-quenching" bezieht sich auf einen intermolekularen Energietransfereffekt, z.B. ein Reporter und ein Quencher sind auf einem Oligonukleotid in einer Konfiguration verbunden, die Energietransfer von dem Fluorophor auf den Quencher ermöglicht.
Der Begriff „Endpunkt-Analyse" bezieht sich auf einen Test, an dem Datenerfassung nur auftritt, wenn die Reaktion abgeschlossen ist. Endpunkt-Analyse des Exonuklease-Test zieht eine Messung des Reportersignals nach sich, wenn die PCR abgeschlossen ist. Die Ergebnisse werden in Form der Veränderung der Fluoreszenz des Reportersignals wiedergegeben, abzüglich der Veränderung in der Fluoreszenz der internen Kontrollamplifikation.
Der Begriff „Echtzeit-Analyse" bezieht sich auf das periodische Überwachen während eines Tests. Echtzeit-Analyse des Exonuklease-Test misst die Veränderungen des Reportersignals von Zyklus zu Zyklus, abzüglich der Veränderung der Fluoreszenz der internen Kontrollamplifikation.
II. EXONUKLEASE-TEST MIT INTERNEM KONTROLLPOLYNUKLEOTID UND BLOCK
Der TaqMan^® Exonuklease-Test (Holland et al., 1991, Lee et al., Livak, 1996), dargestellt in 1 zeigt eine selbst-quenchende Sonde 1, einschließlich sowohl eine Reportermarkierung, F₁, und eine Quencher-Markierung, Q, und Zielprimer 3a und 3b, die an das Zielpolynukleotid 2 hybridisiert sind. Während der Polymerisierungsphase der Amplifikation werden die Primer 3a und 3b dann mit einem Polymerase-Enzym verlängert, wodurch die verlängerten Primer 4a und 4b gebildet werden, z.B. durch die Verwendung einer DNA-Polymerase. Während der Primer-Verlängerungsreaktion dient eine 5'→3' Nuklease-Aktivität der Polymerase dazu, die Sonde 1 zu schneiden, um Sondenfragmente zu bilden, einschließlich das Reporter-tragende Fragment 5 und das Quencher-tragende Fragment 6.
Somit werden die Reporter- und Quencher-Markierungen getrennt, wodurch Energietransfer zwischen den beiden verhindert wird, und die Emission des Reporters wird nach Verdau der Sonde nicht mehr gequencht. Es kommt zu einem Anstieg der Fluoreszenz, nachweisbar als F₁.
Wenn die internen Kontrollreagenzien und das erfindungsgemäße Verfahren während des Exonuklease-Test durchgeführt werden, dann werden zusätzlich Reagenzien in die Reaktionskammer gegeben, einschließlich selbst-quenchende Sonde 7 und Primer 8a und 8b, die zum internen Kontrollpolynukleotid 9 (4) komplementär sind. Während der Polymerisationsphase der Amplifikation werden die Primer 8a und 8b dann durch ein Polymerase-Enzym verlängert, wodurch verlängerte Primer gebildet werden; unter Verwendung einer DNA Polymerase. Während der Primer- Verlängerungsreaktion dient eine 5'→3' Nuklease-Aktivität der Polymerase dazu, die Sonde 7 zu schneiden, um Sondenfragmente zu bilden, einschließlich das Reportertragende Fragment 10 und das Quencher-tragende Fragment 11. Somit werden die Reporter- und Quencher-Markierungen getrennt, wodurch Energietransfer zwischen den beiden verhindert wird, und die Emission des Reporters wird nach Verdau der Sonde nicht mehr gequencht. Es kommt zu einem Anstieg der Fluoreszenz, nachweisbar als Fa. Die Reporterfarbstoffe F₁ und F₂ werden so ausgewählt, dass sie spektral auflösbar sind. Quencher-Reste auf 1 und 7 können gleich oder unterschiedlich sein.
Wenn der negative interne Kontrollblock 12 zugegeben wird, dann kommt es zu keiner Amplifikation des internen Kontrollpolynukleotids 9. Der nicht-verlängerbare Block 12 bindet selektiv an die Primer-Bindestelle 8a, oder an eine andere Stelle auf 9, und verhindert die Amplifikation. Die selbst-quenchende Sonde 7 bleibt intakt und gequencht. Eine negative Kontroll-Basislinie kann gemessen werden und auf positive Veränderungen der Kontrollfluoreszenz angewandt werden.
III. DESIGN UND SYNTHESE DER REAGENZIEN
Im allgemeinen folgt das Design und die Synthese von erfindungsgemäßen Oligonukleotiden herkömmlichen Lehren. Vorzugsweise werden Oligonukleotide in einem automatisierten Festphase-DNA-Synthesegerät mit Phosphoamidit-Chemie synthetisiert (Beaucage et al., 1992; Caruthers, 1983), z.B. ein Modell 392 oder 394 DNA-Synthesegerät (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).
a. Selbst-quenchende Sonden
Beim Design von selbst-quenchenden Sonden kann man den folgenden allgemeinen Richtlinien folgen: (1) wenn die Zielnukleinsäure innerhalb eines PCR-Amplikons lokalisiert ist, sollte die Sondensequenz so sein, dass die Sonde an eine Stelle auf der Sequenz innerhalb der PCR-Primer bindet; (2) Sonden sollten etwa 20–30 Nukleotide lang sein, so dass gute Hybridisierungskinetiken und Bindungsspezifität gewährleistet werden; (3) Sekundärstruktur in der Sonde und in der Nukleinsäuresequenz des Ziels sollte vermieden werden: (4) die Sonde sollte an keinen der vorwärts- und reversen Primer hybridisieren; und (5) Proben mit langen Abschnitten eines einzelnen Nukleotids sollten vermieden werden, d.h., mehr als vier, und (6) bei Wahl zwischen einer Sondensequenz und ihrem Gegenstück, soll der Strang mit mehr C- als G-Nukleotiden gewählt werden.
Das Design der selbst-quenchenden Sonde ist so gewählt, dass der Reporter in enge Nachbarschaft zum Quencher gebracht wird, um effizienten Energietransfer vom Reporter zum Quencher zu ermöglichen. Anleitung hinsichtlich der Auswahl einer geeigneten Distanz für eine gegebene Ausführungsform findet man in zahlreichen Referenzen über resonanten Energietransfer zwischen fluoreszierenden Reportermolekülen und Quencher-Molekülen (manchmal auch als „Donor"-Moleküle bzw. „Akzeptormoleküle" bezeichnet), z.B. Clegg, 1992; Cardullo, 1988, Ozaki et al., Livak et al., 1995. Selbst-quenchende Sonden können intramolekulare Watson/Crick-Basenpaarungseigenschaften haben, d.h. Selbst-Komplementarität. Annahme einer stabilen Wasserstoff-gebundenen Konformation kann zum einem höheren Grad von Energietransfer zwischen dem Reporter und dem Quencher aufgrund ihrer verstärkten Nähe führen (Tyagi et al., 1996; Tyagi et al., 1997). Die Zunahme an Fluoreszenz von selbst-komplementären, selbst-quenchenden Sonden („Molecular Beacons") nach Hybridisierung an Ziel oder interne Kontrollpolynukleotide während der Amplifikation kann ausreichend signifikant sein, um keine Exonuklease-Spaltung der Proben erforderlich zu machen.
Der Reporter und der Quencher sind vorzugsweise nah genug beieinander, so dass im wesentlichen die vollständige Fluoreszenz, z.B. 90% vom Reporter gequencht werden. Typischerweise sollte für auf Energietransfer basierendes Quenching die Distanz zwischen den ersten und zweiten Fluorophoren innerhalb eines Bereichs von 10–100 Angstrom sein. Vorzugsweise sind der fluoreszierende Rest und der Quencher durch etwa 4 bis 10 Nukleotide getrennt. Die Erfindung umfasst jedoch auch Ausführungsformen, in denen die Zahl an Nukleotiden, die die Fluorophore trennen, größer als 10 sein kann. Vorzugsweise sind entweder der Reporter und Quencher an das 5'-terminale Nukleotid der Oligonukleotidsonde angeheftet. Der Reporter und Quencher können ebenfalls an das 3'-terminale Nukleotid angeheftet sein. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Referenzmoleküle sind das fluoreszierende Molekül und der Quencher an internen Stellen des Polynukleotid angeheftet. Die Erfindung umfasst auch Ausführungsformen, in denen eine der beiden Fluorophore an einer internen Stelle lokalisiert und die andere Fluorophore an einen Terminus des Polynukleotids angeheftet ist.
Farbstoffe, die als Quencher verwendet werden, umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, deren fluoreszierende Eigenschaften durch die Anwesenheit oder Assoziation mit Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngige DNA, im wesentlich unbeeinträchtigt sind. Ein Reporter-Quencher-Paar für eine bestimmte Sonde wird so ausgewählt, dass das Emissionsspektrum des Reporters mit der Absorption des Quencher überlappt (5). Spektrale Überlappung erlaubt einen effizienten Energietransfer (FRET), wenn die Sonde intakt ist. Solche Farbstoffe können eigentlich jeden Fluoreszenzfarbstoff, der dieses Kriterium erfüllt, der spektral von irgendeinem Fluorophor abtrennbar ist, die in Reporter-Quencher-Sonden verwendet werden, umfassen. Als Reporter geeignete Farbstoffe können auch als Quencher geeignet sein. In ähnlicher Weise können als Quencher geeignete Farbstoffe als Reporter geeignet sein. In einer Ausführungsform einer selbst-quenchenden Sonde wird 6-Carboxy-Fluorescein (6-FAM) als Reporter verwendet und 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) als Quencher verwendet, so dass der TAMRA-Farbstoff im wesentlichen alle fluoreszierenden Emissionen von 6-FAM quencht.
Zusätzlich zu DNA und RNA-Oligonukleotiden können verschiedene Nukleinsäureanaloga als selbst-quenchende Sonden verwendet werden, wie (i) Sauerstoff in der Internukleotidverknüpfung kann durch Schwefel, Kohlenstoff oder Stuckstoff ersetzt sein, und (ii) die Internukleotid-Phosphodiester-Verknüpfungen können Sulfat, Carboxylat, Amid und Ähnliches sein. Alternativ dazu können Sonden Zuckermodifikationen in einem oder mehreren der Nukleoside haben, wie 2'-O-Alkyl-Ribonukleoside und Ähnliches. Sonden können auch Nukleobasenmodifikationen in einem oder mehreren der Nukleoside haben, wie C-5-Alkynyl-Pyrimidine und Ähnliches. Die Fluorophore können durch geeignete Funktionalisierung der Fluorophore und/oder der Polymer-Aufbaublöcke an das Oligonukleotid oder das Nukleinsäureanalog gekoppelt sein. Eine ausführliche Beschreibung, wie man Fluorophore an Nukleinsäuren und Analoga koppelt, findet man in der Literatur (Andrus, 1992; Andrus 1995; Hermanson, 1996; Ju et al., 1995).
Die Reporter und Quencher der selbst-quenchenden Sonden können an vorbestimmte Nukleotide eines Oligonukleotids durch Nukleosidphosphoramidit-Monomere, die reaktive Gruppen enthalten, kovalent angeheftet werden. Solche reaktiven Gruppen können auf einem Phosphat, oder Phosphatanalog (Agrawal, S. 1990), auf dem 5'-Hydrpxyl, wenn die Anheftung an das 5'-terminale Nukleotid erfolgt (Andrus, 1995) und auf Basenresten (z.B. Ruth; Urdea et al., oder Ähnliches) sein. Weiter bevorzugt ist es, dass das 3'-terminale Nukleotid der Oligonukleotidsonde blockiert ist oder nicht durch eine Nukleinsäurepolymerase verlängert werden kann. Solch eine 3'-Blockierung wird durch chemische Anheftung einer Phosphatgruppe (Horn, 1986; erhältlich von PhosphaLink, PE Applied Biosystems) ausgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird TAMRA als Quencher auf selbst-quenchenden Sonden verwendet und der TAMRA-Farbstoff ist an das 3'-Ende angeheftet (Mullah, 1997; Mullah, 1998).
b. Block
Der bevorzugte Block ist ein Peptid-Nukleinsäure-Oligomer (PNA), ein DNA-Analog, in dem das natürliche Phosphodiester-Desoxyribose Gerüst durch N-(2-Aminoethyl)-Glycin, eine Peptid-artige Einheit ersetzt ist (Nielsen, 1991). Die Nukleobasen natürlicher Nukleinsäuren, DNA und RNA werden durch eine Amidbindung an das neutrale Gerüst zurückbehalten. Die Struktur von PNA ist nachstehend dargestellt, wobei B₁ und B₂ Nukleobasen sind.
PNA-Oligomere sind in der Lage, komplementäre Sequenzen durch Watson/Crick-Basenpaarung zu erkennen. Die Bindung von PNA an sein Komplement kann entweder in paralleler oder anti-paralleler Orientierung der PNA erfolgen; die anti-parallele Duplex ist jedoch viel stabiler (Egholm et al.). Die Schmelztemperatur von PNA/DNA und PNA/RNA Hybriden ist viel höher als die der entsprechenden DNA/DNA oder DNA/RNA Duplex aufgrund des Fehlens einer elektrostatischen Abstoßung in der PNA-enthaltenden Duplex. PNA-Oligomere können durch herkömmliche Verfahren auf käuflich erwerbbaren, automatisierten Synthesegeräten, z.B. dem Model 394 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) mit käuflich erhältlichen Reagenzien (Vinayak, 1997, Van der Laan, 1997) synthetisiert werden.
IV. REAGENZKIT
Ein Aliquot eines Mastermix eines Kit, umfassend ein internes Kontrollpolynukleotid, interne Kontrollprimer, ein nicht-verlängerbares Oligonukleotid oder ein Nukleinsäureanalog, das komplementär zum internen Kontrollpolynukleotid ist, Zielprimer, eine Polymerase mit 5'→3' Nuklease-Aktivität, selbst-quenchende Fluoreszenzsonden, Nukleotid-5'-Triphosphate und andere Reagenzien, die für den Exonuklease-Test notwendig sind, wird in alle Probenvertiefungen gegeben.
Ausführungsformern der Erfindung umfassen Reagenz-Zusammensetzungen zur Verwendung in Nukleinsäureamplifikationsreaktionen. Die jeweiligen Zusammensetzungen umfassen einen Nukleinsäureamplifikationspuffer. Der Begriff „Nukleinsäureamplifikationspuffer" bezieht sich auf eine gepufferte wässrige Lösung, die die enzymatische Reaktion oder Reaktionen unterstützt, die für eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion notwendig sind. Die Wahl der Pufferzusammensetzung wird gemäß dem jeweiligen Enzym, das für die Katalyse der interessierenden Nukleinsäureamplifikation ausgewählt wurde, variieren (McPherson et al., 1991; McPherson et al., 1995; Dieffenbach, C. 1995). Ein Beispiel für einen geeigneten Nukleinsäureamplifikationspuffer für durch Taq DNA-Polymerase katalysierte Amplifikationsreaktionen ist: 10 mM Tris (pH 8,4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂; 0.01% Gelatine, 0.01% NP40 und 0,01% Tween^TM.
Die erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzungen können in konzentrierter Form oder in einer Form bereitgestellt werden, die vor der Verwendung keine signifikante Verdünnung benötigt. Die Reagenzzusammensetzungen können durch Zugabe von zusätzlichen Verbindungen, die zur Durchführung des interessierenden Tests notwendig sind, verwendet werden, wobei solche Verbindungen eine thermostabile Polymerase, Nukleotide, Zielpolynukleotid, eine Reporter-Quencher-Sonde und Ähnliches umfassen. Nach Zugabe der notwendigen zusätzlichen Verbindungen kann das Reaktionsgemisch entsprechend verarbeitet werden, z.B. Wärmezyklieren, um die gewünschten Amplifikationsergebnisse zu erzielen.
V. NACHWEIS DER PCR-PRODUKTE
Das Echtzeit-Erkennungssystem umfasst optische Komponenten, die operational mit einer geschlossenen Reaktionskammer assoziiert sind, die eine Linse zur Fokussierung eines Anregungsstrahls in das Reaktionsgemisch und zum Bündeln der entstehenden Fluoreszenz umfasst und eine Faseroptik zur Übertragung sowohl des Anregungsstrahls aus einer Lichtquelle zur Linse und der Fluoreszenzsignale von der Linse zu einem Nachweis- und Analysemittel. Zur Induktion von Fluoreszenz während der Amplifikation kann Laserlicht über einen Multiplex-Array von optischen Fasern auf 96-Lochplatten verteilt werden. Die entstehende Fluoreszenzemission kehrt über die Fasern zurück und wird mit einer CCD-Kamera auf einen Spektrographen geleitet. Vorzugsweise ist das Reaktionsgemisch in einer geschlossenen Reaktionskammer enthalten, um Proben-Kreuzkontaminationen oder „Übertrag" zu vermeiden. Die Linse fokussiert daher den Anregungsstrahl und bündelt Fluoreszenz durch einen Teil der Wand der geschlossenen Reaktionskammer. Die bevorzugte Reaktionskammer ist ein Röhrchen, das z.B. die Geometrie und das Volumen eines herkömmlichen Mikrozentrifugenröhrchens hat. Das Röhrchen wird verschlossen, nachdem das Reaktionsgemisch zugegeben wurde, durch Anheftung eines Deckels an das offene Ende des Röhrchens, so dass ein undurchlässiger Verschluss gebildet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des Proben-Interface für PCR leitet die Linse den Anregungsstrahl und bündelt Fluoreszenz, die durch die Sonden erzeugt wurde, durch den Deckel des Röhrchens. In anderen Worten, sobald einmal Reaktionsgemisch in das Röhrchen gegeben und der Deckel aufgesetzt wurde, ist eine geschlossene Reaktionskammer hergestellt. Mögliche Variabilität, die aus aufeinanderfolgender Analyse der ersten und zweiten Fluoreszenzsignale entstehen könnte, wird durch gleichzeitige Analyse der Signale durch spektrales Auftrennen des Signallichtes auf einen Array von Photodetektoren eliminiert, z.B. durch Brechung des Signals auf einen CCD-Array. Ein Anregungsstrahl, der durch eine einzelne Lichtquelle erzeugt wird, z.B. durch einen Laser, wird auf eine Vielzahl von geschlossenen Reaktionskammern durch Faseroptik verteilt. In ähnlicher Weise kann die gleiche Faseroptik die Fluoreszenzsignale von der Vielzahl von Reaktionskammern für die Analyse durch ein Einzelnachweis und -Analysesystem bündeln. Alternativ dazu kann die Reaktionskammer eine Vertiefung, z.B. eine Miktrotiter-Vertiefung, oder eine Einbuchtung auf einem festen Array sein. Der Array kann aus einer Vielzahl von räumlich addressierbaren Stellen bestehen. Vorzugsweise wird das System mit der PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren verwendet. Ein Beispiel der bevorzugten Ausführungsform ist das ABI PRISM^TM 7700 Sequenz-Nachweissystem (PE Applied Biosystems). Eine weitere Ausführungsform ist das ABI PRISM^TM 7200 Sequenz-Nachweissystem für die Endpunkt-Analyse. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße System dazu verwendet, PCR zu überwachen, obwohl es auch mit anderen Amplifikationsschemata verwendet werden kann.
VI. DATENANALYSE
Die Ergebnisse eines Exonuklease-Tests können mit zwei Parametern analysiert werden; dem Rn-Wert und dem Ct-Wert. Der Rn-Wert ist das Verhältnis eines Reporterfarbstoffs und der Fluoreszenz der passiven Referenz am Ende eines PCR-Experiments. Der Rn wird für das Ziel und für das ICP berechnet: Rn (Ziel) = Emissionsintensität der Zielsonde + Emissionsintensität der passiven Referenz Rn (ICP) = Emissionsintensität der ICP-Sonde + Emissionsintensität der passiven Referenz
Der Ct-Wert oder die Schwellenzykluszahl, ist die PCR-Zykluszahl, bei der das Fluoreszenzverhältnis vom Hintergrund zu unterscheiden ist. Für einen gegebenen Reporterfarbstoff und eine feste Konzentration des Ziels geben sowohl der Rn als auch der Ct-Wert die Wirksamkeit des Quencher wieder.
VII. BEISPIELE
Die Erfindung wird durch Betrachtung der folgenden Beispiele weiter verdeutlicht, die lediglich veranschaulichend und nicht beschränkend gedacht sind.
BEISPIEL 1
Herstellung einer doppelt markierten, selbst-quenchenden Sonde für den Exonuklease-Test
Automatisierte Synthese von selbst-quenchenden Sonden kann miteinem Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA Synthesegerät (The Perkin-Elmer Corporation, PE Applied Biosystems Division) gemäß den Anweisungen im Handbuch des Herstellers durchgeführt werden. Eine 5' FAM, 3' TAMRA Sonde kann im 0.2 μmol Maßstab mit TAMRA-markierten CPG festen Trägern (Mullah et al., 1997, Mullah et al., 1998), dem Satz von Phosphoramidit-Nukleosiden A^bz, G^dmf, C^bz, T, anderen, vom Hersteller empfohlenen Reagenzien (PE Applied Biosystems) und FAM Farbstoff-markiertem Phosphoramidit (Theisen et al.) synthetisiert werden. Der herkömmliche 0,2 μmol Maßstab-Synthesezyklus wird leicht modifiziert durch Verlängerung der Kopplungszeit von FAM-Amidit durch zusätzliche 120 Sekunden. Jede Sonde beinhaltet einen Reporterfarbstoff, angeheftet an ein 5'-Ende der Sonde und einen Quencher-Farbstoff, angeheftet an ein 3'-Ende der Sonde (6).
Nach Abschluss der Synthese werden die Oligonukleotide von dem Träger auf dem DNA-Synthesegerät durch Behandlung mit einem Gemisch aus MeOH:t-BuNH₂:H₂O (1 : 1 : 2) (Woo, 1993) für eine 1-stündige Autoklavierprozedur autoklaviert, wie beschrieben im Handbuch für das Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA Synthesegerät. Basenschutzgruppen werden durch Erhitzen des Gemisches bei 85°C für 1 Stunde oder bei 65°C für 3 Stunden entfernt. Die Oligonukleotide können durch reverse Phase HPLC, Anionenaustausch-HPLC, Kapillargelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese und andere herkömmliche Techniken (Andrus, 1992) analysiert und aufgereinigt werden.
BEISPIEL 2
Nachweis von C-myc mRNA durch Exonuklease-Test mit exogenem ICP
Reverse Transkription
Die cDNA wird unter Verwendung von 50 ng menschlicher RNA und C-MYC reversem Primer erzeugt:
5' CAACATCGAT TTCTTCCTCA TCTTCT 3' (SEQ ID NO:1)
in 100 μl Lösung, enthaltend 1 × PCR Puffer II, 5.5 mM MgCl₂, jeweils 500 µM dATP, dCTP, dTTP und dGTP, 1.25 U/μl MuLV reverser Transkriptase, 0.4 U/μl Rnase Inhibitor und Rnase-freies H₂O bei 48°C für 30 Minuten in einem ABI Modell 9600 Thermocycler.
Reagenzien

1) Der folgende Reagenzkit wird gemischt und 45 μl werden in jedes von 96 Vertiefungen gegeben, A1–H12 (7): Tris-HCl pH 8.0, 100 mM, 16% Glycerin, 0.1% Gelatine, 0.02% Tween20^TM, 10 mM MgCl₂, jeweils 400 µM dATP, dCTP, deaza dGTP und 800 µM dUTP, 0,1 U/μl AmpliTaq Gold Polymerase 0,02 U/ml Amperase UNG 120 nM passive Referenz vorwärts C-MYC Zielprimer: 5' GCCCCTGGTT GCTCCATGA 3' (SEQ ID NO:2) reverser C-MYC Zielprimer 100 mM FAM selbst-quenchende Zielsonde: 5' FAM-CAGCACAACT ACGCAGCGCC TCCT – TAMRA 3' (SEQ ID NO:3) Exogene interne positive Kontroll (ICP) Reagenzien: Plasmid DNA, die ein 80 bp großes Amplikon internes Kontrollpolynukleotid (IPC) enthält 50 nM vorwärts Primer: 5' TCCAACCGCC ACACTATCAA 3' (SEQ ID NO:4) 50 nM reverser IPC Primer: 5' CATCCGCACA CTATCTCATC GT 3' (SEQ ID NO:5) 200 nM selbst-quenchende IPC-Sonde: 5' JOE-CAGCTCGTTG ATCTTCCGTT CTGGCA – TAMRA 3' (SEQ ID NO:6)
2) 10 μl der cDNA werden in jede der 84 Vertiefungen, B1–H12 (7) gegeben
3) PNA-Block wird in die Vertiefungen A1–A6 (7) gegeben: 300 nM PNA Block: H₂N – TCCAACCCGC CACCCACTAT C – CONH₂ (SEQ ID NO:7)

PCR
Menschliche cDNA wird durch Thermocycling-Bedingungen amplifiziert, die mit 2 Minuten bei 50°C, 10 Minuten bei 95°C beginnen und dann 40 Zyklen von: 15 Sekunden Denaturierung bei 95°C und 1 Minute Anlagerung und Verlängerung bei 60°C. Thermocycling und Echtzeit-Fluoreszenznachweis wird auf einem ABI PRISM^TM 7700 Sequenz-Nachweissystem (Perkin-Elmer Co) durchgeführt.
Die Ziel-cDNA und das IPC werden in Anwesenheit von IPC amplifiziert und durch die Anwesenheit von FAM-, bzw. JOE-Signalen in den Vertiefungen B1–H12 nachgewiesen. Der PNA-Block hemmt die Amplifikation von IPC in den Vertiefungen A1–A6, wie durch Abwesenheit eines JOE-Signals nachgewiesen. In den Vertiefungen A1–A12 wird aufgrund Fehlen eines FAM-Signals keine Amplifikation des Ziels nachgewiesen. In den Vertiefungen A7–A12 (7) wird, wie durch ein JOE-Signal nachgewiesen, IPC amplifiziert.
BEISPIEL 3
Nachweis von DNA:NPTII Gen aus transgenen Baumwoll-Pflanzen durch Exonuklease-Test mit exogenem IPC
Etwa 200 ng genomische DNA von transgener Baumwolle werden für den 96-Lochtest nach herkömmlichen Verfahren präpariert.
Reagenzien
Die gleichen Kitreagenzien wie bei Beispiel 2, einschließlich derselben IPC-Reagenzien, werden vermischt und ein Gesamtvolumen von 45 μl wird in jedes der 96 Löcher gegeben, A1–H12 (7), einschließlich NPTII Ziel-spezifische Primer und Sonde:
300 nM vorwärts Zielprimer:
5' CAGGACGGGC GTTCCTTGC 3' (SEQ ID NO:8)
300 nM reverser Zielprimer:
5' GTGGGTCGAA TGGGCAGGTAG C 3' (SEQ ID NO:9)
200 nM selbst-quenchende Zielsonde:
5'-FAM – ACTGAAGCGG GAAGGGACTG GCT – TAMRA 3'
(SEQ ID NO:10)
PCR
Die Amplifikation wird unter den gleichen Bedingungen und auf dem gleichen System wie in Beispiel 2 durchgeführt.
Sowohl die Baumwollproben-DNA als auch das IPC werden erfolgreich amplifiziert. Vergleich des Ct mit und ohne IPC legt nahe, dass die Effizienz der PCR durch die Komplexität der Proben-DNA nicht beeinträchtigt wird.
BEISPIEL 4
Nachweis von E. coli 0157:H7 durch Exonuklease-Test mit exogenem IPC
Etwa 100 ng DNA von aufgereinigtem Plasmid mit klonierter Zielsequenz werden nach herkömmlichen Verfahren für den 96-Lochtest präpariert. Ein Bereich von 10000 bis weniger als 1 Kopie pro Vertiefung werden in den unbekannten Proben verwendet.
Reagenzien
Die gleichen Kitreagenzien wie bei Beispiel 2, einschließlich derselben IPC-Reagenzien, werden vermischt und ein Gesamtvolumen von 45 μl wird in jedes der 96 Löcher gegeben, A1–H12 (7), einschließlich NPTII Ziel-spezifische Primer und Sonde:
300 nM vorwärts Zielprimer:
5' ATCCTGGACC AGGTTCCTGA 3' (SEQ ID NO:11)
300 mM vorwärts Zielprimer:
5' CGGTACAAGC TGCAACTGTTA 3' (SEQ ID NO:12)
200 nM Zielsonde:
5' FAM – TAGGCAGTAT TCCGAAATGAC – TAMRA 3' (SEQ ID NO:13)
PCR
Die Amplifikation wird unter den gleichen Bedingungen und auf dem gleichen System wie in Beispiel 2 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Die unbekannten Proben von 1 bis 10000 Kopien ergaben positiven Nachweis durch Nachweis eines FAM-Signals oberhalb des Hintergrunds.
BEISPIEL 5
Nachweis von Mycoplasma synoviae DNA, extrahiert aus kultivierten Zellen, durch Exonuklease-Test mit exogenem IPC
Etwa 100 ng DNA aus multiplen Quellen von Mycoplasma synoviae wird für den 96-Loch-Test nach herkömmlichen Verfahren präpariert. Jede Quelle wird als 10-fach Replikat getestet.
Reagenzien
Die gleichen Kitreagenzien wie bei Beispiel 2, einschließlich derselben IPC-Reagenzien, werden vermischt und ein Gesamtvolumen von 45 μl wird in jedes der 96 Löcher gegeben, A1–H12 (7).
Der Reagenzkit beinhaltet:
Vorwärts Primer:
5' CGGATTGTAG TCTGCAACTCGACT A 3' (SEQ ID NO:14)
reverser Primer:
5' ACAAACCGAC TTCGGGCATT 3' (SEQ ID NO:15)
selbst-quenchende Sonde:
5' FAM – AATACGTTCT CGGGTCTTGT ACACACCGC – TAMRA 3' (SEQ ID NO:16)
PCR
Die Amplifikation wird unter den gleichen Bedingungen und auf dem gleichen System wie in Beispiel 2 durchgeführt. Die Länge des Zielamplikons ist 143 bp.
Die Ergebnisse werden in 9 gezeigt. Alle „keine Amplifikations-Kontrolle"-Proben (A1–A6), die IPC, PNA-Block und kein Ziel enthielten, führten wie erwartet zu unsiginifikanten FAM- oder JOE-Signalen. Alle „keine Matrize-Kontrolle"-Proben (A7–A12), die IPC, keinen PNA-Block und kein Ziel enthielten, führten wie erwartet zu unsignifikanten FAM- und signifikantem JOE-Signal. Alle unbekannten Proben (B1–H12), die IPC, keinen PNA-Block, und Ziel enthielten, ergaben wahre positive Ergebnisse, mit der Ausnahme von Probe H8 (Ziel Ct = 40), die negativ war. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Durchführung von Nukleinsäureamplifikations-Kontrollreaktionen in einer einzigen Reaktionskammer, umfassend: Bereitstellen eines internen Kontroll-Polynukleotids, wobei das interne Kontroll-Polynukleotid aus DNA oder RNA mit einer Länge von 50–500 bp besteht und keine Sequenzhomologie zu einem Ziel-Polynukleotid aufweist, von internen Kontrollprimern, die an ein internes Kontroll-Polynukleotid hybridisieren, eines nicht-verlängerbaren Oligonukleotids oder Oligonukleotidanalogons, das komplementär zum internen Kontrollpolynukleotid ist und an irgendeinen Teil des internen Kontrollpolynukleotids bindet und die Amplifikation des internen Kontrollpolynukleotids verhindert, einer Nukleinsäure-Polymerase mit 5'→3' Nukleaseaktivität, Nukleotid 5'-Triphosphaten; einer selbst-unterdrückenden Fluoreszenzsonde einschließlich Reporter- und Unterdrücker-(Quencher-) Resten, wobei diese Sonde in nicht-hybridisiertem Zustand in wenigstens einer einzelsträngigen Konformation vorliegt, wobei der Quencherfarbstoff die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes unterdrückt, und wobei die Sonde in wenigstens einer Konformation vorliegt, wenn sie an das interne Kontroll-Polynukleotid hybridisiert ist, wobei die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs nicht unterdrückt wird, wobei die Fluoreszenz-Intensität des Reporterfarbstoffs größer ist als die Fluoreszenzintensität des Quencherfarbstoffes, wenn die Sonde an das Polynukleotid hybridisiert ist; und wobei die Sonde an eine Stelle in der Sequenz zwischen den Primern hybridisiert; und die Schritte Hybridisieren der selbst-unterdrückenden Fluoreszenzsonde an das interne Kontroll-Polynukleotid, Hybridisieren der internen Kontroll-Primer an das interne Kontroll-Polynukleotid; und Amplifizieren des internen Kontroll-Polynukleotids durch PCR, wobei von den internen Kontroll-Polynukleotid-Amplifikationsprodukten keine Amplifikationsprodukte erzeugt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, weiter umfassend eine zweite selbst-unterdrückende Fluoreszenzsonde, wobei der Reporterfarbstoff der ersten selbst- unterdrückenden Fluoreszenzsonde vom Reporterfarbstoff der zweiten selbst-unterdrückenden Fluoreszenzsonde spektral aufgetrennt werden kann.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei ein Produkt der Nukleinsäureamplifikation des internen Kontrollpolynukleotids von den Produkten der Nukleinsäureamplifikation des Ziel-Polynukleotids spektral aufgetrennt werden kann.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Produkte der Nukleinsäureamplifikation des internen Kontroll-Polynukleotids und des Ziel-Polynukleotids gemessen und durch Endpunkt-Analyse quantifiziert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Produkte der Nukleinsäureamplifikation des internen Kontroll-Polynukleotids und des Ziel-Polynukleotids gemessen und durch Echtzeit-Analyse quantifiziert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Reporter ein Fluoresceinfarbstoff ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der Fluoresceinfarbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
wobei L ein Linker ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Quencher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
wobei L ein Linker ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Reporterfarbstoff durch wenigstens 12 Nukleotide vom Quencherfarbstoff getrennt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Reporterfarbstoff an das 5'-Ende oder an das 3'-Ende der selbst-unterdrückenden Fluoreszenzsonde angeheftet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Quencherfarbstoff an das 5'-Ende oder an das 3'-Ende der selbst-unterdrückenden Fluoreszenzsonde angeheftet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das nicht-verlängerbare Oligonukleotid oder Nukleinsäureanalogon, das zu dem internen Kontroll-Polynukleotid komplementär ist eine modifizierte 3' Phosphatgruppe, 2-Aminoethylglycin, PNA, Amid-verknüpfte Oligomere, 2'-O'-Methyl-Oligoribonukleotide, 2'-O'-Alkyl-Oligoribonukleotide oder Phosphatanaloga umfasst.
Reagenzien-Kit zur Nukleinsäureamplifikation, umfassend: ein internes Kontroll-Polynukleotid, wobei das interne Kontroll-Polynukleotid aus DNA oder RNA mit einer Länge von 50–500 bp besteht und keine Sequenzhomologie zu einem Ziel-Polynukleotid aufweist, interne Kontrollprimer, die an ein internes Kontroll-Polynukleotid hybridisieren, ein nicht-verlängerbares Oligonukleotid oder Nukleinsäure-Analogon, das komplementär zum internen Kontrollpolynukleotid ist und an irgendeinen Teil des internen Kontrollpolynukleotids bindet und die Amplifikation des internen Kontrollpolynukleotids verhindert, und wobei das nicht-verlängerbare Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon nach Bindung an das interne Kontroll-Polynukleotid die Amplifikation abschaltet, Zielprimer, eine Nukleinsäure-Polymerase mit 5'→3' Nukleaseaktivität, selbst-unterdrückende Fluoreszenzsonden einschließlich Reporter- und Quencherresten, Nukleotid 5'-Triphosphate.