DE60028534T2 - Binärsonde, klammerzusammensetzung und verfahren zum zielhybridisierungsnachweis - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich generell auf das Feld der Nukleinsäure Hybridisierung und spezieller auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Nukleinsäure-Amplifizierung.
  • Referenzen
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  • Hintergrund
  • Nukleinsäure-Hybridisierungsassays umfassen eine wichtige Klasse von Techniken in der modernen Biologie, mit verschiedenen Anwendungen in der Diagnose von vererbten Krankheiten, menschlicher Identifikation, Identifikation von Mikroorganismen, Vaterschaftstests, Virologie und DNA Sequenzierung. Primärextensions-Reaktionen sind die Schlüsselkomponenten vieler Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur Amplifizierung. Das Polymerasekettenreaktion (PCR) Verfahren zur Amplifizierung hat Fortschritte bei der Klonierung, der Genexpressionsanalyse, der DNA Sequenzierung, der genetischen Kartierung, der Entdeckung von Arzneimitteln und ähnlichem ermöglicht (Gilliland, 1990; Bevan, 1992; Green, 1991; McPherson, 1995).
  • Die Spezifität and Affinität von zwei oder mehreren Strängen von Nukleinsäure und nukleinsäure-analogen Molekülen, die durch Watson/Crick und nicht-Watson/Crick Basenpaarung hybridisieren, sind die Schlüsselparameter von effizienten Nukleinsäure Hybridisierungsassays.
  • In der Europäischen Patentanmeldung EP 0 857 791 A1 wird ein Verfahren zur Bestimmung eines Moleküls in einer Probe durch die Bildung von Trippelhelix-Strukturen beschrieben, dass die Bildung von verzweigten Strukturen erlaubt. Das Patent US-A-4716106 aus den Vereinigten Staaten beschreibt ein Verfahren mit einer primären Sonde, die Sequenzen hat, welche komplementär zu einer Zielsequenz und einer sekundären markierten Sonde sind. Die Europäische Patentanmeldung EP-A-450594 bezieht sich auf die Verwendung einer primären Sonde, die mittels eines überbrückenden Moleküls mit einer markierten Sonde gekoppelt ist. Die UK Patentanmeldung GB-A-2202328 beschriebt eine Methode zur Amplifizierung umfassend die Verwendung eines Primers, der einen homopolynukleotischen Schwanz trägt, wobei das Produkt der Amplifizierung mittels einer markierten Sonde detektiert wird, die komplementär zu besagtem Schwanz ist. Kovalent angebrachte Markierungen oder Gruppen, die die Hybridisierung verbessern oder stabilisieren, sind wünschenswert.
  • Ein weiterer wichtiger Aspekt der Nukleinsäure-Hybridisierungsassays ist das Verfahren welches verwendet wird, um die Detektion des Hybridisierungsereignisses zu ermöglichen. Fluoreszente Verfahren haben viele Vorteile gegenüber Radioisotopen, wobei entweder das Ziel-Polynukleotid oder die Sonde oder der Primer einfach und sicher mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert werden kann. Verfahren, um die Kosten der markierten Sonden und Primer, oder deren funktioneller Äquivalente, zu erniedrigen sind höchst wünschenswert. Es verbleibt ein Bedürfnis nach weiteren Verbesserungen in der Spezifität, der Affinität und der Detektion von Nukleinsäure-Hybridisierungsassays.
  • Zusammenfassung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf neue, binäre Sonden- und Klammerzusammensetzungen ausgerichtet, die für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays nützlich sind und Verfahren die von solchen Zusammensetzungen Gebrauch machen. Die Erfindung umfasst eine binäre Zusammensetzung zur Hybridisierung an eine Ziel-Polynukleotidsequenz umfassend: eine Sonde umfassend einen Ziel-spezifischen Teil und einen Klammer-spezifischen Teil, wobei der Ziel-spezifische Teil fähig ist, Sequenz-spezifisch an eine Ziel-Polynukleotidsequenz zu binden; und eine Klammer umfassend zwei Sonden-spezifische Teile, eine oder mehrere Markierungen und einschließend Nukleinsäureanaloge ausgewählt aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog; wobei die zwei Sonden-spezifischen Teile der Klammer fähig sind, an den Klammer-spezifischen Teil der Sonde zu binden, um eine Triplexstruktur zu bilden und die Klammer nicht fähig ist, Sequenz-spezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu binden.
  • In einem zweiten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Detektion einer Ziel-Polynukleotidsequenz umfassend: zur Verfügung stellen einer binären Sonden- und Klammerzusammensetzung umfassend: eine Sonde umfassend einen Ziel-spezifischen Teil und einen Klammer-spezifischen Teil, wobei der Ziel-spezifische Teil fähig ist, Sequenz-spezifisch an eine Ziel-Polynukleotidsequenz zu binden; und eine Klammer umfassend zwei Sonden-spezifische Teile, eine oder mehrere Markierungen und einschließend Nukleinsäureanaloge ausgewählt aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog; wobei die zwei Sonden-spezifischen Teile der Klammer fähig sind, Sequenz-spezifisch an den Klammer-spezifischen Teil der Sonde zu binden, um eine Triplexstruktur zu bilden und die Klammer nicht fähig ist, Sequenz-spezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu binden; Hybridisieren des Ziel-spezifischen Teils der Sonde mit der Ziel-Polynukleotidsequenz; Hybridisieren des Sonden-spezifischen Teils der Klammer mit dem Klammer-spezifischen Teil der Sonde; und Detektieren der binären Sonde.
  • In einem dritten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Detektion von Produkten der Polymerasekettenreaktion umfassend: zur Verfügung stellen einer binären Sonden- und Klammerzusammensetzung umfassend: eine Sonde umfassend einen Ziel-spezifischen Teil und einen Klammer-spezifischen Teil und eine oder mehrere Markierungen, wobei der Ziel-spezifische Teil fähig ist, Sequenz-spezifisch an eine Ziel-Polynukleotidsequenz zu binden; und eine Klammer umfassend zwei Sonden-spezifische Teile, eine oder mehrere Markierungen und beinhaltend Nukleinsäureanaloge ausgewählt aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog; wobei die zwei Sonden-spezifischen Teile der Klammer fähig sind, Sequenz-spezifisch an den Klammer-spezifischen Teil der Sonde zu binden; und die Klammer nicht fähig ist, Sequenz-spezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu binden; Hybridisieren des Ziel-spezifischen Teils der Sonde an die Ziel-Polynukleotidsequenz; Hybridisieren des Sonden-spezifischen Teils der Klammer an den Klammer-spezifischen Teil der Sonde; und Amplifizieren des Ziels mit einer DNA Polymerase, die eine Exonukleaseaktivität besitzt, PCR Primern und Nukleosid 5' Triphosphaten, Schneiden der Sonde mittels Exonukleaseaktivität der Polymerase und detektieren der Markierungen.
  • In einem vierten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Markierung von Produkten der Polymerasekettenreaktion umfassend: zur Verfügung stellen eines Primers umfassend einen Ziel-spezifischen Teil und einen Klammer-spezifischen Teil, wobei der Ziel-spezifische Teil fähig ist, Sequenz-spezifisch an eine Ziel-Polynukleotidsequenz zu binden; und eine Klammer umfassend zwei primer-spezifische Teile, eine oder mehrere Markierungen und einschließend Nukleinsäureanaloge ausgewählt aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog; wobei die beiden Primer-spezifischen Teile der Klammer fähig sind, Sequenz-spezifisch an den Klammer-spezifischen Teil des Primers zu binden um eine Triplexstruktur zu bilden; und amplifizieren des Ziels mit einer DNA Polymerase, einer oder mehreren binären Primer- und Klammerzusammensetzungen, einem oder mehreren Primern des entgegengesetzten Strangs und Nukleosid 5' Triphosphaten; wobei ein oder mehrere markierte Produkte der Polymerasekettenreaktion resultieren.
  • In einem fünften Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Detektion von Produkten der Polymerasekettenreaktion umfassend: zur Verfügung stellen eines oder mehrerer Primer umfassend einen Ziel-spezifischen Teil am 3' Ende und eines Homopyrimidinsequenz-Teils am 5' Ende, wobei der Ziel-spezifische Teil fähig ist, Sequenz-spezifisch an eine Ziel-Polynukleotidsequenz zu binden; und eine Klammer umfassend zwei Homopyrimidinsequenz-Teile und eine oder mehrere Markierungen; und einschließend Nukleinsäureanaloge ausgewählt aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem intermediären Analog; Amplifizieren des Ziels mit eine DNA Polymerase, einem oder mehreren Primern des entgegengesetzten Stranges und Nukleosid 5' Triphosphaten; und Detektieren der Markierungen, wobei die zwei Homopyrimidinsequenz-Teile der Klammer an das Komplement der Homopyrimidinsequenz am 3' Terminus des Produkts der Polymerasekettenreaktion binden, wobei die Klammer eine Triplexstruktur durch Hybridisierung mit dem PCR Produkt bildet.
  • In einem sechsten Aspekt umfasst die Erfindung einen Kit umfassend: eine Sonde umfassend einen Ziel-spezifischen Teil und einen Klammer-spezifischen Teil, wobei der Ziel-spezifische Teil fähig ist, Sequenz-spezifisch an eine Ziel-Polynukleotidsequenz zu binden; und eine Klammer umfassend zwei Sonden-spezifische Teile, eine oder mehrere Markierungen und ein Nukleinsäureanalog ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog; wobei die zwei Sonden-spezifischen Teile der Klammer fähig sind, Sequenz-spezifisch an den Klammer-spezifischen Teil der Sonde zu binden und die Klammer unfähig ist, Sequenz-spezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu binden; und wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hybridisierungs-stabilisierenden Gruppen, Fluoreszenzfarbstoffen, Fluoreszenzquenchern, chemilumineszenten Farbstoffen, Aminosäuren und Affinitätsliganden.
  • Weitere Ausführungsformen der Erfindung können in den abhängigen Ansprüchen gefunden werden.
  • Eine binäre Sonden- und Klammerzusammensetzung, in der die Sonde einen Ziel-spezifische Teil und einen Klammer-spezifischen Teil umfasst, ist beschrieben. Der Ziel-spezifische Teil ist fähig, Sequenz-spezifisch an eine Ziel-Polynukleotidsequenz zu binden. Eine Klammer umfasst einen Sonden-spezifischen Teil und eine Markierung. Der Klammer-spezifische Teil der Sonde und der Sonden-spezifische Teil der Klammer bilden eine Duplexstruktur in der binären Sonden- und Klammerzusammensetzung. Alternativ bilden der Klammer-spezifische Teil der Sonde und zwei Sonden-spezifische Teile der Klammer eine Triplexstruktur.
  • Figure 00080001
  • Während eines Nukleinsäure-Hybridisierungsassays kann die Zielsequenz in der Probe detektiert und quantifiziert werden mittels Detektion der Markierung auf der binären Zusammensetzung. Der Klammer-spezifische Teil der Sonde ist während der Detektionsphase des Assays an den Sonden-spezifischen Teil der Klammer gebunden.
  • Die Klammer kann ein Oligonukleotid oder ein Nukleinsäureanalog sein. Das Nukleinsäureanalog kann Modifikationen an der Internukleotidbindung, dem Zucker oder den Nukleobasengruppen umfassen. Eine bevorzugte Klammer ist 2-Aminoethylglyzin, PNA, (Nielsen, 1991) mit der Struktur
    Figure 00090001
    wobei B eine Nukleobase oder ein Nukleobasenanalog ist.
  • Die Sonde kann ein Oligonukleotid oder ein Nukleinsäureanalog, enthaltend Nukleobasenanaloge, Zuckeranaloge und/oder Internukleotidanaloge, sein.
  • Die Sonde oder Klammer in der binären Zusammensetzung kann eine oder mehrere Markierungen haben. Die Markierung der Sonde kann an Stellen einschließlich, doch nicht limitiert auf, dem 5' Terminus, dem 3' Terminus, einer Nukleobase, einer Internukleotidbindung, oder einem Zucker angebracht sein. Die Markierung der Klammer kann an Stellen angebracht sein, einschließlich einem Terminus, einer Nukleobase, einer Internukleotidbindung, einem Zucker, einer Aminogruppe, einer Sulfidgruppe und einer Carboxylgruppe. Die Markierungen können hybridisierungs-stabilisierende Gruppen, Fluoreszenzfarbstoffe, Fluoreszenzquencher, Chemilumineszenzfarbstoffe, Aminosäuren und Affinitätsliganden beinhalten.
  • Es wird ein Verfahren bereitgestellt zur Detektion einer Ziel-Polynukleotidsequenz mittels einer binären Sonden- und Klammerzusammensetzung. Im Verfahren hybridisiert ein Ziel-spezifischer Teil der Sonde an eine Ziel-Polynukleotidsequenz mit der binären Sonden- und Klammerzusammensetzung, und eine markierte Klammer hybridisiert an die Sonde. Die Schritte des (i) Hybridisierens des Ziel spezifischen Teils der Sonde mit der Ziel-Polynukleotidsequenz; (ii) des Hybridisierens des Sonden-spezifischen Teils der Klammer mit dem Klammer-spezifischen Teil der Sonde; und (iii) Detektierens der binären Sonde werden ausgeführt um ein Ziel-Polynukleotid zu detektieren.
  • Zusätzlich wird ein Verfahren bereitgestellt zum Detektieren von Polymerase Ketten Reaktions Produkten mit einer binären Sonden- und Klammerzusammensetzung. In dem Verfahren schließt die Sonde einen fluoreszierenden Farbstoff oder Quencher ein, und die Klammer schließt einen fluoreszierenden Farbstoff oder Quencher ein, so dass die binäre Zusammensetzung einen fluoreszierenden Farbstoff oder Quencher umfasst. Die binäre Zusammensetzung ist größtenteils selbst-quenchend, wenn die Sonde an die Klammer hybridisiert ist. Das Verfahren wird durchgeführt mittels der Schritte des (i) Hybridisierens des Ziel-spezifischen Teils einer Sonde mit einer Ziel-Polynukleotidsequenz; (ii) des Hybridisierens eines Sonden-spezifischen Teils der Klammer mit dem Klammer-spezifischen Teil der Sonde; und (iii) der Amplifikation des Ziels mit einer DNA Polymerase (Lawyer, 1989) mit 5' zu 3' Exonuklease Aktivität, PCR Primern und Nukleosid 5' Triphosphaten, (iv) des Spaltens der Sonde durch die Exonuklease Aktivität der Polymerase, und (v) des Detektierens des fluoreszenten Farbstoffs. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung die Markierung zu detektieren, indem die emittierte Fluoreszenz in Echtzeit oder am Endpunkt der Zielamplifikation beobachtet wird.
  • Darüber hinaus wird ein Verfahren bereitgestellt zum Markieren von Polymerase Ketten Reaktions-Produkten mit einer binären Primer- und markierten Klammerzusammensetzung. In dem Verfahren, besitzt der Primer einen Ziel-spezifischen Teil, der fähig ist, Sequenz-spezifisch an ein Ziel-Polynukleotid zu binden, und einen Klammer-spezifischen Teil. Die Klammer schließt ein eine Markierung und einen Primer-spezifischen Teil, der in der Lage ist Sequenz-spezifisch an den Klammer-spezifischen Teil des Primers zu binden. Die Markierung kann ein detektierbarer fluoreszierender Farbstoff sein. Der Klammer-spezifische Teil des Primers und der Primer-spezifische Teil der Klammer bilden eine Duplex Struktur in der binären Primer- und Klammerzusammensetzung. Alternativ bilden der Klammer-spezifische Teil des Primers und die zwei Primer-spezifischen basenpaarenden Teile der Klammer eine Triplex Struktur in der binären Prmer- und Klammerzusammensetzung. Ein Ziel-Polynukleotid wird mit einer DNA-Polymerase amplifiziert, einem oder mehreren binären Primer- und Klammerzusammensetzungen, einem oder mehreren sich gegenüberliegenden Strangprimern, und Nukleosid 5' Triphosphaten, wobei ein oder mehrere markierte Polymerase Ketten Reaktionsprodukte resultieren.
  • Weiterhin wird ein Verfahren bereitgestellt zum Detektieren von Polymerasen Ketten Reaktionsprodukten, wobei ein Ziel-Polynukleotid mit einem Primer amplifiziert wird, der einen Ziel-spezifischen Teil an einem 3' Ende und einen Homopyrimidin Sequenzteil an einem 5' Ende umfasst. Eine Klammer umfassend die gleiche Homopyrimidin Sequenz wie das 5' Ende des Ziels und eine oder mehrere Markierungen sind in der PCR Mischung vorhanden. Die Homopyrimidin Sequenz des Primers wird amplifiziert und bildet einen endständigen Teil des PCR Produkts. Die Klammer bildet Duplex oder Triplex Strukturen, indem mit dem PCR Produkt hybridisiert wird und die Markierung detektiert wird. Die Markierung kann ein fluoreszierender Farbstoff sein.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 Fluoreszierende Farbstoff (F)-Sonde und Quencher (Q-)Klammer binäre Zusammensetzungen; hybridisiert und nicht hybridisiert
  • 2 Hybridisierung der binären Sonden und Klammer Triplex (oben) und Duplex (unten) Zusammensetzungen an Ziel-Polynukleotid
  • 3 Hybridisierung der fluoreszierenden Farbstoff markierten Sonden- und Quencher-Klammerzusammensetzung an Ziel-Polynukleotid
  • 4 Hybridisierung der Sonden- und fluoreszierenden Farbstoff markierten Klammer an Ziel-Polynukleotid
  • 5 Hybridisierung der fluoreszierenden Farbstoff markierten Sonde an Quencher/kleine Gruben Binder (MGB)-markierte Sonde und Hybridisierung der Sonde an Ziel-Polynukleotid. Stabilisierung von Sondenbindung an Ziel durch MGB
  • 6 Hybridisierung von unmarkiertem Primer und fluoreszierender Farbstoff markierter Sonde an PCR Ziel
  • 7 Amplifizierung von Ziel-Polynukleotid mit 5'-Homopyrimidin Sequenz und Bindung einer Triplex bildender Fluoreszenz markierten Klammer an 3' Homopurin Sequenz von PCR Produkt
  • 8 Exonuklease Assay, wobei Trippelhelix bildende selbst-quenchende binäre Sonden- und Klammerzusammensetzung 1, einschließend einen fluoreszierende Farbstoff und einen Quencher, und Zielprimer 2a und 2b an Ziel-Polynukleotid 3 hybridisiert werden. Während der Polymerisierungsphase der Amplifikation werden die Primer 2a und 2b verlängert unter Verwendung eines Polymeraseenzyms, wodurch verlängerte Primer 4a und 4b gebildet werden. Während der Primer Verlängerungsreaktion, dient eine 5' zu 3' Nuklease Aktivität der Polymerase dazu, die Sonde 1 so zu schneiden, dass Sondenfragmente gebildet werden, einschließend fluoreszierendes Farbstoff-Sonden Fragment 5 und Quencher-markierter Klammer mit Klammer-spezifischem Sondenfragment 6.
  • 9 Fluoreszin fluoreszierende Farbstoffstrukturen: FAM, TET, HEX, JOE, VIC, NED, wobei L ein Linker ist
  • 10 Quencher Strukturen: TAMRA, ROX, DABCYL, DABSYL, NTB
  • 11 Kleine Gruben Binder Strukturen: MGB1, Fmoc-CDPI, CDPI3
  • 12 PNA Sonde einschließend die Monomer Einheiten: T, C, Pseudo-Isocytosin J, und Ethylenoxy Spacer O.
  • 13 Binäre Sonden- und Klammerzusammensetzungen. Triplex bildende Klammern, Sequenz ID NOS. 19, 22 gezeigt ohne Markierungen.
  • 14 Hybridisierungsrate der binären Sonden- und Klammerzusammensetzungen, Fluoreszenzintensität [F] gegen Zeit. 100 nM Klammer (SEQ. ID NOS. 19, 20, 21), 100 nM Sonde (SEQ. ID NO. 1), 60°C; ABI Model 7700.
  • 15 Hybridisierungsrate der binären Sonden- und Klammerzusammensetzungen, Fluoreszenzintensität [F] gegen Zeit. 400 nM Klammer (SEQ. ID NOS. 19, 20, 21), 100 nM Sonde (SEQ. ID NO. 1), 60°C; ABI Model 7700.
  • 16 Echtzeit PCR Detektion des BAK Ziels, ΔRn gegen Zyklen, Messung von CT, abzüglich der Hintergrundsfluoreszenz. Binäre Sonden- und Klammerzusammensetzungen: 400 nM Klammer (SEQ. ID NOS. 19, 20, 21), 100 nM Sonde (SEQ. ID NO. 1).
  • 17 Echtzeit PCR Detektion des BAK Ziels, Rn gegen Zyklen, Messung von CT, ohne Abzug der Hintergrundsfluoreszenz. Binäre Sonden- und Klammerzusammensetzungen: 400 nM Klammer (SEQ. ID NOS. 19, 20, 21), 100 nM Sonde (SEQ. ID NO. 1).
  • 18 Echtzeit PCR Detektion des GTT1 Ziels, ΔRn gegen Zyklen, Messung von CT, abzüglich der Hintergrundsfluoreszenz. Binäre Sonden- und Klammerzusammensetzungen: 400 nM Klammer (SEQ. ID NOS. 20, 21), 100 nM Sonde (SEQ. ID NO. 2). Taqman Sonde: 5' FAM-CCTGCAGGCCCGTGCCCGT-TAMRA 3'.
  • 19 Echtzeit PCR Detektion des GTT1 Ziels, Rn gegen Zyklen, Messung von CT, ohne Abzug der Hintergrundsfluoreszenz. Binäre Sonden- und Klammerzusammensetzungen: 400 nM Klammer (SEQ. ID NOS. 20, 21), 100 nM Sonde (SEQ. ID NO. 2). Taqman Sonde: 5' FAM-CCTGCAGGCCCGTGCCCGT-TAMRA 3' (SEQ. ID NO. 43).
  • Eingehende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Es wird nun detailliert auf die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung eingegangen, Beispiele davon werden in den beigefügten Zeichnungen veranschaulicht. Während die Erfindung in Verbindung mit den bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wird, versteht sich, dass dies nicht dazu dienen sollen, die Erfindung auf diese Ausführungsformen zu beschränken. Im Gegenteil soll die Erfindung Alternativen, Modifikationen, und Äquivalente umfassen, die von der Erfindung, wie sie durch die beigefügten Ansprüche definiert ist, eingeschlossen sein können.
  • I. Definitionen
  • Falls nicht abweichend vermerkt sollen die folgenden hier verwendeten Begriffe und Ausdrücke die folgenden Bedeutungen haben:
    Die Begriffe „Nukleinsäure", „Polynukleotid" oder „Oligonukleotid" meinen Polymere aus Nukleotidmonomeren oder Analogen davon, einschließend doppel- und einzelsträngige Deoxribonukleotide, Ribonukleotide, α-anomere Formen davon, und dergleichen. Gewöhnlich sind die Monomere über Phosphodiester Verbindungen verbunden, wobei der Begriff „Phosphodiester Verbindung" sich auf Phosphodiesterbindungen oder Bindungen bezieht, die Phosphatanaloge davon einschließen, einschließlich assoziierter Gegenionen, z.B., H+, NH4 +, Na+. Polynukleotide besitzen typischerweise eine Größe von wenigen monomeren Einheiten, z.B. 5–40, bis zu zahlreichen tausend monomeren Einheiten. Wann immer ein Polynukleotid durch eine Sequenz von Buchstaben dargestellt wird, so wie „ATGCCTG", versteht es sich, dass die Nukleotide in 5' zu 3' Anordnung von links nach rechts sind und dass „A" Deoxyadenosin, „C" Deoxycitidin, „G" Deoxyguanosin, und „T" Deoxythymidin bezeichnet, falls ein anderes nicht abweichend vermerkt ist.
  • „Nukleosid" bezieht sich auf eine Verbindung bestehend aus Purin, Deazapurin, oder Pyrimidin-Nukleobase, z.B. Adenin, Guanin, Cytosin, Urazil, Thymin, Deazaadenin, Deazaguanosin, und ähnliche, verbunden mit einer Pentose an der 1'-Position. Wenn die Nukleosidbase Purin oder 7-Deazapurin ist, wird die Pentose an die Nukleobase an der Position 9 des Purins oder Deazapurins angebracht, und wenn die Nukleobase Pyrimidin ist, wird die Pentose an die Nukleobase an der Position 1 der Pyrimidins angebracht.
  • „Nukleotid" bezieht sich auf einen Phosphatester eines Nukleosids, z.B., einen Triphosphatester, wobei die häufigste Stelle für Veresterung die Hydoxylgruppe ist, die an der C5 Position der Pentose angebracht ist. Ein Nukleotid besteht aus drei Einheiten: einem Zucker, einem Phosphat, und einer Nukleobase (Blackburn, 1996). Wenn Nukleotide Teil einer Duplex sind, werden sie auch als „Basen" oder „Basenpaare" bezeichnet. Die häufigsten natürlich vorkommenden Nukleobasen Adenin (A), Guanin (G), Urazil (U), Cytosin (C) und Thymin (T) besitzen die Wasserstoffbrücken-Bindungsfunktionalität, die Watson/Crick Basenpaarung bewirkt.
  • Der Begriff „Watson/Crick Basenpaarung" bezieht sich auf ein Muster von spezifischen Nukleotidpaaren, und Analogen davon, die miteinander über Sequenz-spezifische Wasserstoff-Bindungen binden, z.B. A paart sich mit T und U, und G paart sich mit C.
  • Der Begriff „Nukleinsäure Analoge" bezieht sich auf Nukleinsäuren hergestellt aus monomeren Nukleotid Analogeinheiten, und die Qualitäten und Eigenschaften, die mit Nukleinsäuren assoziiert werden, besitzen. Nukleinsäure Analoge können modifizierte (i) Nukleobaseneinheiten, z.B. C-5-Propyn-Pyrimidin, Pseudo-Isocytidin und Isoguanosin, (ii) Zucker Einheiten, z.B. 2'-O-Alkyl Ribonukleotide, und/oder (iii) Internukleotideinheiten, z.B. 3'-N-Phosphoramidat (Englisch, 1991) besitzen. Eine Analogklasse, bei der die Zucker- und Internukleotideinheiten mit einem 2-Aminoethylglycin-amid Rückrat Polymer ersetzt wurden, sind Peptid Nukleinsäuren PNA (Nielsen, 1991).
  • „Ziel" bezieht sich auf ein Polynukleotid umfassend eine Sequenz für die Hybridisierung durch einen Primer oder eine Sonde.
  • „Anbringungsstelle" bezieht sich auf eine Stelle auf einer Sonde oder Klammer, an der ein Linker angebracht ist.
  • „Linker" bezieht sich auf ein oder mehrere Atome umfassend ein Kette, die eine Sonde oder Klammer mit einer Markierung verbindet.
  • „Chimäre", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, das ein oder mehrere Nukleotid oder ein oder mehrere Nukleotidanalog Einheiten umfasst.
  • „Niedriges Alkyl", „niedriges Alkylen" und „niedriges substituiertes Alkylen" bezeichnet unverzweigte, verzweigte oder zyklische Gruppen bestehend aus 1–12 Kohlenstoffatome.
  • „Markierung" bezieht sich auf eine Einheit, die kovalent mit einem Oligonukleotid oder Nukleinsäure Analog verbunden ist. Eine bevorzugte Klasse dieser Markierungen stellt ein Signal zur Detektion eines Moleküls durch solche Mittel, wie Fluoreszenz, Chemilumineszenz und elektrochemische Lumineszenz (Kricka, 1992) bereit. Eine andere bevorzugte Klasse von Markierungen, Hybridisierung stabilisierenden Einheiten, dienen dazu, um die Hybridisierung von Duplexen zu verstärken, zu stabilisieren, oder zu beeinflussen, z.B. interkalierende Agentien, Binder der kleine Grube, und quervernetzende funktionale Gruppen. Eine andere bevorzugte Gruppe von Markierungen dient dazu die Abtrennung oder Immobilisierung eines Moleküls durch spezifische oder nichtspezifische Fangmittel zu bewirken (Andrus, 1995).
  • „Detektion" bezieht sich auf das Detektieren, Beobachten oder Messen eines Moleküls aufgrund der Eigenschaften einer kovalent verbundenen Detektionsmarkierung. Detektionsmarkierungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, fluoreszierende Farbstoffe, so wie Fluoreszin und Rhodamin Derivate, Cyanin Farbstoffe (Kubista, 1997) und Energietransfer-Farbstoffe (Clegg, 1992; Cardullo, 1988).
  • „Sonde" bezieht sich auf ein Oligonukleotid oder Nukleinsäure Analog, das einen Ziel spezifischen Teil und einer Klammer-spezifischen Teil besitzen kann.
  • „Klammer" bezieht sich auf ein Oligonukleotid oder Nukleinsäure Analog, das einen Sonden-spezifischen Teil besitzt. Eine Klammer kann eine Markierung tragen, z.B. einen fluoreszierenden Farbstoff oder Quencher, und einem Energietransfer unterzogen werden, wenn sie an eine Sonde, die einen fluoreszierenden Farbstoff oder eine Quenchereinheit trägt, hybridisiert ist. Die Klammer kann auch andere Markierungen tragen, wie einen Binder der kleinen Grube oder ein interkalierendes Agens, um die Bindung der binären Sonden Zusammensetzung mit einem Ziel Polynukleotid zu stabilisieren.
  • „Primer" bezieht sich auf eine Sonde, die fähig ist selektiv an eine spezielle Zielnukleinsäure zu annealen und danach als ein Initiationspunkt für eine Primerverlängerungsreaktion dient, bei dem der Primer in eine 5' → 3' Richtung verlängert wird.
  • Der Begriff „Primerverlängerungsreaktion" bezieht sich auf eine Reaktion zwischen einer Ziel/Primer Duplex und einem Nukleotid, die in der Hinzufügung des Nukleotids an ein 3'-Ende des Primers resultiert, so dass das hinzugefügte Nukleotid komplimentär ist gegenüber dem korrespondierendem Nukleotid des Ziels.
  • Der Begriff „5' → 3' Nuklease Aktivität" bezieht sich auf eine Enzymaktivität, die Nukleinsäure an Phosphodiester Bindungen spaltet. Diese Aktivität kann entweder Endo (spaltet an internen Phosphodiesterbindungen) oder Exo sein (spaltet an der Phosphodiesterbindung, die dem 5' Terminus des Nukleinsäurestranges am nahesten ist).
  • Der Begriff „selbst quenchend" bezieht sich auf einen intermolekularen Energiertransfer Effekt, z.B. werden ein fluoreszierender Farbstoff und Quencher auf einer Sonde so in einer Konfiguration verbunden, dass Energietransfer vom Fluorophor auf den Quencher möglich ist, was eine Reduzierung der Fluoreszenz durch den fluoreszierenden Farbstoff bewirkt.
  • Der Begriff „Endpunktanalyse" bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem Datenerfassung nur dann stattfindet, wenn eine Reaktion beendet ist. Endpunktanalyse des Exonuklease-Assays hat Fluoreszenzfarbstoff-Signalmessung zur Folge, wenn die PCR beendet ist. Die Ergebnisse werden in der Form der Änderung der Fluoreszenz des fluoreszierenden Farbstoffsignals zwischen Start und Ende des thermischen Zyklierens der PCR berichtet, vorzugsweise abzüglich interner Kontrollsignale.
  • Der Begriff „Echtzeitanalyse" bezieht sich auf das periodische Beobachten während der PCR. Echtzeitanalyse des Exonuklease-Assays misst Fluoreszenzfarbstoff-Signaländerungen von Zyklus zu Zyklus, vorzugsweise abzüglich interner Kontrollsignale.
  • II. Konstruktion und Synthese von binären Zusammensetzungen
  • A. Sonden und Primer
  • Eine Sonde oder ein Primer kann jede Struktur besitzen, die fähig ist zur Sequenz-spezifischen Hybridisierung an ein Ziel. Bevorzugte Sonden und Primer sind Oligonukleotide und Nukleinsäure Analoge. Im Allgemeinen folgt die Konstruktion und die Synthese der erfindungsgemäßen binären Zusammensetzungen der konventionellen Lehre. Oligonukleotide und Nukleinsäure Analoge werden vorzugsweise auf einem automatisiertem Festphasen DNA Synthetisierer unter Verwendung von Phosphoramidit Chemie synthetisiert (Beaucage, 1992, Caruthers, 1983). Das Phosphoramidit-Verfahren der Oligonukleotid Synthese ist ein bevorzugtes Verfahren wegen seiner effizienten und raschen Kopplung und der Stabilität der Start Nukleosid-Monomere. Synthese wird typischerweise mit einer wachsenden Polynukleotidkette durchgeführt, die an einen festen Träger gebunden ist, so dass Überschuss Reagentien in der flüssigen Phase leicht durch Filtration entfernt werden können, wodurch die Notwendigkeit für Aufreinigungsschritte zwischen den Zyklen eliminiert wird.
  • DNA Phosphoramidit Nukleosid Monomere können von Perkin-Elmer Co. (Foster City, CA) bezogen werden und 2'-OMe RNA Monomere können von Glen Research (Sterling, VA) bezogen werden. Die Nukleobasen Schutzgruppen können Benzoyl (Abz und Cbz und Dimethylformamidin (Gdmf) sowohl für die DNA als auch die 2'-OMe RNA Nukleoside sein. Der nicht-nukleosidische PEO Linker kann als ein Phosphoramidit Synthon mit der unten angegebenen Struktur eingebaut werden.
  • Figure 00170001
  • Für jeden Koppelungszyklus der Synthese in einem 0.2 μmol Ansatz werden 40 μl 0.1 M Phosphoramidit Nukleosid (ca. 3.5 mg) in Acetonitril gleichzeitig mit 120 μl 0.5 M 5-H Tetrazol in Acetonitril vorgelegt. Koppelungszeit sind 25 Sekunden für DNA Phosphoramidite und 4 Minuten für 2'-OMe RNA Phosphoramidite und das PEO Phosphoramidit.
  • Nach Beendigung der Synthese können die Oligonukleotide von den Träger abgespalten werden durch eine Behandlung mit einer Mischung aus MeOH:t-BuNH2:H2O (1:1:2)(Woo, 1993) oder mit konzentriertem Ammonium-Hydroxid für 1 Stunde bei Raumtemperatur, wie beschrieben in der Gebrauchsanweisung für den Applied Biosysthems Model 394 DNA/RNA Synthetisierer. Schutzgruppen für Basen können durch Erhitzen der Mischung auf 85°C für 1 Stunde oder auf 65°C für 3 Stunden entfernt werden. Die Oligonukleotide können analysiert und aufgereinigt werden durch Umkehrphasen HPLC, Anionenaustausch HPLC, Kappilliar Gelelektrophorese, Polyacrylamidgel Elektrophorese und andere konventionelle Techniken (Andrus, 1995).
  • Beim Konstruieren der binären Sonden- und Klammerzusammensetzungen werden vorzugsweise die folgenden allgemeinen Richtlinien befolgt: (i) die Sonde ist 6–100 Nukleotide lang, (ii) wenn die Ziel Nukleinsäurensequenz innerhalb eines PCR Amplikons lokalisiert ist, sollte die Sondensequenz so sein, dass die Sonde an eine Stelle auf der Sequenz zwischen den PCR Primern hybridisiert; und (iii) die Affinität (Tm, Schmelztemperatur) der Sonde/Klammer sollte die gleiche oder höher sein als die der Sonde/des Ziels (Clegg, 1992; Cardullo, 1988; Livak, 1995).
  • Wenn die Sonde eine Markierung umfassend einen fluoreszierenden Farbstoff und/oder Quencher einschließt, sind der Farbstoff und/oder Quencher in der binären Proben- und Klammerzusammensetzung vorzugsweise nahe genug, so dass die Fluoreszenz des fluoreszierenden Farbstoffs im Wesentlichen durch den Quencher gequencht wird (1). Der fluoreszierende Farbstoff und/oder Quencher kann angebracht werden an: (i) internen Stellen auf der Sonde und Klammer, (ii) einer internen Stelle und der andere an einen Terminus der Sonde oder Klammer, oder (iii) Termini der Sonde und Klammer.
  • B. Klammern
  • Eine Klammer kann jede Struktur sein, die: (i) Sequenz-spezifische Hybridisierung an den Klammer spezifischen Teil einer Sonde einer binären Zusammensetzung durchführt und (ii) ein oder mehrere Markierungen tragen kann. Vorzugsweise haben Klammern: (i) hohe Affinität, (ii) hohe Spezifität, (iii) hohe Löslichkeit, (iv) Nichtverlängerbarkeit, (v) chemische Stabilität, und (vi) behindern nicht die Amplifikation. Vorzugsweise schließen Klammern ein Oligonukleotid oder Nukleinsäure Analog, z.B. PNA. Die Sonde und Klammer können entweder eine Duplex oder Triplex Struktur bilden (2), indem sie Bindung durch Watson/Crick und andere Basenpaarung Wechselwirkung haben (Froehler, 1997; Rumney, 1995). Die Klammer hat eine oder mehrere kovalent angebrachte Markierungen. Die Affinität zwischen der Klammer und der Sonde der binären Zusammensetzung ist stark genug um Nukleinsäure Hybridisierungsassay Bedingungen auszuhalten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind Klammern nicht durch eine Polymerase verlängerbar. Beispiel für nicht verlängerbare Zuckermodifikationen in der Klammer schließen ein 3' Phosphat, 3' Acetyl, 2'-3' Dideoxy, und 3' Amino, 2'-3' Dehydro. Die Klammer kann enthalten einen nicht basenpaarenden, nicht nukleosidischen Linker wie Ethylenoxy oder Poly-ethylenoxy. Die Klammer in der binären Zusammensetzung besteht vorzugsweise aus 6–50 Nukleotiden und/oder Nukleotidanalogen.
  • Eine besonders bevorzugte Klammer umfasst einen Petid-Nukleinsäure Oligomer (PNA), ein Nukleinsäureanalog, bei dem das natürliche Phosphodiester-Deoxyribose Rückrat durch N-(2-Aminoethyl)-Glyzin ersetzt wurde, eine Peptid-artige Einheit (Nielsen, 1991). PNA Klammern der vorliegenden Erfindung sind in der Lage mit komplementären Sequenzen in dem Klammer-spezfischen Teil der Sonde durch Watson/Crick Basenpaarung zu basenpaaren. Bindung von PNA an eine Sonde kann entweder in paralleler oder anti-paralleler Orientierung der PNA erfolgen, obwohl die anti-parallele Duplex wesentlich stabiler ist (Egholm, 1993). Bei der binären Zusammensetzung, bei der die DNA Klammer konstruiert wurde, eine Triplex Struktur mit zwei Sonden- oder Primer-spezifischen Sequenzen zu bilden, kann eine Gelenk Region entweder am 3' Terminus der Sonde oder Richtung des 5' Endes der Sonde sein (13).
  • Sich wiederholende Sequenzen werden in dem Sonden-spezifischen Teil der Klammer ihrem Komplement in dem Klammer-spezifischen Teil der Sonde bevorzugt wegen ihrer: (i) hohen Affinität, (ii) hohen Spezifität, und (iii) hohen Löslichkeit. Eine besonders bevorzugte sich wiederholende Sequenz in dem Sonden-spezfischen Teil einer Duplex bildenden Klammer ist (CAG)n, wobei die 3 Basensequenz von 1 bis 10 Mal wiederholt wird (Boffa, 1995; Wittung, 1997). Bevorzugte sich wiederholende Sequenzen in dem Sonde-spezifischen Teil einer Triplex bildenden Klammer sind (TCC)n und Analoge, die Sondensequenz (GGA)n binden.
  • PNA Klammern können unter Verwendung konventioneller Verfahren auf kommerziell verfügbaren, automatisierten Synthetisierern, mit kommerziell verfügbaren Reagentien synthetisiert werden (Dueholm, 1994; Vinayak, 1997; Van der Laan, 1997).
  • C. Nukleinsäureanaloge der binären Sonden- und Klammerzusammensetzungen
  • Sonden und Klammern können verschiedene Nukleinsäureanaloge mit Modifikationen an den Nukleobase, Zucker, und/oder Internukleotid-Einheiten enthalten.
  • Bevorzugte Nukleobasenanalog Modifikationen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, C-5-Alkylpyrimidine, 2-Thiopyrimidin, 2,6-Diaminopurin, C-5-Propyn Pyrimidin, 7-Deazapurin, Isocytidin, Pseudo-Isocytidin, Isoguanosin, 4(3H)-Pyrimidon, Hypoxanthin, 8-Oxopurine und universale Base (Meyer, 1994).
  • Bevorzugte Zuckeranalog Modifikationen in einem oder mehreren Nukleosiden schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, 2'- oder 3'-Modifikationen, bei denen die 2'- oder 3'-Position Wasserstoff, Hydroxy-, Methoxy-, Ethoxy-, Allyloxy-, Isopropoxy-, Butoxy-, Isobutoxy-, Methoxyethyl-, Alkoxy-, Phenoxy-, Azido-, Amino-, Alkylamino-, Fluoro-, Chloro- und Bromo- sein kann.
  • Andere bevorzugte Zuckeranalog Modifikationen schließen ein 4'-α-anomerische Nukleotide, 1'-α-anomerische Nukleotide, 2'-verzweigende Gruppen-Ribonukleotide, und 2'-O-verzweigende Gruppen-Ribonukleotide. Die Struktur unten veranschaulicht zahlreiche bevorzugte 2'-Zucker Modifikationen.
    Figure 00200001
    X=NH2, F, Cl, CH2CH=CH2, und OR, wobei R CH3, CH=CHCH2, CH2CH2OCH3, und niedriges Alkyl ist.
  • Bevorzugte Internukleotid Analoge zwischen einem oder mehreren Nukleotiden schließen ein, sind aber nicht eingeschränkt auf: (i) Substitution von Sauerstoff in der Internukleotid Verbindung durch Schwefel, Kohlenstoff, oder Stickstoff, und (ii) Sulfat, Carboxylat, und Amid Internukleotid Phosphodiester Verbindungen. Andere bevorzugte Internukleotid Analoge schließen ein; 2-Aminoethylglycin (PNA), 2'-5'-Verbindung, invertierte 3'-3' Verbindung, invertierte 5'-5' Verbindung, Phosphorothioat Phosphorodithioat, Methyl Phosphonat, nicht-verbrückendes N-substituiertes Phosphoramidat, Alkylierte Phosphotriester verzweigte Struktur, und 3'-N-Phosphoramidat.
  • D. Markierung von Sonden und Klammern
  • Markierungen auf den Sonden und Klammern der binären Zusammensetzungen können einer Vielzahl von Funktionen dienen, einschließlich der Ermöglichung von Detektion, Verstärkung der Affinität, und Stabilisierung der Hybridisierung. Verfahren für das Anbringen von Markierungen an Oligonukleotide und Nukleinsäure Analoge sind wohl bekannt (Hermanson, 1996). Markierungen können bei Oligonukleotiden und Nukleinsäure Analogen an zahlreichen Anbringungsstellen angebracht sein einschließlich; (i) der Termini, z.B. 5' und 3' Termini der Sonden, (ii) der Internukleotid Verbindungen, (iii) der Zucker, und (iv) der Nukleobasen Gruppen.
  • Markierungen, z.B. fluoreszierende Farbstoffe, können mit dem Oligonukleotid oder Nukleinsäure Analog durch geeignete Funktionalisierung der Markierungen und/oder der Monomere, z.B. Phosphoramidit Nukleoside verbunden werden. Eine ausführliche Beschreibung darüber, wie Markierungen mit Nukleinsäure und Analogen verbunden werden, sind frei in der Literatur verfügbar (Theisen, 1992; Andrus, 1995; Hermanson, 1996; Ju, 1995). Ein Verfahren, um kovalent einen fluoreszierenden Farbstoff und/oder Quencher an das 5' Hydroxyl eines Oligonukleotids zu binden ist durch Koppelung von fluoreszierendem Farbstoff und Quencher Phosphoramidit Monomeren (Theisen, 1992). Diese Monomere werden in einer Acetonitril Lösung in dem automatischen Synthetisierer vorgelegt und als das letzte Monomer an das Träger gebundene Oligonukleotid gekoppelt. Alternativ können Nukleobase Einheiten der Oligonukleotide intern nach Spaltung vom Träger und Deprotektion markiert werden. Ein drittes Verfahren liegt dann vor, wenn eine nukleophile reaktive Gruppe, wie eine Amino- oder Thiol-Gruppe, auf der Nukleobase mit einem aktiven Ester oder anderen reaktiven Gruppe auf einer Markierung koppeln kann. Zum Beispiel kann ein Amino Linker, der an der Position 5 von Cytidin oder Thymin angebracht ist, mit einem NHS-Ester des Carboxy-FAM Farbstoffs koppeln, um eine Amid Bindung zu bilden, zur Markierung eines Oligonnukleotids an jedem vorbestimmten Nukleotid innerhalb eines Oligonukleotids (Ruth, 1990; Meyer, 1994). Der 5' Terminus von Oligonukleotiden kann auch in dieser Weise markiert werden (Andrus, 1995). Phosphate und Phosphat Analoge können auch mit ähnlichen Verfahren markiert werden (Agrawal, 1990). Festphasensynthese Träger können Markierungen, z.B. fluoreszierende Farbstoffe, tragen, um 3' markierte Oligonukleotide zu produzieren (Woo, 1996; Mullah, 1997; Mullah, 1998). Das 3' terminale Nukleotid der Sonde kann weiterhin blockiert werden und ihm dadurch die Fähigkeit entzogen werden, durch eine Nukleinsäure Polymerase verlängert zu werden. Solche 3' Blockierungen werden in einfacher Weise durch chemische Anbringung einer Phosphat Gruppe durchgeführt (Horn, 1986; kommerziell erhältlich als PhosphaLink, PE Biosysthems).
  • PNA Klammern können an den Carboxy und Amino Termini und an den Nukleobasen durch die selben aktivierten Ester Verfahren (NHS), die oben für Oligonukleotide beschrieben wurden, und durch andere konventionelle Verfahren, markiert werden.
  • Hybridisierungs-Stabilisierungs-Einheiten schließen ein, sind aber nicht eingeschränkt auf, Binder der kleinen Grube, interkallierende Agentien, Polykatione, wie Poly-Lysin und Spermin, und quervernetzende funktionale Gruppen. Hybridisierungs-Stabilisierungs-Einheiten können die Stabilität der Basenpaarung oder Hybridisierungsrate, d.h. die Affinität, erhöhen. Hybridisierungs-Stabilisierungs-Einheiten dienen dazu, die Spezifität der Basenpaarung zu erhöhen, was sich ausdrückt in großen Unterschieden der thermalen Schmelztemperaturen, Tm, zwischen perfekt komplementärer Sonden- und Zielsequenz und einer Sonde, die eine oder mehrere Fehlpaarungen der Watson/Crick Basenpaarung enthält. Bevorzugte Binder der kleinen Grube schließen ein Hoechst 33258, CDPI1-3, MGB1, Netropsin und Distamycin (Blackburn, 1996). Ein Beispiel für einen Binder der kleinen Grube ist CDPI3 (Kutyavin, 1996; Lukhtanov, 1995) mit der Struktur
    Figure 00220001
    wobei L ein Linker oder eine Anbringungsstelle für die Markierung von Sonden und Klammern ist.
  • Die Carboxyl Gruppe von Bindern der kleinen Grube, wie CDPI1-3 und MGB1 (11) kann als NHS Ester zur Koppelung an Amin Gruppen oder als Phosphoramdidite zur direkten Markierung durch automatisierte Synthese aktiviert werden. Binder der kleinen Grube, wenn sie als Markierung an Sonden oder Klammern in binären Sonden- und Klammerzusammensetzungen vorliegen, können die Affinität und Spezifität der Hybridisierung an einige oder fast alle Zielsequenzen erhöhen (Blackburn, 1996, S. 337–46) (6).
  • Fluoreszierender Farbstoff, der nützlich für die Markierung von Sonden und Klammern ist, schließt ein; FAM, TET, HEX, JOE, TAMRA, ROX, VIC, NED, Dichloro-Fluoreszin, Dichloro-Rhodamin und Zyanine (Bergot, 1994, Menchen, 1993). Quencher schließen ein; TAMRA, ROX, DABCYL, DABSYL, Malachitgrün, und Zyanine. Zynanine können die Struktur
    Figure 00220002
    haben, wobei R1 oder R2 H, niedriges Alkyl, niedriges Alkylen, niedriges substituiertes Alkylen, Phenyl-, oder Aryl- ist; X ist S, O, NH oder N-R; R3 ist Nitro-, Halo-, Sulfonat, Hydroxy, Amino-, niedriges Alkyl- oder Trihalomethyl, und n = 0–2 (Kubista, 1997). Die Markierungsstelle zur Markierung der Sonden oder Klammern kann an R1, R2 oder R3 sein.
  • Eine andere bevorzugte Klasse von Markern umfasst chemilumineszente Verbindungen. Besonders bevorzugt sind chemilumineszente Farbstoff mit der Struktur
    Figure 00230001
    wobei R1 Wasserstoff oder Halogen ist; R2 ist Phosphat, Galactosid, Glucosid, Glucuronid, Trialkylsilyloxy, Acyloxy oder Wasserstoff; R3 ist Methyl-, Ethyl- und niedriges Alkyl, und L ist ein Linker zu der binären Zusammensetzung (Bronstein, 1994; Bronstein, 1990). Affinitätsliganden schließen ein Biotin, Dinitrophenyl, Digoxigenin, Cholesterin, Polyethylenoxy, und Peptide.
  • Fluorescin Farbstoffe schließen ein 6-Carboxyfluorescin (6-FAM), 2',4',1,4,-Tetrachlorofluorescin (TET), 2',4',5',7',1,4-Hexachlorofluorescin (HEX), 2',7'-Dimethoxy-4',5'-Dichloro-6-Carboxyrhodamin (JOE), 2'-Chloro-5'-Fluoro-7',8'-fusioniertes Phenyl-1,4-Dichloro-6-Carboxyfluorescin (NED) und 2'-Chloro-7'-Phenyl-1,4-Dichloro-6-Carboxyfluorescein (VIC) (9). Die 5-Carboxy Isomere sind auch nützlich. Andere Ausführungsformen von fluoreszierenden Farbstoffeinheiten sind Zyanin-Farbstoffe, Dansyl Derivate und dergleichen.
  • Eine andere bevorzugte Klasse von Markern schließen Quencher Einheiten ein. Besonders bevorzugte Quencher schließen ein, sind aber nicht eingegrenzt auf (i) Rhodamin Farbstoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetramethyl-6-Carboxyrhodamin (TAMRA), Tetrapropano-6-Carboxyrhodamin (ROX), und (ii) DABSYL, DABCYL, Zyanin Farbstoffe einschließend Nitrothiazolblau (NTB), Anthraquinon, Malachitgrün, Nitrothiazol und Nitroimidazol Verbindungen und dergleichen (10).
  • Erfindungsgemäße Fluorescin (links) und Rhodamin (rechts) Derivate können die unten angegebene allgemeine Struktur und das Nummerierungssystem haben, wobei L ein Linker ist, und an einer oder mehreren der nummerierten Stellen substituiert sein kann.
  • Figure 00240001
  • III. Verfahren unter Verwendung von binären Sonden- und Klammerzusammensetzungen
  • Erfindungsgemäße binäre Sonden- und Klammerzusammensetzungen können in jedem Hybridisierungsassay verwendet werden, bei dem die Sonde an das komplementäre Ziel hybridisieren (2).
  • Hybridisierung ohne Amplifikation kann durch Fluoreszenz einer binären unmarkierten Sonde und einer Fluoreszenz markierten Klammerzusammensetzung detektiert und gemessen werden (4). Das Verfahren zieht nach sich: i) Hybridisieren der binären Sonden- und Klammerzusammensetzung an das Ziel, ii) Waschen oder Entfernen ungebundener Zusammensetzung, und iii) Detektieren und Messen der Fluoreszenz der gebundenen Zusammensetzung/Ziel Duplex.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die binäre Sonden- und Klammerzusammensetzung markiert sein, so dass eine einzelne Klammersequenz ausgewählt sein kann an viele verschiedene Sondensequenzen zu hybridisieren zum Zwecke der Wirtschaftlichkeit, Bequemlichkeit, und vereinfachten Verteilung und Handhabung. Ein einzelner Klammer-spezifischer Teil kann in viele Sonden eingebaut werden, die verschiede Ziel-spezifische Teile umfassen. Eine einzelne komplementäre Klammersequenz kann dann in vielen Nukleinsäure Hybridisierungsassays dienen. Zum Beispiel kann eine markierte Klammer, die im 2 μmol Maßstab hergestellt wurde > 100,000 Assays bereitstellen, bei denen ungefähr 10 pmol pro Assay benötigt werden. Unmarkierte Sonden haben Kosten- und Simplizitätsvorteile, wenn sie in Zusammensetzungen mit markierten Klammern verwendet werden. Da das Markieren von Sonden teuer und arbeitsintensiv ist, ist die vielseitige Anwendbarkeit der binären Sonden- und Klammerzusammensetzung eine hoch gewünschte Eigenschaft. Zusätzlich können multiple Loci einer Zielprobe in einem einzigen Reaktionsgefäß getestet werden, indem mit multiplen Zusammensetzungen sondiert wird, bei denen jede Sequenz mit einen unterschiedlichen und spektral auflösbaren fluoreszierendem Farbstoff markiert ist. Die jeweiligen Emissionsspektren der fluoreszierenden Farbstoffeinheiten innerhalb eines Reaktionsgefäßes müssen genügend nicht überlappend sein, so dass separate Emissionsbeiträge aufgelöst werden können. Die separaten Spitzen können quantifiziert werden, korrelierend mit der relativen Menge der Zielsequenzen, d.h. Amplifikationsprodukten.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Sonden und Klammern in quantitativen Verfahren und Reagentien verwendet werden, die z.B. Echtzeitmessung der Amplifikationsprodukte während der PCR ermöglichen (Holland, 1991; Higuchi 1992; Higuchi, 1993; Gelfand, 1993; Livak, 1996). Der Exouklease Assay (Taqman®) unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff-Quencher Sonden (Livak, 1995) erlaubt direkte Detektion von Polymerase Ketten Reaktions (PCR) Produkten in einem geschlossenem Reaktionsgefäß System, ohne Probenbearbeitung, die über das, was notwendig ist, um PCR durchzuführen, hinaus gehen würde. In dem Taqman Assay verdrängt und spaltet die Polymerase, die auch Primerverlängerung durchführt und das Polynukleotid amplifiziert, eine Sonde, die an das Ziel anncalt ist durch 5' zu 3' Exonuklease Aktivität. In einem Taqman-artigen Assay ist die Sonde selbst quenchend und enthält fluoreszierende Farbstoff und Quencher Einheiten. Spektrale Überlappung ermöglicht effizienten Energietransfer (FRET), wenn die Sonde intakt ist (Clegg, 1992). Wenn sie an ein Ziel hybridisiert ist, wird die Sonde während der PCR gespalten um ein fluoreszierendes Signal freizusetzen, das proportional ist zu der Menge des vorhandenen Ziel-Sonden Hybrids (Livak, 1996; Livak, 1998).
  • In einem Taqman-artigen Assay kann Polymerase mit geeigneter Exonuklease Aktivität die Sonde der binären Zusammensetzung während der Amplifikation im Wesentlichen schneiden, um den fluoreszierenden Farbstoff von dem Quencher Farbstoff zu trennen. In einer erfindungsgemäßen selbst quenchenden binären Sonden- und Klammerzusammensetzung, wenn die Sonde an die Klammer hybridisiert ist, bewirkt die Nähe des fluoreszierenden Farbstoffs zum Quencher, dass die Fluoreszenz des fluoreszierenden Farbstoffs gequencht wird (3). Wenn die Sonde nicht an die Klammer hybridisiert ist, wird die Fluoreszenz des fluoreszierenden Farbstoffs nicht gequencht (1). Der Klammer-spezifische Teil der Sonde bleibt an den Sonden-spezifischen Teil der Klammer nach Spaltung gebunden (8).
  • Ein fluoreszierendes Farbstoff-Quencher Paar für eine bestimmte binäre Sonden- und Klammerzusammesetzung wird ausgewählt, so dass das Emmissionsspektrum des fluoreszierenden Farbstoffs mit der Absorption des Quenchers überlappt. Die Sonde kann entweder mit dem fluoreszierenden Farbstoff oder dem Quencher markiert werden und die Klammer wird dann mit dem anderen markiert. Der Quencher wird von seiner engen Nähe zu dem fluoreszierenden Farbstoff nach Spaltung freigesetzt, so dass das Signal des fluoreszierenden Farbstoffs nicht länger gequencht wird. Ein Anstieg der Fluoreszenz ereignet sich, der direkt und proportional mit dem Anstieg der Kopien des PCR Produkts korreliert (8). Durch Verwendung von Echtzeit oder Endpunkt Analyse können Detektion und Quantifizierung der PCR Produkte erreicht werden, indem der Anstieg der Fluoreszenz der gespaltenen selbst quenchenden fluoreszierenden Sonden gemessen wird. Zwei oder mehrere selbst-quenchende binäre Zusammensetzungen bestehend aus Sonden mit unterschiedlichen Farbstoffen können parallel oder sequentiell mit den verschiedenen Stellen auf einem Ziel-Polynukleotid hybridisiert werden.
  • Auf diese Weise können Hybridisierungsereignisse durch Fluoreszenz detektiert und gemessen werden. Das Hybridisierungsereignis kann reversibel sein, beeinflusst sein von den Bedingungen, die typischerweise Basenpaarung schmelzen oder unterbrechen, z.B. denaturierenden Agentien oder Erhitzung. Das Vorliegen oder die Abwesenheit von spezifischen Zielsequenzen kann in einer Probe detektiert werden.
  • Selbst quenchende binäre Zusammensetzungen können weiterhin markiert sein, zum Beispiel mit Hybridisierungs Stabilisierungs Einheiten, so wie Binder der kleinen Grube (5). Der Binder der kleinen Grube kann die Spezifität und Affinität der Bindung zwischen dem Ziel und der Sonde erhöhen.
  • Selbstverständlich können diese Verfahren verallgemeinert werden, so dass sie eine Vielzahl von unabhängig detektierbaren Markierungen enthalten, z.B. fluoreszierenden Farbstoffen mit spektrale auflösbaren Emississonspektren, z.B. um die simultane Detektion und Amplifikation von zahlreichen Ziel-Nukleinsäuren in einer einzelnen Reaktion zu beobachten, so dass eine Vielzahl von Detektionssignalen beobachtet wird. Solche Multimarkierungssysteme sind vorteilhaft bei Anwendungen, die der Analyse von multiplen Sondenexperimenten und multiplen Amplifikationen, die in einem einzelnen Gefäß sich ereignen, bedürfen. Wenn in solchen Systemen die Markierungen fluoreszierende Farbstoffe sind, kann jeder Farbstoff durch spektrale Auflösung identifiziert werden, wodurch multiple Zielidentifikation ermöglicht wird (Livak, 1996; Menchen, 1993; Bergot, 1994).
  • Binäre Sonden- und Klammerzusammensetzungen mit selbst quenchenden fluoreszierenden Farbstoff Quencher Einheiten können in Verbindung mit einer Vielzahl von Nukleinsäure Amplifikationsverfahren verwendet werden. Beispielhafte Amplifikations Techniken, die mit dem erfindungsgemäßen System verwendet werden können, schließen ein PCR, Ligase basierte Amplifikationstechniken, wie Ligase Ketten Reaktion (Barany, 1991), Q-beta Replicase, und Strangverdrängungsamplifikationstechniken (Walker, 1992).
  • Binäre Primer und markierte Klammerzusammensetzungen können verwendet werden, um die Zielsequenzen durch PCR zu amplifizieren, um markierte PCR Produkte zu erzeugen (6 und 7). Die Markierung der resultierenden PCR Produkte kann durch Hybridisierung mit dem Klammer-spezifischen Teil des Primers binden. Bei diesen Verfahren können unmarkierte Primer verwendet werden, die wesentlich wenig kostspielig und arbeitsintensiv sind bei der Herstellung als markierte Primer, wie 5' fluoreszierende Farbstoff markierte Primer. Jeder unmarkierte Primer kann eine konservierte Klammer spezifische Sequenz haben, wie AAAGGAGGA-3' am 5' Terminus zur Bindung an eine konservierte Seqeunzklammer, enthaltend die Primer spezifische Sequenz TCCTCCTTTT, und Analoge davon. Alternativ kann der unmarkierte Primer eine konservierte Homopyrimidin Sequenz am 5' Ende haben, die nach Amplifikation Teil des PCR Produkts wird. Die markierte Klammer hat die gleiche Homopyrimidin Sequenz, um spezifisch eine detektierbare Duplex oder Triplex Struktur mit der Homopurin Komplementsequenz an einem 3' Terminus des PCR Produkts zu bilden (7). Somit kann eine einzelne Synthese einer markierten Klammer für viele Markierungs-PCR Experimente ausreichen.
  • IV. Beispiele
  • Die Erfindung wird noch klarer werden durch eine Berücksichtigung der folgende Beispiele, die rein als Beispiele für die vorliegende Erfindung dienen sollen, und in keiner Weise ihren Umfang beschränken soll. Beispiel 1. Synthese von markierten Sonden A. 5' fluoreszierende Farbstoff Sonden
    Figure 00270001
    BAK – Bak Polymorphismus in dem Gen für „human platelet membrane glycoprotein IIb" (Lyman, 1990)
    GTT1 – humanes Gen für Glutathion S Transferase, Theta-Klasse (Pemble, 1994) B. 3' Quencher Sonden
    Figure 00270002
    Figure 00280001
    C. 5' Quencher-2'-O-Methyl RNA/DNA Chimären Sonden
    Figure 00280002
    Fettgedruckte Buchstaben sind 2'-O-Methylnukleotide D. 3' Fluoreszierender Farbstoff, 5-Propynyl enthaltende Sonden
    Figure 00280003
    C und T (fett, unterstrichen) sind 5-Propynyl Cytidin bzw. 5-Propynyl Thymin Nukleotide. E. 2,6-Diaminopurin (DAP) enthaltende Sonden
    Figure 00280004
    A (fettes, unterstrichenes A) sind DAP Nukleotide (Kutyavin, Rhinehart, 1996) F. 2-Thiopyrimidine enthaltende Sonden
    Figure 00280005
    T (fettes, kursives T) sind 2-Thiopyrimidin Nukleotide (Kutyavin, Rhineart, 1996)
  • Figure 00290001
  • Sonden wurden synthetisiert im 0.2 μmol Maßstab auf dem Model 394 DNA/RNA Synthetisierer. Die 5' fluoreszierenden Farbstoffe wurden als fluoreszierende Farbstoff Phosphoramidite (0.1 M in Aetontril) mit einer verlängerten 120 Sekunden Koppelungszeit angebracht. Die 5' fluoreszierenden Farbstoff markierten Oligonukleotide wurden in konzentriertem Ammonium Hydroxid für 2 Stunden bei 65°C deprotektiert. Die 3' Quencher Sonden wurden mit Quencher Trägern mit der unten angegebenen Struktur und anderen strukturellen Variaten synthetisiert (Mullah, 1997; Mullah, 1998). Die Markierung ist an einem Linker angebracht, der Anbringungsstellen für den festen Träger S und die DMT geschützte Hydroxyl Stelle für die Initierung der Oligonukleotid Synthese besitzt. Der feste Träger kann Glas mit kontrollierten Poren oder Polystyrol sein. Nach Beendigung der Synthese, wird die Esterbindung gespalten, wodurch das 3' markierte Oligonukleotid von dem festem Träger mit der unten angegebenen Struktur getrennt wird.
  • Figure 00290002
  • Beispiel 2. Synthese von PNA Klammern
  • Automatisierte Synthese von PNA wurde durchgeführt unter Verwendung eines ABI Model 394 DNA/RNA Synthetisierers oder 433A Peptidsynthetisierers (Perkin-Elmer Co.) gemäß den allgemeinen Verfahren, die in der Synthetisierer Gebrauchsanweisung des Herstellers beschrieben wurden, wie auch bei Egholm, 1993.
  • PNA Klammern wurden im 2.5 μmol Maßstab im Wesentlich so synthetisiert, wie zuvor berichtet (Dueholm, 1994). Das Carboxy-terminale Lysin von PNA wurde auf einem MBHA festen Träger vorgelegt, vorgeladen mit t-Boc-lys (Fmoc). PNA mit Carboxy-terminalen Amiden wurde entweder direkt auf einem MBHA Träger oder auf einem MBHA Träger, der mit dem t-Boc T PNA Monomer vorgeladen war, synthetisiert. Alle Kügelchen wurden mit 0.1 bis 0.25 mmol/g geladen. Interne Lysinreste (K) wurden als t-Boc-lys (clbz) gekoppelt außer bei der Herstellung von Klammer SEQ. ID NO. 23, die interne Markierung benötigte und mit t-Boc-lys (Fmoc) hergestellt wurde. Eine Piperidin Waschung wurde nach dem Capping Schritt durchgeführt, wurde aber weggelassen, wenn t-Boc-lys (Fmoc) in den PNA Zusammenbau aufgenommen wurden. Ein Teil einer repräsentativen PNA Struktur ist abgebildet (12) mit Thymin T, Cytidin C, und Pseudo-isocytidin J Nukleobasen. Der Spacer O, 2-[2-(2-Aminoethoxy]essigsäure, wird als das Fmoc-Amino geschützte Synthon gekoppelt. Eine oder mehrere Spacer O Einheiten funktionieren als eine flexible, nicht Basen paarende Gelenkregion n Tripel Helix bildenden Klammern (13). Synthese von PNA kann auf einem MBHA (Methylbenzhydrylamin) Linker, hoch geladenem Polystyrol Träger im 2–50 μmol Maßstab durch einen Zyklus von Stufen durchgeführt werden. Der Zyklus wird für jede Boc-PNA Monomer Addition (Koch, 1997; Dueholm, 1994) durchgeführt und wird in der Tabelle unten zusammengefasst.
    Figure 00300001
    • DIEA
    Diisopropylethylamin
    TFA
    Trifluoressigsäure
    HATU
    1-Hydroxy-7-Azabenzotriazol-Tetramethyluronium Hexafluorophosphat
    DCM
    Dichloromethan
    DMF
    Dimethylformamid
  • Tabelle. PNA Synthese Zyklus auf dem Modell 433A Synthetisierer
  • Die Synthese von PNA wurde mit Standard Synthese Techniken und Nukleobase (Abz, Cbz, Gibu, T) und primären Amino (MMT, Fmoc, oder Boc) Schutzgruppen durchgeführt. Ein 3 ml Reaktionsgefäß wird bei dem 5 μmol Maßstab mit einem Gesamtvolumen von 440 μl verwendet. Am Ende der Synthese wird PNA mit TFMSA (Trifluoromethansulfonischer Säure) bei Raumtemperatur für 1 Stunde gespalten, gefolgt von Äther Präzipitation der rohen PNA.
  • Beispiel 3. Synthese von PNA/DNA Chimären Klammern
  • Automatisierte Synthese von PNA/DNA Chimären wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA Synthetisierers oder 433A Peptidsynthetisierers gemäß den allgemeinen Verfahren, die in der Gebrauchsanweisung wie auch von Uhlmann, 1996; van der Laan, 1997; Vinayak, 1997 beschrieben wurden.
  • Der Träger, der für die PNA/DNA Chimären Synthese verwendet wurde, ist ein nicht quellendes, hoch quervernetztes Polystyrol Kügelchen mit einem Hydroxymethylbenzosäuren Linker (Vinayak, 1997). PNA Monomeren für die Chimären Synthese verwenden die Monomethoxytrityl (MMT) Gruppe für den primären Amino Schutz. Im ersten Schritt werden die Monomere HATU und DIPEA, jeder gelöst in DMF/Acetonitril, 1/1, zusammen in die Reaktionskammer eingeführt. Nach 16 Min werden die Capping Reagentien zugeführt. Um die Neigung der primären Amino Funktion von PNA zu wandern oder zu zyklieren zu minimieren, wird der Amino Terminus acetyliert nach Entfernung der letzten MMT Gruppe. Reagentien DNA und PNA Einheiten zu verbinden, und andere Verfahren zur Chimären Synthese, Spaltung, Deprotektion und Aufreinigung wurden beschrieben (Van der Lann, 1997). In diesem Ansatz können die Chimären kontinuierlich, in einer einzelnen Kammer oder einem einzelnen Synthetisierer hergestellt werden.
  • Beispiel 4. Markierung von Klammern A. Quencher-PNA Klammer
    Figure 00320001
  • B. Fluoreszierende Farbstoff PNA Klammer
    Figure 00320002
  • C. MGB, Markierungs-PNA Klammer
    Figure 00320003
  • D. Quencher und Binder der kleinen Grube markierte 2'-O-Methyl RNA Klammern
    Figure 00320004
  • E. 5-Propenyl enthaltende PNA Klammer
    Figure 00330001
  • PNA Sequenzen werden mit Amino Terminus auf der linken, Carboxyl Terminus auf der rechten Seite geschrieben, 2'-O-Methyl RNA Sequenzen werden mit dem 5' auf der linken 3' auf der rechten Seite geschrieben.
  • Klammersequenzen SEQ. ID NOS. 19–21, 22, 23, 28, 29, 31–37 wurden konstruiert die Sequenz AAAGGAGGA-3' am 3' Ende der Sonde zu klammern. Klammer SEQ. ID NOS. 25, 27, 38, 40 und 24, 26, 30, 39 binden den kürzeren Sequenzen AAGGAGGA bzw. AGGAGGA. Klammer SEQ. ID NOS. 22–26, 28, 29, 35–39 enthalten eine Gelenkregion, die zum 5' Ende der Sonde hin orientiert ist, und Termini komplementär zu dem 3' Terminus der Sonde, während Klammern SEQ. ID NOS. 19–21, 31–34 eine Gelenkregion haben, die zum 3' Ende der Sonde hin orientiert ist, und Termini komplementär zu dem 5' Terminus der Sonde (13). Klammer SEQ. ID NOS. 19 und 22 sind repräsentativ für die stabilsten Orientierungen von PNA zu DNA. Das PNA/DNA Hybrid ist in der antiparallelen Orientierung, wenn der Amino Terminus der PNA gepaart ist mit dem 3' Terminus der DNA, und der Carboxy Terminus der PNA mit der 5' Termiuns der DNA gepaart ist. Das Amino Ende des Watson-Crick Basenpaarungsteils der PNA Klammern, (C)-TTTCCTCCT(N), ist in der anti-parallelen Orientierung gegenüber dem 3' Terminus der Sonde. Das Carboxyl Ende des Hoogsteen Basenpaarungsteils der PNA Klammern, (N)-TTTJJTJJTC-(C) ist in der parallelen Orientierung gegenüber dem 3' Terminus der Sonde. Diese Orientierungen erwiesen sich als die stabilsten in (PNA)2/DNA Triplexe (Egholm, 1995, Egholm, 1993). Klammern SEQ. ID NOS. 27, 30, 40 bilden Duplex Strukturen mit einer Sonde, während Klammern SEQ. ID NOS. 19–26, 28, 29, 31–39, 41, 42 Triplex Strukturen mit einer Sonde bilden.
  • Alle berichteten Markierungsreaktionen für Klammern sind für eine 2 μmol Synthesepräparation. Vor der internen und der Amin Terminus Markierung wird die Fmoc Schutzgruppe durch die Lysin (K) Seitenkette durch Behandlung der Träger gebundenen geschützten PNA mit 4:1 DMF:Piperidin für drei Stunden bei Raumtermperatur entfernt. Die Amin Terminus t-BOC Gruppe wurde durch Behandlung der Träger gebundenen PNA mit 19:1 TFA:Metacresol für 10 Minuten entfernt. Der Träger wurde ausgiebig mit DMF und DCM gewaschen nach der Deprotektion. Carboxy terminale und interne Markierungen wurden an der Lysin Seitenkette angebracht. Carboxy terminale Markierung wurde vor der Amin Terminus Deprotektion und Markierung durchgeführt, außer für Klammer SEQ. ID NO. 21, bei der die Markierung beider Termini gleichzeitig durchgeführt wurde.
  • PNA wurde am Carboxy Terminus mit MGB1 und CDPI3, und NTB und TAMRA am Amin Terminus markiert.
  • TAMRA und NTB Markierung:
  • Markierung wurde mit 5 mg NHS Ester von TAMRA oder NTB, gelöst in 100 μl DMF oder NMP und 10 μl DIEA hinzugefügt zu dem Träger gebundenen PNA und für 2 bis 18 Stunden (typischerweise über Nacht) reagieren gelassen, durchgeführt. Der Träger wurde nach der Markierung mit DMF und nach DCM vor der Spaltung gewaschen.
  • MGB1 Markierung:
  • Die Carboxyl Säure von MGB1 (Gong, 1997) (5 mg, 0.010 mmol) wurde in 100 μl DMF (11) gelöst und aktiviert durch die Zugabe von 0.95 Äquivalenten HATU (0.2 m in DMF) und 5 μl DIEA. Die aktivierte MGB1 Lösung wurde zu der Träger gebundenen PNA hinzugegeben und erlaubt für 1 Stunde bei Raumtemperatur zu koppeln. Die Kügelchen wurden dann mit DMF und DCM gewaschen, gefolgt von Spaltung.
  • CDPI Markierung:
  • CDPI3 (11) wurde an die PNA durch drei aufeinander folgende Koppelungen von Fmoc-CDPI (Lukhtanov, 1995) angebracht, um CDPI3 markierte PNA zu ergeben. Die CDPI Monomereinheit, 1,2-Dihydro-(3H)-Pyrrolo[3,2-e]Indol-7-Carboxylat, geschützt mit Fmoc (5 mg, 0.012 mmol) wurde in 100 μl NMP gelöst und aktiviert mit 0.95 Äquivalenten HATU (0.2 M in DMF) und 2 Äquivalenten DIEA (0.4 m in DMF). Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wird die aktivierte Fmoc-CDPI Lösung zu dem Träger gebundenen PNA hinzugefügt und erlaubt für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur zu koppeln. Die Kügelchen wurden nach der Koppelung mit 20 ml DMF gewaschen. Das Fmoc wurde durch Behandlung des Kügelchenträgers mit 1:4 Piperidin:DMF für 10 Minuten bei Raumtemperatur entfernt. Dieser Koppelungs- und Deprotektionszyklus wurde zwei zusätzliche Male wiederholt für insgesamt 3 manuelle Koppelungen.
  • Beispiel 5. Hybridisierungsrate von Sonde und Klammer
  • Die Hybridisierungsrate der drei Klammern (SEQ. ID NOS. 19, 20, 21) an eine Sonde (SEQ. ID NO. 1) wurde als eine Funktion des Quenchens gemessen. Der Abfall der Fluoreszenzintensität [F] des FAM Farbstoffs der Sonde nach Hybridisierung und Quenchen durch den Klammer Quencher NTB wurde bei 60°C auf dem ABI Model 7700 gemessen. Äquimolare Mengen der Klammer (100 nM) und der Sonde (100 nM) wurden bei 95°C für 1 Minute gemischt, gekühlt auf 60°C und [F] wurde für 29 Minuten gemessen (14). Eine signifikante Beschleunigung des Quenchens der Sonde wurde durch eine vierfachen Überschuss der Klammer (400 nM) erreicht, bei dem das Quenchen bei jeder der drei Klammern innerhalb von 15 Sekunden praktisch vollständig war (15).
  • Beispiel 6. Exonuklease/Amplifikationsassay mit binären Sonden- und Klammerzusammensetzungen
  • Die folgenden Reagentien wurden gemischt und 25 μl in jedes Probengefäß für PCR verteilt:
    12.5 μl Universal PCR Master Mix (PE Biosystems, P/N 4304437) enthaltend Tris-HCl, Glyzerin, 10 mM MgCl2, dATP, dCTP, deaza dGTP, dUTP, 0.1 u/μl Amplitaq Gold DNA Polymerase, Amperase UNG, und passive Referenz 900 nM (Endkonzentration): GTT1 Vorwärtszielprimer:
    Figure 00350001
    900 nM (Endkonzentration): GTT1 Rückwärtszielprimer:
    Figure 00350002
    100 nM Sonde und 400 nM Klammerzusammensetzung
    10 μl (ungefähr 20 ng) genomische Ziel-DNA
  • Zielproben wurden durch thermische Zyklierungsbedingungen amplifiziert, die mit 2 Min bei 50°C beginnen, bei 95°C 10 Min halten und dann 40 Zyklen von: 15 Sek. Denaturierung bei 95°C und 1 Min Annealen und Verlängerung bei 60°C. Thermisches Zyklieren und Echtzeit Fluoreszenzdektion wurden auf einem ABI PRISMTM 7700 Sequenz Detektionssystem durchgeführt (Perkin-Elmer Co.). Ein bevorzugtes Endpunkt Detektionssystem ist das ABI PRISMTM 7200 Sequenz Detektionssystem.
  • Die Ergebnisse eines Exonukleaseassays können unter Verwendung von zwei Parametern analysiert werden; dem Rn Wert und dem Ct Wert. Der Rn Wert ist der Anstieg der Fluoreszenz während der PCR, oder genauer, das Verhältnis der Fluoreszenz eines fluoreszierenden Farbstoffs und der Fluoreszenz eines passiven fluoreszierenden Referenzfarbstoffs am Ende eines PCR Experiments, d.h. Rn (Ziel) = Emissionsintensität einer Zielsonde ÷ Emissionsintensität der passiven Referenz. Der Ct Wert, oder Schwellenwert Zyklusanzahl, ist die Anzahl an PCR Zyklen, bei der das Fluoreszenz Verhältnis vom Hintergrund unterscheidbar ist. Für einen gegebenen Fluoreszenzfarbstoff und eine festgelegte Konzentration des Ziels, geben sowohl die Rn als auch die Ct Werte die Effizienz des Quenchers wider. Der Term ΔRn ist der Anstieg der Fluoreszenz während der PCR mit Abzug des Hintergrunds oder der Anfangsfluoreszenz.
  • Die Produkte der PCR wurden mit Echtzeit Detektion der Spaltung von binären Sonden- und Klammerzusammensetzungen gemessen. Das BAK Ziel wurde sequentiell in der Gegenwart der binären Sonden- und Klammerzusammensetzungen amplifiziert: 400 nM Klammer (SEQ. ID NOS. 19, 20, 21), 100 nM Sonde (SEQ. ID NO. 1) auf dem ABI Model 7700 (16). Die Änderung der Fluoreszenz ΔRn wurde gegen die Amplifationszyklen aufgetragen. Der Zyklus, bei dem die Änderung der Fluoreszenz vom Hintergrund unterscheidbar ist, Ct, zeigt das Vorhandensein der Zielsequenz an. Wenn die Hintergrundfluoreszenz nicht abgezogen wird, Rn, ist der Unterschied der Quench Effizienz der drei Klammern ausgeprägt (17). Klammer SEQ. ID NO. 21 mit zwei NTB Markierungen quencht besser als Klammer SEQ. ID NO. 19. Klammer SEQ. ID NO. 20 mit drei Lysinmarkierungen quencht besser als Klammer SEQ. ID NO. 19 mit einem Lysin.
  • Das GTT1 Ziel wurde sequentiell amplifiziert in der Gegenwart von: 1) binäre Sonden- und Klammerzusammensetzungen: 100 nM Sonde (SEQ. ID NO. 2) und 400 nM Klammer (SEQ. ID NOS. 20, 21), und 2) Taqman Sonde enthaltend eine fluoreszierenden Farbstoff und einen Quencher:
  • Figure 00360001
  • Echtzeit PCR Detektion wurde gemessen auf dem ABI Model 7700 mit Abzug der Hintergrundfluoreszenz, ΔRn (18), und ohne Abzug der Hintergrundfluoreszenz Rn (19). Kein signifikanter Unterschied im Ct wurde gemessen, wenn die binäre Sonden/Klammerzusammensetzung und die Taqman Sonde verglichen wurden.
  • Obwohl nur wenige Ausführungsformen oben in Detail beschrieben wurden, wird der durchschnittliche Fachmann aus der Molekularbiologie und der Chemie sicherlich verstehen, dass viele Modifikationen der bevorzugten Ausführungsform möglich sind, ohne von den Lehren der Erfindung abzuweichen, die in den folgenden Ansprüchen definiert ist.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
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  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001

Claims (37)

  1. Eine binäre Zusammensetzung zur Hybridisierung an eine Ziel-Polynukleotidsequenz, umfassend: eine Sonde umfassend einen zielspezifischen Teil und einen klammerspezifischen Teil, wobei der zielspezifische Teil zum sequenzspezifischen Binden an eine Ziel-Polynukleotidsequenz fähig ist; und eine Klammer umfassend zwei sondenspezifische Teile, eine oder mehrere Markierungen und beinhaltend Nukleinsäureanaloge ausgesucht aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog; wobei die zwei sondenspezifischen Teile der Klammer fähig sind sequenzspezifisch an den klammerspezifischen Teil der Sonde zu binden, um eine Triplexstruktur zu bilden und die Klammer nicht fähig ist, sequenzspezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu binden.
  2. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Sonde 6 bis 100 Nukleotide umfasst.
  3. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der klammerspezifische Teil der Sonde Purin-Nukleotidanaloge umfasst.
  4. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der sondenspezifische Teil der Klammer Pyrimidin-Nukleobasenanaloge umfasst.
  5. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Klammer 6 bis 50 Nukleobasenanaloge umfasst.
  6. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Klammersequenz (CAG)n umfasst, wobei n = 1–10.
  7. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Klammersequenz (TCC)n und Nukleinsäureanaloge einschließt, die die Sondensequenz (GGA)n binden, wobei n = 1–10.
  8. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Sonde ein Nukleinsäureanalog umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehende aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog.
  9. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei das Nukleobasenanalog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C-5-Alkylpyrimidin, 2,6-Diaminopurin, 2-Thiopyrimidin, C-5-Propynpyrimidin, 7-Deazapurin, Isocytidin, Pseudo-Isocytidin, Isoguanosin, 4(3H)-Pyrimidon, Hypoxanthin, 8-Oxopurin, und einer Universalbase.
  10. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei das Zuckeranalog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2'-O-Alkylribonukleotiden, 2'-O-Methyribonukleotiden, 2'-O-Allyribonukleotiden, 2'-Allyribonukleotiden, 2'-Haloribonukleotiden, 2'-O-Methoxyethylribonukleotiden, 2'-verzweigte Ribonukleotide, 2'-O-verzweigte Ribonukleotide, 4'-α-anomere Nukleotide und 1'-α-anomere Nukleotide.
  11. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei das Internukleotidanalog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-Aminoethylglycin (PNA), 2'-5'-Bindung, invertierte 3'-3'-Bindung, invertierte 5'-5'-Bindung, Phosphorothioat, Methylphosphonat, nicht-überbrückendes N-substituiertes Phosphoramidat, alkylierte verzweigte Phosphotriester Struktur, und 3'-N-Phosphoramidat.
  12. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Klammer einen nicht-basenpaarenden, nicht-nukleosidischen Linker umfasst.
  13. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Klammer einen oder mehrere 2-Aminoethylglycin (PNA) monomere Einheiten umfasst.
  14. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei an die Klammer eine oder mehrere Markierungen an Stellen angebracht sind, die aus einem Terminus, einer Nukleobase, einer Internukleotidbindung, einem Zucker, einer Aminogruppe, einer Sulfidgruppe und einer Carboxylgruppe bestehen.
  15. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Sonde eine oder mehrere Markierungen umfasst.
  16. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei die Markierung an Stellen angebracht ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem 5' Terminus, einem 3' Terminus, einer Nukleobase, einer Internukleotidbindung und einem Zucker.
  17. Die binäre Zusammensetzung gemäß Ansprüchen 1 und 15, wobei die Klammer und Sondenmarkierungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus hybridisierungs- stabilisierenden Gruppen, fluoreszierende Farbstoffe, fluoreszierende Quencher, chemiluminiszierende Farbstoffe, Aminosäuren und Affinitätsliganden.
  18. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei die hybridisierungs-stabilisierenden Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Binder der kleinen Furche, Interkalatoren und quervernetzende funktionale Gruppen.
  19. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 18, wobei die Binder der kleinen Furche aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus Hoechst 33258, CDPI1-3, MGB1, Netropsin und Distamycin.
  20. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei die fluoreszierenden Farbstoffe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus FAM, TET, HEX, JOE, TAMRA, ROX, VIC, NED, 4,7-Dichlorofluorescin, 4,7-Dichlororhodamin, und Zyaniden.
  21. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei die fluoreszierenden Farbstoffe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, NTB, ROX, DABCYL, DABSYL, Malachitgrün und Zyaniden.
  22. Die binäre Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei die chemiluminiszierenden Quencher ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus chemiluminiszierenden Vorläufern mit der Struktur
    Figure 00480001
    wobei R1 Wasserstoff oder ein Halogen; R2 Phosphat, Galactosid, Glucosid, Glucuronid, Trialkylsilyloxy, Acyloxy, oder Wasserstoff; R3 Methyl, Ethyl, ein niederes Alkyl; und L ein Linker ist.
  23. Die binäre Affinitätszusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei die Liganden ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Biotin, Dinitrophenyl, Digoxigenin, Cholesterin, Polyethylenoxy und Peptiden.
  24. Ein Verfahren zur Detektion einer Ziel-Polynukleotidsequenz, umfassend: zur Verfügung stellen einer binären Sonde- und Klammerzusammensetzung umfassend: eine Sonde, umfassend einen zielspezifischen Teil und einen klammerspezifischen Teil, wobei der zielspezifische Teil zur sequenzspezifischen Bindung an eine Ziel-Polynukleotidsequenz fähig ist; und eine Klammer umfassend zwei sondenspezifische Teile, eine oder mehrere Markierungen und beinhaltend Nukleinsäureanaloge ausgewählt von einem Nukleobasenanalog, Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog; wobei die zwei sondenspezifischen Teile der Klammer fähig sind sequenzspezifisch an den klammerspezifischen Teil der Sonde zu binden, um eine Triplexstruktur zu bilden und die Klammer unfähig ist sequenzspezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu binden; hybridisieren des zielspezifischen Teils der Sonde an die Ziel-Polynukleotidsequenz; hybridisieren des sondenspezifischen Teils der Klammer an den klammerspezifischen Teil der Sonde; und Detektion der binären Sonde.
  25. Ein Verfahren zur Detektion von Produkten der Polymerasekettenreaktion, umfassend: zur Verfügung stellen einer binären Sonde- und Klammerzusammensetzung umfassend: eine Sonde, umfassend einen zielspezifischen Teil und einen klammerspezifischen Teil und eine oder mehrere Markierungen, wobei der zielspezifische Teil zur sequenzspezifischen Bindung an eine Ziel-Polynukleotidsequenz fähig ist; und eine Klammer umfassend zwei sondenspezifische Teile, eine oder mehrere Markierungen und beinhaltend Nukleinsäureanaloge ausgewählt aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog; wobei die zwei sondenspezifischen Teile der Klammer fähig sind, sequenzspezifisch and den klammerspezifischen Teil der Sonde zu binden; und die Klammer unfähig ist sequenzspezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu binden; hybridisieren des zielspezifischen Teils der Sonde an die Ziel-Polynukleotidsequenz; hybridisieren des sondenspezifischen Teils der Klammer an den klammerspezifischen Teil der Sonde; und amplifizieren des Ziels mit einer DNA Polymerase mit Exonukleaseaktivität, PCR Primern und Nucleosid 5' Triphosphaten, schneiden der Sonde mittels Exonukleaseaktivität der Polymerase, und Detektion der Markierungen.
  26. Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Markierungen durch Überwachung der emittierten Fluoreszenz in Echtzeit oder am Endpunkt der Zielamplifikation detektiert werden.
  27. Ein Verfahren zur Markierung von Produkten der Polymerasekettenreaktion, umfassend: zur Verfügung stellen eines Primers umfassend einen zielspezifischen Teil und einen klammerspezifischen Teil, wobei der zielspezifische Teil fähig ist, sequenzspezifisch an eine Ziel-Polynukleotidsequenz zu binden; und eine Klammer umfassend zwei primerspezifische Teile, eine oder mehrere Markierungen und beinhaltend Nukleinsäureanaloge ausgewählt aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog; wobei die zwei primerspezifischen Teile der Klammer fähig sind, sequenzspezifisch an den klammerspezifischen Teil des Primers zu binden um eine Triplexstruktur zu bilden; und amplifizieren des Ziels mit einer DNA Polymerase, einem oder mehreren binären Primer- und Klammerzusammensetzungen, einem oder mehreren Primern des entgegengesetzten Strangs und Nukleosid 5' Triphosphate; wobei ein oder mehrere markierte Produkte der Polymerasekettenreaktion resultieren.
  28. Das Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Markierung ein fluoreszierender Farbstoff ist.
  29. Ein Verfahren zur Detektion von Produkten der Polymerasekettenreaktion, umfassend: zur Verfügung stellen eines oder mehrerer Primer(s) umfassend einen zielspezifischen Teil am 3' Ende und einen Homopyrimidinsequenzteil am 5' Ende, wobei der zielspezifische Teil fähig ist, sequenzspezifisch an eine Ziel-Polynukleotidsequenz zu binden; und eine Klammer umfassend zwei Homopyrimidinsequenzteile und eine oder mehrere Markierungen; und beinhaltend Nukleinsäureanaloge ausgewählt aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog; amplifizieren des Ziels mit einer DNA Polymerase, einem oder mehreren Primern des entgegengesetzten Strangs und Nukleosid 5' Triphosphaten; und Detektion der Markierungen, wobei die zwei Homopyrimidinsequenzteile der Klammer an das Komplement der Homopyrimidinsequenz am 3' Terminus des Produkts der Polymerasekettenreaktion binden, wobei die Klammer eine Triplexstruktur mittels Hybridisierung mit dem PCR Produkt bildet.
  30. Das Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Markierung ein fluoreszierender Farbstoff ist.
  31. Ein Kit umfassend: eine Sonde umfassend einen zielspezifischen Teil und einen klammerspezifischen Teil, wobei der zielspezifische Teil fähig ist, sequenzspezifisch an eine Ziel-Polynukleotidsequenz zu binden; und eine Klammer umfassend zwei sondenspezifische Teile, eine oder mehrere Markierungen und ein Nukleinsäureanalog ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleobasenanalog, einem Zuckeranalog und einem Internukleotidanalog; wobei die zwei sondenspezifischen Teile der Klammer fähig sind, sequenzspezifisch an den klammerspezifischen Teil der Sonde zu binden und die Klammer unfähig ist sequenzspezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu binden; und wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus hybridisierungs-stabilisierenden Gruppen, fluoreszierenden Farbstoffen, fluoreszierenden Quenchern, chemiluminiszierenden Farbstoffen, Aminosäuren und Affinitätsliganden.
  32. Das Kit gemäß Anspruch 31, wobei der sondenspezifische Teil der Klammer einen oder mehrere 2-Aminoethylglycin (PNA) monomere Einheiten umfasst.
  33. Das Kit gemäß Anspruch 31, wobei der sondenspezifische Teil der Klammer einen nicht-basenpaarenden, nicht-nukleosidischen Linker umfasst.
  34. Das Kit gemäß Anspruch 31, wobei der sondenspezifische Teil der Klammer Nukleobasenanaloge umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C-5-Alkylpyrimidin, 2,6-Diaminopurin, 2-Thiopyrimidin, C-5-Propynpyrimidin, 7-Deazapurin, Isocytidin, Pseudo-Isocytidin, Isoguanosin, 4(3H)-Pyrimidon, Hypoxanthin, 8-Oxopurin, und einer Universalbase.
  35. Das Kit gemäß Anspruch 31, wobei der klammerspezifische Teil der Sonde Nukleobasenanaloge umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C-5-Alkylpyrimidin, 2,6-Diaminopurin, 2-Thiopyrimidin, C-5-Propynpyrimidin, 7-Deazapurin, Isocytidin, Pseudo-Isocytidin, Isoguanosin, 4(3H)-Pyrimidon, Hypoxanthin, 8-Oxopurin, und einer Universalbase.
  36. Das Kit gemäß Anspruch 31, wobei die Markierungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Binder der kleinen Furche, Interkalatoren und quervernetzende funktionale Gruppen.
  37. Das Kit gemäß Anspruch 31, wobei die Sondenmarkierung und die Klammermarkierung ein fluoreszierendes Farbstoffquencherpaar bilden.
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