JP3628614B2 - 多重核酸検出のためのプローブ／移動度モディファイア複合体 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核酸配列の分析に有用な方法および組成物に関する。特に、本発明は、多重核酸配列の混合物の分析に有用な方法および組成物を提供する。
【０００２】
（背景）
多数の多型遺伝子座の大規模多重分析が可能な核酸分析技術は、実際に重要な種々の適用に必要である（例えば、個体識別（例えば、親子鑑定）のため、法医学的分析において、器官移植のドナー−レシピエント適合のため、遺伝病診断、予後および遺伝子カウンセリングのため、感染因子の特徴付けのため、ならびにオンコジーン変異の研究のため）。これらの適用の多くは、複数の遺伝子座における標的核酸配列中の単一ヌクレオチドの差異を識別する能力に依存する。
【０００３】
核酸の多重分析の問題に対する１つの解決法は、固体支持体に結合した種々の配列の核酸のアレイを使用することである。ここで、結合した核酸の配列は、アレイにおけるそれらの位置に関連する（例えば、ＫｕｃｈｅｒｌａｐｔｉおよびＣｈｉｌｄｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１：１５−１９（１９９９）；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１：２０−２４（１９９９））。しかし、核酸アレイは、いくつかの重大な実質的欠点を有する。これらの欠点としては、以下が挙げられる：（１）アレイの製作に関連する結果（例えば、製作およびアレイの試験（例えば、インサイチュ合成またはスポッティングによる）が高価かつ複雑であること）；（２）一旦製作されたアレイの特徴づけ（例えば、適切な配列が適切な位置に位置づけられることの確認）；（３）各アレイ位置における核酸の完全性（例えば、鎖内架橋および／または固体支持体と結合した核酸との間の多重制限接触状態（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｔａｃｔ）があり得る）；および（４）固体支持体上でのハイブリダイゼーション事象を検出することに関連する困難性（例えば、蛍光バックグラウンドおよび／または支持体への標識した実体の非特異的結合）。
【０００４】
代替的アプローチにおいては、多重プローブが、プローブを電気泳動的に分離することにより分析される。このプローブは、特定のプローブと特定の移動度アドレスとを相関付ける移動度改変テイルを含む（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４５２７−４５３４（１９９４）；Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，６２４，８００号）。しかし、このアプローチは、多数のテイルを付けたプローブの合成を必要とするという欠点を有する。
【０００５】
従って、核酸アレイと関連する欠点もなく、既存の移動度ベースの方法に伴う欠点もない、非常に多重化した分析を可能にする核酸分析技術が依然として必要である。
【０００６】
（要旨）
本発明は、核酸の多重分析に有用な方法および組成物に関する。
【０００７】
第１の局面において、本発明は、混合物中の１つ以上の標的核酸配列を検出するための二成分組成物を提供する。この二成分組成物は、標的核酸配列に対する配列特異的ハイブリダイゼーションのための標的特異的部分、およびタグを有するプローブを含む。この二成分組成物は、テイルおよびタグに結合するためのタグ相補体を有する移動度モディファイアをさらに含む。このプローブおよび移動度モディファイアがタグおよびタグ相補体によって結合される場合、プローブ／移動度モディファイア複合体が形成される。好ましい実施形態において、このプローブは、ポリヌクレオチドを含む。
【０００８】
第２の局面において、本発明は、サンプル中に存在する１つ以上の標的核酸配列を検出するための方法を提供する。この方法において、１つ以上の標的核酸配列を潜在的に含むサンプルは、１つ以上のプローブと、このプローブおよびこの標的核酸配列の配列依存性ハイブリダイゼーションに有効な条件下で接触され、ここで、各プローブは、標的特異的部分およびタグを含む。次いで、このハイブリダイズしたプローブは、改変したプローブを形成するように処理され、ここで、この処理は、標的核酸に結合したプローブと、標的核酸に結合していないプローブとを区別するために有効である。プローブが標的核酸に接触する前またはその後に、このプローブを１つ以上の移動度モディファイアと接触させて、プローブ／移動度モディファイア複合体を形成し、各移動度モディファイアは、会合したプローブのタグに選択的に結合するためのタグ相補体、およびテイルを有する。最終的に、プローブ／移動度モディファイア複合体を、移動度依存性分析技術を用いて分析する。
【０００９】
本発明は、以下の記載された説明、図面および添付の特許請求の範囲を参照してよりよく理解される。
【００１０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ここで、本発明の好ましい実施形態に関して詳細に言及するが、この例は、添付の図面に示される。本発明は、これらの好ましい実施形態とともに記載されるが、本発明はこれらの実施形態に制限されることは意図しないことが理解される。対照的に、本発明は、添付の特許請求の範囲により規定されるように、本発明内に含まれ得るこれらの好ましい実施形態の代替物、改変および等価物を含むことが意図される。
【００１１】
（Ｉ．定義）
他に述べられなければ、本明細書中で使用される場合、以下の用語および句は、以下の意味を有することが意図される。
【００１２】
用語「標識」は、本発明の組成物に結合した場合、このような組成物を公知の検出手段を用いて検出可能にする部分をいう。これらの検出手段としては、例えば、分光学的手段、光化学的手段、放射活性手段、生化学的手段、免疫化学的手段、酵素的手段または化学的手段が挙げられる。例示的標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：発蛍光団、発色団、放射性同位体、スピン標識、酵素標識および化学発光標識。このような標識は、適切な検出器（例えば、蛍光検出器）により標識化合物の直接的検出を可能にする。さらに、このような標識は、複数成分標識スキーム（例えば、リガンドが、検出可能な抗リガンドに特異的に、かつ高親和性で結合するシステム（例えば、標識された抗体は、その対応する抗原に結合する））の成分を含む。
【００１３】
用語「ハイブリダイゼーションエンハンサー」とは、２つのポリヌクレオチド間でハイブリダイゼーションを増強し、安定化し、そうでなければ陽性に影響を与えるように働く部分（例えば、インターカレーター（例えば、米国特許第４，８５３，２６３号）、マイナーグルーブバインダー（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）（例えば、米国特許第５，８０１，１５５号）および架橋官能基）を意味する。
【００１４】
「連結基」とは、「相補性官能基」と反応して、「連結」を形成し得る部分を意味する。連結基およびその会合される相補性官能基は、「連結対」と本明細書中で言われる。好ましい連結対としては、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、４，６−ジクロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、または他の活性なカルボキシレートの群から選択される第１のメンバー、およびアミンである第２のメンバーが挙げられる。好ましくは、連結対の第１のメンバーは、連結対の第２のメンバーがスルフヒドリルである場合は常に、マレイミド、ハロアセチル、またはヨードアセトアミドである（例えば、Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２））。特定の好ましい実施形態において、連結対の第１のメンバーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、そして連結対の第２のメンバーは、アミンである、ここで、ＮＨＳエステルを形成するために、カルボキシレート部分が、ジクロロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルと反応される。
【００１５】
用語「ワトソン／クリック型塩基対合」とは、ヌクレオチドの特異的対のパターン、およびそのアナログをいう。これは、配列特異的水素結合を介して共に結合する（例えば、Ａは、ＴおよびＵと対合し、そしてＧは、Ｃと対合する）。
【００１６】
用語「ヌクレオシド」とは、プリン、デアザプリン、またはピリミジンの核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシンなど）を含む化合物をいう。これらの化合物は、１位でペントースに連結している。ヌクレオシド塩基がプリンまたは７−デアザプリンである場合、ペントースは、プリンまたはデアザプリンの９位で核酸塩基に結合している。そして核酸塩基がピリミジンの場合、ペントースは、ピリミジンの１位で核酸塩基に結合している（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２））。用語「ヌクレオシド」は、本明細書中で使用される場合、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）をいう。ここで、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ５位に結合したヒドロキシル基である。用語「ヌクレオシド／ヌクレオチド」とは、本明細書中で使用される場合、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を含む一連の化合物をいう。
【００１７】
用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドモノマーのポリマー（このようなポリマーのアナログを含む）を意味し、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、そのα−アノマー形態などが挙げられる。モノマーは、「ヌクレオチド間連結（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）」（例えば、ホスホジエステル連結）により連結され、ここで、本明細書中で使用される場合、用語「ホスホジエステル連結」とは、ホスホジエステル結合、またはそのホスフェートアナログ（対イオンが存在する場合、会合したこのような対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、Ｎａ＋）を含む）を含む結合をいう。ポリヌクレオチドが文字配列によって示される場合（例えば、ＡＴＧＣＣＴＧ）は常に、ヌクレオチドが左から右に５’から３’の順序であり、そして他に示されない限り、「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」がデオキシチミジンを示すことが理解される。
【００１８】
ヌクレオシド／ヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドを参照する際の「アナログ」は、改変された核酸塩基部分、改変されたペントース部分および／または改変されたホスフェート部分を有する合成アナログ、ならびにポリヌクレオチドの場合には、他の箇所に一般的に示されるように、改変されたヌクレオチド間連結を含む（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８０））；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：６１３−２９（１９９１）；Ａｇｒａｗａｌ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））。概して、改変されたホスフェート部分は、ホスフェートのアナログを含む。ここで、リン原子は、＋５酸化状態にあり、そして酸素原子の１つ以上が非酸素部分（例えば、硫黄）と置換されている。例示的なホスフェートアナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロホスフェート（対イオンが存在する場合には、会合するこのような対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、Ｎａ＋）を含む）。例示的な改変された核酸塩基部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジンおよび他の類似のアナログ。特に好ましい核酸塩基アナログは、イソ−Ｃおよびイソ−Ｇ核酸塩基アナログ（Ｓｕｌｆｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬから入手可能）である（例えば、Ｂｅｎｎｅｒら、米国特許第５，４３２，２７２号）。例示的な改変されたペントース部分としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：２’−または３’−改変（ここで、２’位または３’位は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリールオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、およびフェノキシ）、アジド、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロ、およびブロモなど。改変されたヌクレオチド間連結としては、以下が挙げられる：ホスフェートアナログ、アキラルおよび変化していないサブユニット間連結を有するアナログ（例えば、Ｓｔｅｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．ら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ，５２：４２０２（１９８７））、ならびにアキラルサブユニット間連結を有する非荷電性モルホリノベースのポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号）。従来の糖およびヌクレオチド間連結が２−アミノエチルグリシンアミド骨格ポリマーで置換されたポリヌクレオチドアナログの特に好ましいクラスは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（１９９１）；Ｅｇｈｏｌｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１８９５−１８９７（１９９２））。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー伸長試薬」とは、ポリヌクレオチドプライマーの酵素的テンプレート媒介伸長をもたらすに必要な成分を含む試薬を意味する。プライマー伸長試薬としては、以下が挙げられる：（１）ポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔａｑポリメラーゼのような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素）；（２）緩衝液；（３）１つ以上の鎖伸長ヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸）（これらのデオキシヌクレオチド三リン酸としては、以下が挙げられる：デオキシグアノシン５’−三リン酸、７−デアザデオキシグアノシン５’−三リン酸、デオキシアデノシン５’−三リン酸、デオキシチミジン５’−三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸）；ならびにＳａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応の場合には、必要に応じて（４）１つ以上の鎖終結ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド三リン酸）（これらのジデオキシヌクレオチド三リン酸としては、以下が挙げられる：例えば、ジデオキシグアノシン５’−三リン酸、７−デアザジデオキシグアノシン５’−三リン酸、ジデオキシアデノシン５’−三リン酸、ジデオキシチミジン５’−三リン酸、およびジデオキシシチジン５’−三リン酸）。
【００２０】
「移動度依存性分析技術」とは、異なる分析物種の間の、移動の差次的速度に基づく分析技術を意味する。例示的な移動度依存性分析技術としては、電気泳動、クロマトグラフィー、沈降（例えば、勾配遠心分離）、フィールドフロー分画（ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、多段階抽出技術などが挙げられる。
【００２１】
（ＩＩ．標的核酸配列）
本発明で使用するための標的核酸配列は、任意の生物またはかつて生存していた生物に由来し得る。これらの生物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：原核生物、真核生物、植物、動物、およびウイルス。標的核酸配列は、細胞の核から生じてもよいし（例えば、ゲノムＤＮＡ）、または核外核酸であってもよい（例えば、プラスミド、ミトコンドリア核酸、種々のＲＮＡなど）。この標的核酸配列は、標的核酸がＲＮＡである場合には、最初にｃＤＮＡに逆転写され得る。さらに、この標的核酸配列は、二本鎖または一本鎖の形態で存在し得る。
【００２２】
本発明の組成物および方法で使用するための標的核酸配列を得るために、種々の方法が利用可能である。標的核酸配列が生物学的マトリックスからの単離を通じて得られる場合、好ましい単離技術としては以下が挙げられる：（１）有機抽出、次いでエタノール沈降（例えば、フェノール／クロロホルム有機試薬を用いる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第Ｉ巻，第２章、第１節，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３））、好ましくは自動化ＤＮＡ抽出機（例えば、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手可能なモデル３４１ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）を用いる）；（２）定常期吸着方法（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）（例えば、Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号；Ｗａｌｓｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０（４）：５０６−５１３（１９９１））；および（３）塩誘導ＤＮＡ沈澱法（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６（３）：９−１０（１９８８））（このような沈澱法は、代表的には、塩析法といわれる）。必要に応じて、上記単離方法の各々は、酵素消化工程の後に行われて、サンプルから所望でないタンパク質を排除することを補助する（例えば、プロテイナーゼＫまたは他の同様のプロテイナーゼでの消化）。
【００２３】
本発明の方法の感度および特異性を増大させるために、好ましくは、標的核酸配列は、適切な核酸増幅手順を使用して、この方法を実施する前に増幅される。このような増幅は、線形的または非線形的であり得、例えば、指数関数的であり得る。例示的増幅手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）、自己持続性配列複製反応（３ＳＲ）（例えば、Ｇｉｎｇｅｒａｓら、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．４８：４９８−５０１（１９９０））、連結増幅反応（ＬＡＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４：５６０−５６９（１９８９））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｉｎｎ−Ｄｅｅｎ，Ｅ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１５２２（１９９１））および核酸配列ベースの増幅反応（ＮＡＳＢＡ）（例えば、ｖａｎ Ｇｅｍｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．４３：１７７−１８８（１９９３））。特に好ましい実施形態において、標的核酸配列の増幅は、ＰＣＲを用いて達成される。一般に、ＰＣＲは、二本鎖核酸の鎖を分離する初期変性工程、次いで、（１）アニーリング工程（これは、２つの増幅プライマーが標的核酸配列に隣接する位置に特異的にアニールすることを可能にする）；（２）伸長工程（これは、５’→３’方向にプライマーを伸長し、それによってプライマー間に位置する標的核酸配列の位置に相補的なアンプリコン核酸を形成する）；および（３）変性工程（これは、増幅物の分離を引き起こす）の反復からなる。上記工程の各々は、異なる温度で行われ得る。ここで、温度変化は、自動サーマルサイクラーを使用してもたらされ得る（例えば、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。特に好ましい実施形態において、標的核酸配列の複数遺伝子座は、多重ＰＣＲによって増幅され、それによって標的核酸配列の複数の領域を同時に調査することが可能になる（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：１１１４１−１１１５６（１９８８）；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編．，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｃａｓｋｅｙら、米国特許第５，５８２，９８９号）。
【００２４】
（ＩＩＩ．二成分組成物）
この節は、本発明の方法において使用するために設計された二成分組成物のいくつかの好ましい実施形態を記載する。代表的な場合において、二成分組成物は、種々の方法に従って、複数のプローブおよび複数の標的核酸配列を検出する際に使用するための関連する移動度モディファイアを含む組成物の部分であり、このうちのいくつかを本明細書中で記載する。
【００２５】
図１、２および３に模式的に示すように、本発明の二成分組成物は、以下を含む：（１）標的核酸配列に対する配列特異的ハイブリダイゼーションのための標的特異的部分１０、およびタグ部分１５を含むプローブ５、ならびに（２）プローブのタグ部分１５に結合するためのタグ相補体５５、および移動度依存性分析技術において特定の移動度をもたらすためのテイル６０を含む移動度モディファイア５０。本発明の重要な特徴に従うと、相補性タグ１５およびタグ相補体５５部分を有するプローブ５および移動度モディファイア５０が接触されると、安定なプローブ／移動度モディファイア複合体８０を形成する。
【００２６】
上記に示されるように、二成分組成物のプローブ５は、標的核酸配列に対する配列特異的ハイブリダイゼーションのための標的特異的部分１０、および移動度モディファイア５０のタグ相補体５５に結合するためのタグ部分１５を含む。
【００２７】
プローブの標的特異的部分１０は、標的核酸配列に配列特異的に結合し得る任意の実体であり得る。この標的核酸配列は、二本鎖形態または一本鎖形態である。ここで、好ましくは、このような配列特異的結合は、１つのヌクレオチド程度の小ささ、またはヌクレオチド当量だけ異なる標的核酸配列間を区別し得る。一般に、用語「ハイブリダイゼーション」または「アニーリング」は、プローブと標的核酸配列との間のこのような配列特異的結合を記載するために使用される。標的特異的部分は、一本鎖標的核酸配列にワトソン−クリック型塩基対合を介して配列特異的に結合するために設計され得るか、または二本鎖標的核酸配列への二重鎖核酸の大きな溝（ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）におけるフーグスティーン型結合部位を介した配列特異的結合のために設計され得る（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．ら、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，４６−４７頁、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２））か、または任意の他の配列特異的結合もしくはハイブリダイゼーション機構のために設計され得る。好ましくは、プローブの標的特異的部分は、独特の標的核酸配列を明白に同定するに十分大きいと同時に、単一ヌクレオチド程度の小ささが異なる標的核酸配列間を区別する能力を維持するに十分な小さな標的核酸配列中の多くのヌクレオチドと相互作用する。
【００２８】
好ましい標的特異的部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：特定の核酸配列に対する特異性を有する抗体、核酸配列認識特性を有する低分子の合成リガンド（例えば、Ｗｈｉｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１：４６８−４７１（１９９８）；Ｋｉｅｌｋｏｐｆら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５（２）：１０４−１０９；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０１（１３）：３６６４−６（１９７９））、ポリヌクレオチドなど（このような構造の組み合わせを含む）。
【００２９】
特に好ましい標的特異的部分は、ポリヌクレオチドを含む。代表的には、プローブの標的特異的部分がポリヌクレオチドである場合、この標的特異的部分は、約１０〜４０ヌクレオチドの標的核酸配列、より好ましくは、約１５〜３０ヌクレオチドの標的核酸配列と相互作用するようなサイズを有する。特定の状況において、プローブのポリメラーゼ媒介伸長を容易にするために、この標的特異的部分は、ＯＨ基またはプローブの３’末端へのヌクレオチドのポリメラーゼ媒介組み込みを可能にするか、あるいはプローブの隣接するヌクレオチドへの酵素的または化学的連結を可能にする他の部分を有する３’末端を含む。
【００３０】
プローブの標的特異的部分（ならびに二成分組成物の他の部分）として適切な、特に好ましいポリヌクレオチドアナログは、ＰＮＡである。ＰＮＡは、ワトソン−クリック標的配列特異性、強い標的−プローブ親和性（例えば、類似のサイズの従来のホスホジエステルポリヌクレオチドに対して高い融解温度）、二重鎖および三重鎖構成における標的核酸配列を結合する能力、およびパラレルおよびアンチパラレル配向で標的核酸配列に結合する能力（例えば、１９９９年１月１５日出願の同時係属中の米国特許出願、標題「Ｂｉｎａｒｙ Ｐｒｏｂｅ ａｎｄ Ｃｌａｍｐ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」（Ｋ．Ｌｉｖａｋ，Ｍ．ＥｇｈｏｌｍおよびＭ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ））を提供するので好ましい。
【００３１】
本発明のプローブ５のタグ部分１５は、移動度モディファイア５０のタグ相補体部分５５に結合し得、かつこのタグ相補体５５と複合体を形成し得る任意の実体であり得る。さらに、好ましいタグおよびタグ相補体は、（１）核酸分析方法で代表的に使用される条件下（例えば、室温での水性緩衝化溶液）で安定である；（２）穏やかな核酸変性条件下で安定である；および（３）プローブの標的特異的部分と標的核酸配列との配列特異的結合を有害にもたらさない複合体を形成するはずである。さらに、本発明のタグおよびタグ相補体は、複数の異なるプローブおよび関連する移動度モディファイアがタグ、タグ相補体、標的核酸配列およびプローブの標的特異的部分の間で交差相互作用を引き起こすことなく、同じ反応容積中に存在し得るように、分離可能なタグとタグ相補体のセットを提供するはずである。最小限に交差ハイブリダイズするタグ配列のセットを選択するための方法は、他の箇所に記載される（例えば、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＡｌｂｒｅｃｈｔ、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／４１０１１）。
【００３２】
例示的なタグおよび／またはタグ相補体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体および関連する抗原またはハプテン、レセプターおよび関連するリガンド、アビジン（またはストレプトアビジン）およびビオチン、ならびにポリヌクレオチド配列およびそれらの相補的配列。
【００３３】
好ましい実施形態において、タグおよびタグ相補体は、各々ポリヌクレオチドである。好ましいポリヌクレオチドタグまたはタグ相補体において、このタグおよび相補体は、例えば、糖修飾（例えば、３’−ホスフェート、３’−アセチル、２’−３’−ジデオキシ、３’−アミノおよび２’−３’−デヒドロ）を含めることによって、ポリメラーゼによって非伸長性にされる。
【００３４】
特に好ましいポリヌクレオチドタグおよびタグ相補体対は、従来の合成ポリヌクレオチドであるタグ、およびＰＮＡであるタグ相補体を含む。ＰＮＡタグ相補体が、タグとの三重鎖構造を形成するように設計される場合、タグ相補体は、タグおよびタグ相補体との間の三重鎖結合を容易にするために「ヒンジ領域」を含み得る。より好ましい実施形態において、タグおよびタグ相補体配列は、反復配列を含む。タグおよにタグ相補体におけるこのような反復配列は、それらの（１）高結合親和性、（２）高結合特異性、および（３）高溶解性によって好ましい。二重鎖形成タグまたはタグ相補体として使用するための特に好ましい反復配列は、（ＣＡＧ）ｎである。ここで３つの塩基配列は、約１〜１０回反復される（例えば、Ｂｏｆｆａら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９２：１９０１−０５（１９９５）；Ｗｉｔｔｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：７９７３−７９（１９９７））。三重鎖形成タグまたはタグ相補体として使用するための特に好ましい反復配列は、（ＴＣＣ）ｎである。
【００３５】
ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラ分子は、市販の自動化合成機で市販の試薬を使用して周知の方法を用いて合成され得る（例えば、Ｄｕｅｈｏｌｍら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：５７６７−７３（１９９４）；Ｖｉｎａｙａｋら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６：１６５３−５６（１９９７））。
【００３６】
タグ部分がポリヌクレオチドである場合、このタグは、プローブの標的特異的部分の全てを含んでいてもよく、この標的特異的部分の一部を含んでいてもよく、この標的特異的部分のいずれも含んでいなくてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、タグは、プローブの標的特異的部分のいくらかまたは全てからなり得る。本発明の他の実施形態において、タグは、プローブの標的特異的部分のいずれの部分も含まない。
【００３７】
タグ１５は、任意の化学的に安定な連結を用いて、プローブの標的特異的部分１０に結合され得る。ここで連結化学物質の選択は、タグの性質およびプローブの標的特異的部分に依存する。１つの好ましい実施形態において、連結は、１級アミノ部分または二級アミノ部分と「相補性官能基」との反応により形成される。好ましくは、相補性官能基は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、スルホニルクロリド、アルデヒドまたはグリオキサール、エポキシド、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、４，６−ジクロロトリアジニルアミンまたは他の活性カルボキシレートである（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。特に好ましい実施形態において、相補性官能基は、活性化ＮＨＳエステルである。これは、本発明の置換されたプロパルギルエトキシアミドヌクレオシドのアミンと反応する。ここで、活性化ＮＨＳエステルを形成するために、カルボキシレート相補性官能基は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応されて、ＮＨＳエステルを形成する（Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４，３１８，８４６号（１９８８）；Ｋａｓａｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，４７：３４０３７（１９７５））。
【００３８】
標的特異的部分およびプローブのタグ両方がポリヌクレオチドである場合に充分適切な１つの特に好ましい連結は、プローブのタグと標的相補性部分との間で１，３−プロパンジオールまたは１，４−アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−リボトール（ｒｉｂｏｔｏｌ）サブユニットの組み込みを含んでいた（例えば、Ｇａｄｅら、ＧＡＴＡ，１０（２）：６１−６５（１９９３）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉら、ＧＡＴＡ，９：１０７−１１２（１９９２））。プローブの標的特異的部分およびタグ部分両方がポリオヌクレオチドである別の好ましい実施形態において、標的特異的部分およびタグ部分は、ポリヌクレオチド自体を作製するヌクレオチド間連結を通じて連結される。
【００３９】
本発明の二成分組成物の移動度モディファイア５０は、プローブのタグ部分１５に結合するためのタグ相補体５５部分、および移動度依存性分析技術において特定の移動度をもたらすためのテイル６０を含む。
【００４０】
移動度モディファイアのテイル部分は、移動度依存性分析技術においてプローブ／移動度モディファイア複合体８０の特定の移動度をもたらし得る任意の実体であり得る。好ましくは、本発明の移動度モディファイア５０のテイル部分６０は、以下のようであるべきである：（１）十分に規定され、かつ容易に分離される移動度をもたらすために低多分散性を有する（例えば、１．０５未満のＭｗ／Ｍｎ）；（２）水性媒体に可溶性である；（３）プローブ−標的ハイブリダイゼーションまたはタグ−タグ相補体結合に有害に影響を与えない；そして（４）異なるセットのメンバーが関連するプローブ／移動度モディファイア複合体に対して識別し得る移動度を与えるように、セット中で利用可能である。
【００４１】
本発明の特に好ましい実施形態において、移動度モディファイアのテイル部分は、ポリマーを含む。具体的には、テイルを形成するポリマーは、ホモポリマー、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマーであり得る。さらに、このポリマーは、直鎖状、櫛状、分枝した、または樹枝状の構成を有し得る。さらに、本発明は単一の点で関連した移動度モディファイアに結合した単一ポリマー鎖に関して本明細書中で記載するが、本発明はまた、１つより多くのポリマー鎖エレメントを含む移動度モディファイアを含み、ここで、このエレメントは、集合的にテイル部分を形成する。
【００４２】
本発明において使用するための好ましいポリマーは親水性であるか、またはタグ相補体に結合した場合に、確実にタグ相補体が水性倍体中で容易に可溶性であるように少なくとも十分に親水性である。このポリマーはまた、標的核酸配列と移動度モディファイアと会合されるプローブの標的特異的部分との間でのハイブリダイゼーションに影響を与えるべきでない。ポリヌクレオチドプローブの場合のように、プローブが変化し、そして移動度依存性分析技術が電気泳動である場合、このポリマーは、好ましくは非荷電性であるか、またはプローブより実質的に低い電荷／サブユニット密度を有する。
【００４３】
１つの好ましい実施形態において、ポリマーは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であり、例えば、１つ以上のヘキサエチレンオキシド（ＨＥＯ）ユニットから形成される。ここで、ＨＥＯユニットは、末端と末端とを連結して、エチレンオキシドサブユニットの壊されない鎖（ｕｎｂｒｏｋｅｎ ｃｈａｉｎ）を形成する。他の例示的な実施形態は、Ｎ １２マーＰＥＯユニットから構成される鎖、およびＮ テトラペプチドユニットから構成される鎖を含み、ここで、Ｎは、調節可能な整数である（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，７７７，０９６号）。
【００４４】
明らかに、本発明の移動度モディファイアのテイル部分として有用なポリマーの合成は、ポリマーの性質に依存する。適切なポリマーを調製するための方法は、一般に、周知のポリマーサブユニット合成方法に従う。選択された長さのＰＥＯ鎖を形成する方法は、以下で議論される。これらの方法（規定されたサイズのマルチサブユニットポリマーユニットを、直接的にまたは荷電性もしくは非荷電性連結基を通じてかのいずれかで互いにカップリングする工程を含む）は、一般に、広範な種々のポリマー（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリ酪酸、ポリウレタンポリマー、ポリペプチドおよびオリゴサッカリド）に適用可能である。ポリマーユニットカップリングのこのような方法は、選択された長さのコポリマー（例えば、ポリエチレンオキシドユニットとポリプロピレンユニットとが交互になったコポリマー）を合成するためにも適切である。選択された長さかつアミノ酸組成のポリペプチド（ホモポリマーまたは混合ポリマーのいずれか）は、標準的な固相合成法（例えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＮｏｂｌｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４（１９９０））により合成され得る。
【００４５】
選択された数のＨＥＯユニットを有するＰＥＯポリマー鎖を調製するための１つの好ましい方法において、ＨＥＯユニットは、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）を用いて一方の末端が保護され、そしてその他方の末端がメタンスルホネートで活性化される。次いで、活性化ＨＥＯを第２のＤＭＴ保護化ＨＥＯ基と反応させて、ＤＭＴ保護化ＨＥＯダイマーを形成する。次いで、このユニット付加を、所望のＰＥＯ鎖長が達成されるまで連続的に行う（例えば、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、米国特許第４，９１４，２１０号）。
【００４６】
テイル部分として使用するための別の特に好ましいポリマーは、ＰＮＡである。ＰＮＡの利点、特性および合成は、上記で記載している。特に、遊離溶液中での電気泳動的分離を包含する移動度依存性分析技術の文脈で使用される場合、ＰＮＡは、本質的に非荷電性であるという有利な特性を有する。
【００４７】
ポリヌクレオチドタグ相補体へのポリマーテイルのカップリングは、従来のホスホルアミダイトポリヌクレオチド合成方法の拡張によって、または他の標準的なカップリング方法によって行われ得、例えば、ビスウレタントリル連結ポリマー鎖は、ホスホルアミダイトカップリングを介して固体支持体上のポリヌクレオチドに連結され得る。あるいは、ポリマー鎖は、ポリヌクレオチドへのポリマー鎖ユニットの段階的付加によって、例えば、標準的固相ポリマー合成方法を用いてポリヌクレオチド（または他のタグ部分）上に構成され得る。
【００４８】
上記のように、移動度モディファイアのテイル部分６０は、プローブ／移動度モディファイア複合体に移動度を与える、この複合体は、各異なるプローブ／移動度モディファイア複合体について弁別可能である。複合体の移動度に対するテイルの寄与は、一般に、テイルのサイズに依存する。しかし、テイルへの荷電性基（例えば、ＰＥＯ鎖における荷電した連結基またはポリペプチド鎖における荷電性アミノ酸）の付加はまた、プローブ／移動度モディファイア複合体における選択された移動度特徴を達成するために使用され得る。プローブ／移動度モディファイア複合体の移動度がプローブ自体の特性により、例えば、篩い分け（ｓｉｅｖｉｎｇ）媒体中の電気泳動において影響を及ぼされ得、大きなプローブがプローブ／移動度モディファイア複合体の電気泳動的移動度を減少させることはまた理解される。
【００４９】
本発明に従う移動度モディファイア５０のタグ相補体部分５５は、プローブ５のタグ部分１５に結合し得、かつこのタグ部分１５と複合体を形成し得る任意の実体であり得る。タグ相補体の構造および特性は、本質的には、プローブ５のタグ部分１５に関して上記で議論したものと同じである。さらに、移動度モディファイアのタグ相補体部分は、プローブに対するタグの結合に関して上で記載したように、実質的に、従来の手段を用いてテイル部分に結合され得る。
【００５０】
タグ相補体がポリヌクレオチド（例えば、ＰＮＡ）である場合、このタグ相補体は、移動度モディファイアのテイル部分の全てを含んでもよいし、移動度モディファイアのテイル部分の一部を含んでもよいし、移動度モディファイアのテイル部分のいずれも含まなくてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、タグ相補体は、移動度モディファイアのテイル部分のいくらか、またはその全てからなり得る。本発明の他の実施形態において、タグ相補体は、移動度モディファイアのテイル部分のいずれの部分も含まない。例えば、ＰＮＡは非荷電性であるので、特に遊離溶液の電気泳動が移動度依存性分析技術として使用される場合、同じＰＮＡオリゴマーが、移動度モディファイアのタグ相補体およびテイル部分の両方として作用し得る。
【００５１】
本発明に従う二成分組成物の好ましい実施形態において、二成分組成物のメンバーとしては、ハイブリダイゼーションエンハンサーが挙げられる。特定の状況において、ハイブリダイゼーションエンハンサーを使用することにより、より短い標的特異的部分を使用することが可能になり、それによってプローブと標的核酸配列との間の単一塩基ミスマッチに対するプローブの感度が増大する。このハイブリダイゼーションエンハンサーは、プローブ、プローブまたは移動度モディファイアに標的−プローブ二重鎖との相互作用を可能にするような様式で結合される限り、プローブまたは移動度モディファイアの任意の部分に結合し得る。しかし、好ましくは、ハイブリダイゼーションエンハンサーは、二成分組成物のプローブに共有結合する。本発明における使用のために特に好ましいハイブリダイゼーションエンハンサーは、マイナーグルーブバインダー（例えば、ネトロプシン、ジスタマイシンなど）である。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、多数の二成分組成物が、標識を含む。標識は、周知の技術（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））を使用して結合され得る。特に好ましい標識としては、蛍光色素が挙げられる。
【００５３】
（ＩＩＩ．配列検出法）
本発明の方法の実施は、他のように示さない限り、分子生物学の標準的技術を利用し、このような技術は、当業者の範囲内にある。
【００５４】
１つの局面において、本発明は、サンプル中に存在する１つ以上の標的核酸配列を検出するための方法を提供する。この方法は、一般的に、以下のように実施される。１つ以上の標的核酸配列を潜在的に含むサンプルを、その標的核酸配列への配列特異的結合のための標的特異的部分およびタグを含むプローブと、その標的核酸配列とこのプローブとの配列依存性結合（例えば、ワトソン−クリック型結合またはフーグスティーン型結合）に適切な条件下で、接触させる。そのタグへの結合のためのタグ相補体を含む移動度モディファイアを、このプローブと、そのタグ相補体へのそのタグの結合に適切な条件下で接触させ、それにより、プローブ／移動度モディファイア複合体を形成する。次いで、このプローブ／移動度モディファイア複合体を、改変されたプローブを形成するように処理する（例えば、標識ヌクレオチドターミネーターを、このプローブの３’末端に酵素により付加し、それにより、このプローブを１ヌクレオチド伸長し、そしてこのプローブを標識する。最後に、このプローブ／モディファイア複合体を、移動度依存性分析技術を使用して分析する。明らかに、分子生物学の当業者によって、この方法の工程の順序は本発明にとって重要ではないこと（例えば、このプローブを、このプローブ／移動度モディファイー複合体を形成させる前に処理してもまたは後に処理してもよいこと）が、理解される。
【００５５】
配列特異的プローブ−標的結合をもたらすために必要な条件は、そのプローブの標的特異的部分の性質およびその標的核酸配列の性質（例えば、その標的核酸配列が一本鎖形態であるかまたは二本鎖形態であるか）に依存する。好ましくは、その標的核酸配列における一ヌクレオチドの変動が検出可能であるような条件を、選択する。一般的には、条件は、プローブアニーリングの特異性（すなわち、所望されない核酸配列がそのプローブとの結合にさえ関与する頻度）と結合の効率（すなわち、所望の標的核酸配列がプローブとの結合反応に関与する程度）との間のバランスを得るように選択すべきである。
【００５６】
プローブの標的特異的部分がポリヌクレオチドである場合、プローブアニーリングの特異性は、そのプローブの標的特異的部分の長さ、溶媒の条件（例えば、塩濃度）およびそのアニーリングの温度またはハイブリダイゼーション反応の温度によって、一般的に制御される。代表的には、約１０ヌクレオチドと３０ヌクレオチドとの間のポリヌクレオチドが好ましい。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、そのアニーリング温度がプローブの融解温度の２〜３℃以内に設定された場合に、非常に配列特異的である傾向があるからである（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編、１３３〜１４２頁、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５））。そのハイブリダイゼーションの相互作用の特徴に影響する他の因子としては、そのプローブおよび標的配列のＧＣ含量、ならびにハイブリダイゼーションエンハンサーの存在が挙げられる。多数のコンピュータープログラムが、異なる状況において、プローブの標的特異的部分の選択を容易にするために利用可能である（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ、ＣＡＢＩＯＳ、８：８３（１９９１）；Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６：１１９〜１２８（１９９２））。
【００５７】
例えば、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションによるその標的核酸配列へのプローブの結合の後、そのプローブを処理して、配列特異的な様式でその標的核酸配列に結合したプローブを選択的に改変し得る。このような選択的改変は、標的特異的結合事象が生じた時および場所を示すために役立ち、そして簡単なプローブハイブリダイゼーションから収集された情報を超えて、その標的核酸配列に関するさらなる情報を提供するために役立ち得る。いくつかの代替的改変法が、そのプローブの性質に依存して利用可能である（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，７７７，０９６号）。
【００５８】
１つの好ましい改変法において、ポリヌクレオチドプローブを、例えば、化学的連結、光化学的連結または酵素的連結による第２のポリヌクレオチドへの連結によって、結合する（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７〜１０８０（１９８８）；Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、米国特許第５，５２１，０６５号：Ｂａｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：１２７９〜１２８２（１９９６）；Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１８９〜１９３（１９９１））。この連結改変工程の特に好ましい実施形態において、この連結結合部は、予想一塩基多型（例えば、一塩基変異部位）を横切って位置する。別の好ましい実施形態において、その第２のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに連結されたプローブのみが標識されるように、標識を含む。シグナルの増幅は、その連結反応（例えば、ＬＡＲ反応）を熱サイクルすることによって達成し得る。
【００５９】
別の好ましい改変法において、１つ以上のプローブを、プライマー伸長試薬の存在下でのポリメラーゼ媒介性プライマー伸長反応において、伸長させる（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号；ＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４：５４６３〜５４６７（１９９７））。一般的にミニ配列決定法または一ヌクレオチド伸長（ＳＮＥ）として公知であるこの実施形態の特に好ましいバージョンにおいて、そのプライマー伸長試薬は、いかなる鎖伸長ヌクレオチドも含まないが、１つ以上の鎖終結ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチドターミネーター）を含む（例えば、Ｓｙｖａｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、８：６８４〜６９２（１９９０）；ＳｏｄｅｒｌｕｎｄおよびＳｙｖａｎｅｎ、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９１／１３０７５；Ｇｏｅｌｅｔら、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９２／１５７１２）。従って、そのプローブを、一ヌクレオチドだけ伸長し、そしてそのヌクレオチドを同定すると、そのプローブの３’末端にすぐ隣接するその標的配列についての情報が提供される。より好ましくは、その鎖終結ヌクレオチドを、そのヌクレオチドの正体（例えば、そのヌクレオチドがＡヌクレオチドであるか、Ｇヌクレオチドであるか、Ｃヌクレオチドであるか、またはＴヌクレオチドであるか）を決定し得る標識で、例えば、そのヌクレオチドに蛍光標識を結合することによって標識する。
【００６０】
なお別の好ましい改変法において、そのプローブを、酵素的切断（例えば、ＲＮａｓｅＨエンドヌクレアーゼによる切断）および／または標的領域に結合した切断可能なプローブの活性化によって、改変する（例えば、Ｄｕｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、９（２）：１４７〜１５２（１９９０）；Ｄｕｃｋら、米国特許第５，０１１，７６９号；米国特許第５，７９２，６０７号）。
【００６１】
プローブ／移動度モディファイア複合体の形成をもたらすために、そのプローブとその移動度モディファイアを、そのプローブのタグ部分とその移動度モディファイアのタグ相補体部分が安定な複合体を形成するような特定の様式で結合するような条件下で、接触させる。そのプローブ／移動度モディファイア複合体の形成をもたらすために使用される方法および条件は、上記のプローブおよび移動度モディファイアのタグおよびタグ相補体部分の性質に依存する。本発明の特に好ましい実施形態において、そのタグは、従来のポリヌクレオチドであり、そしてそのタグ相補体は、ＰＮＡであり、このＰＮＡは、二重鎖または三重鎖の立体構造でこのポリヌクレオチドタグに結合し、そして、その結合条件は、このＰＮＡおよび従来のポリヌクレオチドが、安定かつ配列特異的な結合を形成するように選択する（例えば、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（９３：１４６７０〜１４６７５（１９９６））。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、そのタグおよびタグ相補体の両方が従来のポリヌクレオチドであり、そしてそのプローブ／移動度モディファイア複合体の形成の後、そのタグとタグ相補体とにより形成される二重鎖を、従来の化学的または光化学的な核酸架橋技術を使用して、架橋させる（例えば、Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８５１７〜１９（１９８９）；Ｐｉｅｌｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２３９９〜２４１２（１９８９）；Ｐｒａｓｅｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：１３４９〜５３（１９８８））。その標的核酸へのそのプローブの架橋を回避するために、そのタグ／タグ相補体架橋反応は、好ましくは、そのプローブおよび標的が互いにハイブリダイズしない場合に実施する。
【００６３】
本発明の特に好ましい実施形態において、複数のプローブを、複数の標的核酸配列に指向させる。ここで、各プローブは、特定の移動度モディファイアのモディファイア部分に特異的な、独特のタグ部分を含む。複数の移動度モディファイアを、それらのプローブと接触させ得る。ここで、各モディファイアは、特定のタグに対するタグ相補体を含む。従って、複数のプローブ／移動度モディファイア複合体を、単一の工程にて形成させる。
【００６４】
本発明の重要な特徴に従って、複数のプローブ／移動度モディファイア複合体を、移動度依存性分析技術を介して分離する。この特徴の１つの利点は、その方法において使用されるプローブを、同様のサイズを有すると同時に、従って、実質的に同じハイブリダイゼーション速度論を示すと同時に、移動度依存性分析技術にて容易に分離されるように、設計し得る。
【００６５】
本発明の１つの実施形態において、プローブを、液体クロマトグラフィーにより分離する（分ける）。この方法における使用のための例示的固定相媒体としては、逆相媒体（例えば、Ｃ−１８固相またはＣ−８固相）、イオン交換媒体（特に、アニオン交換媒体）および疎水性相互作用媒体が、挙げられる。関連する実施形態において、そのプローブを、ミセル導電（ｍｉｃｅｌｌｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ）キャピラリークロマトグラフィー（ＭＥＣＣ）により分離し得る。
【００６６】
逆相クロマトグラフィーを、イソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶媒勾配、あるいはより代表的には、直線状溶媒勾配、曲線状溶媒勾配または階段型溶媒勾配を使用して実行する。ここで、水性溶媒中の非極性溶媒（例えば、アセトニトリルまたはイソプロパノール）のレベルは、クロマトグラフィーの実行の間に増加し、それにより、その固相への各分析物の親和性によって、分析物が連続的に溶出される。ポリヌクレオチドを分離するために、イオン対合剤（例えば、テトラアルキルアンモニウム）を、代表的には、リン酸の電荷をマスクするために、その溶媒中に含める。
【００６７】
プローブの移動度は、その固相または固定相へのそのプローブの親和性を変化させるポリマー鎖を含む移動度モディファイアに結合することによって、変化し得る。従って、逆相クロマトグラフィーを用いて、その固定相へのそのプローブの親和性の増加を、そのプローブにに中程度疎水性のテール（例えば、ＰＥＯ含有ポリマー、短いポリペプチドなど）の添加によって、達成し得る。テールをより長くすると、その固相へのより大きな親和性が付与され、従って、そのプローブが溶出するのに、より高い非極性溶媒濃度（およびより長い溶出時間）が必要となる。
【００６８】
一般的には、アニオン交換クロマトグラフィーにおいて、分析物を、塩勾配を使用して、正に荷電した固定相から溶出する。ここで、分析物は、各分析物における負電荷の数および分布に応じて溶出する。ポリアニオンとして、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドの長さに応じて溶出し、最小のポリヌクレオチドが最初に溶出し、そしてより長いポリヌクレオチドが、塩濃度が経時的に増加すると溶出する。従って、アニオン交換クロマトグラフィーを本発明の方法において使用する場合、そのプローブに結合した移動度モディファイアを荷電させ得；正に荷電したテールを使用して、その固相へのプローブの親和性を減少させ得、そして負に荷電したテールを使用して、その固相への親和性を増加させ得る。類似の考えを、疎水性相互作用クロマトグラフィーに適用する。
【００６９】
ミセル導電キャピラリークロマトグラフィー（ＭＥＣＣ）において、ポリヌクレオチドを、界面活性剤分子（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）により形成されるミセルを含む分離媒体に電気泳動によって通過させることによって、分離し得る。サンプルの分離は、クロマトグラフィーの形態として特徴付けられ得る分離プロセスにおいて、ランニング緩衝液により形成される第１相とミセルにより形成される第２相との間でそのサンプル成分を分割することによって、媒介される。ポリヌクレオチド分離の増強のために、その分離媒体は、サンプルのポリヌクレオチドと複合体を形成してポリヌクレオチドの移動度を改変するための、二価の金属イオンを含み得る。
【００７０】
本発明の特に好ましい実施形態によると、そのプローブ移動度モディファイア複合体を、篩い分けマトリクスまたは非篩い分けマトリクス中での電気泳動によって分離する。好ましくは、その電気泳動分離は、キャピラリー電気泳動によって、毛管において実行する（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＣｏｌｂｕｒｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））。使用し得る好ましい篩い分けマトリクスとしては、共有結合架橋したマトリクス（例えば、ビスアクリルアミドで共有結合架橋したポリアクリルアミド）；直鎖状ポリマーで形成されるゲルマトリクス（例えば、Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉら、米国特許第５，５５２，０２８号）；およびゲルなし篩い分け媒体（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，６２４，８００号；ＨｕｂｅｒｔおよびＳｌａｔｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１６：２１３７〜２１４２（１９９５）；Ｍａｙｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６６（１０）：１７７７〜１７８０（１９９４））が、挙げられる。その電気泳動媒体は、核酸変性剤（例えば、７Ｍホルムアミド）を、一本鎖形態にポリヌクレオチドを維持するために含み得る。適切なキャピラリー電気泳動器具は、例えば、市販されているＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）である。
【００７１】
検出を容易にするために、本発明の二成分組成物のエレメントは、適切な検出器による標識エレメントの直接検出を可能にする標識を含み得るか、またはそのような標識を含むように改変され得る。好ましくは、その標識は、蛍光標識であり、この蛍光標識は、より好ましくは、セット中の他の蛍光標識からスペクトルにより分離可能である。例えば、レポーター標識を、ヌクレオチド化学の分野で周知の方法によって、そのプローブのポリヌクレオチド部分の５’末端塩基または３’末端塩基に結合し得る（例えば、Ｆｕｎｇら、米国特許第４，８５５，２２５号；Ｐｒｏｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８、４７６７〜４７７１（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２３９９〜２４１２（１９８５））。
【００７２】
例示的蛍光標識としては、以下の色素が挙げられる：５−カルボキシフルオレセインおよび６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，７’−ジメトキシ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセインおよび２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，７’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ならびに２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン。上記の色素は、ほかの場所に開示されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．、米国特許第４，９９７，９２８号；Ｆｕｎｇら、米国特許第４，８５５，２２５号；およびＭｅｎｃｈｅｎら、米国特許第５，１８８，９３４号）。あるいは、本発明のプローブを、スペクトルによって分離可能なローダミン色素で標識し得る（例えば、Ｂｅｒｇｏｔら、米国特許第５，３６６，８６０号）。本発明において有用な色素の特に好ましい種類は、蛍光エネルギー転移色素を含む（例えば、Ｌｅｅら、米国特許第５，８００，９９６号；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５（１４）：２８１６〜２８２２（１９９７））。
【００７３】
本発明による方法の好ましい例示的な実施形態は、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄに模式的に示される。図４Ａにおいて、４つのポリヌクレオチドプローブ１０５、１１０、１１５および１２０が、配列特異的ハイブリダイゼーションに適切な条件下にて、単一の反応混合物中で標的核酸配列１００にハイブリダイズされる。次いで、図４Ｂにおいて、そのハイブリダイズしたプローブまたは結合したプローブが、改変されたプローブ１２５、１３０、１３５および１４０を形成するように改変される。例えば、その改変工程は、一ヌクレオチドプライマー伸長反応（すなわち、ミニ配列決定反応）（その付加されるヌクレオチドターミネーターは、識別可能な標識（例えば、スペクトルにより分離可能な蛍光標識）で標識される）を含み得るか、または連結反応（その第２のポリヌクレオチドが、識別可能な標識を含む）を含み得る。次いで、図４Ｃにおいて、その改変されたプローブ１２５、１３０、１３５および１４０が、それぞれ、その関連する移動度モディファイア１５０、１６０、１７０および１８０と接触させられて、プローブ／移動度モディファイア複合体１５５、１６５、１７５および１８５を形成し、各プローブが、特定のサイズを有する移動度モディファイアと結合し、この移動度モディファイアが、各プローブ／移動度モディファイア複合体について異なる移動度アドレスを生じる。最後に、図４Ｄにおいて、そのプローブ／移動度モディファイア複合体１５５、１６５、１７５および１８５は、移動度依存性分析技術（例えば、篩い分け媒体または非篩い分け媒体中でのキャピラリー電気泳動）を使用して分離され、ピーク１９０、１９５、２００および２０５を含む電気泳動図を生じ、これらのピークは、それぞれ、プローブ／移動度モディファイア複合体１５５、１６５、１７５および１８５に対応する。
【００７４】
上記の例において、各プローブを、別個の移動度アドレスへと分離した。しかし、移動度アドレスを保存するために、いくつかの状況においては、同じ移動度アドレスにいくつかのプローブを配置し、そして識別可能な標識（例えば、スペクトルにより分離可能な蛍光標識）によって、各位置内のプローブを識別することが望ましくあり得ることが、理解される。
【００７５】
本発明の方法および二成分組成物の特に魅力的な特徴が、１セットの移動度モディファイアを異なるセットの標的特異的プローブとともに使用し得、それにより合成されるに違いないテイルが付加された（ｔａｉｌｅｄ）実体の数を大きく減少し得る。
【００７６】
１つの例示的系において、１０，０００個の二対立遺伝子ＳＮＰ遺伝子座を、１００個の移動度モディファイアおよび１０，０００個の非標識でありかつテイル付加されていないポリヌクレオチドプローブを使用して、インターロゲートする（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）。この系は、１００個の異なる移動度モディファイアを含み、各移動度モディファイアは、プローブ／移動度モディファイア複合体の一部である場合に識別可能なタグ相補体および識別可能な移動度を有する。この系はさらに、１００セットのプローブを含み、各セットは、１００個の個々のプローブを含み、各プローブは、識別可能なタグ部分を含み、そしてプローブの各セットは、別個の反応チューブ中に位置する。可能な２０，０００個の標的核酸配列を含む標的核酸を含むサンプルのアリコートを、その１００個のチューブコレクションのチューブの各反応チューブに添加する（すなわち、その１０，０００個の遺伝子座の２つの対立遺伝子の各々）。多重ＰＣＲを使用して、これら標的配列の各々を増幅する。ついで、各チューブにおいて、それらプローブと増幅した標的核酸とを、配列依存性ハイブリダイゼーションに有効な条件下で接触させる。次いで、このハイブリダイズしたプローブを、蛍光標識ヌクレオチドターミネーターを使用するミニ配列決定反応を実行することにより改変する。この反応において、Ａターミネーター、Ｇターミネーター、ＣターミネーターおよびＴターミネーターの各々を、スペクトルにより分離可能な蛍光標識で標識する。次いで、１００個の反応チューブの各々に、１００個の移動度モディファイアの同じコレクションを添加する。次いで、各チューブを、移動度依存性分析技術を使用して別々に分析して、色が、各移動度アドレスと関連するようにする。例えば、各チューブを、マルチキャピラリー電気泳動系（例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｍｏｄｅｌ ３７００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を使用する電気泳動によって、同時に分析する。本発明の文脈において、移動度アドレスが、電気泳動移動度の絶対値に基づいてもよいし、または内部標準もしくは外部標準に基づく相対的電気泳動移動度に基づいてもよいことに、留意されたい。最後に、得られた色−移動度アドレスのデータを、コンピューターに保存されたベースラインデータセットと比較し、そのサンプルの遺伝子型を決定する。従って、この例示的実施形態において、１００×１００（１０，０００）個の異なるプローブが必要（すなわち、各遺伝子座特異的標的核酸配列について１つのプローブ）であるが、１００個の異なる移動度モディファイアだけしか必要ではない。そして、その改変工程が、プローブを標識しそしてさらなる配列情報（すなわち、プローブの３’末端にすぐ隣接するヌクレオチドの同定）を提供するのに役立つ例において、１０，０００個のプローブのいずれもが、事前に標識される必要がない。従って、この例が示すように、本発明の方法および組成物を使用して、４０，０００個の標的配列（例えば、１０，０００個のＳＮＰ遺伝子座）をインターロゲートし得るアッセイを作製するために、１００個の異なる移動度モディファイアおよび１０，０００個の非標識でありかつテイル付加されていないプローブを作製することだけが必要である。
【００７７】
もちろん、上記のセットの各々を、コンピューター制御したＸ−Ｙ−Ｚ実験室ロボット（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＢｉｏＭｅｋ）を、高スループットキャピラリー電気泳動デバイス（例えば、ＰＥ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ）と組み合わせて使用して、自動化し得る。
【００７８】
すべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が最初に引用された時に、特に、明らかに、そして個々に、参考として援用されると示された場合と同じ程度に、本明細書中にて参考として援用される。
【００７９】
数個の実施形態のみが上記で詳細に記載されているが、分子生物学の当業者は、好ましい実施形態において、その教示および趣旨から逸脱することなく、多くの改変が可能であることを、明確に理解する。このような改変すべてが、上記の特許請求の範囲内に包含されることが、意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に従うプローブの模式図を示す。
【図２】図２は、本発明に従う移動度モディファイアの模式図を示す。
【図３】図３は、本発明のプローブ／移動度モディファイア複合体の模式図を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明に従う好ましい方法の種々の段階の模式図を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明に従う好ましい方法の種々の段階の模式図を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本発明に従う好ましい方法の種々の段階の模式図を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、本発明に従う好ましい方法の種々の段階の模式図を示す。
（発明の分野）
本発明は、核酸配列の分析に有用な方法および組成物に関する。特に、本発明は、多重核酸配列の混合物の分析に有用な方法および組成物を提供する。
【０００２】
（背景）
多数の多型遺伝子座の大規模多重分析が可能な核酸分析技術は、実際に重要な種々の適用に必要である（例えば、個体識別（例えば、親子鑑定）のため、法医学的分析において、器官移植のドナー−レシピエント適合のため、遺伝病診断、予後および遺伝子カウンセリングのため、感染因子の特徴付けのため、ならびにオンコジーン変異の研究のため）。これらの適用の多くは、複数の遺伝子座における標的核酸配列中の単一ヌクレオチドの差異を識別する能力に依存する。
【０００３】
核酸の多重分析の問題に対する１つの解決法は、固体支持体に結合した種々の配列の核酸のアレイを使用することである。ここで、結合した核酸の配列は、アレイにおけるそれらの位置に関連する（例えば、ＫｕｃｈｅｒｌａｐｔｉおよびＣｈｉｌｄｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１：１５−１９（１９９９）；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１：２０−２４（１９９９））。しかし、核酸アレイは、いくつかの重大な実質的欠点を有する。これらの欠点としては、以下が挙げられる：（１）アレイの製作に関連する結果（例えば、製作およびアレイの試験（例えば、インサイチュ合成またはスポッティングによる）が高価かつ複雑であること）；（２）一旦製作されたアレイの特徴づけ（例えば、適切な配列が適切な位置に位置づけられることの確認）；（３）各アレイ位置における核酸の完全性（例えば、鎖内架橋および／または固体支持体と結合した核酸との間の多重制限接触状態（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｔａｃｔ）があり得る）；および（４）固体支持体上でのハイブリダイゼーション事象を検出することに関連する困難性（例えば、蛍光バックグラウンドおよび／または支持体への標識した実体の非特異的結合）。
【０００４】
代替的アプローチにおいては、多重プローブが、プローブを電気泳動的に分離することにより分析される。このプローブは、特定のプローブと特定の移動度アドレスとを相関付ける移動度改変テイルを含む（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４５２７−４５３４（１９９４）；Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，６２４，８００号）。しかし、このアプローチは、多数のテイルを付けたプローブの合成を必要とするという欠点を有する。
【０００５】
従って、核酸アレイと関連する欠点もなく、既存の移動度ベースの方法に伴う欠点もない、非常に多重化した分析を可能にする核酸分析技術が依然として必要である。
【０００６】
（要旨）
本発明は、核酸の多重分析に有用な方法および組成物に関する。
【０００７】
第１の局面において、本発明は、混合物中の１つ以上の標的核酸配列を検出するための二成分組成物を提供する。この二成分組成物は、標的核酸配列に対する配列特異的ハイブリダイゼーションのための標的特異的部分、およびタグを有するプローブを含む。この二成分組成物は、テイルおよびタグに結合するためのタグ相補体を有する移動度モディファイアをさらに含む。このプローブおよび移動度モディファイアがタグおよびタグ相補体によって結合される場合、プローブ／移動度モディファイア複合体が形成される。好ましい実施形態において、このプローブは、ポリヌクレオチドを含む。
【０００８】
第２の局面において、本発明は、サンプル中に存在する１つ以上の標的核酸配列を検出するための方法を提供する。この方法において、１つ以上の標的核酸配列を潜在的に含むサンプルは、１つ以上のプローブと、このプローブおよびこの標的核酸配列の配列依存性ハイブリダイゼーションに有効な条件下で接触され、ここで、各プローブは、標的特異的部分およびタグを含む。次いで、このハイブリダイズしたプローブは、改変したプローブを形成するように処理され、ここで、この処理は、標的核酸に結合したプローブと、標的核酸に結合していないプローブとを区別するために有効である。プローブが標的核酸に接触する前またはその後に、このプローブを１つ以上の移動度モディファイアと接触させて、プローブ／移動度モディファイア複合体を形成し、各移動度モディファイアは、会合したプローブのタグに選択的に結合するためのタグ相補体、およびテイルを有する。最終的に、プローブ／移動度モディファイア複合体を、移動度依存性分析技術を用いて分析する。
【０００９】
本発明は、以下の記載された説明、図面および添付の特許請求の範囲を参照してよりよく理解される。
【００１０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ここで、本発明の好ましい実施形態に関して詳細に言及するが、この例は、添付の図面に示される。本発明は、これらの好ましい実施形態とともに記載されるが、本発明はこれらの実施形態に制限されることは意図しないことが理解される。対照的に、本発明は、添付の特許請求の範囲により規定されるように、本発明内に含まれ得るこれらの好ましい実施形態の代替物、改変および等価物を含むことが意図される。
【００１１】
（Ｉ．定義）
他に述べられなければ、本明細書中で使用される場合、以下の用語および句は、以下の意味を有することが意図される。
【００１２】
用語「標識」は、本発明の組成物に結合した場合、このような組成物を公知の検出手段を用いて検出可能にする部分をいう。これらの検出手段としては、例えば、分光学的手段、光化学的手段、放射活性手段、生化学的手段、免疫化学的手段、酵素的手段または化学的手段が挙げられる。例示的標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：発蛍光団、発色団、放射性同位体、スピン標識、酵素標識および化学発光標識。このような標識は、適切な検出器（例えば、蛍光検出器）により標識化合物の直接的検出を可能にする。さらに、このような標識は、複数成分標識スキーム（例えば、リガンドが、検出可能な抗リガンドに特異的に、かつ高親和性で結合するシステム（例えば、標識された抗体は、その対応する抗原に結合する））の成分を含む。
【００１３】
用語「ハイブリダイゼーションエンハンサー」とは、２つのポリヌクレオチド間でハイブリダイゼーションを増強し、安定化し、そうでなければ陽性に影響を与えるように働く部分（例えば、インターカレーター（例えば、米国特許第４，８５３，２６３号）、マイナーグルーブバインダー（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）（例えば、米国特許第５，８０１，１５５号）および架橋官能基）を意味する。
【００１４】
「連結基」とは、「相補性官能基」と反応して、「連結」を形成し得る部分を意味する。連結基およびその会合される相補性官能基は、「連結対」と本明細書中で言われる。好ましい連結対としては、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、４，６−ジクロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、または他の活性なカルボキシレートの群から選択される第１のメンバー、およびアミンである第２のメンバーが挙げられる。好ましくは、連結対の第１のメンバーは、連結対の第２のメンバーがスルフヒドリルである場合は常に、マレイミド、ハロアセチル、またはヨードアセトアミドである（例えば、Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２））。特定の好ましい実施形態において、連結対の第１のメンバーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、そして連結対の第２のメンバーは、アミンである、ここで、ＮＨＳエステルを形成するために、カルボキシレート部分が、ジクロロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルと反応される。
【００１５】
用語「ワトソン／クリック型塩基対合」とは、ヌクレオチドの特異的対のパターン、およびそのアナログをいう。これは、配列特異的水素結合を介して共に結合する（例えば、Ａは、ＴおよびＵと対合し、そしてＧは、Ｃと対合する）。
【００１６】
用語「ヌクレオシド」とは、プリン、デアザプリン、またはピリミジンの核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシンなど）を含む化合物をいう。これらの化合物は、１位でペントースに連結している。ヌクレオシド塩基がプリンまたは７−デアザプリンである場合、ペントースは、プリンまたはデアザプリンの９位で核酸塩基に結合している。そして核酸塩基がピリミジンの場合、ペントースは、ピリミジンの１位で核酸塩基に結合している（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２））。用語「ヌクレオシド」は、本明細書中で使用される場合、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）をいう。ここで、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ５位に結合したヒドロキシル基である。用語「ヌクレオシド／ヌクレオチド」とは、本明細書中で使用される場合、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を含む一連の化合物をいう。
【００１７】
用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドモノマーのポリマー（このようなポリマーのアナログを含む）を意味し、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、そのα−アノマー形態などが挙げられる。モノマーは、「ヌクレオチド間連結（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）」（例えば、ホスホジエステル連結）により連結され、ここで、本明細書中で使用される場合、用語「ホスホジエステル連結」とは、ホスホジエステル結合、またはそのホスフェートアナログ（対イオンが存在する場合、会合したこのような対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、Ｎａ＋）を含む）を含む結合をいう。ポリヌクレオチドが文字配列によって示される場合（例えば、ＡＴＧＣＣＴＧ）は常に、ヌクレオチドが左から右に５’から３’の順序であり、そして他に示されない限り、「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」がデオキシチミジンを示すことが理解される。
【００１８】
ヌクレオシド／ヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドを参照する際の「アナログ」は、改変された核酸塩基部分、改変されたペントース部分および／または改変されたホスフェート部分を有する合成アナログ、ならびにポリヌクレオチドの場合には、他の箇所に一般的に示されるように、改変されたヌクレオチド間連結を含む（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８０））；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：６１３−２９（１９９１）；Ａｇｒａｗａｌ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））。概して、改変されたホスフェート部分は、ホスフェートのアナログを含む。ここで、リン原子は、＋５酸化状態にあり、そして酸素原子の１つ以上が非酸素部分（例えば、硫黄）と置換されている。例示的なホスフェートアナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロホスフェート（対イオンが存在する場合には、会合するこのような対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、Ｎａ＋）を含む）。例示的な改変された核酸塩基部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジンおよび他の類似のアナログ。特に好ましい核酸塩基アナログは、イソ−Ｃおよびイソ−Ｇ核酸塩基アナログ（Ｓｕｌｆｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬから入手可能）である（例えば、Ｂｅｎｎｅｒら、米国特許第５，４３２，２７２号）。例示的な改変されたペントース部分としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：２’−または３’−改変（ここで、２’位または３’位は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリールオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、およびフェノキシ）、アジド、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロ、およびブロモなど。改変されたヌクレオチド間連結としては、以下が挙げられる：ホスフェートアナログ、アキラルおよび変化していないサブユニット間連結を有するアナログ（例えば、Ｓｔｅｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．ら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ，５２：４２０２（１９８７））、ならびにアキラルサブユニット間連結を有する非荷電性モルホリノベースのポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号）。従来の糖およびヌクレオチド間連結が２−アミノエチルグリシンアミド骨格ポリマーで置換されたポリヌクレオチドアナログの特に好ましいクラスは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（１９９１）；Ｅｇｈｏｌｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１８９５−１８９７（１９９２））。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー伸長試薬」とは、ポリヌクレオチドプライマーの酵素的テンプレート媒介伸長をもたらすに必要な成分を含む試薬を意味する。プライマー伸長試薬としては、以下が挙げられる：（１）ポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔａｑポリメラーゼのような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素）；（２）緩衝液；（３）１つ以上の鎖伸長ヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸）（これらのデオキシヌクレオチド三リン酸としては、以下が挙げられる：デオキシグアノシン５’−三リン酸、７−デアザデオキシグアノシン５’−三リン酸、デオキシアデノシン５’−三リン酸、デオキシチミジン５’−三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸）；ならびにＳａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応の場合には、必要に応じて（４）１つ以上の鎖終結ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド三リン酸）（これらのジデオキシヌクレオチド三リン酸としては、以下が挙げられる：例えば、ジデオキシグアノシン５’−三リン酸、７−デアザジデオキシグアノシン５’−三リン酸、ジデオキシアデノシン５’−三リン酸、ジデオキシチミジン５’−三リン酸、およびジデオキシシチジン５’−三リン酸）。
【００２０】
「移動度依存性分析技術」とは、異なる分析物種の間の、移動の差次的速度に基づく分析技術を意味する。例示的な移動度依存性分析技術としては、電気泳動、クロマトグラフィー、沈降（例えば、勾配遠心分離）、フィールドフロー分画（ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、多段階抽出技術などが挙げられる。
【００２１】
（ＩＩ．標的核酸配列）
本発明で使用するための標的核酸配列は、任意の生物またはかつて生存していた生物に由来し得る。これらの生物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：原核生物、真核生物、植物、動物、およびウイルス。標的核酸配列は、細胞の核から生じてもよいし（例えば、ゲノムＤＮＡ）、または核外核酸であってもよい（例えば、プラスミド、ミトコンドリア核酸、種々のＲＮＡなど）。この標的核酸配列は、標的核酸がＲＮＡである場合には、最初にｃＤＮＡに逆転写され得る。さらに、この標的核酸配列は、二本鎖または一本鎖の形態で存在し得る。
【００２２】
本発明の組成物および方法で使用するための標的核酸配列を得るために、種々の方法が利用可能である。標的核酸配列が生物学的マトリックスからの単離を通じて得られる場合、好ましい単離技術としては以下が挙げられる：（１）有機抽出、次いでエタノール沈降（例えば、フェノール／クロロホルム有機試薬を用いる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第Ｉ巻，第２章、第１節，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３））、好ましくは自動化ＤＮＡ抽出機（例えば、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手可能なモデル３４１ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）を用いる）；（２）定常期吸着方法（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）（例えば、Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号；Ｗａｌｓｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０（４）：５０６−５１３（１９９１））；および（３）塩誘導ＤＮＡ沈澱法（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６（３）：９−１０（１９８８））（このような沈澱法は、代表的には、塩析法といわれる）。必要に応じて、上記単離方法の各々は、酵素消化工程の後に行われて、サンプルから所望でないタンパク質を排除することを補助する（例えば、プロテイナーゼＫまたは他の同様のプロテイナーゼでの消化）。
【００２３】
本発明の方法の感度および特異性を増大させるために、好ましくは、標的核酸配列は、適切な核酸増幅手順を使用して、この方法を実施する前に増幅される。このような増幅は、線形的または非線形的であり得、例えば、指数関数的であり得る。例示的増幅手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）、自己持続性配列複製反応（３ＳＲ）（例えば、Ｇｉｎｇｅｒａｓら、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．４８：４９８−５０１（１９９０））、連結増幅反応（ＬＡＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４：５６０−５６９（１９８９））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｉｎｎ−Ｄｅｅｎ，Ｅ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１５２２（１９９１））および核酸配列ベースの増幅反応（ＮＡＳＢＡ）（例えば、ｖａｎ Ｇｅｍｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．４３：１７７−１８８（１９９３））。特に好ましい実施形態において、標的核酸配列の増幅は、ＰＣＲを用いて達成される。一般に、ＰＣＲは、二本鎖核酸の鎖を分離する初期変性工程、次いで、（１）アニーリング工程（これは、２つの増幅プライマーが標的核酸配列に隣接する位置に特異的にアニールすることを可能にする）；（２）伸長工程（これは、５’→３’方向にプライマーを伸長し、それによってプライマー間に位置する標的核酸配列の位置に相補的なアンプリコン核酸を形成する）；および（３）変性工程（これは、増幅物の分離を引き起こす）の反復からなる。上記工程の各々は、異なる温度で行われ得る。ここで、温度変化は、自動サーマルサイクラーを使用してもたらされ得る（例えば、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。特に好ましい実施形態において、標的核酸配列の複数遺伝子座は、多重ＰＣＲによって増幅され、それによって標的核酸配列の複数の領域を同時に調査することが可能になる（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：１１１４１−１１１５６（１９８８）；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編．，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｃａｓｋｅｙら、米国特許第５，５８２，９８９号）。
【００２４】
（ＩＩＩ．二成分組成物）
この節は、本発明の方法において使用するために設計された二成分組成物のいくつかの好ましい実施形態を記載する。代表的な場合において、二成分組成物は、種々の方法に従って、複数のプローブおよび複数の標的核酸配列を検出する際に使用するための関連する移動度モディファイアを含む組成物の部分であり、このうちのいくつかを本明細書中で記載する。
【００２５】
図１、２および３に模式的に示すように、本発明の二成分組成物は、以下を含む：（１）標的核酸配列に対する配列特異的ハイブリダイゼーションのための標的特異的部分１０、およびタグ部分１５を含むプローブ５、ならびに（２）プローブのタグ部分１５に結合するためのタグ相補体５５、および移動度依存性分析技術において特定の移動度をもたらすためのテイル６０を含む移動度モディファイア５０。本発明の重要な特徴に従うと、相補性タグ１５およびタグ相補体５５部分を有するプローブ５および移動度モディファイア５０が接触されると、安定なプローブ／移動度モディファイア複合体８０を形成する。
【００２６】
上記に示されるように、二成分組成物のプローブ５は、標的核酸配列に対する配列特異的ハイブリダイゼーションのための標的特異的部分１０、および移動度モディファイア５０のタグ相補体５５に結合するためのタグ部分１５を含む。
【００２７】
プローブの標的特異的部分１０は、標的核酸配列に配列特異的に結合し得る任意の実体であり得る。この標的核酸配列は、二本鎖形態または一本鎖形態である。ここで、好ましくは、このような配列特異的結合は、１つのヌクレオチド程度の小ささ、またはヌクレオチド当量だけ異なる標的核酸配列間を区別し得る。一般に、用語「ハイブリダイゼーション」または「アニーリング」は、プローブと標的核酸配列との間のこのような配列特異的結合を記載するために使用される。標的特異的部分は、一本鎖標的核酸配列にワトソン−クリック型塩基対合を介して配列特異的に結合するために設計され得るか、または二本鎖標的核酸配列への二重鎖核酸の大きな溝（ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）におけるフーグスティーン型結合部位を介した配列特異的結合のために設計され得る（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．ら、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，４６−４７頁、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２））か、または任意の他の配列特異的結合もしくはハイブリダイゼーション機構のために設計され得る。好ましくは、プローブの標的特異的部分は、独特の標的核酸配列を明白に同定するに十分大きいと同時に、単一ヌクレオチド程度の小ささが異なる標的核酸配列間を区別する能力を維持するに十分な小さな標的核酸配列中の多くのヌクレオチドと相互作用する。
【００２８】
好ましい標的特異的部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：特定の核酸配列に対する特異性を有する抗体、核酸配列認識特性を有する低分子の合成リガンド（例えば、Ｗｈｉｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１：４６８−４７１（１９９８）；Ｋｉｅｌｋｏｐｆら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５（２）：１０４−１０９；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０１（１３）：３６６４−６（１９７９））、ポリヌクレオチドなど（このような構造の組み合わせを含む）。
【００２９】
特に好ましい標的特異的部分は、ポリヌクレオチドを含む。代表的には、プローブの標的特異的部分がポリヌクレオチドである場合、この標的特異的部分は、約１０〜４０ヌクレオチドの標的核酸配列、より好ましくは、約１５〜３０ヌクレオチドの標的核酸配列と相互作用するようなサイズを有する。特定の状況において、プローブのポリメラーゼ媒介伸長を容易にするために、この標的特異的部分は、ＯＨ基またはプローブの３’末端へのヌクレオチドのポリメラーゼ媒介組み込みを可能にするか、あるいはプローブの隣接するヌクレオチドへの酵素的または化学的連結を可能にする他の部分を有する３’末端を含む。
【００３０】
プローブの標的特異的部分（ならびに二成分組成物の他の部分）として適切な、特に好ましいポリヌクレオチドアナログは、ＰＮＡである。ＰＮＡは、ワトソン−クリック標的配列特異性、強い標的−プローブ親和性（例えば、類似のサイズの従来のホスホジエステルポリヌクレオチドに対して高い融解温度）、二重鎖および三重鎖構成における標的核酸配列を結合する能力、およびパラレルおよびアンチパラレル配向で標的核酸配列に結合する能力（例えば、１９９９年１月１５日出願の同時係属中の米国特許出願、標題「Ｂｉｎａｒｙ Ｐｒｏｂｅ ａｎｄ Ｃｌａｍｐ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」（Ｋ．Ｌｉｖａｋ，Ｍ．ＥｇｈｏｌｍおよびＭ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ））を提供するので好ましい。
【００３１】
本発明のプローブ５のタグ部分１５は、移動度モディファイア５０のタグ相補体部分５５に結合し得、かつこのタグ相補体５５と複合体を形成し得る任意の実体であり得る。さらに、好ましいタグおよびタグ相補体は、（１）核酸分析方法で代表的に使用される条件下（例えば、室温での水性緩衝化溶液）で安定である；（２）穏やかな核酸変性条件下で安定である；および（３）プローブの標的特異的部分と標的核酸配列との配列特異的結合を有害にもたらさない複合体を形成するはずである。さらに、本発明のタグおよびタグ相補体は、複数の異なるプローブおよび関連する移動度モディファイアがタグ、タグ相補体、標的核酸配列およびプローブの標的特異的部分の間で交差相互作用を引き起こすことなく、同じ反応容積中に存在し得るように、分離可能なタグとタグ相補体のセットを提供するはずである。最小限に交差ハイブリダイズするタグ配列のセットを選択するための方法は、他の箇所に記載される（例えば、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＡｌｂｒｅｃｈｔ、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／４１０１１）。
【００３２】
例示的なタグおよび／またはタグ相補体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体および関連する抗原またはハプテン、レセプターおよび関連するリガンド、アビジン（またはストレプトアビジン）およびビオチン、ならびにポリヌクレオチド配列およびそれらの相補的配列。
【００３３】
好ましい実施形態において、タグおよびタグ相補体は、各々ポリヌクレオチドである。好ましいポリヌクレオチドタグまたはタグ相補体において、このタグおよび相補体は、例えば、糖修飾（例えば、３’−ホスフェート、３’−アセチル、２’−３’−ジデオキシ、３’−アミノおよび２’−３’−デヒドロ）を含めることによって、ポリメラーゼによって非伸長性にされる。
【００３４】
特に好ましいポリヌクレオチドタグおよびタグ相補体対は、従来の合成ポリヌクレオチドであるタグ、およびＰＮＡであるタグ相補体を含む。ＰＮＡタグ相補体が、タグとの三重鎖構造を形成するように設計される場合、タグ相補体は、タグおよびタグ相補体との間の三重鎖結合を容易にするために「ヒンジ領域」を含み得る。より好ましい実施形態において、タグおよびタグ相補体配列は、反復配列を含む。タグおよにタグ相補体におけるこのような反復配列は、それらの（１）高結合親和性、（２）高結合特異性、および（３）高溶解性によって好ましい。二重鎖形成タグまたはタグ相補体として使用するための特に好ましい反復配列は、（ＣＡＧ）ｎである。ここで３つの塩基配列は、約１〜１０回反復される（例えば、Ｂｏｆｆａら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９２：１９０１−０５（１９９５）；Ｗｉｔｔｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：７９７３−７９（１９９７））。三重鎖形成タグまたはタグ相補体として使用するための特に好ましい反復配列は、（ＴＣＣ）ｎである。
【００３５】
ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラ分子は、市販の自動化合成機で市販の試薬を使用して周知の方法を用いて合成され得る（例えば、Ｄｕｅｈｏｌｍら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：５７６７−７３（１９９４）；Ｖｉｎａｙａｋら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６：１６５３−５６（１９９７））。
【００３６】
タグ部分がポリヌクレオチドである場合、このタグは、プローブの標的特異的部分の全てを含んでいてもよく、この標的特異的部分の一部を含んでいてもよく、この標的特異的部分のいずれも含んでいなくてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、タグは、プローブの標的特異的部分のいくらかまたは全てからなり得る。本発明の他の実施形態において、タグは、プローブの標的特異的部分のいずれの部分も含まない。
【００３７】
タグ１５は、任意の化学的に安定な連結を用いて、プローブの標的特異的部分１０に結合され得る。ここで連結化学物質の選択は、タグの性質およびプローブの標的特異的部分に依存する。１つの好ましい実施形態において、連結は、１級アミノ部分または二級アミノ部分と「相補性官能基」との反応により形成される。好ましくは、相補性官能基は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、スルホニルクロリド、アルデヒドまたはグリオキサール、エポキシド、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、４，６−ジクロロトリアジニルアミンまたは他の活性カルボキシレートである（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。特に好ましい実施形態において、相補性官能基は、活性化ＮＨＳエステルである。これは、本発明の置換されたプロパルギルエトキシアミドヌクレオシドのアミンと反応する。ここで、活性化ＮＨＳエステルを形成するために、カルボキシレート相補性官能基は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応されて、ＮＨＳエステルを形成する（Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４，３１８，８４６号（１９８８）；Ｋａｓａｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，４７：３４０３７（１９７５））。
【００３８】
標的特異的部分およびプローブのタグ両方がポリヌクレオチドである場合に充分適切な１つの特に好ましい連結は、プローブのタグと標的相補性部分との間で１，３−プロパンジオールまたは１，４−アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−リボトール（ｒｉｂｏｔｏｌ）サブユニットの組み込みを含んでいた（例えば、Ｇａｄｅら、ＧＡＴＡ，１０（２）：６１−６５（１９９３）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉら、ＧＡＴＡ，９：１０７−１１２（１９９２））。プローブの標的特異的部分およびタグ部分両方がポリオヌクレオチドである別の好ましい実施形態において、標的特異的部分およびタグ部分は、ポリヌクレオチド自体を作製するヌクレオチド間連結を通じて連結される。
【００３９】
本発明の二成分組成物の移動度モディファイア５０は、プローブのタグ部分１５に結合するためのタグ相補体５５部分、および移動度依存性分析技術において特定の移動度をもたらすためのテイル６０を含む。
【００４０】
移動度モディファイアのテイル部分は、移動度依存性分析技術においてプローブ／移動度モディファイア複合体８０の特定の移動度をもたらし得る任意の実体であり得る。好ましくは、本発明の移動度モディファイア５０のテイル部分６０は、以下のようであるべきである：（１）十分に規定され、かつ容易に分離される移動度をもたらすために低多分散性を有する（例えば、１．０５未満のＭｗ／Ｍｎ）；（２）水性媒体に可溶性である；（３）プローブ−標的ハイブリダイゼーションまたはタグ−タグ相補体結合に有害に影響を与えない；そして（４）異なるセットのメンバーが関連するプローブ／移動度モディファイア複合体に対して識別し得る移動度を与えるように、セット中で利用可能である。
【００４１】
本発明の特に好ましい実施形態において、移動度モディファイアのテイル部分は、ポリマーを含む。具体的には、テイルを形成するポリマーは、ホモポリマー、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマーであり得る。さらに、このポリマーは、直鎖状、櫛状、分枝した、または樹枝状の構成を有し得る。さらに、本発明は単一の点で関連した移動度モディファイアに結合した単一ポリマー鎖に関して本明細書中で記載するが、本発明はまた、１つより多くのポリマー鎖エレメントを含む移動度モディファイアを含み、ここで、このエレメントは、集合的にテイル部分を形成する。
【００４２】
本発明において使用するための好ましいポリマーは親水性であるか、またはタグ相補体に結合した場合に、確実にタグ相補体が水性倍体中で容易に可溶性であるように少なくとも十分に親水性である。このポリマーはまた、標的核酸配列と移動度モディファイアと会合されるプローブの標的特異的部分との間でのハイブリダイゼーションに影響を与えるべきでない。ポリヌクレオチドプローブの場合のように、プローブが変化し、そして移動度依存性分析技術が電気泳動である場合、このポリマーは、好ましくは非荷電性であるか、またはプローブより実質的に低い電荷／サブユニット密度を有する。
【００４３】
１つの好ましい実施形態において、ポリマーは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であり、例えば、１つ以上のヘキサエチレンオキシド（ＨＥＯ）ユニットから形成される。ここで、ＨＥＯユニットは、末端と末端とを連結して、エチレンオキシドサブユニットの壊されない鎖（ｕｎｂｒｏｋｅｎ ｃｈａｉｎ）を形成する。他の例示的な実施形態は、Ｎ １２マーＰＥＯユニットから構成される鎖、およびＮ テトラペプチドユニットから構成される鎖を含み、ここで、Ｎは、調節可能な整数である（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，７７７，０９６号）。
【００４４】
明らかに、本発明の移動度モディファイアのテイル部分として有用なポリマーの合成は、ポリマーの性質に依存する。適切なポリマーを調製するための方法は、一般に、周知のポリマーサブユニット合成方法に従う。選択された長さのＰＥＯ鎖を形成する方法は、以下で議論される。これらの方法（規定されたサイズのマルチサブユニットポリマーユニットを、直接的にまたは荷電性もしくは非荷電性連結基を通じてかのいずれかで互いにカップリングする工程を含む）は、一般に、広範な種々のポリマー（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリ酪酸、ポリウレタンポリマー、ポリペプチドおよびオリゴサッカリド）に適用可能である。ポリマーユニットカップリングのこのような方法は、選択された長さのコポリマー（例えば、ポリエチレンオキシドユニットとポリプロピレンユニットとが交互になったコポリマー）を合成するためにも適切である。選択された長さかつアミノ酸組成のポリペプチド（ホモポリマーまたは混合ポリマーのいずれか）は、標準的な固相合成法（例えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＮｏｂｌｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４（１９９０））により合成され得る。
【００４５】
選択された数のＨＥＯユニットを有するＰＥＯポリマー鎖を調製するための１つの好ましい方法において、ＨＥＯユニットは、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）を用いて一方の末端が保護され、そしてその他方の末端がメタンスルホネートで活性化される。次いで、活性化ＨＥＯを第２のＤＭＴ保護化ＨＥＯ基と反応させて、ＤＭＴ保護化ＨＥＯダイマーを形成する。次いで、このユニット付加を、所望のＰＥＯ鎖長が達成されるまで連続的に行う（例えば、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、米国特許第４，９１４，２１０号）。
【００４６】
テイル部分として使用するための別の特に好ましいポリマーは、ＰＮＡである。ＰＮＡの利点、特性および合成は、上記で記載している。特に、遊離溶液中での電気泳動的分離を包含する移動度依存性分析技術の文脈で使用される場合、ＰＮＡは、本質的に非荷電性であるという有利な特性を有する。
【００４７】
ポリヌクレオチドタグ相補体へのポリマーテイルのカップリングは、従来のホスホルアミダイトポリヌクレオチド合成方法の拡張によって、または他の標準的なカップリング方法によって行われ得、例えば、ビスウレタントリル連結ポリマー鎖は、ホスホルアミダイトカップリングを介して固体支持体上のポリヌクレオチドに連結され得る。あるいは、ポリマー鎖は、ポリヌクレオチドへのポリマー鎖ユニットの段階的付加によって、例えば、標準的固相ポリマー合成方法を用いてポリヌクレオチド（または他のタグ部分）上に構成され得る。
【００４８】
上記のように、移動度モディファイアのテイル部分６０は、プローブ／移動度モディファイア複合体に移動度を与える、この複合体は、各異なるプローブ／移動度モディファイア複合体について弁別可能である。複合体の移動度に対するテイルの寄与は、一般に、テイルのサイズに依存する。しかし、テイルへの荷電性基（例えば、ＰＥＯ鎖における荷電した連結基またはポリペプチド鎖における荷電性アミノ酸）の付加はまた、プローブ／移動度モディファイア複合体における選択された移動度特徴を達成するために使用され得る。プローブ／移動度モディファイア複合体の移動度がプローブ自体の特性により、例えば、篩い分け（ｓｉｅｖｉｎｇ）媒体中の電気泳動において影響を及ぼされ得、大きなプローブがプローブ／移動度モディファイア複合体の電気泳動的移動度を減少させることはまた理解される。
【００４９】
本発明に従う移動度モディファイア５０のタグ相補体部分５５は、プローブ５のタグ部分１５に結合し得、かつこのタグ部分１５と複合体を形成し得る任意の実体であり得る。タグ相補体の構造および特性は、本質的には、プローブ５のタグ部分１５に関して上記で議論したものと同じである。さらに、移動度モディファイアのタグ相補体部分は、プローブに対するタグの結合に関して上で記載したように、実質的に、従来の手段を用いてテイル部分に結合され得る。
【００５０】
タグ相補体がポリヌクレオチド（例えば、ＰＮＡ）である場合、このタグ相補体は、移動度モディファイアのテイル部分の全てを含んでもよいし、移動度モディファイアのテイル部分の一部を含んでもよいし、移動度モディファイアのテイル部分のいずれも含まなくてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、タグ相補体は、移動度モディファイアのテイル部分のいくらか、またはその全てからなり得る。本発明の他の実施形態において、タグ相補体は、移動度モディファイアのテイル部分のいずれの部分も含まない。例えば、ＰＮＡは非荷電性であるので、特に遊離溶液の電気泳動が移動度依存性分析技術として使用される場合、同じＰＮＡオリゴマーが、移動度モディファイアのタグ相補体およびテイル部分の両方として作用し得る。
【００５１】
本発明に従う二成分組成物の好ましい実施形態において、二成分組成物のメンバーとしては、ハイブリダイゼーションエンハンサーが挙げられる。特定の状況において、ハイブリダイゼーションエンハンサーを使用することにより、より短い標的特異的部分を使用することが可能になり、それによってプローブと標的核酸配列との間の単一塩基ミスマッチに対するプローブの感度が増大する。このハイブリダイゼーションエンハンサーは、プローブ、プローブまたは移動度モディファイアに標的−プローブ二重鎖との相互作用を可能にするような様式で結合される限り、プローブまたは移動度モディファイアの任意の部分に結合し得る。しかし、好ましくは、ハイブリダイゼーションエンハンサーは、二成分組成物のプローブに共有結合する。本発明における使用のために特に好ましいハイブリダイゼーションエンハンサーは、マイナーグルーブバインダー（例えば、ネトロプシン、ジスタマイシンなど）である。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、多数の二成分組成物が、標識を含む。標識は、周知の技術（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））を使用して結合され得る。特に好ましい標識としては、蛍光色素が挙げられる。
【００５３】
（ＩＩＩ．配列検出法）
本発明の方法の実施は、他のように示さない限り、分子生物学の標準的技術を利用し、このような技術は、当業者の範囲内にある。
【００５４】
１つの局面において、本発明は、サンプル中に存在する１つ以上の標的核酸配列を検出するための方法を提供する。この方法は、一般的に、以下のように実施される。１つ以上の標的核酸配列を潜在的に含むサンプルを、その標的核酸配列への配列特異的結合のための標的特異的部分およびタグを含むプローブと、その標的核酸配列とこのプローブとの配列依存性結合（例えば、ワトソン−クリック型結合またはフーグスティーン型結合）に適切な条件下で、接触させる。そのタグへの結合のためのタグ相補体を含む移動度モディファイアを、このプローブと、そのタグ相補体へのそのタグの結合に適切な条件下で接触させ、それにより、プローブ／移動度モディファイア複合体を形成する。次いで、このプローブ／移動度モディファイア複合体を、改変されたプローブを形成するように処理する（例えば、標識ヌクレオチドターミネーターを、このプローブの３’末端に酵素により付加し、それにより、このプローブを１ヌクレオチド伸長し、そしてこのプローブを標識する。最後に、このプローブ／モディファイア複合体を、移動度依存性分析技術を使用して分析する。明らかに、分子生物学の当業者によって、この方法の工程の順序は本発明にとって重要ではないこと（例えば、このプローブを、このプローブ／移動度モディファイー複合体を形成させる前に処理してもまたは後に処理してもよいこと）が、理解される。
【００５５】
配列特異的プローブ−標的結合をもたらすために必要な条件は、そのプローブの標的特異的部分の性質およびその標的核酸配列の性質（例えば、その標的核酸配列が一本鎖形態であるかまたは二本鎖形態であるか）に依存する。好ましくは、その標的核酸配列における一ヌクレオチドの変動が検出可能であるような条件を、選択する。一般的には、条件は、プローブアニーリングの特異性（すなわち、所望されない核酸配列がそのプローブとの結合にさえ関与する頻度）と結合の効率（すなわち、所望の標的核酸配列がプローブとの結合反応に関与する程度）との間のバランスを得るように選択すべきである。
【００５６】
プローブの標的特異的部分がポリヌクレオチドである場合、プローブアニーリングの特異性は、そのプローブの標的特異的部分の長さ、溶媒の条件（例えば、塩濃度）およびそのアニーリングの温度またはハイブリダイゼーション反応の温度によって、一般的に制御される。代表的には、約１０ヌクレオチドと３０ヌクレオチドとの間のポリヌクレオチドが好ましい。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、そのアニーリング温度がプローブの融解温度の２〜３℃以内に設定された場合に、非常に配列特異的である傾向があるからである（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編、１３３〜１４２頁、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５））。そのハイブリダイゼーションの相互作用の特徴に影響する他の因子としては、そのプローブおよび標的配列のＧＣ含量、ならびにハイブリダイゼーションエンハンサーの存在が挙げられる。多数のコンピュータープログラムが、異なる状況において、プローブの標的特異的部分の選択を容易にするために利用可能である（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ、ＣＡＢＩＯＳ、８：８３（１９９１）；Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６：１１９〜１２８（１９９２））。
【００５７】
例えば、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションによるその標的核酸配列へのプローブの結合の後、そのプローブを処理して、配列特異的な様式でその標的核酸配列に結合したプローブを選択的に改変し得る。このような選択的改変は、標的特異的結合事象が生じた時および場所を示すために役立ち、そして簡単なプローブハイブリダイゼーションから収集された情報を超えて、その標的核酸配列に関するさらなる情報を提供するために役立ち得る。いくつかの代替的改変法が、そのプローブの性質に依存して利用可能である（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，７７７，０９６号）。
【００５８】
１つの好ましい改変法において、ポリヌクレオチドプローブを、例えば、化学的連結、光化学的連結または酵素的連結による第２のポリヌクレオチドへの連結によって、結合する（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７〜１０８０（１９８８）；Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、米国特許第５，５２１，０６５号：Ｂａｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：１２７９〜１２８２（１９９６）；Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１８９〜１９３（１９９１））。この連結改変工程の特に好ましい実施形態において、この連結結合部は、予想一塩基多型（例えば、一塩基変異部位）を横切って位置する。別の好ましい実施形態において、その第２のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに連結されたプローブのみが標識されるように、標識を含む。シグナルの増幅は、その連結反応（例えば、ＬＡＲ反応）を熱サイクルすることによって達成し得る。
【００５９】
別の好ましい改変法において、１つ以上のプローブを、プライマー伸長試薬の存在下でのポリメラーゼ媒介性プライマー伸長反応において、伸長させる（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号；ＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４：５４６３〜５４６７（１９９７））。一般的にミニ配列決定法または一ヌクレオチド伸長（ＳＮＥ）として公知であるこの実施形態の特に好ましいバージョンにおいて、そのプライマー伸長試薬は、いかなる鎖伸長ヌクレオチドも含まないが、１つ以上の鎖終結ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチドターミネーター）を含む（例えば、Ｓｙｖａｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、８：６８４〜６９２（１９９０）；ＳｏｄｅｒｌｕｎｄおよびＳｙｖａｎｅｎ、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９１／１３０７５；Ｇｏｅｌｅｔら、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９２／１５７１２）。従って、そのプローブを、一ヌクレオチドだけ伸長し、そしてそのヌクレオチドを同定すると、そのプローブの３’末端にすぐ隣接するその標的配列についての情報が提供される。より好ましくは、その鎖終結ヌクレオチドを、そのヌクレオチドの正体（例えば、そのヌクレオチドがＡヌクレオチドであるか、Ｇヌクレオチドであるか、Ｃヌクレオチドであるか、またはＴヌクレオチドであるか）を決定し得る標識で、例えば、そのヌクレオチドに蛍光標識を結合することによって標識する。
【００６０】
なお別の好ましい改変法において、そのプローブを、酵素的切断（例えば、ＲＮａｓｅＨエンドヌクレアーゼによる切断）および／または標的領域に結合した切断可能なプローブの活性化によって、改変する（例えば、Ｄｕｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、９（２）：１４７〜１５２（１９９０）；Ｄｕｃｋら、米国特許第５，０１１，７６９号；米国特許第５，７９２，６０７号）。
【００６１】
プローブ／移動度モディファイア複合体の形成をもたらすために、そのプローブとその移動度モディファイアを、そのプローブのタグ部分とその移動度モディファイアのタグ相補体部分が安定な複合体を形成するような特定の様式で結合するような条件下で、接触させる。そのプローブ／移動度モディファイア複合体の形成をもたらすために使用される方法および条件は、上記のプローブおよび移動度モディファイアのタグおよびタグ相補体部分の性質に依存する。本発明の特に好ましい実施形態において、そのタグは、従来のポリヌクレオチドであり、そしてそのタグ相補体は、ＰＮＡであり、このＰＮＡは、二重鎖または三重鎖の立体構造でこのポリヌクレオチドタグに結合し、そして、その結合条件は、このＰＮＡおよび従来のポリヌクレオチドが、安定かつ配列特異的な結合を形成するように選択する（例えば、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（９３：１４６７０〜１４６７５（１９９６））。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、そのタグおよびタグ相補体の両方が従来のポリヌクレオチドであり、そしてそのプローブ／移動度モディファイア複合体の形成の後、そのタグとタグ相補体とにより形成される二重鎖を、従来の化学的または光化学的な核酸架橋技術を使用して、架橋させる（例えば、Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８５１７〜１９（１９８９）；Ｐｉｅｌｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２３９９〜２４１２（１９８９）；Ｐｒａｓｅｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：１３４９〜５３（１９８８））。その標的核酸へのそのプローブの架橋を回避するために、そのタグ／タグ相補体架橋反応は、好ましくは、そのプローブおよび標的が互いにハイブリダイズしない場合に実施する。
【００６３】
本発明の特に好ましい実施形態において、複数のプローブを、複数の標的核酸配列に指向させる。ここで、各プローブは、特定の移動度モディファイアのモディファイア部分に特異的な、独特のタグ部分を含む。複数の移動度モディファイアを、それらのプローブと接触させ得る。ここで、各モディファイアは、特定のタグに対するタグ相補体を含む。従って、複数のプローブ／移動度モディファイア複合体を、単一の工程にて形成させる。
【００６４】
本発明の重要な特徴に従って、複数のプローブ／移動度モディファイア複合体を、移動度依存性分析技術を介して分離する。この特徴の１つの利点は、その方法において使用されるプローブを、同様のサイズを有すると同時に、従って、実質的に同じハイブリダイゼーション速度論を示すと同時に、移動度依存性分析技術にて容易に分離されるように、設計し得る。
【００６５】
本発明の１つの実施形態において、プローブを、液体クロマトグラフィーにより分離する（分ける）。この方法における使用のための例示的固定相媒体としては、逆相媒体（例えば、Ｃ−１８固相またはＣ−８固相）、イオン交換媒体（特に、アニオン交換媒体）および疎水性相互作用媒体が、挙げられる。関連する実施形態において、そのプローブを、ミセル導電（ｍｉｃｅｌｌｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ）キャピラリークロマトグラフィー（ＭＥＣＣ）により分離し得る。
【００６６】
逆相クロマトグラフィーを、イソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶媒勾配、あるいはより代表的には、直線状溶媒勾配、曲線状溶媒勾配または階段型溶媒勾配を使用して実行する。ここで、水性溶媒中の非極性溶媒（例えば、アセトニトリルまたはイソプロパノール）のレベルは、クロマトグラフィーの実行の間に増加し、それにより、その固相への各分析物の親和性によって、分析物が連続的に溶出される。ポリヌクレオチドを分離するために、イオン対合剤（例えば、テトラアルキルアンモニウム）を、代表的には、リン酸の電荷をマスクするために、その溶媒中に含める。
【００６７】
プローブの移動度は、その固相または固定相へのそのプローブの親和性を変化させるポリマー鎖を含む移動度モディファイアに結合することによって、変化し得る。従って、逆相クロマトグラフィーを用いて、その固定相へのそのプローブの親和性の増加を、そのプローブにに中程度疎水性のテール（例えば、ＰＥＯ含有ポリマー、短いポリペプチドなど）の添加によって、達成し得る。テールをより長くすると、その固相へのより大きな親和性が付与され、従って、そのプローブが溶出するのに、より高い非極性溶媒濃度（およびより長い溶出時間）が必要となる。
【００６８】
一般的には、アニオン交換クロマトグラフィーにおいて、分析物を、塩勾配を使用して、正に荷電した固定相から溶出する。ここで、分析物は、各分析物における負電荷の数および分布に応じて溶出する。ポリアニオンとして、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドの長さに応じて溶出し、最小のポリヌクレオチドが最初に溶出し、そしてより長いポリヌクレオチドが、塩濃度が経時的に増加すると溶出する。従って、アニオン交換クロマトグラフィーを本発明の方法において使用する場合、そのプローブに結合した移動度モディファイアを荷電させ得；正に荷電したテールを使用して、その固相へのプローブの親和性を減少させ得、そして負に荷電したテールを使用して、その固相への親和性を増加させ得る。類似の考えを、疎水性相互作用クロマトグラフィーに適用する。
【００６９】
ミセル導電キャピラリークロマトグラフィー（ＭＥＣＣ）において、ポリヌクレオチドを、界面活性剤分子（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）により形成されるミセルを含む分離媒体に電気泳動によって通過させることによって、分離し得る。サンプルの分離は、クロマトグラフィーの形態として特徴付けられ得る分離プロセスにおいて、ランニング緩衝液により形成される第１相とミセルにより形成される第２相との間でそのサンプル成分を分割することによって、媒介される。ポリヌクレオチド分離の増強のために、その分離媒体は、サンプルのポリヌクレオチドと複合体を形成してポリヌクレオチドの移動度を改変するための、二価の金属イオンを含み得る。
【００７０】
本発明の特に好ましい実施形態によると、そのプローブ移動度モディファイア複合体を、篩い分けマトリクスまたは非篩い分けマトリクス中での電気泳動によって分離する。好ましくは、その電気泳動分離は、キャピラリー電気泳動によって、毛管において実行する（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＣｏｌｂｕｒｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））。使用し得る好ましい篩い分けマトリクスとしては、共有結合架橋したマトリクス（例えば、ビスアクリルアミドで共有結合架橋したポリアクリルアミド）；直鎖状ポリマーで形成されるゲルマトリクス（例えば、Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉら、米国特許第５，５５２，０２８号）；およびゲルなし篩い分け媒体（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，６２４，８００号；ＨｕｂｅｒｔおよびＳｌａｔｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１６：２１３７〜２１４２（１９９５）；Ｍａｙｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６６（１０）：１７７７〜１７８０（１９９４））が、挙げられる。その電気泳動媒体は、核酸変性剤（例えば、７Ｍホルムアミド）を、一本鎖形態にポリヌクレオチドを維持するために含み得る。適切なキャピラリー電気泳動器具は、例えば、市販されているＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）である。
【００７１】
検出を容易にするために、本発明の二成分組成物のエレメントは、適切な検出器による標識エレメントの直接検出を可能にする標識を含み得るか、またはそのような標識を含むように改変され得る。好ましくは、その標識は、蛍光標識であり、この蛍光標識は、より好ましくは、セット中の他の蛍光標識からスペクトルにより分離可能である。例えば、レポーター標識を、ヌクレオチド化学の分野で周知の方法によって、そのプローブのポリヌクレオチド部分の５’末端塩基または３’末端塩基に結合し得る（例えば、Ｆｕｎｇら、米国特許第４，８５５，２２５号；Ｐｒｏｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８、４７６７〜４７７１（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２３９９〜２４１２（１９８５））。
【００７２】
例示的蛍光標識としては、以下の色素が挙げられる：５−カルボキシフルオレセインおよび６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，７’−ジメトキシ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセインおよび２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，７’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ならびに２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン。上記の色素は、ほかの場所に開示されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．、米国特許第４，９９７，９２８号；Ｆｕｎｇら、米国特許第４，８５５，２２５号；およびＭｅｎｃｈｅｎら、米国特許第５，１８８，９３４号）。あるいは、本発明のプローブを、スペクトルによって分離可能なローダミン色素で標識し得る（例えば、Ｂｅｒｇｏｔら、米国特許第５，３６６，８６０号）。本発明において有用な色素の特に好ましい種類は、蛍光エネルギー転移色素を含む（例えば、Ｌｅｅら、米国特許第５，８００，９９６号；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５（１４）：２８１６〜２８２２（１９９７））。
【００７３】
本発明による方法の好ましい例示的な実施形態は、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄに模式的に示される。図４Ａにおいて、４つのポリヌクレオチドプローブ１０５、１１０、１１５および１２０が、配列特異的ハイブリダイゼーションに適切な条件下にて、単一の反応混合物中で標的核酸配列１００にハイブリダイズされる。次いで、図４Ｂにおいて、そのハイブリダイズしたプローブまたは結合したプローブが、改変されたプローブ１２５、１３０、１３５および１４０を形成するように改変される。例えば、その改変工程は、一ヌクレオチドプライマー伸長反応（すなわち、ミニ配列決定反応）（その付加されるヌクレオチドターミネーターは、識別可能な標識（例えば、スペクトルにより分離可能な蛍光標識）で標識される）を含み得るか、または連結反応（その第２のポリヌクレオチドが、識別可能な標識を含む）を含み得る。次いで、図４Ｃにおいて、その改変されたプローブ１２５、１３０、１３５および１４０が、それぞれ、その関連する移動度モディファイア１５０、１６０、１７０および１８０と接触させられて、プローブ／移動度モディファイア複合体１５５、１６５、１７５および１８５を形成し、各プローブが、特定のサイズを有する移動度モディファイアと結合し、この移動度モディファイアが、各プローブ／移動度モディファイア複合体について異なる移動度アドレスを生じる。最後に、図４Ｄにおいて、そのプローブ／移動度モディファイア複合体１５５、１６５、１７５および１８５は、移動度依存性分析技術（例えば、篩い分け媒体または非篩い分け媒体中でのキャピラリー電気泳動）を使用して分離され、ピーク１９０、１９５、２００および２０５を含む電気泳動図を生じ、これらのピークは、それぞれ、プローブ／移動度モディファイア複合体１５５、１６５、１７５および１８５に対応する。
【００７４】
上記の例において、各プローブを、別個の移動度アドレスへと分離した。しかし、移動度アドレスを保存するために、いくつかの状況においては、同じ移動度アドレスにいくつかのプローブを配置し、そして識別可能な標識（例えば、スペクトルにより分離可能な蛍光標識）によって、各位置内のプローブを識別することが望ましくあり得ることが、理解される。
【００７５】
本発明の方法および二成分組成物の特に魅力的な特徴が、１セットの移動度モディファイアを異なるセットの標的特異的プローブとともに使用し得、それにより合成されるに違いないテイルが付加された（ｔａｉｌｅｄ）実体の数を大きく減少し得る。
【００７６】
１つの例示的系において、１０，０００個の二対立遺伝子ＳＮＰ遺伝子座を、１００個の移動度モディファイアおよび１０，０００個の非標識でありかつテイル付加されていないポリヌクレオチドプローブを使用して、インターロゲートする（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）。この系は、１００個の異なる移動度モディファイアを含み、各移動度モディファイアは、プローブ／移動度モディファイア複合体の一部である場合に識別可能なタグ相補体および識別可能な移動度を有する。この系はさらに、１００セットのプローブを含み、各セットは、１００個の個々のプローブを含み、各プローブは、識別可能なタグ部分を含み、そしてプローブの各セットは、別個の反応チューブ中に位置する。可能な２０，０００個の標的核酸配列を含む標的核酸を含むサンプルのアリコートを、その１００個のチューブコレクションのチューブの各反応チューブに添加する（すなわち、その１０，０００個の遺伝子座の２つの対立遺伝子の各々）。多重ＰＣＲを使用して、これら標的配列の各々を増幅する。ついで、各チューブにおいて、それらプローブと増幅した標的核酸とを、配列依存性ハイブリダイゼーションに有効な条件下で接触させる。次いで、このハイブリダイズしたプローブを、蛍光標識ヌクレオチドターミネーターを使用するミニ配列決定反応を実行することにより改変する。この反応において、Ａターミネーター、Ｇターミネーター、ＣターミネーターおよびＴターミネーターの各々を、スペクトルにより分離可能な蛍光標識で標識する。次いで、１００個の反応チューブの各々に、１００個の移動度モディファイアの同じコレクションを添加する。次いで、各チューブを、移動度依存性分析技術を使用して別々に分析して、色が、各移動度アドレスと関連するようにする。例えば、各チューブを、マルチキャピラリー電気泳動系（例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｍｏｄｅｌ ３７００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を使用する電気泳動によって、同時に分析する。本発明の文脈において、移動度アドレスが、電気泳動移動度の絶対値に基づいてもよいし、または内部標準もしくは外部標準に基づく相対的電気泳動移動度に基づいてもよいことに、留意されたい。最後に、得られた色−移動度アドレスのデータを、コンピューターに保存されたベースラインデータセットと比較し、そのサンプルの遺伝子型を決定する。従って、この例示的実施形態において、１００×１００（１０，０００）個の異なるプローブが必要（すなわち、各遺伝子座特異的標的核酸配列について１つのプローブ）であるが、１００個の異なる移動度モディファイアだけしか必要ではない。そして、その改変工程が、プローブを標識しそしてさらなる配列情報（すなわち、プローブの３’末端にすぐ隣接するヌクレオチドの同定）を提供するのに役立つ例において、１０，０００個のプローブのいずれもが、事前に標識される必要がない。従って、この例が示すように、本発明の方法および組成物を使用して、４０，０００個の標的配列（例えば、１０，０００個のＳＮＰ遺伝子座）をインターロゲートし得るアッセイを作製するために、１００個の異なる移動度モディファイアおよび１０，０００個の非標識でありかつテイル付加されていないプローブを作製することだけが必要である。
【００７７】
もちろん、上記のセットの各々を、コンピューター制御したＸ−Ｙ−Ｚ実験室ロボット（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＢｉｏＭｅｋ）を、高スループットキャピラリー電気泳動デバイス（例えば、ＰＥ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ）と組み合わせて使用して、自動化し得る。
【００７８】
すべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が最初に引用された時に、特に、明らかに、そして個々に、参考として援用されると示された場合と同じ程度に、本明細書中にて参考として援用される。
【００７９】
数個の実施形態のみが上記で詳細に記載されているが、分子生物学の当業者は、好ましい実施形態において、その教示および趣旨から逸脱することなく、多くの改変が可能であることを、明確に理解する。このような改変すべてが、上記の特許請求の範囲内に包含されることが、意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に従うプローブの模式図を示す。
【図２】図２は、本発明に従う移動度モディファイアの模式図を示す。
【図３】図３は、本発明のプローブ／移動度モディファイア複合体の模式図を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明に従う好ましい方法の種々の段階の模式図を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明に従う好ましい方法の種々の段階の模式図を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本発明に従う好ましい方法の種々の段階の模式図を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、本発明に従う好ましい方法の種々の段階の模式図を示す。
Claims (26)
- ２つ以上の標的核酸配列を検出するための組成物であって、該組成物が、以下：
以下を含む第１の複合体：
第１の標的核酸配列に対する配列特異的ハイブリダイゼーションのための第１の標的特異的部分、および第１のタグを含む、第１のプローブ；
第１のテイルおよび該第１のタグに結合するための第１のタグ相補体を含む第１の移動度モディファイア；ならびに
第１の標的核酸配列を含む第１の核酸配列；ならびに
以下を含む第２の複合体；
第２の標的核酸配列に対する配列特異的ハイブリダイゼーションのための第２の標的特異的部分、および第２のタグを含む、第２のプローブ；
第２のテイルおよび該第２のタグに結合するための第２のタグ相補体を含む第２の移動度モディファイア；ならびに
第２の標的核酸配列を含む第２の核酸配列、
を含む、組成物であって、
ここで該第１の移動度モディファイアに結合した該第１のプローブを含む第１の二成分組成物の移動度依存性分析技術における移動度は、該第２の移動度モディファイアに結合された該第２のプローブを含む第２の二成分組成物の該移動度依存性分析技術における移動度から識別可能であり；そして
ここで該第１の複合体および該第２の複合体は、混合物として存在する、
組成物。 - 前記第１の標的特異的部分がポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記第１の標的特異的部分が３’ヒドロキシル基を含む、請求項２に記載の組成物。
- 前記第１の標的特異的部分がＰＮＡを含む、請求項２に記載の組成物。
- 前記第１のタグがポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記第１のタグがＰＮＡを含む、請求項５に記載の組成物。
- 前記第１のタグ相補体がＰＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記第１のタグおよび前記第１のタグ相補体の両方がポリヌクレオチドを含み、該第１のタグ相補体および該第１のタグのうちの１つが（ＣＡＧ）ｎおよび（ＴＣＣ）ｎから選択される配列を含み、ここでｎが１〜１０である、請求項１に記載の組成物。
- 前記第１のテイルは、少なくとも部分的にはポリヌクレオチドでない、請求項１に記載の組成物。
- 前記第１のテイルがポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記ポリマーが、ポリエチレンオキシドおよびポリペプチドから選択される、請求項１０に記載の組成物。
- ハイブリダイゼーションエンハンサーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- サンプル中に存在する１つ以上の標的核酸配列を検出するための方法であって、該方法は、
１つ以上の標的核酸配列を潜在的に含むサンプルを提供する工程；
１つ以上のプローブを提供する工程であって、該プローブの各々が標的特異的部分およびタグを含む、工程；
１つ以上の移動度モディファイアを提供する工程であって、該モディファイアの各々がタグ相補体およびテイルを含む、工程；
該プローブと該標的核酸配列とを、該プローブおよび該標的核酸配列の配列依存性ハイブリダイゼーションに有効な条件下で接触させ、それによって結合したプローブを形成する工程；
該結合したプローブを処理して、改変したプローブを形成する工程；
該プローブ、該結合したプローブまたは該改変したプローブと、該移動度モディファイアとを、該タグおよび該タグ相補体を選択的に結合するために適切な条件下で接触させ、それによって１つ以上のプローブ／移動度モディファイア複合体を形成する工程；ならびに
移動度依存性分析技術を用いて、該プローブ／移動度モディファイア複合体を破壊しない条件下で、該プローブ／移動度モディファイア複合体を分析する工程、
を包含する、方法。 - 前記結合したプローブを処理する工程が、連結反応を包含する、請求項１３に記載の方法。
- 前記結合したプローブを処理する工程が、プライマー伸長反応を包含する、請求項１３に記載の方法。
- 前記結合したプローブを処理する工程が、前記プローブに標識を結合する工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
- 前記標的特異的部分が、ポリヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
- 前記標的特異的部分が、３’ヒドロキシル基を含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記標的特異的部分がＰＮＡを含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記タグ相補体が、ポリヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
- 前記タグ相補体がＰＮＡである、請求項２０に記載の方法。
- 前記タグおよびタグ相補体の両方がポリヌクレオチドであって、該タグ相補体およびタグのうちの１つが、配列（ＣＡＧ）ｎを含み、ここで、ｎが１〜１０である、請求項１３に記載の方法。
- 前記テイルがポリマーを含む、請求項１３に記載の方法。
- 前記ポリマーが、ポリエチレンオキシドおよびポリペプチドから選択される、請求項２３に記載の方法。
- ハイブリダイゼーションエンハンサーをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
- ２つ以上のプローブおよび２つ以上の移動度モディファイアが提供され、その結果、該プローブの各々が移動度モディファイアに選択的に結合し、それによってプローブ／移動度モディファイア複合体が形成され、ここで、該プローブ／移動度モディファイア複合体の少なくとも２つが、移動度依存性分析技術において分離可能である、請求項１３に記載の方法。
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