PT1040202E - Determinação da identidade de polimorfismos de adn utilizando citometria de fluxo - Google Patents

Determinação da identidade de polimorfismos de adn utilizando citometria de fluxo Download PDF

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Hong Cai
P Scott White
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Description

ΕΡ 1 040 202/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Determinação da identidade de polimorfismos de ADN utilizando citometria de fluxo"
CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se genericamente à utilização de citometria de fluxo para a determinação da composição de bases nucleotidicas de ADN e, mais particularmente, à utilização de citometria de fluxo para determinar a identificação de bases de polimorfismos de um único nucleótido, incluindo polimorfismos, inserções e deleções nucleotídicos. O presente invento foi concretizado com o apoio do governo sob o contracto N.° W-7405-ENG-36 atribuído pelo US Department of Energy a The Regents of The University of Califórnia. O governo tem certos direitos neste invento.
ANTECEDENTES DO INVENTO A determinação da sequência de bases de ADN do genoma humano terá um grande impacto na ciência biomédica no próximo século. A determinação do primeiro ADN humano completo estimulará uma variedade de aplicações do mapeamento genético de genes associados a doenças, a testes de diagnóstico para susceptibilidade a doenças e resposta a fármacos. A determinação da composição de bases em locais específicos e variáveis do ADN conhecidos como polimorfismos de um único nucleótido (SNP) é especialmente importante. A geração actual de métodos de determinação da sequência é demasiado lenta e dispendiosa para satisfazer os requisitos da análise de SNP em grande escala. Assim, existe a necessidade de métodos mais rápidos e eficientes para análise de sequências genéticas quanto a SNP.
Os SNP têm várias utilizações no mapeamento, na identificação de genes de doenças e em ensaios de diagnóstico. Todas estas aplicações envolvem a determinação da composição de bases no local do SNP. A sequenciação convencional pode proporcionar esta informação, mas não é prática para pesquisa de um grande número de locais num grande número de indivíduos. 2 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ Vários métodos alternativos foram desenvolvidos para aumentar a produtividade.
Foram desenvolvidas duas técnicas para determinar a composição de bases num único local, mini-sequenciação (ver, p. ex., "Minisequencing: A Specific Tool For DNA Analysis And Diagnostics On Oligonucleotide Arrays", por Tomi Pastinen et al., Genome Research 7: 606, 1997) e oligo-ligação (ver, p. ex., "Single-Well Genotyping Of Diallelic Sequence Variations By A Two-Color ELISA-Based Oligonucleotide Ligation Assay", por Vincent O. Tobe et al., Nuclear Acids Res. 24: 3728, 1996). Na mini-sequenciação, é desenhado um iniciador para interrogar um local especifico num molde de amostra, e é utilizada polimerase para alongar o iniciador com um didesoxinucleótido marcado. Na oligo-ligação, é desenhado um iniciador semelhante, e é utilizada ligase para ligar covalentemente um oligo a jusante que seja variável no local de interesse. Em cada caso, é utilizada a preferência de uma enzima por substratos com bases emparelhadas correctamente para discriminar a identidade das bases que é revelada através da ligação covalente de um marcador ao iniciador. Na maioria das aplicações estes ensaios são configurados com o iniciador imobilizado num substrato sólido, incluindo microplacas, contas magnéticas e, recentemente, oligonucleótidos dispostos em série em lâminas de microscópio (mlcroarrays). Estratégias de detecção incluem marcação directa com detecção de fluorescência ou marcação indirecta utilizando biotina e uma estreptavidina marcada com detecção de fluorescência, quimioluminescência ou absorvância.
Os mlcroarrays de oligonucleótidos ou "chips de ADN" geraram muita atenção quanto ao seu potencial para análise paralela em massa. A possibilidade de sequenciação de dezenas de milhar de bases de uma pequena amostra em apenas alguns minutos é excitante. Actualmente, esta tecnologia tem uma disponibilidade limitada por estarem presentemente disponíveis arrays para sequenciar apenas um punhado de genes, com custos substanciais de equipamento e consumiveis. Adicionalmente, a abordagem geral de sequenciação através de hibridação não é particularmente robusta, com a necessidade de uma significativa optimização dependente da sequência das condições de hibridação. Contudo, o paralelismo de uma 3 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ tecnologia de "array" é muito potente e a determinação de sequências multiplexadas é um elemento importante do novo método de citometria de fluxo.
Em US-A-5670325 divulgam-se métodos para detecção da presença de sequências mutantes numa subpopulação de sequências génicas numa amostra biológica. Estes métodos são particularmente úteis para identificação de indivíduos com mutações génicas indicadoras de cancro colorrectal precoce. Mais especificamente, o método para detecção da presença de uma subpopulação clonal de células transformadas numa amostra biológica obtida de um organismo, compreendendo os passos de: a) determinação na amostra biológica de um número X de um primeiro polinucleótido de tipo selvagem característico de uma região genómica do referido organismo que não esteja mutada na referida subpopulação de células transformadas; b) determinação na amostra biológica de um número Y de um segundo polinucleótido de tipo selvagem, numa região genómica do referido organismo suspeita de estar mutada na referida subpopulação de células transformadas; e c) determinação de se existe uma diferença entre o número X e o número Y, sendo a presença de uma diferença estatisticamente significativa indicadora de uma subpopulação clonal de células transformadas na referida amostra biológica.
Deste modo, é um objectivo do presente invento proporcionar um método para determinação da composição de bases em locais específicos numa cadeia de ADN utilizando microesferas e citometria de fluxo, em que a especificidade das enzimas para a discriminação da composição de bases é combinada com a análise paralela de um array de microesferas fluorescentes.
Objectivos, vantagens e novas características adicionais do presente invento serão expostos em parte na descrição que se segue e tornar-se-ão em parte evidentes para os peritos na especialidade após examine do que se segue ou podem ser aprendidos pela prática do presente invento. Os objectivos e vantagens do presente invento podem ser compreendidos e alcançados por meio das implementações e combinações particularmente apontadas nas reivindicações anexas. 4 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ
SUMARIO DO INVENTO
Para alcançar os objectos anteriores e outros, e de acordo com os fins do presente invento tal como aqui concretizado e amplamente descrito, o método para determinação da composição de bases em locais específicos numa cadeia de ADN daqui inclui os passos de: preparação de um iniciador oligonucleotidico possuindo um marcador de imobilização ou captura, didesoxinucleótidos marcados com fluorescência; alongamento do iniciador oligonucleotidico utilizando ADN-polimerase com o didesoxinucleótido fluorescente; ligação especifica dos iniciadores marcados a microesferas; e medição da fluorescência das microesferas através de citometria de fluxo.
De preferência, os iniciadores oligonucleotidicos são desenhados para hibridarem com a amostra de ADN sob investigação imediatamente adjacentes ao local de interesse de modo a interrogar a base nucleotídica seguinte na amostra de ADN. É também preferido que os iniciadores tenham no seu terminal 5' um de: a) um aminoácido ou outro grupo funcional adequado para ligação covalente a uma microesfera; b) um grupo biotina adequado para ligação a avidina ou estreptavidina imobilizado numa microesfera; ou c) um marcador oligonucleotidico que seja complementar a uma sonda de captura oligonucleotídica imobilizada na superfície de uma microesfera.
Os benefícios e as vantagens do presente invento incluem um método sensível, homogéneo e flexível para determinação da composição de bases de ADN em locais específicos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Os desenhos anexos, que são incorporados e fazem parte do fascículo, ilustram uma concretização do presente invento e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios do presente invento. Nos desenhos: 5 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ A FIGURA la é uma representação esquemática de uma mini-sequenciação baseada em microesferas para citometria de fluxo, em que um iniciador imobilizado numa microesfera é utilizado para hibridação com a sequência de ADN sob investigação na presença de didesoxinucleótidos, dos quais pelo menos um está marcado com fluorescência, e polimerase, por meio da qual o iniciador é alongado numa base, enquanto a FIG. lb é uma representação esquemática do iniciador resultante possuindo um único didesoxinucleótido fluorescente ligado na sua extremidade que pode ser detectado utilizando citometria de fluxo e representa a base complementar do SNP no ADN. A FIGURA 2a é uma representação esquemática de uma mini-sequenciação baseada em microesferas para citometria de fluxo semelhante à descrita nas FIGS. la e lb aqui, excepto que são utilizados iniciadores biotinilados solúveis e microesferas de captura revestidas com avidina em vez de iniciadores que tenham já sido imobilizados nas microesferas. A Figura 2B mostra a hibridação do iniciador biotinilado à cadeia de ADN a investigar e o alongamento deste iniciador através de um didesoxinucleótido A fluorescente (assumindo que o SNP é uma base T) em resultado da ADN-polimerase presente na solução, e a FIGURA 2c mostra a captura do iniciador biotinilado alongado numa microesfera revestida com avidina após a cadeia de ADN hibridada desnaturar, com a subsequente análise da fluorescência utilizando citometria de fluxo. A FIGURA 3a é uma representação esquemática de um procedimento de mini-sequenciação baseado em microesferas multiplexadas utilizando iniciadores marcados com sequência solúveis e microesferas possuindo sondas de captura de um modo semelhante à mini-sequenciação ilustrada nas FIGS. 2a e 2b daqui, excepto que se assumiu que estavam presentes quatro SNP na cadeia de ADN, enquanto a FIGURA 3b ilustra as microesferas e os iniciadores alongados capturados a analisar utilizando citometria de fluxo. A FIGURA 4a é uma representação esquemática de um ensaio de ligação de oligonucleótidos baseado em microesferas utilizando citometria de fluxo, com um iniciador imobilizado numa microesfera juntamente com iniciadores complementares fluorescentes para ligação ao iniciador que hibridou com a 6 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ cadeia de ADN a investigar na região do SNP, enquanto a FIGURA 4b é uma representação esquemática do iniciador ligado à microesfera ao qual o complemento fluorescente correcto se ligou após o ADN ter desnaturado, a fluorescência determinada através de citometria de fluxo da microesfera indicando qual o complemento fluorescente foi ligado à cadeia de ADN.
As FIGURAS 5a e 5b são representações esquemáticas da ligação de oligonucleótidos no ADN não amplificado, seguida de amplificação por PCR, captura em microesferas e análise da fluorescência das microesferas através de citometria de fluxo, para o caso em que a base complementar se encontra na cadeia de ADN e em que a base complementar não existe na cadeia de ADN, respectivamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Resumidamente, o presente invento inclui a utilização de iniciadores oligonucleotídicos, didesoxinucleótidos fluorescentes, ADN-polimerase, microesferas e citometria de fluxo para determinar a composição de bases de ADN em locais específicos numa cadeia de ADN. Os iniciadores oligonucleotídicos marcados são incubados com uma amostra de ADN e deixados hibridar imediatamente adjacentes ao local de interesse. Os didesoxinucleótidos fluorescentes e a ADN-polimerase são adicionados e deixa-se que alonguem o iniciador numa unidade de base, para que após incorporação enzimática do didesoxinucleótido fluorescente único na cadeia de ADN, a cadeia de ADN possa ser detectada através de um citómetro de fluxo. A ADN-polimerase pode ser Sequenase, Thermosequenase, ou qualquer outra ADN-polimerase convencional ou termoestável.
Outra concretização do presente invento utiliza iniciadores oligonucleotídicos, repórteres oligonucleótidos e ADN-ligase juntamente com microesferas e citometria de fluxo para fazer esta determinação. Um oligonucleótido repórter fluorescente e ADN-ligase são adicionados e deixados a ligar o iniciador ao repórter. Os oligonucleótidos repórter fluorescentes são desenhados para se ligarem ao ADN da amostra imediatamente a 3' do iniciador oligonucleotidico hibridado. Isto é, a sequência do oligonucleótido repórter é complementar à cadeia do ADN da amostra excepto no seu terminal 5', onde o 7 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ repórter é variável de modo a interrogar o local de interesse no ADN da amostra, que pode então ser investigado através da sua assinatura fluorescente utilizando citometria de fluxo. A ADN-ligase pode ser qualquer ligase convencional ou termoestável. O alongamento ou ligação do iniciador pode ser estimulado através da utilização de ciclos térmicos utilizando ADN-polimerase ou ligase termoestável.
Os iniciadores oligonucleotídicos são ligados a microesferas antes ou após o alongamento ou a ligação enzimática. Os iniciadores amino-marcados podem ser covalentemente ligados a microesferas carboxiladas utilizando EDAC. Os iniciadores biotinilados podem ser ligados a microesferas revestidas com avidina ou estreptavidina. Os iniciadores possuindo um marcador de sequência oligonucleotidica podem ser hibridados a sequências de captura oligonucleotidicas complementares imobilizadas em microesferas covalentemente ou através da interacção biotina-avidina. As microesferas podem ser compostas de poliestireno, celulose ou outro material apropriado. Podem ser utilizadas microesferas possuindo diferentes tamanhos ou coradas com diferentes quantidades de corantes fluorescentes, para efectuar análise de sequências multiplexadas.
Tendo sido descrito genericamente o presente invento, os seguintes EXEMPLOS pretendem proporcionar mais detalhes específicos do mesmo. EXEMPLO 1
Mini-sequenciação por Citometria de Fluxo Utilizando
Iniciadores Imobilizados:
Será agora feita referência em detalhe às concretizações preferidas do presente invento tal como ilustradas nos desenhos anexos. Voltando agora às Figuras, a Fig. la é uma representação esquemática da mini-sequenciação baseada em microesferas para citometria de fluxo, em que um iniciador imobilizado numa microesfera é utilizado para hibridar com a sequência de ADN sob investigação na presença de didesoxinucleótidos, pelo menos um dos quais está marcado com fluorescência, e polimerase. O iniciador é alongado numa base 8 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ através da acção da polimerase. A Figura lb é uma representação esquemática do iniciador resultante possuindo um único didesoxinucleótido fluorescente ligado à extremidade deste que pode ser detectado utilizando citometria de fluxo, e representa a base complementar ao SNP no ADN. O molde de ADN da amostra é primeiro amplificado utilizando a reacção em cadeia pela polimerase (PCR) e o produto resultante é tratado com fosfatase alcalina de camarão (SAP) e exonuclease I (Exol) para remover desoxinucleótido-trifosfatos não consumidos e iniciadores de PCR, respectivamente. O iniciador da mini-sequenciação, desenhado para interrogar um local especifico na cadeia de ADN sob investigação, é imobilizado por meio de um grupo amino a 5' numa microesfera de poliestireno carboxilada utilizando um reagente de reticulação (p. ex., carbodiimida). As microesferas possuindo iniciadores (5 μΐ) são adicionadas ao ADN amplificado (1 μΐ, 1 nM), ADN-polimerase (uma unidade, Thermosequenase, Amersham Life Sciences, Cleveland, OH) , um ddNTP marcado com fluoresceina (5 μΜ), 5 μΜ de cada um dos outros três ddNTP não fluorescentes e tampão (tampão de Thermosequenase, Amersham) num volume total de 10 μΐ. Este processo foi repetido três vezes utilizando cada um dos quatro ddNTP fluorescentes. As misturas reaccionais são sujeitas a ciclos 99 vezes a 94°C durante 10 s e 60°C durante 10 s num termociclador. Foram diluidos dois microlitros de cada mistura reaccional em 500 μΐ de tampão TEB (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, albumina de soro bovino, BSA, a 0,5% (p/v)), e a fluorescência associada às microesferas foi medida utilizando citometria de fluxo. Utilizando este procedimento, foi determinada a identidade correcta da base nucleotidica para uma posição especifica num molde oligonucleotidico com uma razão de sinal para fundo superior a cem. EXEMPLO 2
Mini-sequenciação por Citometria de Fluxo Utilizando Iniciadores Biotinilados: A Figura 2a é uma representação esquemática de mini-sequenciação baseada em microesferas para citometria de fluxo semelhante à descrita nas Figs. la e lb daqui, excepto que são utilizados iniciadores biotinilados solúveis e microesferas de captura revestidas com avidina em vez de iniciadores que 9 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ estejam já imobilizados nas microesferas. A Figura 2b mostra a hibridação do iniciador biotinilado com a cadeia de ADN a investigar e o alongamento deste iniciador por um único didesoxinucleótido A fluorescente (assumindo que o SNP é uma base T) em resultado da ADN-polimerase presente na solução. A Figura 2c mostra a captura do iniciador biotinilado alongado numa microesfera revestida com avidina após a cadeia de ADN hibridada se desnaturar, com a subsequente análise de fluorescência utilizando citometria de fluxo. O molde de ADN da amostra é amplificado através de PCR e o produto resultante tratado com fosfatase alcalina de camarão (SAP) e exonuclease I (Exo I) para remover desoxinucleótido-trifosfatos não consumidos e iniciadores de PCR, respectivamente. É preparado o iniciador de mini-sequenciação, desenhado para interrogar um local especifico no ADN molde e possuindo um grupo biotina a 5'. 0 iniciador biotinilado é adicionado ao ADN molde (1 μΐ, 1 nM), ADN-polimerase (uma unidade, Thermosequenase, Amersham), um ddNTP marcado com fluoresceina (5 μΜ), 5 μΜ de cada um dos outros três ddNTP não fluorescentes e tampão (tampão de Thermosequenase, Amersham) num volume total de 10 μΐ. Este processo é repetido três vezes utilizando um ddNTP fluorescente diferente. As misturas reaccionais são sujeitas a ciclos 99 vezes a 94°C durante 10 s e 60°C durante 10 s num termociclador. São adicionados à mistura reaccional 5 μΐ de microesferas revestidas com avidina para capturar os iniciadores biotinilados. São diluídos dois microlitros de cada mistura reaccional em 500 μΐ de tampão teb (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, albumina de soro bovino, BSA, a 0,5% (p/v)) e a fluorescência associada às microesferas é medida utilizando citometria de fluxo. Utilizando este procedimento, foi determinada a identidade correcta da base nucleotídica em trinta das trinta amostras amplificadas por PCR tal como foi confirmado através de técnicas convencionais de sequenciação de ADN. EXEMPLO 3
Mini-sequenciação por Citometria de Fluxo Utilizando Iniciadores Marcados: A Figura 3a é uma representação esquemática de um procedimento de mini-sequenciação baseado em microesferas 10 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ multiplexadas utilizando iniciadores com marcador de sequência solúveis e microesferas possuindo sondas de captura de um modo semelhante ao da mini-sequenciação ilustrado nas Figs. 2a e 2b daqui, excepto que foi assumido que estavam presentes quatro SNP na cadeia de ADN. A Figura 3b ilustra as microesferas e os iniciadores alongados capturados para serem analisados utilizando citometria de fluxo. O molde de ADN da amostra é amplificado através de PCR e o produto resultante tratado com fosfatase alcalina de camarão (SAP) e exonuclease I (Exo I) para remover desoxinucleótido-trifosfatos e iniciadores de PCR não consumidos, respectivamente. É preparado o iniciador da mini-sequenciação, desenhado para interrogar um local especifico no ADN molde e possuindo um marcador de sequência a 5'. É desenhada uma sonda de captura para se ligar ao marcador de sequência a 5' do iniciador e é imobilizada em microesferas. O iniciador possuindo o marcador de captura é adicionado ao ADN molde (1 μΐ, 1 nM), ADN-polimerase (uma unidade, Thermosequenase, Amersham), um ddNTP marcado com fluoresceina (5 μΜ), 5 μΜ de cada um dos outros três ddNTP não fluorescentes e tampão (tampão de Thermosequenase, Amersham) num volume total de 10 μΐ. Este processo é repetido três vezes utilizando um ddNTP fluorescente diferente. As misturas reaccionais são sujeitas a ciclos 99 vezes a 94°C durante 10 s e 60°C durante 10 s num termociclador. São adicionados à mistura reaccional 5 μΐ de microesferas revestidas com avidina para capturar os iniciadores biotinilados. São diluídos dois microlitros de cada mistura reaccional em 500 μΐ de tampão TEB (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, albumina de soro bovino, BSA, a 0,5% (p/v)) e a fluorescência associada as microesferas é medida utilizando citometria de fluxo. EXEMPLO 4
Ligação de Oligonucleótidos por Citometria de Fluxo Utilizando Iniciadores Imobilizados: A Figura 4a é uma representação esquemática do ensaio de ligação de oligonucleótidos baseado em microesferas utilizando citometria de fluxo, em que um iniciador imobilizado numa microesfera juntamente com iniciadores complementares fluorescentes para ligação ao iniciador hibridou com a cadeia de ADN a investigar na região do SNP. A Figura 4b é uma 11 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ representação esquemática do iniciador ligado à microesfera ao qual o complemento fluorescente correcto foi ligado após o ADN se ter desnaturado, a fluorescência da microesfera foi determinada através de citometria de fluxo indicando que complemento fluorescente foi ligado à cadeia de ADN. O molde de ADN da amostra é amplificado através de PCR, e o produto resultante tratado com fosfatase alcalina de camarão (SAP) e exonuclease I (Exo I) para remover os desoxinucleótido- trifosfatos e os iniciadores de PCR não consumidos, respectivamente. O iniciador da ligação dos oligonucleótidos, desenhado para interrogar um local especifico no ADN molde, é imobilizado através de um grupo amino a 5' numa microesfera de poliestireno carboxilada utilizando carbodiimida. São preparados quatro oligonucleótidos repórter fluorescentes desenhados para se ligarem imediatamente adjacente ao local de interesse, mas variando no terminal 5'. As microesferas possuindo iniciador (5 μΐ) são adicionadas ao ADN molde (1 μΐ, 1 nM), ADN-ligase (uma unidade, Thermoligase, Epicentre Technologies, Madison, Wl), um oligonucleótido repórter marcado com fluoresceina (5 μΜ) e tampão (tampão de Thermoligase, Epicentre) num volume total de 10 μΐ. Este processo é repetido três vezes utilizando cada um dos quatro oligonucleótidos repórter fluorescentes (5 μΜ) . As misturas reaccionais são sujeitas a ciclos 99 vezes a 94°C durante 10 s e 60°C durante 10 s num termociclador. São diluídos dois microlitros de cada mistura reaccional em 500 μΐ de tampão TEB (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, albumina de soro bovino, BSA, a 0,5% (p/v)) e a fluorescência associada às microesferas é medida utilizando citometria de fluxo. Utilizando este procedimento, foi determinada a identidade correcta da base nucleotídica em trinta das trinta amostras amplificadas por PCR tal como confirmado através de técnicas convencionais de sequenciação de ADN. EXEMPLO 5
Ligação de Oligonucleótidos Multiplexados em ADN Não Amplificado, Seguida de Amplificação por PCR:
As Figuras 5a e 5b são representações esquemáticas da ligação de oligonucleótidos em ADN não amplificado, seguida de amplificação por PCR, captura em microesferas e análise da 12 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ fluorescência das microesferas através de citometria de fluxo, para o caso em que a base complementar se verifica na cadeia de ADN e em que a base complementar não existe na cadeia de ADN, respectivamente. É desenhado um conjunto de iniciadores oligonucleotídicos incluindo um oligonucleótido (oligonucleótido 1) que é complementar à sequência do ADN molde imediatamente adjacente a um local de interesse, e quatro oligonucleótidos (oligonucleótidos IA, 1C, 1G e 1T) que são complementares à sequência do ADN molde imediatamente adjacente ao oligonucleótido 1, e contendo o local de interesse. Cada um dos quatro oligonucleótidos (IA, 1C, 1G e 1T) difere na base nucleotidica adjacente ao outro oligonucleótido (oligonucleótido 1), correspondendo a cada uma das quatro bases possíveis, A, C, G e T. Pretende-se que o oligonucleótido 1 se ligue a um dos outros oligonucleótidos (IA, 1C, 1G ou 1T), dependendo de qual contém a base complementar para o local de interesse. Adicionalmente, cada um dos dois oligonucleótidos num potencial par (total de cinco oligonucleótidos) contém nucleótidos adicionais que formam uma "cauda" consistindo num local de iniciação de PCR. Este local é diferente para o oligonucleótido 1 que para os oligonucleótidos IA, 1C, 1G e 1T, que têm o mesmo local de ligação ao iniciador dentro deste grupo, mas diferente do do oligonucleótido 1. São realizadas em paralelo quatro reacções de ligação, cada uma com o oligonucleótido 1, um de cada um dos outros oligonucleótidos (IA, 1C, 1G ou 1T) e uma enzima ADN-ligase. Espera-se que todos os oligonucleótidos hibridem com o molde, mas apenas o oligonucleótido com um emparelhamento perfeito se ligará ao oligonucleótido 1. O produto de ligação resultante serve como molde para uma reacção de PCR que se segue utilizando um iniciador (iniciador 1) complementar à causa introduzida no oligonucleótido 1, e o outro iniciador (iniciador 2) possuindo a mesma sequência que a da cauda dos oligonucleótidos IA, 1C, 1G e 1T. Os oligonucleótidos não ligados não podem ser amplificados com a técnica de PCR (Fig. 5b) porque não existe um local de iniciação para o oligonucleótido 2 a menos que a amplificação por PCR a partir do iniciador 1 se alongue ao longo de um fragmento ligado, criando uma sequência complementar ao iniciador 2. Para além dos dNTP não marcados 13 ΕΡ 1 040 202/ΡΤ durante ο passo de PCR, são adicionados dNTP marcados com fluorescência para marcar os fragmentos de PCR durante a amplificação. Alternativamente, o iniciador 2 é marcado com um corante fluorescente, produzindo produtos de amplificação de PCR marcados com corante quando ocorre a amplificação. O passo final envolve a adição à mistura de PCR de microesferas com um oligonucleótido imobilizado na sua superfície que tenha a mesma sequência que os oligonucleótidos IA, 1C, 1G e 1T, excepto quanto ao nucleótido variável numa extremidade e o local de início da amplificação na outra. Pretende-se que esta microesfera capture produtos de PCR marcados se estes estiverem presentes na mistura de PCR através de hibridação com o complemento recentemente sintetizado do complexo oligonucleotídico ligado. A fluorescência das contas devida a fragmentos hibridados é então analisada através de citometria de fluxo. Muitos conjuntos de iniciadores podem tipificar simultaneamente muitos SNP em solução, sendo cada um capturado numa conta diferente num conjunto multiplexado a ler simultaneamente num citómetro de fluxo. A descrição antecedente do presente invento foi apresentada para fins de ilustração e descrição e não se pretende que seja exaustiva ou que limite o presente invento à forma precisa divulgada e obviamente são possíveis muitas modificações e variações à luz dos ensinamentos de cima. Por exemplo, para ligar os iniciadores oligonucleotídicos a microesferas para análise utilizando citometria de fluxo, os iniciadores oligonucleotídicos podem incluir um marcador de sequência que hibride com uma sonda de captura que seja complementar ao marcador de sequência e seja imobilizada nas microesferas, contendo os marcadores de sequência e as sondas de captura pelo menos uma das bases não naturais iso-C e 5-metil-iso-G. As concretizações foram escolhidas e descritas para explicar melhor os princípios do presente invento e a sua aplicação prática para deste modo permitir que outros peritos na especialidade utilizem melhor o presente invento em várias concretizações e com várias modificações conforme seja adequado à utilização particular contemplada. Pretende-se que o âmbito do presente invento seja definido através das reivindicações anexas.
Lisboa, 2009-03-18

Claims (11)

  1. ΕΡ 1 040 202/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método homogéneo para determinação da identidade de uma base numa cadeia de adn, que compreende, por ordem, os passos de: a) hibridação de um oligonucleótido à cadeia de ADN imediatamente adjacente à base cuja identidade se pretende determinar; b) incubação da cadeia de ADN hibridada e do oligonucleótido com quatro didesoxinucleótidos diferentes, um dos didesoxinucleótidos possuindo uma molécula repórter fluorescente, na presença de ADN-polimerase, alongando deste modo o oligonucleótido numa unidade de bases; c) imobilização do oligonucleótido alongado numa microesfera; e d) análise da microesfera utilizando citometria de fluxo através da qual é determinada a base em investigação.
  2. 2. Método tal como descrito na reivindicação 1, em que o oligonucleótido é biotinilado e a microesfera é revestida com avidina ou estreptavidina.
  3. 3. Método tal como descrito na reivindicação 1, em que o oligonucleótido é ligado covalentemente à microesfera.
  4. 4. Método tal como descrito na reivindicação 1, em que o oligonucleótido é hibridado com uma sonda de captura complementar imobilizada numa microesfera.
  5. 5. Método tal como descrito na reivindicação 6, em que o oligonucleótido compreende um marcador de sequência que é hibridado com a sonda de captura e em que o marcador de sequência e a sonda de captura compreendem pelo menos uma base não natural seleccionada de entre o grupo que consiste em iso-C e 5-metil-iso-G.
  6. 6. Método homogéneo para determinação da identidade de uma base num local numa cadeia de ADN, que compreende, por ordem, os passos de: a) hibridação de um primeiro oligonucleótido e de um segundo oligonucleótido à cadeia de ADN adjacente ao primeiro ΕΡ 1 040 202/ΡΤ 2/3 oligonucleótido e na presença de ADN-ligase, em que o segundo oligonucleótido contém simultaneamente uma molécula repórter fluorescente e uma base interrogadora, que é variável de modo a interrogar o local de interesse no ADN da amostra, apenas o segundo oligonucleótido com um emparelhamento perfeito na base interrogadora se ligará ao primeiro oligonucleótido.; b) desnaturação da cadeia de ADN e imobilização dos oligonucleótidos ligados numa microesfera; e c) análise da microesfera utilizando citometria de fluxo através da qual é determinada a base sob investigação.
  7. 7. Método homogéneo para determinação da identidade de uma base num local de uma cadeia de ADN, que compreende, por ordem, os passos de: a) hibridação de um primeiro oligonucleótido e de um segundo oligonucleótido à cadeia de ADN adjacente ao primeiro oligonucleótido e na presença de ADN-ligase, em que o segundo oligonucleótido contém simultaneamente uma molécula repórter fluorescente e uma base interrogadora, que é variável de modo a interrogar o local de interesse no ADN da amostra, apenas o segundo oligonucleótido com um emparelhamento perfeito na base interrogadora se ligará ao primeiro oligonucleótido; b) amplificação dos oligonucleótidos ligados; c) captura dos oligonucleótidos ligados amplificados numa microesfera; d) análise da microesfera utilizando citometria de fluxo através da qual é determinada a base em investigação.
  8. 8. Método tal como descrito na reivindicação 6, em que o primeiro oligonucleótido é biotinilado e a microesfera é revestida com avidina ou estreptavidina.
  9. 9. Método tal como descrito na reivindicação 6, em que o primeiro oligonucleótido é ligado covalentemente às microesferas. ΕΡ 1 040 202/ΡΤ 3/3
  10. 10. Método tal como descrito na reivindicação 6, em que o primeiro oligonucleótido é hibridado com uma sonda de captura complementar imobilizada numa microesfera.
  11. 11. Método tal como descrito na reivindicação 10, em que um marcador de sequência é hibridado com a sonda de captura que é complementar a ela, e em que o marcador de sequência e a sonda de captura compreendem uma base não natural seleccionada de entre o grupo que consiste em iso-C e 5-metil-iso-G. Lisboa, 2009-03-18
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