PT1352097E - Método e estojo de teste para determinação quantitativa de variações em quantidades de polinucleótidos em amostras celulares ou de tecidos - Google Patents

Description

ΡΕ1352097 1 DESCRIÇÃO "MÉTODO E ESTOJO DE TESTE PARA DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE VARIAÇÕES EM QUANTIDADES DE POLINUCLEÓTIDOS EM AMOSTRAS CELULARES OU DE TECIDOS"

CAMPO TÉCNICO O presente invento refere-se a um método para determinação quantitativa das quantidades de polinu-cleótidos ou variações nas suas quantidades numa amostra celular ou de tecido utilizando bancos organizados de sondas polinucleotidicas com tamanhos distintos. O método quantitativo permite a avaliação comparativa de variações, e.g., em perfis de transcrição ou padrões de expressão. É ainda divulgado um estojo de teste compreendendo meios e reagentes para a realização do método do presente invento. É também divulgada a utilização do referido método e um estojo de teste para vários fins de diagnóstico e biotecnológicos.

Como resposta ao rápido aumento da informação genética disponível e ao seu impacto na biologia molecular, nos cuidados de saúde, nas modalidades de tratamento, na investigação farmacêutica, nos estudos epidemiológicos, etc., o interesse científico está actualmente focado nos efeitos celulares dos elementos genéticos chave bem como 2 ΡΕ1352097 nas suas funções e papel biológico. À medida que a acumulação de nova informação relacionada com os elementos chave básicos em genética está a abrandar, o desejo de estudar os seus efeitos e/ou o seu papel biológico está constantemente a aumentar. A bioinformática, manuseando informação relacionada com os processos da vida e acumulando-se na genómica, proteómica, transcritómica, etc., de um modo matematicamente exacto, criou uma procura de novas ferramentas precisas que permitam uma avaliação rápida e quantitativa dos efeitos e da importância do conhecimento acumulado. A química combinatória permite a síntese rápida de uma enorme quantidade de compostos novos e já existentes. É desejável avaliar rapidamente os efeitos e a potencial importância dos referidos compostos novos e já existentes ou de outros estímulos externos sobre a expressão génica em organismos vivos, incluindo seres humanos e animais experimentais. Por outras palavras, a informação que se acumula na genómica, proteómica, transcritómica, etc., bem como a química combinatória combinada com a bioinformática criou uma procura de novas ferramentas que permitam uma avaliação rápida, precisa e de preferência quantitativa dos efeitos e do papel biológico dos referidos compostos. De facto, cresceu um mercado significativo em torno da tecnologia que permite a elaboração de perfis de transcrição. Os perfis de transcrição são utilizados não só por cientistas em muitas áreas de investigação básica nas ciências da vida, como também em investigação e desenvolvimento industriais. Os 3 ΡΕ1352097 efeitos de fármacos conhecidos e novos na expressão génica dos seres humanos e de animais experimentais é actualmente um conhecimento essencial na indústria farmacêutica e de diagnóstico, mas os beneficiários serão também vários outros sectores da indústria de biotecnologia.

Uma poderosa ferramenta na elaboração de perfis de transcrição é a tecnologia de chips de oligómeros, divulgada por exemplo nas seguintes patentes US 6040138, US 5556752; US 5770722, US 5807522 ou no pedido de patente WO 200003037. A patente US 6040138 divulga a monitorização simultânea da expressão de múltiplos genes através de hibridação de ácidos nucleicos alvo com uma série ("array") de sondas oligonucleotidicas imobilizadas. As patentes US 5556752 e US 5770722 descrevem a sequenciação de ácidos nucleicos e métodos de análise através do auxilio de "arrays" de bibliotecas de ácidos nucleicos em suportes sólidos bem como através da aplicação de reacções de hibridação e de nucleases ou ligases. No pedido de patente WO 200003037 é divulgada a pesquisa de polinucleótidos alvo num "array" para determinar a sua função genética. A US 5807522 divulga micro-"arrays" de certas regiões de ensaio de objectos de análise contendo reagentes específicos dos objectos de análise, que são úteis para muitas aplicações genéticas que aplicam técnicas de hibridação em larga escala. A característica comum das técnicas de micro-"arrays" descritas acima é que as sondas, i.e., as 4 ΡΕ1352097 sequências polinucleotídicas utilizadas como reagentes são imobilizadas ou ligadas a um transportador sólido. A imobilização das sondas actua como um impedimento espacial e impede que a hibridação ocorra de um modo estequiométrico resultando em baixo rendimento. Assim, os métodos acima mencionados são apenas semi-quantitativos e requerem dupla marcação e verificação comparativa.

Devido a uma insuficiente capacidade de distinção causada, e.g., por pontos de sondas pouco nítidos, é frequentemente impossível comparar os pontos com suficiente exactidão. Embora isto não seja um obstáculo à aplicação das técnicas de micro-"arrays", permanece um problema, quando são necessários resultados quantitativos e isso explica porque é necessário um grande grau de redundância nos testes actuais. No pedido de patente WO 98/51789 é descrita a preparação de bibliotecas de ADNc subdivididas a partir de ARNm através de transcrição reversa e amplificação. As bibliotecas são utilizadas para pesquisa de novos genes, proteínas de interacção, potenciais fármacos e/ou para diagnóstico. Este sistema depende da tecnologia de PCR e de um conjunto de diferentes iniciadores. Mesmo que o referido sistema permita a detecção de sequências sub-reguladas presentes em pequenas quantidades, aumenta os problemas de quantificação. Concordantemente, existem poderosas ferramentas para estudar o papel biológico de elementos genéticos chave, mas permanece ainda o problema de obtenção de resultados quantitativos. Para além disso, as técnicas anteriores não 5 ΡΕ1352097 são aplicáveis para monitorização dos efeitos de genomas não caracterizados.

Assim, o principal objectivo do presente invento é proporcionar um método e estojos de teste não só para quantificação de padrões de expressão ou de perfis de transcrição que permitam avaliações comparativas de variações neles, como também para proporcionar um teste muito sensível, que permita a determinação quantitativa de quantidades muito pequenas de polinucleótidos de análise, que de outro modo estariam abaixo do limite de detecção. 0 objectivo é proporcionar um método verdadeiramente quantitativo e um estojo de teste, que como resposta dá a quantidade de cópias do polinucleótido na amostra, e.g., permite que se avalie o número de cópias de ARNm presente na amostra e que pode ainda ser modificado para aumentar a sua sensibilidade significativamente.

Uma vantagem do método é do estojo de teste do presente invento é que permitem a avaliação de perfis de transcrição ou de padrões de expressão não só para genomas caracterizados como também para não caracterizados.

Outra vantagem do presente invento é que a qualidade do objecto de análise, i.e., a preparação de polinucleótido, a analisar, não é crítica. 0 ARN, que geralmente se sabe requerer tratamento especial devido à sua instabilidade, pode ser utilizado directamente para a avaliação quantitativa. 6 ΡΕ1352097 A produção dos estojos de teste, que não precisa de incluir passos de imobilização e certos reagentes comercialmente disponíveis, permite uma fácil adaptação dos testes feitos à medida, dirigindo a atenção para certos subconjuntos de genes num dado organismo. O método é muito adaptável. Pode ser utilizado em montagens completamente automáticas ou semi-automáticas. 0 procedimento pode ser interrompido em vários estádios. As amostras e os produtos de reacção podem ser conservados até terem sido recolhidos dados suficientes ou a continuação do processo ser mais conveniente, e.g., registando os resultados.

Em resumo, o presente invento permite a quantificação de alterações e variações das quantidades de polinucleótidos em amostras contendo nucleótidos, que foram tomadas a diferentes momentos, de diferentes locais ou de diferentes organismos alvo. Isto é útil especialmente quando se estudam processos da vida e o impacto de estímulos físicos e químicos aplicados nas mesmas células ou tecidos. 0 invento permite a avaliação comparativa simultânea de vários fenómenos biológicos. O método do presente invento não é apenas quantitativo, pode também ser tornado muito sensível e permitir a detecção quantitativa de sequências polinucleotídicas sub-reguladas. As características do 7 ΡΕ1352097 método do presente invento são tal como definido nas reivindicações. A Fig. 1 é uma ilustração esquemática do método para preparação de sondas etiquetadas com marcador (P). A Fig. 2A ilustra o processo de hibridação entre as sondas etiquetadas com marcador (estrela) (P) e as sequências objecto de análise de ARN de cadeia simples etiquetadas por afinidade ou com biotina (B) e a formação de hibridos (H) entre os objectos de análise (A) e as sondas (P). A Fig. 2B ilustra o processo de hibridação entre as sondas etiquetadas com marcador (estrela) (P) e as sequências objecto de análise polinucleotidicas ou de ARN de cadeia dupla etiquetadas por afinidade ou com biotina (B) e a formação de híbridos (H) entre os objectos de análise (A) e as sondas (P) . As sondas, que não coincidem com as sequências objecto de análise ou que estão presentes em excesso molar, permanecem livres em solução. A Fig. 3A representa a captura dos híbridos etiquetados por afinidade (B) numa ferramenta auxiliar de separação sólida (SAT) coberta com o parceiro da etiqueta de afinidade (B). A Fig. 3B representa a captura dos híbridos etiquetados por afinidade (B) numa ferramenta auxiliar de ΡΕ1352097 separação sólida (SAT) coberta com o parceiro da etiqueta de afinidade (B) . As sequências das sondas etiquetadas com marcador que não hibridaram com a sequência objecto de análise etiquetada por afinidade não são capturadas. Naturalmente, as ferramentas auxiliares de separação (SAT) ligam-se à etiqueta de afinidade livre bem como aos objectos de análise etiquetados por afinidade aos quais não hibridou qualquer sequência de sonda. A Fig. 4 representa a libertação utilizando eluição das sondas etiquetadas com marcador (P) da ferramenta auxiliar de separação sólida (SAT), deixando a sequência objecto de análise etiquetada por afinidade (A) com a ferramenta auxiliar de separação (SAT) e a sonda etiquetada com marcador (P) em solução. A Fig. 5 representa a sintese por PCR de sondas através de iniciadores com mais sequências idênticas 16-mero ou etiquetas iniciadoras terminais (TPTs). A Fig. 6 representa a captura de sondas etiquetadas por iniciadores terminais (TPT-P): objecto de análise (A) etiquetado por afinidade (B) numa ferramenta auxiliar de separação (SAT). Os iniciadores terminais em cada extremidade das sondas etiquetadas por iniciadores terminais (TPT-P) são também marcados com (Ps). A Fig. 7 ilustra a amplificação por PCR das sondas etiquetadas por iniciadores terminais (TPT-Ps) eluidas com iniciadores etiquetados com marcador (estrela). 9 ΡΕ1352097 A Fig. 8 mostra os resultados, que podem ser registados a partir de um electroferograma e a partir de um ficheiro de dados obtido quando se realiza o processo quantitativo do invento de acordo com o Exemplo 1. A Fig. 8A mostra o resultado registado com um padrão externo. A Fig. 8B mostra os resultados registados de todos os picos obtidos de pASllMspI. A Fig. 8C mostra os resultados registados a partir da selecção de ARNm de egl5. A Fig. 9 mostra os resultados que podem ser registados a partir de um electroferograma e a partir de um ficheiro de dados obtido quando se realiza o processo comparativo do invento de acordo com o Exemplo 2. A Fig. 9A mostra os resultados obtidos quando se utilizam condições induzidas. A Fig. 9B mostra os resultados obtidos sob condições não induzidas. A Fig. 10 mostra um desempenho semi-automático do processo como um fluxograma. 10 ΡΕ1352097

Os termos utilizados no presente invento têm o significado habitual nos campos da tecnologia de ADN recombinante e da tecnologia de hibridação de ácidos nucleicos. Alguns termos do presente invento são, no entanto, utilizados num sentido mais amplo ou de algum modo diferente. Portanto, alguns dos termos são definidos em maior detalhe abaixo. O termo "banco" significa um subconjunto ou uma biblioteca de sondas polinucleotidicas solúveis ou solubilizáveis. Cada banco compreende um número opcional definido de sondas polinucleotidicas. Um número opcional conveniente é, por exemplo, aproximadamente 10 sondas. No entanto, o método pode ser utilizado com apenas duas ou três sondas, mas um número conveniente de sondas é cinco ou mais sondas em cada banco. Estojos de teste com bancos compreendendo centenas de sondas solúveis podem ser preparados e utilizados no método quantitativo ou comparativo do presente invento. Mesmo que seja possível preparar bancos compreendendo milhares de sondas, um limite superior preferido parece ser de aproximadamente 300-500 sondas diferentes para se obter uma resolução satisfatória.

Tal como dito acima as "sondas solúveis ou solubilizáveis" são caracterizadas por terem tamanhos distintos, que permitem a sua identificação precisa quando se registam os resultados através de meios ou instrumentos automáticos ou semi-automáticos opcionais, incluindo espectrometria de massa. Os tamanhos das sondas solúveis 11 ΡΕ1352097 podem variar entre aproximadamente 16 pb até vários milhares de nucleótidos.

As "sondas solúveis" para os bancos podem ser preparadas a partir de uma biblioteca de sequências polinucleotídicas caracterizada, parcialmente caracterizada ou completamente por caracterizar, e.g. fragmentos de ADN do genoma do organismo alvo, cujo perfil de transcrição se pretende determinar. No caso de genomas bem caracterizados, as sondas são de preferência dispostas em bancos de modo a que as moléculas das sondas tenham um tamanho distinto ou caracteristico, que permita a sua identificação pelo seu tamanho ou massa, e.g. utilizando electroforese capilar ou em gel ou espectrometria de massa. Bancos de genomas fracamente caracterizados são do mesmo modo desenhados para conterem vários fragmentos de ácido nucleico com tamanhos distintos. No entanto, como os fragmentos nucleotidicos não estão caracterizados, alguns dos fragmentos nucleotidicos obtidos através de clivagem com várias enzimas de restrição podem por acaso ter tamanhos idênticos. Isto significa que as sondas são apenas parcialmente identificáveis através dos seus tamanhos. Quando se repetem os testes, a redundância é logo detectada e tais sondas, que não podem ser identificadas com 100% de exactidão, podem ser suprimidas ou substituídas por outras sondas mais convenientes. Mesmo com um genoma completamente por caracterizar pode-se acumular muita informação num curto período de tempo e pelo menos as partes do genoma que são utilizadas para preparação dos bancos solúveis organizados, estarão em breve bem caracterizadas. 12 ΡΕ1352097 O "banco solúvel organizado" compreendendo "sondas polinucleotídicas solúveis ou solubilizáveis" pode estar contido em qualquer tipo de vasos, que podem estar totalmente separados ou ligados de um modo não fixo ou rigidamente fixo. Na sua forma mais simples, um banco organizado compreende um ou mais vasos, por exemplo tubos de ensaio ou garrafas, que podem estar ligados uns aos outros de um modo fixo por exemplo, num suporte para tubos de ensaio. Um exemplo prático de bancos organizados colocados em vasos, que são ligados uns aos outros de um modo rigidamente fixo é proporcionado pelos compartimentos ou poços de uma placa de microtitulo. Tal como referido acima os bancos solúveis são de preferência colocados de um modo organizado, e.g. nos poços de uma placa de microtitulo. Os bancos solúveis são organizados de tal modo que cada banco e cada sonda polinucleotidica no referido banco é distintamente identificável. As placas de microtitulo com os seus poços são concretizações típicas comercialmente disponíveis que permitem a organização e o manuseamento simultâneo de muitos bancos organizados. Naturalmente, podem ser desenvolvidos e construídos outros bancos organizados feitos à medida mais convenientes com múltiplos compartimentos que podem ser proporcionados com marcas e instruções de utilização apropriadas.

As "sondas" ou "bancos de sondas" significam um conjunto de sequências polinucleotídicas solúveis, i.e., fragmentos de ADN, que são de preferência obteníveis a 13 ΡΕ1352097 partir de sequências de ADN genómico dos organismos alvo, cujas sequências podem estar caracterizadas, parcialmente caracterizadas ou por caracterizar. As sondas podem ser, por exemplo, ADNc copiado a partir de ARNm caracterizado, parcialmente caracterizado ou por caracterizar. As sondas podem convenientemente obter o seu tamanho distinto através de clivagem com enzimas de restrição ou através da sua amplificação utilizando reacções de PCR com iniciadores adequados. As sondas podem também ser oligómeros sintetizados preparados com ADN natural como modelo.

Alternativamente, podem ser preparadas e utilizadas sondas de ADN possuindo sequências aleatórias com tamanhos distinguíveis para estudar padrões de expressão específicos. Naturalmente, se um conjunto de sondas oligonucleotídicas for preparado sinteticamente, é também conveniente preparar sondas polinucleotídicas modificadas, caso em que a estrutura de fosfato-açúcar das sequências nucleotídicas pode ser substituída por ligações peptídicas ou constituída pelos chamados análogos nucleósidos trancados. Os polinucleótidos modificados são, por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) descritos e.g. em WO 96/20212 ou ácidos nucleicos trancados (LNA), descritos e.g. em WO 99/14226. As referidas sondas polinucleotídicas modificadas podem ser convenientemente aplicadas no método e estojos de teste do presente invento. Podem ser copiadas utilizando ADN genómico ou ADNc como modelo. Frequentemente, têm propriedades melhoradas, incluindo melhor estabilidade e podem também ter a vantagem de ser mais 14 ΡΕ1352097 fáceis de proporcionar com etiquetas marcadoras que as sondas de ADN naturais.

Os pré-requisitos do presente invento são que as sondas nos bancos solúveis tenham tamanhos distintos significando massas moleculares distinguíveis. As sondas podem opcionalmente ser proporcionadas com uma "etiqueta", o que significa uma etiqueta ou um marcador, que permite a detecção ou o registo da sonda ou alternativamente a amplificação da sonda. Na concretização básica do presente invento a etiqueta é um marcador de seguimento, i.e., um marcador ou etiqueta detectável ou registável tal como um fluoróforo. Deve notar-se que a etiqueta marcadora é de preferência colocada numa extremidade da sonda, e.g. é etiquetada na extremidade, para prevenir que o marcador perturbe as reacções de hibridação entre a sonda e o objecto de análise.

Numa concretização mais avançada do presente invento que permite não só a avaliação quantitativa como também proporcionar um teste muito mais sensível, a "etiqueta" compreende "um par de sequências iniciadoras terminais" e opcionalmente um marcador. Estas etiquetas iniciadoras colocadas nas extremidades terminais 3' e 5' da sonda permitem a amplificação das sondas após uma recuperação quantitativa das sondas que hibridam com os objectos de análise etiquetados por afinidade. Nesta concretização as sondas podem ser proporcionadas com uma etiqueta marcadora opcional durante ou após a amplificação. 15 ΡΕ1352097

Se for utilizada espectrometria de massa para o registo, não são necessários marcadores. 0 termo "etiquetas marcadoras" significa etiquetas ou marcadores, que são visíveis ou de outro modo detectáveis, i.e., registáveis como tais ou que podem ser tornados detectáveis ou registáveis quando em contacto com outros reagentes. As etiquetas marcadoras registáveis através das suas propriedades electroquímicas ou magnéticas, incluindo as espectrométricas de massa, fluorescência, luminescência, absorção nos infravermelhos radioactividade ou através de reacções enzimáticas são especialmente apropriadas, mas podem ser utilizadas quaisquer etiquetas marcadoras, que sejam facilmente registáveis através de meios ou instrumentos automáticos. Deve notar-se que não é necessária qualquer etiqueta marcadoras se for utilizada espectrometria de massa para o registo porque as sondas são distinguíveis pelos seus tamanhos distintos.

As etiquetas marcadoras preferidas são os fluorocromos ou fluoróforos, especialmente os que têm diferentes comprimentos de onda de emissão. O referido marcador fluorescente pode ser e.g. corantes fluorescentes tiol-reactivos, tais como o ácido 5-(2-((iodoace-til)amino)etil)aminonaftileno-1-sulfónico) (1,5- IEDANS), fluoresceína, Bodipy, FTC, Texas Red, ficoeritrina, rodaminas, carboxitetrametilrodamina, DAPI, corantes indo-piras, Azul Cascade, Verde Oregon, eosinas, eritrosina, 16 ΡΕ1352097 piridiloxazolas, benzoxadiazolas, aminonaftalenos, pirenos, maleimidas, coumarinas, MBD, Amarelo Lucifer, iodeto de propidio, poririnas, CY3, CY5, CY9, lantanideos, criptatos, quelatos de lantanideo, ou derivados ou análogos das referidas moléculas marcadoras. As sondas polinucleotidicas fluorescentes são especialmente úteis no registo automático ou semi-automático dos resultados, combinadas com sistemas e instrumentos de fluxo continuo. 0 termo "objectos de análise" significa as sequências polinucleotidicas, especialmente ARN mensageiro (ARNm) presente num certo momento na amostra celular ou de tecido do objecto ou sujeito em investigação do estudo. A preparação da amostra compreendendo as sequências polinucleotidicas objecto de análise é modificada para incluir uma etiqueta de afinidade adequada. O termo "etiquetas de afinidade" significa que os polinucleótidos objecto de análise são proporcionados com uma etiqueta ou um marcador que tem uma elevada afinidade para outra substância. Por outras palavras, a etiqueta de afinidade tende a formar ligações fortes com o seu parceiro ou par de afinidade. As ligações fortes formadas entre pares de afinidade permitem que o par de afinidade actue como meio de captura das substâncias desejadas. Um par de afinidade útil é por exemplo biotina-avidina ou biotina-estreptavidina mas podem também ser aplicados outros "pares de afinidade" ou substâncias de ligação sintéticos ou não sintéticos. "Pares de afinidade" adequados podem ser 17 ΡΕ1352097 encontrados entre receptores e ligandos, antigénios e anticorpos bem como entre fragmentos destes. As "etiquetas de afinidade" preferidas do presente invento incluem moléculas mais pequenas tais como biotina, oligómeros de histidina, haptenos, glicanos, etc., enquanto os parceiros preferidos das "etiquetas de afinidade" incluem moléculas maiores tais como avidina, estreptavidina, quelatos metálicos, anticorpos, lectinas, etc.

De preferência, os polinucleótidos objecto de análise são etiquetados por afinidade através de uma reacção química, na qual, e.g., resíduos de biotina são covalentemente ligados aos polinucleótidos ou moléculas de ácido nucleico a estudar resultando num polinucleótido objecto de análise modificado, i.e., um polinucleótido biotinilado objecto de análise. Para evitar que impedimentos espaciais perturbem a reacção de hibridação entre a sonda etiquetada com marcador e o polinucleótido objecto de análise, os polinucleótidos objecto de análise são etiquetados com o parceiro mais pequeno do par de afinidade, enquanto o seu parceiro maior é ligado a um suporte sólido ou ferramenta auxiliar de separação. Para estudos relacionados com perfis de transcrição a sequência polinucleotídica objecto de análise etiquetada por afinidade é tipicamente uma preparação de ARNm. A etiqueta de afinidade e o seu parceiro ou par proporcionam o designado par de afinidade, que permite a captura de substâncias etiquetadas por afinidade num suporte sólido, que neste caso é designado uma ferramenta auxiliar de separação. 18 ΡΕ1352097 O termo "ferramenta auxiliar de separação" significa preferencialmente suportes sólidos, tais como microsferas, partículas de látex, partículas magnéticas, fios, estacas, paus, micropoços, colunas de afinidade, que são proporcionados com, ou cobertos com, o parceiro ou par de afinidade da "etiqueta de afinidade". Opcionalmente, a ferramenta auxiliar de separação pode incluir e.g. meios de separação de fases ou electroforéticos que sejam dependentes da presença do parceiro da etiqueta de afinidade. 0 termo "organismo alvo" significa quaisquer organismos unicelulares ou multicelulares com genomas caracterizados, parcialmente caracterizados ou por caracterizar, cujos perfis de transcrição ou padrões de expressão se pretende determinar. Os organismos unicelulares incluem microrganismos, tais como bactérias, e.g. Escherichia coli, leveduras, e.g. Saccharomyces cerevisiae ou fungos filamentosos. 0 organismo alvo pode ser naturalmente amostras celulares ou de tecido de qualquer planta ou animal incluindo seres humanos. Os genomas de E. coli, S. cerevisiae e dos seres humanos são exemplos de genomas que estão actualmente mais ou menos completamente caracterizados. 0 presente invento refere-se a um método para determinação quantitativa de quantidades de vários polinucleótidos presentes numa amostra celular ou de tecido 19 ΡΕ1352097 e de variações nas quantidades devidas a causas intrínsecas ou a estímulos externos. Na concretização básica do método do presente invento é permitida a ocorrência de uma reacção de hibridação numa solução e o híbrido formado é capturado num suporte sólido proporcionado com, ou coberto com, o parceiro ou par de afinidade da etiqueta de afinidade. A cobertura é alcançada por meios químicos, e.g. através de conjugação. Por vezes a afinidade entre a superfície ou superfícies da ferramenta auxiliar de separação sólida e o parceiro da etiqueta de afinidade é suficiente para formar uma ligação estável. As sondas polinucleotídicas etiquetadas com marcador, de preferência etiquetadas nas extremidades de um banco (biblioteca) anteriormente caracte-rizado, parcialmente caracterizado ou não caracterizado são colocadas em contacto com as sequências polinucleotídicas etiquetadas por afinidade obtidas a partir da amostra a analisar, i.e., os objectos de análise.

Um ou mais bancos solúveis são proporcionados com números pré-estabelecidos mas opcionais, que variam de preferência entre 10-500, de preferência entre 50-400, de maior preferência entre 100-300 de sequências polinucleotídicas solúveis, com tamanhos distintos que permitem a sua identificação precisa, e.g. através de espectrometria de massa. As sondas solúveis, que podem ser identificadas sem quaisquer etiquetas marcadoras, podem alternativamente ser proporcionadas com etiquetas, que na concretização básica do presente invento são marcadores detectáveis ou registáveis e numa concretização avançada que permita uma 20 ΡΕ1352097 avaliação mais sensível, um par de etiquetas iniciadoras terminais, que permitem uma reacção de amplificação durante a qual as sondas podem ser proporcionadas com uma etiqueta marcadora utilizando e.g. iniciadores etiquetados com marcador ou nucleótidos etiquetados. Os bancos solúveis são colocados de um modo organizado nos seus próprios vasos, que podem estar separados, ligados de um modo flexível ou serem removíveis. Os bancos organizados podem também ser colocados numa ou sobre uma estrutura compacta, em que os vasos estejam mais ou menos rigidamente unidos uns aos outros como os poços de uma placa de microtítulo.

No método do presente invento os bancos de sequências polinucleotídicas solúveis são obteníveis a partir de genomas caracterizados, parcialmente caracteri-zados ou por caracterizar. Geralmente, uma sonda correspondendo a cada gene num genoma caracterizado é suficiente para uma determinação quantitativa da sua expressão. Um banco é geralmente preparado através de fragmentação com enzimas de restrição de uma inserção genómica. A inserção é colocada num plasmídeo para multiplicação conveniente. As sondas são construídas através de fraccionamento das sequências polinucleotídicas seleccionadas com enzimas de restrição. Assim, um modo conveniente de preparação das sondas é inserir a sequência polinucleotídica num plasmídeo, para multiplicar o referido plasmídeo, e a partir daí clivar o referido plasmídeo com a sua inserção. Alternativamente, as sondas podem ser preparadas a partir de bibliotecas de ADN genómico ou ADNc utilizando reacções 21 ΡΕ1352097 de PCR ou amplificação. Uma vez que o objectivo do presente invento é avaliar simultaneamente a expressão de mais de um gene, cada banco compreende habitualmente mais de um, de preferência pelo menos dez, de maior preferência cerca de cem ou mais sondas.

Se os polinucleótidos objecto de análise são por exemplo produtos de expressão de um genoma não caracte-rizado, deve ser utilizada pelo menos uma sonda para cada gene a quantificar no genoma não caracterizado. Isto significa que os bancos organizados a partir de genomas parcialmente caracterizados ou por caracterizar devem ser preparados a partir de mais de um plasmideo, de preferência a partir de pelo menos dois plasmideos. As inserções genómicas dos plasmideos devem de preferência ser diferentes, mas podem ser preparadas a partir da mesma inserção, caso em que podem ter algumas sequências parcialmente sobreponíveis. Se as sondas forem produzidas a partir de plasmideos compreendendo as mesmas sequências, podem ser utilizadas diferentes enzimas de restrição para se obter as sondas com tamanhos distintos requeridas no presente invento.

Quando o objecto de estudo são genomas não caracterizados e não estão disponíveis estojos de teste comerciais, deve recomendar-se que seja preparado um grande conjunto de bancos organizados idênticos de uma só vez, para evitar a necessidade de repetir o fastidioso passo preparativo e permitir a concentração no passo analítico. 22 ΡΕ1352097

Isto também é a base para proporcionar estojos de teste comerciais para estudar genomas parcialmente caracterizados ou por caracterizar.

Na concretização básica do presente invento as sondas de ADN etiquetadas com marcador ou iniciadores são deixadas a hibridar com a preparação de ARN, que se pretende analisar. As sequências polinucleotídicas objecto de análise ou os ARNs objectos de análise, presentes na amostra celular ou de tecido a determinar, são isolados através de métodos conhecidos per se. Geralmente os polinucleótidos objecto de análise a determinar a partir da amostra celular ou de tecido, são ARNs mensageiros (ARNm). Os referidos objectos de análise são proporcionados com pelo menos uma etiqueta de afinidade, tal como biotina, oligómeros de histidina, haptenos ou glicanos. O polinu-cleótido objecto de análise, e.g. ARN, é de preferência etiquetado com biotina.

Após estes passos de preparação dos reagentes, deixa-se ocorrer a reacção de hibridação entre as sondas e os objectos de análise. Deste modo, os híbridos são formados de um modo quantitativo molecularmente preciso entre as sondas solúveis e os objectos de análise etiquetados por afinidade. Como a quantidade de sondas diferentes presente nos bancos é conhecida e como existe um excesso de cada sonda em comparação com os objectos de análise, é evidente que a reacção de hibridação entre os objectos de análise e as sondas, que resulta num híbrido, é 23 ΡΕ1352097 estequiométrica e a quantidade de sonda recuperada corresponde exactamente à quantidade de polinucleótidos objecto de análise presente na amostra. Naturalmente, a sequência do objecto de análise não necessita de ser uma sequência de ARNm expressa. É possível através do presente método quantificar qualquer sequência de cadeia simples bem como qualquer sequência de cadeia dupla, após um passo de desnaturação que torna o objecto de análise de cadeia dupla em cadeia simples.

Tal como descrito acima através da hibridação em solução formar-se-ão híbridos de ADN:ARN. A partir daí, os híbridos, através do auxílio das moléculas de ARN possuindo a etiqueta de afinidade, de preferência biotina, são recolhidos através da sua afinidade para o seu par de afinidade, avidina ou estreptavidina. As únicas sondas ou ADN a serem recolhidos na ferramenta auxiliar de separação tem de estar presente num híbrido. Os híbridos recolhidos podem ser lavados do excesso de sondas, incluindo tais sondas que não foram capazes de hibridar com uma sequência objecto de análise etiquetada por afinidade. Em tais casos a sequência objecto de análise não estava presente na amostra porque falta o qene ou porque este não é expresso. As sondas recolhidas, que podem ser separadas ou libertadas do ARN são opcionalmente proporcionadas com uma etiqueta. As etiquetas de afinidade redundantes e as sequências objecto de análise etiquetadas por afinidade, que não foram capazes de hibridar, porque não estavam presentes sondas correspondentes no banco, são naturalmente capturadas na 24 ΡΕ1352097 ferramenta auxiliar de separação sólida, mas podem ser separadas dos hibridos durante a eluição e subsequentes processos de separação.

Geralmente, a hibridação em solução ocorre sob condições que conduzem a hibridação à formação de hibridos, incluindo ADN:ADN, ADN:ARN, ARN:ARN, PNA:ADN, PNA:ARN. As condições mais preferidas variam dependendo das sondas reagentes, dos objectos de análise, etc. A partir dai, os hibridos possuindo as etiquetas de afinidade são isolados através da sua recolha ou captura na ferramenta auxiliar de separação utilizando o parceiro ou par de afinidade da etiqueta de afinidade. Os híbridos são recolhidos ou recuperados, i.e. são removidos ou separados da solução de hibridação e podem ser lavados de outros reagentes. As moléculas de sonda, que não formaram híbridos com o objecto de análise etiquetado por afinidade permanecerão nas soluções de hibridação ou de lavagem e são concordantemente removidas. Consequentemente, apenas as sondas que foram capazes de hibridar com um polinucleótido objecto de análise presente na amostra celular ou de tecido, i.e. apenas as sondas que têm um objecto de análise com uma cadeia complementar presente na amostra são capturadas pela ferramenta auxiliar de separação e recuperadas e podem ser recolhidas. Naturalmente, tais objectos de análise etiquetados por afinidade, que não têm uma cadeia complementar entre as sondas são capturados na ferramenta auxiliar de separação, mas não perturbam a estequiometria do processo de hibridação e não perturbam os passos 25 ΡΕ1352097 analíticos consequentes. Eles podem, por exemplo, ser destruídos ou removidos quando as sondas são isoladas ou libertadas do híbrido. Isto significa que as sondas detectáveis ou registáveis automaticamente ou semi-automaticamente opcionalmente etiquetadas com marcador, que são identificáveis através dos seus tamanhos distintos, são capturadas ou recuperadas e subsequentemente libertadas ou isoladas para registo.

Apenas as sondas de ADN, que estavam presentes num complexo ou hibrido compreendendo uma cadeia de ARN objecto de análise etiquetada por afinidade da amostra são recolhidas na ferramenta auxiliar de separação e subsequentemente isoladas para registo. Ferramentas auxiliares de separação opcionais são necessárias no método do presente invento para recuperar os híbridos formados entre as sondas etiquetadas com marcador e os objectos de análise etiquetados por afinidade. As ferramentas auxiliares de separação, que são suportes sólidos, tais como micropartículas, microsferas, partículas de látex, partículas magnéticas, fios, estacas, paus, micropoços e colunas de afinidade são proporcionadas ou cobertas com o parceiro ou parceiros ou par ou pares de afinidade das etiquetas de afinidade. A ferramenta auxiliar de separação pode compreender meios para separação de fases ou meios electroforéticos para captura do parceiro da etiqueta de afinidade. 26 ΡΕ1352097

Os híbridos recuperados na ferramenta auxiliar de separação são subsequentemente libertados da ferramenta, primeiro através de eluição, e a partir daí através de quebra das pontes de hidrogénio dos híbridos e opcionalmente das sondas etiquetadas que foram libertadas dos híbridos, e isolados, separados através dos seus tamanhos e registados com meios que permitam a sua quantificação. Porque cada sonda isolada representa um ARNm expresso, a expressão pode ser quantificada numa base molecular. Alternativamente, as ligações do híbrido são primeiro quebradas e depois o suporte sólido e a solução contendo as sondas são separados um do outro através de um método apropriado dependente do auxiliar de separação utilizado. A partir daí, e.g. através de centrifugação, as sondas são separadas com base no seu tamanho e registadas através de meios que permitam a sua quantificação. As sondas purificadas e isoladas nas ferramentas auxiliares de separação são eluídas com uma solução, tal como NAOH, NH4OH ou formamida capaz de quebrar as ligações entre as cadeias polinucleotidicas.

Se a etiqueta marcadora não existir, as sondas podem ser directamente registadas com espectrometria de massa. Se a etiqueta for um marcador, e.g. uma substância fluorescente, a sonda de ADN pode também ser directamente registada quando for separada do ARN, que não possui qualquer etiqueta marcadora. As sondas reagentes 27 ΡΕ1352097 opcionalmente etiquetadas com marcador estão agora presentes numa forma isolada e livre e a sua quantidade corresponde exactamente à quantidade de ácido nucleico objecto de análise que anteriormente hibridou com elas.

Se a etiqueta for um par de iniciadores terminais, a sonda pode ser amplificada após separação do ARN e ser proporcionada com uma etiqueta marcadora durante ou após a amplificação. Por exemplo, após um número opcional de ciclos de amplificação, a sonda de ADN pode ser proporcionada com uma etiqueta marcadora e registada. Alternativamente, os iniciadores complementares podem ser proporcionados com etiquetas marcadoras, deste modo as sondas são proporcionadas com etiquetas marcadoras durante a amplificação. A amplificação permite o registo da expressão em quantidades tão pequenas que estão abaixo do limite de detecção quando são utilizados outros métodos. Na referida concretização avançada do presente invento, que permite uma avaliação mais sensível dos polinucleótidos objecto de análise, as etiquetas nas sondas são sequências iniciadoras terminais. As sondas etiquetadas com iniciadores terminais são deixadas a hibridar com os polinucleótidos objecto de análise etiquetados por afinidade do mesmo modo que na concretização básica do presente invento. Após a reacção de hibridação estequiométrica, os híbridos são capturados numa ferramenta auxiliar de separação e as sondas etiquetadas com iniciadores são recuperadas através de métodos conhecidos per se. A quantidade de sondas recuperadas, que corresponde 28 ΡΕ1352097 exactamente à quantidade de polinucleótidos objecto de análise presente na amostra pode ser amplificada um número opcional de vezes através de técnicas de PCR conhecidas per se. A partir dai ou durante a amplificação, as sondas são proporcionadas com marcadores e é registada a quantidade e o tamanho das sondas. Como a recuperação da sonda etiquetada com iniciadores é quantitativa e corresponde exactamente ao número de moléculas do objecto de análise e se sabe quantas vezes as sondas foram amplificadas, i.e. multiplicadas ou copiadas, é fácil calcular a quantidade de objecto de análise na amostra original. Isto permite uma avaliação quantitativa mesmo de tais polinucleótidos objecto de análise que sem a amplificação estariam abaixo do limite de detecção e não seriam assim registáveis. Concordantemente, a sensibilidade do método do presente invento pode ser altamente aumentada. Isto é uma grande vantagem, se for necessário um teste muito sensivel, por exemplo quando as amostras clinicas compreendem apenas poucas células de um espécimen de tecido histológico ou de uma biopsia de tecido.

Assim, o perfil da sonda seleccionada por afinidade pode ser avaliado através de um registo quantitativo automático sensivel, após a separação das sondas umas das outras com base no seu tamanho, e.g. através de electroforese capilar ou em gel ou espectrometria de massa. Uma sonda de um dado tamanho de um dado banco corresponde a uma molécula objecto de análise especifica. Assim o perfil de transcrição pode ser deduzido muito precisamente. 29 ΡΕ1352097

Uma avaliação quantitativa comparativa das variações na quantidade de vários polinucleótidos presentes na amostra celular ou de tecido como resposta a alterações intrínsecas devidas a mecanismos de controlo intrínsecos ou como resposta a estímulos externos, incluindo fármacos e estados patológicos, requer pelo menos dois bancos solúveis organizados, mas de preferência pelo menos um banco organizado por cada amostra a testar. Cada banco compreende sondas polinucleotídicas idênticas, mas os bancos organizados, e.g. cada um na sua própria placa de microtítulo, são opcionalmente proporcionados com uma etiqueta marcadora registável. Se forem utilizadas etiquetas marcadoras é vantajoso utilizar marcadores distinguíveis, e.g. fluoróforos possuindo diferentes comprimentos de onda de emissão. Numa concretização preferida os bancos preferidos são proporcionados em placas de microtítulo. Cada placa de microtítulo é de outro modo idêntica, mas cada uma tem os seus marcadores registáveis específicos, que se forem fluoróforos emitem de preferência a diferentes comprimentos de onda de emissão distinguíveis. É possível comparar as quantidades sem etiquetas marcadoras utilizando espectrometria de massa e permitindo que sistemas automáticos baseados em computador calculem e comparem os resultados registados. O seguinte fluxograma do método descreve como realizar o presente invento: 30 ΡΕ1352097

Passos Preparativos

Passo 1 - Preparação de bancos organizados de sondas de ADN solúveis com tamanhos distintos

Caso 1 - um genoma conhecido (levedura ou homem) São seleccionados fragmentos de ADN para representar genes individuais e os seus tamanhos são escolhidos para permitir uma boa resolução no estádio de fraccionamento de tamanhos.

Casos 2 - genomas desconhecidos (fungo filamentoso,

Trichoderma reesei)

Um conjunto de clones representativos de cerca de 50 kb de tamanho é clivado com uma endonuclease de restrição adequada que reconhece um local de endonuclease de restrição de 4 bases, para gerar um conjunto de fragmentos distintos. Neste caso, um fragmento de ADN pode abranger dois genes e assim hibridar com dois ARNs objecto de análise. É possível ter vários fragmentos para um gene. Alternativamente, nalguns casos podem ser utilizados fragmentos diferentes com um tamanho idêntico. Para cobrir um genoma completo, é necessária redundância e consequentemente são necessárias centenas de bancos de ADN solúveis. 31 ΡΕ1352097

Passo 2 - Marcação terminal das sondas de ADN com uma etiqueta marcadora ou um fluoróforo

De preferência, são preparados dois (ou mais) conjuntos do ADN com corantes distinguíveis. Isto permite estudos comparativos simultâneos de variações nos padrões de expressão ou nos perfis de transcrição devido a mecanismos internos, e.g. estádios patológicos, ou devido a estímulos externos, tais como fármacos. Os passos 1 e 2 são preparativos e as bases para os estojos de teste com valor comercial. Os bancos de ADN podem ser feitos em grandes quantidades para um grande número de experiências. Concordantemente, não deve haver qualquer necessidade de repetir frequentemente esta fase bastante fastidiosa.

Passos analíticos

Passo 1 - Preparação de um polinucleótido de cadeia simples objecto de análise 0 isolamento do ARN a partir das células é utilizado durante condições experimentais apropriadas utilizando métodos conhecidos per se (Sambrook, J. et al.r "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Segunda edição, 1989). Se o polinucleótido objecto de análise for de cadeia dupla o objecto de análise tem de ser desnaturado para proporcionar as sequências de cadeia simples requeridas no método do presente invento. 32 ΡΕ1352097

Passo 2 - Preparação dos objectos de análise etiquetados por afinidade 0 ARNm isolado é etiquetado por afinidade, por exemplo biotinilado utilizando um processo quimico não enzimático. 0 reagente fotoactivado fotobiotina é conveniente para este fim e está comercialmente disponível. Como o ARN não será transcrito em ADNc ou de outro modo modificado enzimaticamente para marcação, o ARN pode ser preparado e mantido em deterqentes fortes tais como SDS. As ARNases são inibidas por SDS e é fácil isolar ARN intacto.

No entanto, a fraqmentação não é um problema se não for demasiado pesado. O tamanho dos fragmentos de ARN não afectará a capacidade de captura.

Passo 3 - Hibridação em solução

Contactar cada banco solúvel de sondas (ADN) etiquetadas com marcador com uma alíquota da preparação do objecto de análise etiquetado por afinidade (ARN). Permitir que a hibridação ocorra na solução livre no pequeno volume proporcionado no respectivo compartimento do banco. Isto dá uma reacção rápida e quantitativa.

Passo 4 - Passo de separação

Adicionar microsferas ou outra ferramenta auxiliar de separação possuindo o par de afinidade, e.g. 33 ΡΕ1352097 avidina, para capturar as moléculas de ARN. Lavagem para eliminar o ADN livre.

Passo 5 - Estádio de recuperação

Eluir com uma solução que quebra o híbrido ADN:ARN tal como formamida ou NaOH. Se necessário, precipitar e lavar o ADN de cadeia simples. Apanhar o ADN de cadeia simples num tampão de electroforese. É preferível que sejam utilizadas condições tais que a electroforese do eluato possa ser realizada directamente e as diferentes sondas registadas simultaneamente.

Passo 6 - Registo dos resultados

Determinar o tamanho e a quantidade de ADN eluído a partir dos híbridos de ADN:ARN através de electroforese capilar ou em gel. Pode também ser utilizada possivelmente espectrometria de massa. As diferenças em duas preparações de ARN são facilmente observadas através de hibridação com fragmentos de ADN marcados com corantes diferentes e misturando os ADNs antes da electroforese.

Passo 7 - interpretação dos resultados

Se o genoma for conhecido (caso 1) o perfil de transcrição fica directamente determinado. No caso 2 é necessário clonar e sequenciar todos os fragmentos com um comportamento interessante. 34 ΡΕ1352097

Passo δ - Amplificação opcional

Se for necessário um ensaio muito sensível, as sequências polinucleotídicas reagentes, i.e. as sondas etiquetadas com marcador eluídas a partir da ferramenta auxiliar de separação, podem ser amplificadas por PCR após o passo de selecção quantitativa. Se for utilizada esta abordagem as sequências polinucleotídicas reagentes, i.e. as sondas, devem ser modificadas para conterem uma sequência terminal comum que permita a amplificação de todas as sondas no mesmo banco com o mesmo par de iniciadores de PCR, proporcionada com uma etiqueta marcadora. O facto de as sondas terem tamanhos distintos e poderem portanto ser registadas com base nas suas massas utilizando espectrometria de massa permite mais uma melhoria do método. Através da omissão da utilização de etiquetas marcadoras, o método pode ser simplificado e pode ser evitada a necessidade de marcadores registáveis dispendiosos. De outro modo, o método corresponde completamente ao método tal como descrito acima e compreende os seguintes passos consecutivos compreendendo: a) proporcionar um ou mais bancos organizados com um número opcional pré-estabelecido de sequências polinucleotídicas de sonda solúveis com tamanhos distintos 35 ΡΕ1352097 que permitem a sua identificação ou registo, colocando os referidos bancos de um modo organizado nos seus próprios vasos que estão separados ou unidos uns aos outros; b) isolar as sequências polinucleotidicas objecto de análise presentes numa amostra celular ou de tecido do organismo alvo e proporcionar os referidos objectos de análise com pelo menos uma etiqueta de afinidade; c) permitir a ocorrência de uma reacção de hibridação entre as sondas solúveis do passo (a) e o objecto de análise do passo (b) conduzindo à formação de híbridos solúveis de sonda:objecto de análise etiquetado por afinidade; d) isolar os híbridos sonda:objecto de análise formados no passo (c) através da captura do referido híbrido numa ferramenta auxiliar de separação proporcionada com o par de afinidade da etiqueta de afinidade do objecto de análise; e) recuperar a sonda a partir da ferramenta auxiliar de separação; e f) registar o tamanho e a quantidade de sonda com espectrometria de massa. 36 ΡΕ1352097

Estojos de teste 0 presente invento refere-se também a um estojo de teste. 0 estojo de teste compreende um ou mais bancos solúveis organizados com um número opcional pré-estabelecido de sequências polinucleotidicas ou sondas solúveis. As sondas são opcionalmente proporcionadas com etiquetas, etiquetas marcadoras ou um par de sequências etiqueta iniciadoras terminais. De preferência, as etiquetas marcadoras são etiquetas marcadoras detectáveis marcadas nas extremidades. O estojo de teste compreende bancos organizados solúveis possuindo cada banco mais de uma, de preferência mais de dez, de maior preferência mais de cerca de cem ou mais sondas. Os bancos são de preferência colocados de um modo organizado nos seus próprios vasos, e.g., tubos de ensaio, garrafas ou nos poços ou compartimentos de uma placa de microtitulo. Mesmo que o estojo de teste para realização da presente determinação quantitativa for de preferência uma placa de microtitulo ou uma estrutura correspondente feita à medida, o estojo de teste pode ser um número opcional de tubos de ensaio, garrafas, etc., que pode ser organizado em disposições mais ou menos fixas, incluindo suportes e/ou outras estruturas rígidas. Os estojos de teste podem ser personalizados ou feitos à medida e proporcionados com marcas e instruções de utilização apropriadas. 37 ΡΕ1352097

Os bancos de sondas polinucleotídicas solúveis para os estojos de teste podem ser preparados a partir de fragmentos de ADN. Podem ser oligonucleótidos sintéticos e ADNs modificados. Quando o estojo de teste é preparado para estudar genomas caracterizados, os bancos do estojo de teste compreendem de preferência pelo menos um fragmento polinucleotidico (sonda) de cada gene a estudar no genoma. Também, quando se pretende estudar genomas não caracterizados, os bancos podem ser vantajosamente preparados em maiores quantidades, não se excluindo de modo algum a produção comercial, para estudos mais gerais ou mais específicos. Os bancos são vantajosamente preparados através da inserção das partes desejadas do genoma num plasmideo, que pode ser convenientemente multiplicado e fragmentado com enzimas de restrição apropriadas para proporcionar os bancos desejados de sondas com tamanhos distintos. As inserções podem ser opcionalmente proporcionadas com locais de enzimas de restrição desejados. Também para genomas parcialmente caracterizados ou por caracterizar podem ser proporcionados estojos de teste comerciais de um modo essencialmente semelhante. Deve notar-se que mesmo um genoma não caracterizado é eficazmente caracterizado através deste método.

Se as sondas polinucleotídicas reagentes forem de um genoma caracterizado sabe-se que cada molécula de sonda corresponde a um dado gene e cada sonda é especificamente identificada pelo seu tamanho e banco. O perfil de 38 ΡΕ1352097 transcrição pode assim ser directamente interpretado como os níveis de expressão dos genes individuais. Se as sondas polinucleotídicas reagentes estiverem fracamente caracte-rizadas, são por exemplo derivadas de um organismo cujo genoma não está sequenciado, podem ainda ser obtidos resultados valiosos. Os bancos de sondas podem neste caso ser criados por exemplo clivando grandes clones de 10 a 200 kb em fragmentos distintos e significativamente menores. Estes fragmentos menores são opcionalmente marcados e utilizados como sondas tal como descrito acima. O perfil de transcrição neste caso não identificará directamente genes, mas dará dados quantitativos e diferenciais referentes a uma dada molécula de sonda. Com estes dados na mão é fácil clonar e sequenciar todos os fragmentos com um comportamento interessante. Deste modo pode ser eficientemente acumulada muita informação num curto período de tempo.

Uma concretização preferida do estojo de teste pode ser preparada numa placa de microtítulo. Numa tal concretização prática do invento, os bancos com fragmentos de ADN de levedura podem ser utilizados para a preparação dos estojos de teste. Se cada banco compreende e.g. 100-300 sondas ou fragmentos então dá uma resolução suficientemente boa. Se cada sonda no banco representa um dado gene de levedura, os aproximadamente 6300 genes de levedura podem ser colocados numa única placa de microtítulo e existe ainda lugar para vários controlos. As sondas de ADN capturadas são identificadas parcialmente através do banco 39 ΡΕ1352097 ou poço de microtítulo ao qual pertencem e parcialmente através do seu tamanho. A etiqueta marcadora registável opcional é vantajosamente seleccionada de entre um grupo de marcadores detectáveis através de fluorescência, absorção de infravermelhos, propriedades electromagnéticas, radioactividade e actividade enzimática. A etiqueta marcadora preferida registável através da sua fluorescência é um fluorocromo ou um fluoróforo. A espectrometria de massa é outro modo preferido, que permite o registo e a quantificação sem quaisquer etiquetas marcadoras. Mesmo que as etiquetas marcadoras sejam concretizações preferidas elas não são essenciais para o método do presente invento, o único pré-requisito para o estojo de teste do presente invento é que as sondas nos bancos solúveis organizados tenham tamanhos distintos. Elas são opcionalmente etiquetadas, com etiquetas marcadoras ou etiquetas iniciadoras terminais. Concordantemente, é proporcionado um estojo de teste operativo através de um banco organizado de sondas etiquetadas com iniciadores terminais mesmo se não for proporcionado um marcador. 0 estojo de teste do presente invento na sua forma mais simples é um banco organizado de sondas etiquetadas solúveis com tamanhos distintos. Deve notar-se que o referido estojo de teste está completo como tal mas pode ser complementado com marcadores opcionais, pares de afinidade e/ou ferramentas auxiliares de separação. No 40 ΡΕ1352097 entanto, os referidos reagentes auxiliares não são um pré-requisito. Tais reagentes auxiliares e meios para a realização do método do invento estão disponíveis mesmo comercialmente em várias outras fontes. Assim, o método e o estojo de teste do presente invento podem ser feitos à medida para as necessidades específicas do utilizador final, especialmente devem ser aplicáveis para manuseamento automático ou semi· -automático. 0 modo de produção do estojo de teste, que concordantemente não necessita incluir passos de imobilização, permite uma fácil adaptação dos testes feitos à medida, dirigindo a atenção para certos subconjuntos de genes num dado organismo. 0 estojo de teste pode compreender uma etiqueta de afinidade opcional para marcação dos polinucleótidos numa amostra celular ou de tecido e uma ferramenta auxiliar de separação opcional proporcionada ou coberta com um parceiro da etiqueta de afinidade para marcação do objecto de análise. Os pares de afinidade opcionais proporcionando as etiquetas de afinidade para os objectos de análise e os parceiros para as ferramentas auxiliares de separação incluem, mas não se limitam a, por exemplo, biotina e avidina ou estreptavidina, oligómeros de histidina e quelatos metálicos, haptenos e anticorpos ou glicanos e lectinas. A ferramenta auxiliar de separação opcional, que pode ser incorporada no estojo de teste ou pode ser proporcionada separadamente, é seleccionada a partir de um 41 ΡΕ1352097 grupo de suportes sólidos consistindo em micropartículas, microsferas, partículas de látex, partículas magnéticas, fios, estacas, paus, micropoços ou colunas de afinidade. A ferramenta auxiliar de separação pode incluir meios para separação de fases ou meios electroforéticos para captura do parceiro da etiqueta de afinidade.

Para a avaliação comparativa das variações nos padrões de expressão ou perfis de transcrição podem ser proporcionados bancos organizados com conjuntos idênticos de sondas. Neste caso, cada banco organizado ou estojo de teste é opcionalmente proporcionado com etiquetas marcadoras opcionalmente diferentes ou distinguíveis, cujas etiquetas emitem de preferência a diferentes comprimentos de onda de emissão. Se as etiquetas são etiquetas iniciadoras terminais os estojos de teste são idênticos, mas após a amplificação as sondas recuperadas e/ou amplificadas podem ser proporcionadas com etiquetas marcadoras distinguíveis.

Alternativamente, o par de iniciadores complementares pode ser proporcionado com uma etiqueta marcadora, permitindo a etiquetagem com marcador durante a amplificação. Estes reagentes auxiliares podem ser opcionalmente incorporados no estojo de teste ou proporcionados a partir de outras fontes comerciais ou não comerciais. Para permitir a simples avaliação comparativa de variações nas quantidades de polinucleótidos numa 42 ΡΕ1352097 amostra, é conveniente preparar estojos de teste proporcionados com etiquetas marcadoras diferentes e distinguíveis a diferentes comprimentos de onda de emissão e que possam ser registadas com instrumentos automáticos ou semi-automáticos.

Os estojos de teste para avaliação quantitativa comparativa das variações nas quantidades de vários polinucleótidos presentes na amostra celular ou de tecido em resposta a alterações intrínsecas ou estímulos externos, incluindo fármacos e estados patológicos, compreendem convenientemente pelo menos dois suportes sólidos ou placas de microtítulo. Cada suporte sólido ou placa de microtítulo é proporcionado com bancos idênticos de sondas polinucleotídicas, opcionalmente proporcionadas com as etiquetas marcadoras. Cada suporte sólido ou placa de microtítulo deve ser opcionalmente proporcionado com a sua própria etiqueta marcadora distinguível, que permite o registo simultâneo de amostras celulares ou de tecido obtidas em diferentes momentos, por exemplo antes ou após o tratamento com um fármaco. Um perfil de transcrição diferencial, i.e. a análise das diferenças em duas ou mais preparações de polinucleótidos objecto de análise, é facilmente registável através da hibridação das amostras do objecto de análise com sondas polinucleotídicas reagentes marcadas nas extremidades com diferentes etiquetas marcadoras distinguíveis e automaticamente registáveis. Após o passo de hibridação as diferentes amostras podem ser 43 ΡΕ1352097 opcionalmente misturadas e as suas diferenças directamente observadas através da medição da razão entre cada etiqueta marcadora e as outras em cada pico. 0 estojo de teste pode também ser proporcionado com pelo menos um par de iniciadores para amplificação das sondas etiquetadas com marcador obtidas no último passo, para aumentar a sensibilidade do teste. O método do presente invento é útil para avaliação quantitativa e comparativa de variações na quantidade ou qualidade de diferentes polinucleótidos caracterizados, parcialmente caracterizados ou não caracterizados em amostras alvo celulares ou de tecido devido a alterações intrínsecas ou em resposta a estímulos externos ou internos. O método e os estojos de teste podem ser utilizados para avaliação do efeito das modalidades de tratamento, situações epidemiológicas, condições higiénicas ou populações microbianas. O estojo de teste do presente invento na sua forma mais simples e barata é de outro modo a mesma que o estojos de teste descritos acima e compreende um ou mais bancos organizados com um número opcional pré-estabelecido de sondas de sequências polinucleotídicas solúveis proporcionadas com tamanhos distintos permitindo a sua identificação e o registo com espectrometria de massa. As sondas podem ser proporcionadas com etiquetas iniciadoras terminais para permitir a amplificação antes da medição 44 ΡΕ1352097 quantitativa com meios espectrográficos ou espectromé-tricos. Os referidos bancos de sondas não marcadas são colocados de um modo organizado nos seus próprios vasos, que ficam separados ou unidos uns aos outros. 0 estojo de teste incluindo os reagentes do presente invento são de preferência aplicáveis para realização de processos automáticos ou semi-automáticos, um exemplo dos quais é mostrado como um fluxograma na Figura 10. 0 processo pode ser interrompido e os reagentes transferidos para outros suportes sólidos se os dispositivos automáticos não forem bastante compatíveis. Os primeiros passos são vantajosamente realizados numa estação de pipetagem automática, em que o ARN da amostra bioti-nilado é pipetado para cada banco contendo as sondas com tamanhos distintos nos seus bancos. A partir daí, o estojo de teste pode ser seco utilizando um liofilizador. A secagem é feita para eliminar a influência de quaisquer diferenças nos volumes. A liofilização opcional permite que o trabalho seja parado até ser conveniente continuar o trabalho. 0 trabalho é retomado através da adição de um tampão de hibridação apropriado aos bancos numa estação de pipetagem automática. A placa é selada com meios apropriados, e.g. uma película ou uma folha metálica para evitar evaporação no passo subsequente. Quando o estojo de teste é proporcionado com um selador térmico apropriado é 45 ΡΕ1352097 posicionado num bloco térmico automático onde a temperatura pode ser sobre- ou sub-regulada conforme necessário para permitir a desnaturação e a hibridação das sondas. Após hibridação, a solução contendo os híbridos de sonda:objecto de análise é colocada num processador de partículas magnéticas para realizar os passos de captura de afinidade, lavagem e eluição através do movimento de contas magnéticas revestidas com estreptavidina/avidina passo a passo e.g. numa placa KingFisher de acordo com um protocolo programado. Os eluatos podem opcionalmente ser transferidos para uma nova placa se as estações automáticas utilizarem tipos diferentes de placas de microtítulo. Os poços podem ser enxaguados com tampão de eluição para transferência quantitativa e depois as soluções combinadas são evaporadas num liofilizador, que permite a conservação das amostras e fazendo o registo num momento mais conveniente. Por outras palavras, o processo pode ser facilmente adaptado a diferentes planificações e protocolos para realização da determinação. Os fragmentos das sondas, padrões de tamanho e padrões de concentração, são automaticamente injectados directamente ou após um passo conveniente, num analisador automático. As intensidades dos marcadores ligados aos fragmentos de sonda são determinadas como áreas. As áreas dos padrões de concentração, com quantidades conhecidas, são então utilizadas para determinar as quantidades absolutas de cada fragmento de sonda. 0 desenho experimental e os princípios gerais do 46 ΡΕ1352097 presente invento são descritos em mais pormenor utilizando plasmideos e inserções disponíveis no laboratório dos inventores. Os plasmideos são utilizados apenas para fins ilustrativos. 0 invento não está de modo algum limitado aos referidos plasmideos. Os princípios do invento podem ser verificados através da substituição da construção utilizada nos exemplos por quaisquer outros plasmideos ou inserções, que estejam disponíveis em abundância.

Os peritos na arte podem facilmente aplicar os princípios do invento em diferentes aplicações.

Exemplo 1

Avaliação quantitativa

Um plasmídeo, pASll, composto de uma parte vector e de uma parte inserção (ADNc), é utilizado para criar um banco de sondas. 0 referido plasmídeo foi criado a partir de um vector de clonagem pSP73 (Promega, P2221) e a partir de um vector de levedura pAS4, contendo ADNc da endoclucanase-5 (Saloheimo, A., et al., Mol. Microbiol. 13: 219-228, 1994), um gene novo e pequeno de endoglucanase, egl5, de Trichoderma reesei isolado através de expressão em levedura (Saloheimo et al., 1994). 0 ADNc de egl5 foi digerido de pAS4 através de digestão com EcoRI-parcial Xhol, as 47 ΡΕ1352097 extremidades foram tornadas cegas através de preenchimento utilizando Fragmento Klenow (1008404 Boehringer-Mannheim) e ligadas ao vector pSP73 digerido com Smal para criar pASll. O vector continha um promotor T7 permitindo a transcrição in vitro. O plasmideo foi também utilizado para preparação de ARN nos exemplos modelo. Os passos nestas experiências modelo diferem de algum modo dos passos principais descritos no método generalizado do presente invento. A experiência seguiu os passos expostos abaixo:

Passos preparativos:

Passo 1 - Preparação de sondas a partir de polinucleótidos de cadeia dupla O plasmideo pASll, em células DH5a, contendo um gene de resistência a ampicilina foi criado de um dia para o outro a 37°C em solução de LB contendo glicose a 1% e 0,1 mg/1 de ampicilina.

Passo 2 - Purificação e verificação dos polinucleótidos das sondas

Subsequentemente os plasmideos foram purificados e analisados de acordo com Plasmid Maxi Protocol de QIAGENR (QIAGENR Plasmid Purification Handbook, Nov. 1998). 48 ΡΕ1352097

Passo 3 - Linearização de plasmídeos 0 plasmídeo purificado foi linearizado através de digestão com EcoRI, isolado através de electroforese em gel de agarose e depois extraido e purificado utilizando QIAquick”1 Gel Extraction Kit Protocol (QIAquick™ Spin Handbook, Jan. 1999).

Passo 4 - Preparação de objectos de análise O ARN, correspondendo à inserção, foi preparado in vitro utilizando RiboMAX™ Large Scale RNA Production System - T7 (Promega, P1300) e a quantidade produzida foi medida através da sua absorção de UV.

Passos analíticos:

Passo 1 - Etiquetagem por afinidade das sequências objecto de análise 0 ARN foi etiquetado por afinidade com PH0T0PR0BEr Biotin SP-1000 de acordo com o protocolo do fabricante (VECTOR Laboratories)

Passo 2 - Fragmentação das sondas

Uma amostra do plasmideo foi clivada com a enzima de restrição MspI para dar 21 fragmentos, dos quais 10 correspondem à inserção e 11 ao vector. 49 ΡΕ1352097

Passo 3 - Marcação terminal da sonda com uma etiqueta marcadora

Os fragmentos de ADN foram etiquetados nas extremidades com Fluoresceina-12-ddCTP, NEL-400 (NENR Life Science Products, Inc.) utilizando Fragmento Klenow (1008404 Boehringer Mannheim). O sucesso do procedimento de marcação foi confirmado através da análise dos fragmentos de ADN num sequenciador de ADN de electroforese em gel ALF DNA Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech) com ALFwin Fragment Analyser 1.02 Software Package (Amersham Pharmacia Biotech) e utilizando um padrão externo de controlo de tamanho 50-500 e um padrão interno de controlo de tamanho 250 (n° de cat. 27-4525-01 e 27-4527-01, Amersham Pharmacia Biotech) (Fig. 8a e 8b).

Passo 4 - Solução de hibridação

Uma aliquota da amostra de ARN (0,44 pmol) foi misturada com uma aliquota (0,044 pmol de cada fragmento) da preparação de ADN marcado nas extremidades num tubo de microcentrifuga livre de ARNases. A concentração de SDS na mistura foi mantida a 0,1%. A mistura foi precipitada utilizando acetato de sódio 3 M (1/10 *V) e etanol a 94% (2,5 xV), sedimentada (20000 xg) , lavada com EtOH a 70% e dissolvida em 25 μΐ de solução de hibridação: NaCl 0,6 M, fosfato de sódio 20 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, SDS a 0,1% (p/v) e Ficoll a 0,02% (p/v), polivinilpirrolidona a 0,02% 50 ΡΕ1352097 (ρ/ν), albumina de soro bovino a 0,02% (p/v) (solução de

Denhardt 1χ). A mistura foi aquecida a 100°C durante 3 min.

Passo 5 - Om passo opcional relacionado com a hibridação A amostra foi incubada a 65°C durante 2 horas e depois movida para um novo tubo de microcentrífuga livre de ARNases. O tubo de incubação foi lavado uma vez com 25 yl de solução de hibridação e a solução de lavagem foi adicionada ao mesmo tubo.

Passo 6 - Passo de captura 0,5 μΐ de uma suspensão de FLUORICON™ Avidin-Polystyrene Assay Particles (IDEXX Laboratories, 31-040-1A) a 5% (p/v) foram adicionados e a incubação foi continuada durante 30 min a 22°C. A suspensão de partículas foi em solução de lavagem: tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 7,5), NaCl 0,15 M, Tween 20 a 0,1 % (v/v).

Passo 7 - Passo de separação

As micropartículas foram recolhidas através de centrifugação (12000 xg, 22°C) e lavadas quatro vezes com 200 μΐ de SSC Ο,ΐχ-SDS a 0,2% a 50°C (12000 xg, 40°C).

Passo 8 - Passo de eluição O ADN ligado foi eluído com 200 μΐ de NaOH 50 mM, 51 ΡΕ1352097 precipitado, sedimentado e lavado tal como descrito no passo 5 e dissolvido em água.

Passo 9 - Passo de recuperação 0 ADN eluido foi analisado num sequenciador de ADN de electroforese capilar ABI PRISMr 310, Genetic Analyser (Applied Biosystems) utilizando GeneScanR Analysis Software (Applied Biosystems) e um Gene Scan-500 Size Standard e uma quantidade conhecida de um padrão de tamanho único feito à medida ou num sequenciador de ADN de electroforese em gel ALF DNA Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech) com ALFwin Fragment Analyser 1.02 Software Package (Amersham Pharmacia Biotech) e utilizando um padrão externo de controlo de tamanho 50-500 e uma quantidade conhecida de padrão interno de controlo de tamanho 250 (n° de cat. 27-4525-01 e 27-4527-01, Amersham Pharmacia Biotech).

Passo 10 - Registo dos resultados O resultado foi lido a partir do electroferograma e a partir do ficheiro de dados tal como mostrado na Fig. 8c.

Tal como observado apenas se verificaram fragmentos correspondentes à inserção tal como comparado com a Fig. 8b, na qual todos os fragmentos são mostrados como comparação. A quantificação foi calculada utilizando a 52 ΡΕ1352097 área do pico do padrão interno, cuja concentração em cada pista da amostra era conhecida.

Exemplo 2

Uma avaliação comparativa e quantitativa O ARN de um fungo filamentoso Trichoderma reesei antes e após indução

Nesta experiência o ARN isolado do fungo filamentoso Trichoderma reesei foi analisado sob duas condições diferentes, antes e após a indução de enzimas hidroliticas extracelulares. A estirpe de Trichoderma reesei utilizada na experiência foi QM 9414 (depositada na colecção de VTT como VTT-D-74075) e é cultivada, induzida com α-sophorose e colhida tal como descrito em Ilmén, M., Onnela, M-L., Klemsdal, S., Keránen, S. e Penttila, M. "Functional analysis of the cellobiohydrolase I promoter of the filamentous fungus Trichoderma reesei”, Mol. Gen. Genet. 253: 303-314, 1996.

O ARN fúngico total foi preparado utilizando o método do Reagente TRIzol® (Life Technologies; Gibco BRL) . Mais ARN poli (A)+ foi isolado a partir do ARN total utilizando Oligotex mRNA Spin-Column Protocol (QIAGEN® Oligotex™ Handbook, Agosto 1998). Este ARN foi biotinilado tal como descrito no Exemplo 1, passo analítico 1 acima. Os fragmentos de ADN sonda foram os mesmos que no Exemplo 1. A 53 ΡΕ1352097 inserção no plasmídeo incluiu o gene para uma enzima hidrolitica endoglucanase, que se sabe ser induzida nas condições utilizadas. A experiência seguiu os passos analíticos 1-10 tal como descrito no Exemplo 1.

Os electroferogramas (Fig. 9a e 9b) mostraram que os fragmentos correspondentes à endoglucanase eram 3 vezes mais abundantes após indução de enzimas hidrolíticas extracelulares com sophorose.

Exemplo 3

Avaliação quantitativa de pequenas quantidades de objectos de análise

Os passos preparativos das sondas diferiram dos dos Exemplos 1 e 2 tal como descrito abaixo no desenho experimental para detectar quantidades muito baixas de ARN.

As sondas foram preparadas com uma reacção de PCR (ver Fig. 5) . Para cada fragmento de sonda foram seleccionadas duas sequências oligonucleotídicas únicas com 16-24 nucleótidos de comprimento que conduzirão especificamente à amplificação por PCR de um simples fragmento de ADN, correspondente a um dado gene. Os iniciadores de PCR continham, adicionalmente, na sua extremidade 5' outra sequência com 16 nucleótidos de 54 ΡΕ1352097 comprimento. Esta sequência era idêntica em metade dos iniciadores, i.e. para todos os iniciadores que dirigiam o alongamento numa direcção, enquanto a outra sequência era idêntica à outra metade dos iniciadores, i.e. para os que dirigiam o alongamento na outra direcção. Os dois 16 meros adicionais ficaram incorporados em todas as sondas durante a sua amplificação preparativa através de PCR. Neste caso, as sondas não foram marcadas com fluoróforo.

Após o procedimento preparativo, no qual foram criadas as moléculas de sonda, a experiência prosseguiu para a parte analítica.

Passo 1 - Preparação do objecto de análise etiquetado por afinidade O ARN objecto de análise foi isolado e etiquetado por afinidade com fotobiotina tal como descrito no passo analítico 1 no Exemplo 1.

Passo 2 - Hibridação em solução A amostra de ARN foi misturada com um banco de sondas de ADN amplificáveis tal como descrito no passo analítico 4 do Exemplo 1 acima.

Passo 3 - Hibridação em solução A mistura de amostra de ARN-sonda de ADN foi 55 ΡΕ1352097 incubada sob condições que permitem a hibridação tal como descrito no passo analítico 5 do Exemplo 1.

Passo 4 - Captura

Os híbridos de ARN e ADN:ARN biotinilados foram recolhidos em partículas revestidas com avidina tal como descrito no Exemplo 1 no passo 6 (Fig. 6).

Passo 5 - Eluição

As moléculas de ADN sonda foram eluídas, precipitadas e lavadas tal como descrito no Exemplo 1 no passo 7 acima.

Passo 6 - Amplificação

Foi adicionado um par de iniciadores, correspondente aos 16 nucleótidos terminais comuns das sondas. O iniciador 1 não foi marcado e foi adicionado a 4χ pmol/μΐ, o iniciador 2 foi marcado a 5' com o fluoróforo e foi adicionado a 50 pmol/μΐ. As condições de tampão foram ajustadas aos requisitos da ADN-polimerase utilizada (e.g., DeepVent® DNA Polymerase, #M0258L, New England Biolabs® Inc.). Foi utilizado um programa de PCR consistindo em 25 ciclos de, e.g., 94°C, 1 min; 52°C, 30 s; 72°C, 1 min para amplificar as sondas e introduzir o marcador fluorescente (Fig. 7). 56 ΡΕ1352097

Passo 7 - Separação do excesso de iniciador 0 excesso de iniciador foi removido através de filtração em vácuo, por exemplo, com Millipore Multiscreen 96-PCR Filter Plate, No. de Cat. MANU 030 10 com um colector MAVM 096 OR) ou através de cromatografia em gel numa coluna de centrifugação, por exemplo QIAquick PCR Purification Kit, 28106) ou através de precipitação com etanol ou propanol.

Passo 8 - Registo

As sondas amplificadas foram analisadas através de electroforese tal como descrito no Exemplo 1 no passo 9 acima.

Exemplo 4

Análise utilizando espectrometria de massa

Para a análise de espectrometria de massa as sondas utilizadas foram oligonucleótidos sintéticos, neste exemplo com 30 pares de bases de comprimento. Eles diferem uns dos outros na sua massa molecular devido a diferenças na sequência. Quatro das sondas foram desenhadas para detectarem unicamente um ARNm do ARN transcrito in vitro no exemplo 1, enquanto 4 foram utilizadas como controlos e não tinham sequências correspondentes nesta preparação de ARN. Os passos analíticos foram como se segue: 57 ΡΕ1352097

Passo 1

As sondas oligonucleotídicas foram combinadas com a preparação de ARN biotinilado do Exemplo 1 em 20 μΐ do tampão descrito no Exemplo 1.

Passo 2 A mistura foi incubada a 100°C durante 3 min e a 68°C durante 4 h.

Passo 3 A solução foi diluída até 40 μΐ com ajustamento da concentração de NaCl até 1 M e seguida de captura de afinidade em contas magnéticas revestidas com estrepta-vidina (Dynal Dynabeads M280 Streptavidin). As contas foram lavadas quatro vezes com citrato de Na 0,15 M, SDS a 0,1% a 68°C durante 15 min cada, seguido de duas lavagens das contas com ARNase - sem água.

Passo 5

As contas foram eluídas com 200 μΐ de NH4OH 1 M à temperatura ambiente.

Passo 6 O eluato foi liofilizado. 58 ΡΕ1352097

Passo 7 0 soluto liofilizado foi suspenso em 100 1 de água ultra-pura.

Passo 8

As 8 sondas oligonucleotídicas foram quantificadas num espectrómetro de Massa MALDI-TOF. Quando os oito oligonucleótidos com pesos moleculares de 9320,1, 9251,0, 9249,0 e 9257,1 (estes quatro correspondendo ao ARN) e de 8893,9, 9249,0, 9264,1 e 9296,1 (estes quatro actuando como controlos negativos) foram analisados sem selecção de afinidade tal como descrito acima, foram detectadas todas as oito massas (9249,0 apenas uma vez). Quando se utilizou o procedimento de selecção com o ARN biotinilado do Exemplo 1 apenas foram identificados os primeiros quatro oligonucleótidos.

Exemplo 5

Desempenho seml-automático do processo

As mesmas sondas e reagentes de ARNm que no Exemplo 1 e 3 acima foram utilizados num processo semiautomático, que é mostrado como um fluxograma na Figura 10. 59 ΡΕ1352097

Passo 1 - Montagem de análise e selagem das placas

Uma estação automática de pipetagem é utilizada primeiramente para combinar as sondas de ADN nos bancos e secundariamente para adicionar o ARN biotinilado da amostra a cada poço na placa. A montagem é então seca utilizando um liofilizador para eliminar a influência dos volumes. Utilizando uma estação automática de pipetagem a montagem é então ressuspensa num tampão de hibridação apropriado, compreendendo por exemplo citrato de Na 0,06 M, fosfato de Na 0,04 M, pH 7,0, NaCl 0,6 M, SDS a 0,5%, formamida a 20%, solução de Denhardt 1χ, sulfato de Dextrano a 2%) . Para evitar a evaporação no passo subsequente, a placa é a partir dai selada com uma película. Por exemplo, pode ser utilizada uma selagem a quente com um selador térmico ou um selo de folha metálica de PCR adesivo.

Passo 2 - Desnaturação e hibridação A placa é posicionada num bloco térmico automático, e.g., um termociclador, onde a temperatura é primeiro elevada até 100°C para desnaturar as cadeias duplas das sondas. Depois a temperatura é abaixada gradualmente até níveis apropriados, por exemplo 68°C, permitindo a hibridação do ADN da sonda com o ARN da amostra.

Passo 3 - Captura de afinidade, lavagens e eluição

Após a hibridação é utilizado um processador de 60 ΡΕ1352097 partículas magnéticas, tal como KingFisher, ThermoLabsystems, para efectuar os passos de captura de afinidade, lavagem e eluição através da movimentação das contas magnéticas revestidas com estreptavidina/avidina passo a passo numa placa KingFisher de acordo com um protocolo programado. Na placa KingFisher as soluções para cada passo são pipetadas com antecedência para locais especificados.

Após o processo de hibridação os conteúdos da placa são transferidos para locais especificados numa ou em mais placas KingFisher. Com o objectivo de enxaguar os poços a solução é ajustada de modo adequado à captura de afinidade através do ajustamento da concentração de NaCl para 1 M.

Passo 4 - Ajustamento do tampão e adição de padrões

Os eluatos são transferidos para uma nova placa (este passo é opcional e utilizado apenas se as estações automáticas utilizarem diferentes tipos de placas de microtítulo). Os poços são enxaguados com tampão de eluição para transferência quantitativa e depois as soluções combinadas são evaporadas num liofilizador. É utilizada uma estação automática de pipetagem para ressuspender os fragmentos de sonda secos numa solução de corrida apropriada para o analisador subsequente (e.g., água se o analisador for ABI 3100) e para adicionar quantidades conhecidas de padrões de tamanho e de padrões de concentração. 61 ΡΕ1352097

Passo 5 - Identificação do tamanho e quantificação dos fragmentos

Os fragmentos de sonda e os padrões de tamanho e concentração são automaticamente injectados num analisador, tal como ABI3100, Applied Biosystems ou BaseStation DNA Fragment Analyzer, MJ Research Inc. O suporte lógico do analisador é utilizado para especificar os tamanhos dos fragmentos. As intensidades dos marcadores fluorescentes ligados aos fragmentos de sonda são determinadas como áreas. As áreas dos padrões de concentração, com quantidades conhecidas, são então utilizadas para determinar as quantidades absolutas de cada fragmento de sonda.

Lisboa, 15 de Novembro de 2007

Claims (38)

1. ΡΕ1352097 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para determinação quantitativa das quantidades de mais de uma sequência polinucleotidica diferentes (objecto de análise) presentes numa amostra celular ou de tecido através da aplicação de hibridação em solução auxiliada por afinidade, caracterizado por o método compreender os passos consecutivos de: a) proporcionar um ou mais bancos organizados com um número opcional pré-estabelecido de diferentes sequências polinucleotídicas solúveis (sondas), em que o número opcional de sondas é de mais de uma, e as sondas têm tamanhos distintos que permitem a sua identificação ou registo, e opcionalmente uma ou mais etiquetas, que são etiquetas marcadoras que permitem o registo directo após o passo quantitativo (e) ou duas etiquetas iniciadoras terminais que permitem a amplificação após o passo quantitativo (e) e a etiquetagem opcional com um marcador durante ou após a amplificação, sendo os referidos bancos colocados de um modo organizado nos seus próprios vasos que estão separados ou unidos uns aos outros; b) proporcionar as sequências polinucleotídicas (objectos de análise) presentes numa amostra celular ou de tecido do organismo alvo com pelo menos uma etiqueta de afinidade; 2 ΡΕ1352097 c) permitir a ocorrência de uma reacção de hibridação entre as sondas solúveis do passo (a) e os objectos de análise do passo (b) conduzindo à formação de híbridos; d) recuperar os hibridos formados no passo (c) através da captura dos referidos hibridos numa ferramenta auxiliar de separação proporcionada com o par de afinidade da etiqueta de afinidade dos objectos de análise; e) libertar as sondas opcionalmente etiquetadas dos hibridos e da ferramenta auxiliar de separação; f) registar o tamanho e a quantidade das sondas opcionalmente etiquetadas com marcador não amplificadas ou amplificadas libertadas.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por quando os bancos não têm etiquetas marcadoras, o tamanho e a quantidade das sondas libertadas serem registados com espectrometria de massa.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por quando as sondas são etiquetadas com marcador, o tamanho e a quantidade de sonda etiquetada com marcador libertada serem registados através das suas propriedades electroquímicas ou magnéticas ou espectro-métricas de massa, de fluorescência, luminescência, absorção de infravermelhos, radioactividade ou uma reacção enzimática como tal ou após contacto com outros reagentes. 3 ΡΕ1352097
4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por quando as sondas são proporcionadas com duas etiquetas iniciadoras terminais, o tamanho e a quantidade das sondas libertadas e subsequentemente amplificadas, que são opcionalmente etiquetadas com marcador durante ou após a reacção de PCR, serem registadas através das suas propriedades electroquimicas, magnéticas ou espectrométricas de massa, de fluorescência, luminescência, absorção de infravermelhos, radioactividade ou uma reacção enzimática como tal ou após contacto com outros reagentes e através da utilização de espectrometria de massa, electroforese capilar ou electroforese em gel.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por as sondas serem fragmentos de ADN, oligonucleótidos sintéticos ou modificados.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por as etiquetas marcadoras serem marcadores registáveis através de meios ou instrumentos automáticos ou semi-automáticos.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a etiqueta marcadora ser seleccionada de entre um grupo registável através de fluorescência, luminescência, absorção de infravermelhos, propriedades electromagnéticas, radioactividade e actividade enzimática. 4 ΡΕ1352097
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a etiqueta marcadora registável através da sua fluorescência ser um fluorocomo ou fluoróforo.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por os objectos de análise na amostra celular ou de tecido compreenderem ARNm.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por os pares de afinidade incluindo uma etiqueta de afinidade e os seus parceiros serem biotina e avidina, biotina e estrepta-vidina, oligómeros de histidina e quelantes metálicos, haptenos e anticorpos, receptores e ligandos ou glicanos e lectinas.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a ferramenta auxiliar de separação ser seleccionada a partir de um grupo de suportes sólidos consistindo em microparticulas, microsferas, partículas de látex, partículas magnéticas, fios, estacas, paus, micropoços e colunas de afinidade.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o número opcional pré-estabelecido de sondas solúveis no banco ser dois ou três. 5 ΡΕ1352097
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o número opcional pré-estabelecido de sondas solúveis no banco ser mais de cinco.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por os bancos solúveis serem colocados em poços numa placa de microtítulo.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser efectuada uma avaliação comparativa e quantitativa de variações nas quantidades de objectos de análise proporcionando um conjunto de métodos compreendendo múltiplos, pelo menos um estojo de teste por cada amostra a comparar, compreendendo cada um dos referidos estojos de teste bancos orqanizados com sondas solúveis idênticas opcionalmente etiquetadas com marcador com tamanhos distintos.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por os métodos individuais no conjunto serem proporcionados com etiquetas marcadoras que são distinguíveis umas das outras.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por as etiquetas marcadoras serem marcadores fluorescentes emitindo a diferentes comprimentos de onda de emissão. 6 ΡΕ1352097
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por os objectos de análise proporcionados com uma etiqueta de afinidade serem capturados no suporte sólido antes de contactarem com os bancos de sonda.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método aplicar um estojo de teste que compreende um ou mais bancos organizados com um número opcional pré-estabelecido de diferentes sequências polinucleotidicas solúveis (sondas), em que o número opcional de sondas é de mais de um e em que as sondas têm cadeias complementares aos objectos de análise a determinar, tamanhos distintos que permitem a sua identificação e registo e etiquetas opcionais, em que as referidas etiquetas opcionais são etiquetas marcadoras ou etiquetas iniciadoras, estando os referidos bancos colocados de um modo organizado nos seus próprios vasos, que estão separados ou unidos uns aos outros.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o estojo de teste compreender um ou mais bancos organizados com um número opcional pré-estabelecido de sondas solúveis proporcionadas com tamanhos distintos permitindo a sua identificação e registo através de espectrometria de massa.
21. 21. Método de acordo com as reivindicações 19 a 20, caracterizado por as sondas serem proporcionadas com 7 ΡΕ1352097 pelo menos duas etiquetas iniciadoras terminais permitindo a sua amplificação por PCR.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o estojo de teste para além das sondas possuindo iniciadores terminais ser proporcionado com um conjunto separado de etiquetas marcadoras.
23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 20 ou 22, caracterizado por a etiqueta marcadora compreender marcadores registáveis através de meios ou instrumentos automáticos ou semi-automáticos.
24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 20, 22 ou 23, caracterizado por as sondas com tamanhos distintos serem proporcionadas com uma etiqueta marcadora seleccionada de entre um grupo de etiquetas marcadoras registáveis através de fluorescência, luminescência, absorção de infravermelhos, propriedades electromagnéticas, radioactividade e actividade enzimática.
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a etiqueta marcadora ser registável através da sua fluorescência como um fluorocromo ou fluoróforo.
26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 25, caracterizado por o estojo de teste compreender pelo menos uma etiqueta de afinidade e/ou uma ΡΕ1352097 ferramenta auxiliar de separação proporcionada com um parceiro da referida etiqueta de afinidade.
27. 27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por os pares de afinidade, incluindo uma etiqueta de afinidade e o seu parceiro serem biotina e avidina, biotina e estreptavidina, oligómeros de histidina e quelatos metálicos, haptenos e anticorpos ou glicanos e lectinas.
28. 28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a ferramenta auxiliar de separação ser seleccionada de entre um grupo de suportes sólidos consistindo em microparticulas, microsferas, partículas de látex, partículas magnéticas, fios, estacas, paus, micropoços e colunas de afinidade.
29. 29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 28, caracterizado por as sondas serem fragmentos de ADN, oligonucleótidos sintéticos ou modificados.
30. 30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 29, caracterizado por o número opcional pré-estabelecido de sondas solúveis nos bancos ser de dois ou três.
31. 31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 30, caracterizado por o número opcional 9 ΡΕ1352097 pré-estabelecido de sondas solúveis nos bancos ser de mais de cinco.
32. 32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 31, caracterizado por 0 banco organizado ser uma placa de microtítulo.
33. 33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 32, caracterizado por compreender um conjunto de estojos de teste múltiplos, pelo menos um para cada amostra, no qual se pretende avaliar comparativamente e quantitativamente a variação na quantidade de objectos de análise, compreendendo o referido estojo de teste bancos com sondas idênticas com tamanhos distintos, opcionalmente com etiquetas marcadoras, que são distinguíveis umas das outras.
34. 34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por as etiquetas marcadoras serem fluoróforos que emitem a diferentes comprimentos de onda de emissão.
35. 35. Utilização do método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 34 para avaliação de variações em quantidades de objectos de análise em amostras celulares ou de tecido devidas a mecanismos de controlo intrínsecos ou como resposta a estímulos externos.
36. 36. Utilização do método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 34 para avaliação do efeito de 10 ΡΕ1352097 modalidades de tratamento, situações epidemiológicas, condições higiénicas ou populações microbianas.
37. 37. Utilização do método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 para avaliação de variações em quantidades de objectos de análise em amostras celulares ou de tecido devidas a mecanismos de controlo intrínsecos ou como resposta a estímulos externos.
38. 38. Utilização do método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 para avaliação do efeito de modalidades de tratamento, situações epidemiológicas, condições higiénicas ou populações microbianas. Lisboa, 15 de Novembro de 2007