DE60221964T2

DE60221964T2 - Verfahren und testkit zur quantitativen bestimmung von variationen der polynukleotidmengen in zell- oder gewebeproben

Info

Publication number: DE60221964T2
Application number: DE60221964T
Authority: DE
Inventors: Hans SÖDERLUND; Kari Kataja; Marja Paloheimo; Marja Ilmen; Kristiina Takkinen
Original assignee: Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus
Current assignee: Plexpress Fi Oy
Priority date: 2001-01-10
Filing date: 2002-01-10
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2022-01-11
Also published as: CA2432201A1; AU2002226448B2; JP2004520035A; US20040053300A1; WO2002055734A1; DE60221964D1; US9416401B2; EP1352097A1; EP1352097B1; ATE371042T1; JP4672234B2; EP1854896A3; FI20010041A0; PT1352097E; SI1352097T1; ES2291457T3; DK1352097T3; CA2432201C; EP1854896A2; FI115139B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Mengen von Polynukleotiden oder Variationen ihrer Mengen in einer Zell- oder Gewebeprobe unter Verwendung organisierter Pools löslicher Polynukleotidsonden mit unterschiedlichen Größen. Das quantitative Verfahren erlaubt die vergleichende Messung von Variationen, z. B. bei Transkriptionsprofilen oder Expressionsmustern. Weiterhin wird ein Test-Kit offenbart, das Mittel und Reagenzien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst. Weiterhin wird die Verwendung des Verfahrens und des Test-Kits zu verschiedenen diagnostischen und biotechnischen Zwecken offenbart.
Als Reaktion auf die schnelle Zunahme der verfügbaren genetischen Information und ihrer Wirkung auf Molekularbiologie, Gesundheitswesen, Behandlungsweisen, pharmazeutische Forschung, epidemiologische Untersuchungen usw. konzentriert sich das wissenschaftliche Interesse heutzutage auf die zellulären Wirkungen der genetischen Schlüsselelemente, ebenso wie auf ihre biologische Rolle und Funktion. Während die Akkumulation neuer Informationen, die sich auf die grundlegenden Schlüsselelemente in der Genetik beziehen, sich verlangsamt, steigt der Wunsch, ihre Wirkungen und/oder biologischen Rollen zu studieren kontinuierlich.
Bioinformatik, die Handhabung von Informationen betreffend Lebensvorgänge und deren Akkumulation in Genomik, Proteomik, Transkriptomik usw. auf eine mathematische exakte Weise, hat ein Bedürfnis nach neuen, genauen Werkzeugen hervorgebracht, die eine schnelle und quantitative Messung der Wirkungen und der Bedeutung des akkumulierten Wissens erlauben. Die kombinatorische Chemie erlaubt die schnelle Synthese einer enormen Menge neuer und bereits existierender Verbindungen. Es ist wünschenswert, die Wirkungen und die mögliche Bedeutung dieser neuen oder bereits existierenden Verbindungen oder anderer externer Stimuli auf die Genexpression in lebenden Organismen, einschließlich von Menschen und Versuchstieren, schnell zu messen. Anders ausgedrückt hat die Information, die sich in Genomik, Proteomik, Transkriptomik usw., ebenso wie in der mit der Bioinformatik kombinierten kombinatorischen Chemie ansammelt, eine Nachfrage nach neuen Werkzeugen erzeugt, die schnelle, genaue und vorzugsweise quantitative Messungen der Wirkungen und der biologischen Rollen dieser Verbindungen erlauben. Tatsächlich ist rings um die Technologie, die die Erstellung von Transkriptionsprofilen erlaubt, ein erheblicher Markt erwachsen. Transkriptionsprofile werden nicht nur von Wissenschaftlern in vielen Gebieten der Grundlagenforschung in den Biowissenschaften, sondern auch in der industriellen Forschung und Entwicklung verwendet. Die Wirkungen bekannter und neuer Pharmaka auf die Genexpression von Menschen und Versuchstieren sind heutzutage ein essentielles Wis sen in der pharmazeutischen und diagnostischen Industrie, aber auch verschiedene andere Sektoren der biotechnischen Industrie werden Nutznießer sein.
Ein mächtiges Werkzeug bei der Erstellung von Transkriptionsprofilen ist die Oligomer-Chip-Technologie, z. B. in den folgenden Patenten offenbart: US 6,040,138 , US 5,556,752 ; US 5,770,722 ; US 5,807,522 oder in der Patentanmeldung WO 200003037 . Das Patent US 6,040,138 offenbart die gleichzeitige Überwachung multipler Genexpression durch Hybridisierung von Nukleinsäurezielen mit einem Array immobilisierter Oligonukleotidsonden. Die Patente US 5,556,752 und US 5,770,722 beschreiben Nukleinsäuresequenzierung und Analysenerfahren vermittels Nukleinsäuren-Bibliotheksarrays auf festen Trägern, ebenso wie durch Anwendung von Hybridisierung und Nuklease- oder Ligasereaktionen. In der Patentanmeldung WO 200003037 wird das Screening von Ziel-Polynukleotiden auf einem Array zur Bestimmung ihrer genetischen Funktion offenbart. US 5,807,522 offenbart Microarrays bestimmter Analytversuchsregionen, die analytspezifische Reagenzien enthalten, die für viele genetische Applikationen verwendbar sind, wobei Hybridisierungstechniken in großem Maßstab angewandt werden.
Das gemeinsame Merkmal der oben beschriebenen Microarray-Techniken ist, dass die Sonden, d. h. die als Reagenzien verwendeten Polynukleotidsequenzen, immobilisiert oder mit einem festen Träger gekoppelt werden. Die Immobilisierung der Sonden fungiert als sterisches Hindernis und verhindert, dass die Hybridisierung auf stöchiometrische Weise erfolgt, was zu geringer Ausbeute führt. Daher sind die oben erwähnten Verfahren lediglich halbquantitativ und erfordern doppelte Markierung und Vergleichskontrollen.
Infolge ungenügender Unterscheidungskraft, die z. B. durch verwaschene Probeauftragungen bewirkt wird, ist es oftmals unmöglich, die Auftragungen mit hinreichender Genauigkeit zu vergleichen. Obwohl dies kein Hindernis in der Anwendung der Microarray-Techniken ist, bleibt es ein Problem, wenn quantitative Ergebnisse benötigt werden, und dies erklärt, warum in den tatsächlichen Tests ein großes Maß an Redundanz erforderlich ist. In der Patentanmeldung WO 98/51789 wird die Herstellung von unterteilten cDNA-Bibliotheken aus mRNA durch reverse Transkription und Amplifikation beschrieben. Diese Bibliotheken werden verwendet, um nach neuen Genen, interagierenden Proteinen und/oder potentiellen Pharmaka zu screenen und/oder zur Diagnose. Dieses System beruht auf PCR-Technologie und einem Satz verschiedener Primer. Selbst wenn dieses System die Detektion herabregulierter Sequenzen erlaubt, die in geringen Mengen vorliegen, steigert es die Quantifizierungsprobleme. Demgemäß existieren mächtige Werkzeuge zur Untersuchung der biologischen Rolle genetischer Schlüsselelemente, aber das Problem, quantitative Ergebnisse zu erhalten, bleibt ungelöst. Weiterhin sind die zuvor genannten Techniken nicht auf die Beobachtung der Wirkungen uncharakterisierter Genome anwendbar.
Somit ist es die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und Test-Kits nicht nur zur Quantifizierung von Expressionsmustern oder transkriptionellen Profilen bereitzustellen, die eine vergleichende Messung von Variationen davon erlauben, sondern auch einen sehr empfindlichen Test bereitzustellen, der die quantitative Bestimmung sehr kleiner Mengen von Analytenpolynukleotiden erlaubt, die ansonsten unterhalb der Detektionsgrenze lägen. Die Aufgabe ist es, ein wirklich quantitatives Verfahren und ein Test-Kit bereitzustellen, die als Antwort die Menge der Polynukleotidkopien in der Probe ergeben, d. h., die es erlauben, die Menge der mRNA-Kopien zu bestimmen, die in der Probe vorliegen, und die weiterhin modifiziert werden können, um ihre Sensitivität erheblich zu steigern.
Ein Vorteil des Verfahrens und des Test-Kits der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie die Messung von Transkriptionsprofilen und Expressionsmustern nicht nur für charakterisierte, sondern auch für uncharakterisierte Genome erlauben.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass die Qualität des Analyten, d. h. der Polynukleotidpräparation, die analysiert werden soll, nicht kritisch ist. RNA, von der allgemein bekannt ist, dass sie aufgrund ihrer Instabilität eine spezielle Behandlung erfordert, kann direkt für die quantitative Messung verwendet werden.
Die Herstellung von Test-Kits, die die Immobilisierungsschritte und bestimmte kommerziell verfügbare Reagenzien nicht zu enthalten brauchen, erlaubt die leichte Anpassung von maßgeschneiderten Tests, was die Aufmerksamkeit auf bestimmte Untergruppen von Genen in einem bestimmten Organismus lenkt.
Das Verfahren ist sehr flexibel anpassbar. Es kann in vollautomatisierten oder halbautomatisierten Einrichtungen verwendet werden. Das Verfahren kann an verschiedenen Punkten unterbrochen werden. Die Proben und Reaktionsprodukte können aufbewahrt werden, bis genügend Daten gewonnen sind, oder bis es zweckmäßiger ist, das Verfahren fortzusetzen, z. B. die Ergebnisse aufzuzeichnen.
Zusammengefasst erlaubt die vorliegende Erfindung die Quantifikation von Veränderungen und Variationen der Polynukleotidmengen in nukleotidhaltigen Proben, die zu verschiedenen Zeitpunkten, an verschiedenen Orten oder von verschiedenen Zielorganismen gewonnen werden. Dies ist insbesondere nützlich, wenn man Lebensvorgänge und den Einfluss physi kalischer und chemischer Stimuli, die man auf die gleichen Zellen oder Gewebe einwirken lässt, untersucht. Die Erfindung erlaubt die gleichzeitige vergleichende Messung verschiedener biologischer Phänomene.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht nur quantitativ, sondern kann auch hochempfindlich gemacht werden und erlaubt die quantitative Detektion herabregulierter Polynukleotidsequenzen. Die Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens sind wie in den Ansprüchen definiert.
1 ist eine schematische Illustration des Verfahrens zur Herstellung von tracermarkierten Sonden (P).
2A illustriert den Hybridisierungsprozess zwischen den mit dem Tracer (Stern) markierten Sonden (P) und affinitäts- oder mit Biotin (B) markierten einzelsträngigen RNA-Analytensequenzen und die Bildung von Hybriden (H) zwischen den Analyten (A) und den Sonden (P).
2B illustriert den Hybridisierungsprozess zwischen den mit dem Tracer (Stern) markierten Sonden (P) und affinitäts- oder mit Biotin (B) markierten doppelsträngigen Polynukleotid- oder RNA-Analytensequenzen und die Bildung von Hybriden (H) zwischen den Analyten (A) und den Sonden (P). Sonden, die nicht zu Analytensequenzen passen oder in molarem Überschuss vorliegen, verbleiben frei in der Lösung.
3A stellt das Einfangen der affinitäts-(B)-markierten Hybriden (H) auf ein festes die Abtrennung unterstützendes Instrument (separation aiding tool, SAT) dar, das mit dem Gegenstück des Affinitätsmarkers beschichtet ist (B).
3B stellt das Einfangen der affinitäts-(B)-markierten Hybriden (H) auf ein festes die Abtrennung unterstützendes Instrument (separation aiding tool, SAT) dar, das mit dem Gegenstück des Affinitätsmarkers beschichtet ist (B). Mit dem Tracer markierte Sondensequenzen, die nicht mit einer affinitätsmarkierten Analytensequenz hybridisiert haben, werden nicht eingefangen. Natürlich binden die die Separation unterstützenden Instrumente (SAT) freie Affinitätsmarkierungen ebenso wie solche affinitätsmarkierten Analyten, an die keine Sondensequenz hybridisiert hat.
4 stellt die Freisetzung unter Verwendung der Flution der mit dem Tracer markierten Sonden (P) von dem festen die Separation unterstützenden Instrument (SAT), wobei die affinitätsmarkierte Analytensequenz (A) mit dem die Trennung unterstützenden Instrument (SAT) und der tracermarkierten Sonde (P) in der Lösung verbleibt.
5 stellt die PCR-Synthese von Sonden durch Primer mit zusätzlichen 16-merigen identischen Sequenzen oder terminalen Primermarkierungen (TPTs) dar.
6 stellt das Einfangen terminal primermarkierter Sonden (TPT-P) dar: affinitäts-(B)-markierter Analyt (A) auf einem die Abtrennung unterstützenden Werkzeug (SAT). Die terminalen Primer an jedem Ende der mit terminalen Primern markierten Sonden (TPT-P) sind ebenfalls mit (Ps) markiert.
7 stellt die PCR-Amplifikation eluierter mit terminalem Primer markierter Sonden (TPT-Ps) mit tracer-(Stern)-markierten Primern dar.
8 zeigt die Ergebnisse, die aus einem Elektropherogramm sowie aus einer Datendatei, die erhalten wird, wenn man das quantitative Verfahren der Erfindung gemäß Beispiel 1 durchführt, aufgezeichnet werden können.
8A zeigt das mit einem externen Standard aufgezeichnete Ergebnis.
8B zeigt das von allen mit pAS11MspI erhaltenen Peaks aufgezeichnete Ergebnis.
8C zeigt die aus der egl5-mRNA-Selektion aufgezeichneten Ergebnisse.
9 zeigt die Ergebnisse, die aus einem Elektropherogramm sowie aus einer Datendatei, die erhalten wird, wenn man das quantitative Verfahren der Erfindung gemäß Beispiel 2 durchführt, aufgezeichnet werden können.
9A zeigt die unter Verwendung von Induktionsbedingungen erhaltenen Ergebnisse.
9B zeigt die unter Nicht-Induktionsbedingungen erhaltenen Ergebnisse.
10 zeigt eine halbautomatisierte Durchführung des Verfahrens als Flussdiagramm.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe haben die Bedeutung, die sie üblicherweise auf den Gebieten der rekombinanten DNA-Technologie und der Nukleinsäurehybridisierungstechnologie haben. Einige Begriffe werden in der vorliegenden Erfindung jedoch in einem breiteren oder in einem etwas verschiedenen Sinn verwendet. Daher werden einige der Begriffe nachfolgend detaillierter beschrieben.
Der Begriff „Pool" bezeichnet eine Untergruppe oder eine Bibliothek löslicher oder solubilisierbarer Polynukleotidsonden. Jeder Pool umfasst eine optionale zuvor festgelegte Anzahl von Polynukleotidsonden. Eine zweckmäßige optionale Anzahl beträgt z. B. ungefähr 10 Sonden. Jedoch kann das Verfahren mit lediglich zwei oder drei Sonden verwendet werden, aber eine zweckmäßige Anzahl von Sonden ist fünf oder mehr Sonden in jedem Pool. Test-Kits mit Pools, die Hunderte von löslichen Sonden umfassen, können hergestellt und in den quantitativen oder vergleichenden erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Selbst wenn es möglich ist, Pools herzustellen, die Tausende von Sonden enthalten, scheint eine bevorzugte Obergrenze bei ungefähr 300–500 verschiedenen Sonden zu liegen, um eine zufriedenstellende Auflösung zu erhalten.
Wie oben erwähnt, sind die „löslichen oder solubilisierbaren Sonden" dadurch charakterisiert, dass sie verschiedene Größen haben, was ihre genaue Identifikation erlaubt, wenn man die Ergebnisse durch optional automatische oder semiautomatische Mittel oder Instrumente einschließlich von Massenspektrometrie aufzeichnet. Die Größe der löslichen Sonden kann von ungefähr 16 Basenpaaren bis zu mehreren Tausend Nukleotiden variieren.
Die „löslichen Sonden" für die Pools können aus einer charakterisierten, einer teilweise charakterisierten oder einer vollständig uncharakterisierten Bibliothek von Polynukleotidsequenzen hergestellt werden, z. B. aus DNA-Fragmenten aus dem Genom des Zielorganismus, dessen Transkriptionsprofil bestimmt werden soll. Im Fall gut charakterisierter Genome sind die Sonden vorzugsweise auf solche Weise in Pools angeordnet, dass alle Sondenmoleküle eine typische oder charakteristische Größe haben, die ihre Identifikation anhand ihrer Größe oder Masse, z. B. unter Verwendung von Kapillar- oder Gelelektrophorese oder Massenspektrometrie ermöglicht. Pools schlecht charakterisierter Genome werden auf die gleiche Weise entworfen, dass sie eine Anzahl von Nukleinsäurefragmenten mit unterschiedlichen Größen enthalten. Jedoch können einige der durch Spaltung mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhaltenen Nukleotidsequenzen zufällig die gleiche Größe haben, da die Nukleotidfragmente nicht charakterisiert sind. Dies bedeutet, dass die Sonden nur teilweise anhand ihrer Größe identifizierbar sind. Bei der Wiederholung der Tests wird die Redundanz schnell entdeckt, und solche Sonden, die nicht mit 100% Genauigkeit identifiziert werden können, können entfernt oder durch andere, zweckmäßigere Sonden ersetzt werden. Selbst bei einem vollständig uncharakterisierten Genom kann eine große Menge an Informationen innerhalb von kurzer Zeit angesammelt werden, und zumindest diejenigen Teile des Genoms, die zur Herstellung der löslichen organisierten Pools verwendet werden, werden schnell charakterisiert.
Der „lösliche organisierte Pool", der „lösliche oder solubilisierbare Polynukleotidsonden" enthält, kann in jeder beliebigen Art von Gefäßen enthalten sein, die vollständig voneinander getrennt oder miteinander auf eine nicht fixierte oder starr fixierte Weise verbunden sein können. In der einfachsten Form umfasst ein organisierter Pool ein oder mehrere Gefäße, z. B. Reagenzgläser oder Flaschen, die miteinander auf eine nicht fixierte Weise verbunden sein können, z. B. in einem Ständer für Reagenzgläser. Ein praktisches Beispiel organisierter Pools, die in Gefäßen untergebracht sind, die auf eine starr fixierte Weise miteinander ver bunden sind, wird von den Abteilungen oder Näpfen in oder auf einer Mikrotiterplatte bereitgestellt. Wie oben gesagt, sind die löslichen Pools vorzugsweise auf organisierte Weise untergebracht, z. B. in den Näpfen auf der Mikrotiterplatte. Die löslichen Pools sind auf eine solche Weise organisiert, dass jeder Pool und jede Polynukleotidsonde in diesem Pool eindeutig identifizierbar ist. Mikrotiterplatten mit ihren Näpfen sind typische, kommerziell verfügbare Ausführungsformen, die die Organisation und die gleichzeitige Handhabung zahlreicher organisierter Pools erlauben. Natürlich können andere maßgeschneiderte und zweckmäßigere organisierte Pools mit mehrfachen Abteilungen entwickelt und hergestellt und mit geeigneten Kennzeichen und Verwendungsanweisungen ausgestattet werden.
Der Begriff „Sonden" oder „Pool von Sonden" bezeichnet einen Satz löslicher Polynukleotidsequenzen, d. h. DNA-Fragmente, die vorzugsweise aus genomischen DNA-Sequenzen des Zielorganismus erhältlich sind, welche Sequenzen charakterisiert, teilweise charakterisiert oder uncharakterisiert sein können. Die Sonden können z. B. von teilweise charakterisierter oder uncharakterisierter mRNA abkopierte cDNAs sein. Die Sonden können zweckmäßigerweise ihre charakteristische Größe durch Spaltung mit Restriktionsenzymen oder durch Amplifikation unter Verwendung der PCR-Reaktion mit geeigneten Primern erhalten. Die Sonden können auch anhand von natürlichen DNAs als Vorlage synthetisierte Oligomere sein.
Alternativ können DNA-Sonden mit Zufallssequenzen mit voneinander unterscheidbaren Größen hergestellt und zur Untersuchung spezifischer Expressionsmuster verwendet werden. Natürlich ist es, wenn ein Satz Oligonukleotidsonden synthetisch hergestellt wird, ebenfalls bequem, modifizierte Polynukleotidsonden herzustellen, in welchem Fall das Zuckerphosphatrückgrat der Nukleotidsequenzen durch Peptidbindungen ersetzt oder aus so genannten verschlossenen Nukleosidanaloga hergestellt sein kann. Modifizierte Polynukleotide sind z. B. Peptidnukleinsäuren (PNAs), z. B. in WO 96/20212 beschrieben, oder verschlossene Nukleinsäuren (LNA), z. B. in WO 99/14226 beschrieben. Diese modifizierten Polynukleotidsonden können zweckmäßigerweise in dem erfindungsgemäßen Verfahren und den Test-Kits verwendet werden. Sie können unter Verwendung von genomischer DNA oder cDNA als Vorbilder kopiert werden. Oftmals haben sie verbesserte Eigenschaften, einschließlich von verbesserter Stabilität; sie können auch den Vorteil haben, leichter mit Tracermarkierungen bereitzustellen zu sein als natürliche DNA-Sonden.
Die Erfordernisse der vorliegenden Erfindung sind es, dass die Sonden in den löslichen Pools verschiedene Größen haben, was unterscheidbare Molekulargewichte bedeutet. Die Sonden können gewünschtenfalls mit einer „Markierung" bereitgestellt werden, was eine Markierung oder Kennzeichnung bedeutet, die die Detektion oder Aufzeichnung der Sonde oder alternativ die Amplifikation der Sonde erlaubt. In der grundlegenden Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Markierung ein Tracer, d. h. eine detektierbare oder aufzeichnungsfähige Kennzeichnung wie z. B. ein Fluorophor. Es sollte festgehalten werden, dass die Tracermarkierung vorzugsweise an einem Ende der Sonde untergebracht ist, d. h. die Sonde endmarkiert ist, um zu verhindern, dass der Tracer die Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und dem Analyten stört.
In einer weiterentwickelten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die nicht nur eine quantitative Messung erlaubt, sondern auch einen erheblich empfindlicheren Test bereitstellt, umfasst die „Markierung" „ein Paar terminaler Primersequenzen" und gewünschtenfalls einen Tracer. Diese an den 3'- und 5'-terminalen Enden der Sonde untergebrachten Primermarkierungen erlauben die Amplifikation der Sonden nach einer quantitativen Rückgewinnung der mit den affinitätsmarkierten Analyten hybridisierenden Sonden. In dieser Ausführungsform können die Sonden mit einer optionalen Tracermarkierung während oder nach der Amplifikation versehen werden. Wenn zur Aufzeichnung Massenspektrometrie verwendet wird, sind keine Tracer erforderlich.
Der Begriff „Tracermarkierungen" bedeutet Markierungen oder Kennzeichnungen, die sichtbar oder auf andere Weise detektierbar sind, d. h. die als solche aufzeichnungsfähig sind, oder die durch Inkontaktbringen mit anderen Reagenzien detektierbar oder aufzeichnungsfähig gemacht werden können. Anhand ihrer elektrochemischen oder magnetischen, einschließlich von massenspektrometrischen, Eigenschaften, ihrer Fluoreszenz, ihrer Lumineszenz, ihrer Infrarotabsorption, ihrer Radioaktivität oder ihrer enzymatischen Reaktionen aufzeichnungsfähige Tracermarkierungen sind besonders geeignet, aber es können beliebige Tracermarkierungen verwendet werden, die durch automatische Mittel oder Instrumente leicht aufzuzeichnen sind. Es sollte festgehalten werden, dass keine Tracermarkierung benötigt wird, wenn Massenspektrometrie zur Aufzeichnung verwendet wird, da die Sonden anhand ihrer unterschiedlichen Größen unterscheidbar sind.
Bevorzugte Tracermarkierungen sind Fluorochrome oder Fluorophore, insbesondere solche, die verschiedene Emissionswellenlängen haben. Eine solche Fluoreszenzmarkierung kann z. B. ein thiolreaktiver Fluoreszenzfarbstoff sein, wie z. B. 5-(2-((Jodacetyl)amino)ethylq)aminonaphthylen1-sulfonsäure) (1,5-IEDANS), Fluorescein, Bodipy, FTC, Texas Red, Phycoerythrin, Rhodamine, Carboxytetramethylrhodamin, DAPI, Indopyrasfarben, Cascade Blue, Oregon Green, Eosine, Erythrosine, Pyridyloxazole, Benzoxadiazole, Aminonaphtaline, Pyrene, Maleimide, Cumarine, MBD, Lucifer Yellow, Propidiumjodid, Porphyrine, CY3, CY5, CY9, Lanthanide, Kryptate, Lanthanidenchelate oder Derivate oder Analoga dieser Tracermoleküle. Fluoreszierende Polynukleotidsonden sind in Kombination mit kontinuierlichen Durchflusssystemen und Instrumenten bei automatischen oder halbautomatischen Aufzeichnungen der Ergebnisse besonders nützlich.
Der Begriff „Analyten" bezeichnet die Polynukleotidsequenzen, insbesondere die Messenger-RNA (mRNA), die zu einem bestimmten Moment in der Zell- oder Gewebeprobe des Forschungsobjektes oder des Studienpatienten vorliegen. Die Probenpräparation, die die Analytenpolynukleotidsequenzen enthält, wird so modifiziert, dass sie eine geeignete Affinitätsmarkierung enthält.
Der Begriff „Affinitätsmarkierung" bedeutet, dass die Analytenpolynukleotide mit einer Markierung oder Kennzeichnung versehen werden, die eine hohe Affinität zu einer anderen Substanz hat. Anders ausgedrückt, neigt die Affinitätsmarkierung dazu, mit ihrem Gegenstück oder Affinitätspartner starke Bindungen auszubilden. Die zwischen den Affinitätspartnern gebildeten starken Bindungen ermöglichen es dem Affinitätspaar, als Mittel zum Einfangen geeigneter Substanzen zu dienen. Ein geeignetes Affinitätspaar ist z. B. Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin, aber es können auch andere synthetische oder nicht synthetische „Affinitätspaare" oder Bindungssubstanzen verwendet werden. Geeignete „Affinitätspaare" können unter Rezeptoren und Liganden, Antigenen und Antikörpern und auch unter Fragmenten davon gefunden werden. Die bevorzugten erfindungsgemäßen „Affinitätsmarkierungen" umfassen kleinere Moleküle wie z. B. Biotin, Histidinoligomere, Haptene, Glykane usw., während die bevorzugten Gegenstücke der „Affinitätsmarkierungen" größere Moleküle wie z. B. Avidin, Streptavidin, Metallchelate, Antikörper, Lektine usw. umfassen.
Die Analytenpolynukleotide werden vorzugsweise durch eine chemische Reaktion affinitätsmarkiert, in der z. B. Biotinreste kovalent mit den zu untersuchenden Polynukleotiden oder Nukleinsäuremolekülen verknüpft werden, was zu einem modifizierten Polynukleotidanalyten führt, d. h. einem biotinylierten Polynukleotidanalyten. Um zu vermeiden, dass sterische Behinderungen die Hybridisierungsreaktionen zwischen der tracermarkierten Sonde und dem Polynukleotidanalyten stören, werden die Polynukleotidanalyten mit dem kleineren Mitglied des Affinitätspaares markiert, während der größere Partner an einen festen Träger oder an ein die Abtrennung unterstützendes Instrument gebunden wird. Für Untersuchungen, die sich auf die Transkriptionsprofilierung beziehen, ist die affinitätsmarkierte Analytenpolynukleotidsequenz typischerweise eine mRNA-Präparation. Die Affinitätsmarkierung und ihr Gegenstück oder Partner stellen ein so genanntes Affinitätspaar bereit, das das Einfangen affinitätsmarkierter Substanzen an einen festen Träger erlaubt, der in diesem Fall als ein die Abtrennung unterstützendes Instrument bezeichnet wird.
Der Ausdruck „die Abtrennung unterstützendes Instrument" bezeichnet vorzugsweise feste Träger, wie z. B. Microbeads, Latexpartikel, magnetische Partikel, Fäden, Pflöcke, Stäbchen, Mikronäpfe, Affinitätssäulen, die mit dem Gegenstück oder Affinitätspartner der „Affinitätsmarkierung" bereitgestellt oder beschichtet sind. Gewünschtenfalls kann das die Abtrennung unterstützende Instrument z. B. Mittel zur Phasentrennung oder elektrophoretischen Trennung umfassen, was von der Präsenz des Gegenstücks der Affinitätsmarkierung abhängt.
Der Begriff „Zielorganismus" bezeichnet beliebige einzellige oder mehrzellige Organismen mit charakterisierten, teilweise charakterisierten oder uncharakterisierten Genomen, deren Transkriptionsprofile oder Expressionsmuster bestimmt werden sollen. Zu den einzelligen Organismen gehören Mikroorganismen wie z. B. Bakterien, z. B. Escherichia coli, Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae oder filamentöse Pilze. Die Zielorganismen können natürlich Zell- oder Gewebeproben von beliebigen Pflanzen oder Tieren einschließlich von Menschen sein. Die Genome von E. coli, S. cerevisiae und Menschen sind Beispiele von gegenwärtig mehr oder weniger vollständig charakterisierten Genomen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Mengen verschiedener Polynukleotide, die in einer Zell- oder Gewebeprobe vorliegen sowie von Variationen der Mengen infolge inhärenter Gründe oder externer Stimuli. In der grundlegenden Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt man eine Hybridisierungsreaktion in einer Lösung stattfinden, und der gebildete Hybride wird auf einem festen Träger eingefangen, der mit dem Gegenstück oder Affinitätspartner der Affinitätsmarkierung versehen oder beschichtet ist. Die Beschichtung wird durch chemische Mittel, z. B. durch Konjugation erreicht. Manchmal genügt die Affinität zwischen der Oberfläche bzw. den Oberflächen des festen, die Abtrennung unterstützenden Instrumentes und dem Gegenstück der Affinitätsmarkierung, um eine stabile Bindung zu bilden. Tracermarkierte, vorzugsweise an den Enden markierte Polynukleotidsonden aus einem zuvor charakterisierten, teilweise charakterisierten oder uncharakterisierten Pool (Bibliothek) werden mit den affinitätsmarkierten Polynukleotidsequenzen in Kontakt gebracht, die aus der zu analysierenden Probe gewonnen wurden, d. h. mit dem Analyten.
Ein oder mehrere lösliche Pools werden bereitgestellt mit einer zuvor festgelegten, aber optionalen Anzahl löslicher Polynukleotidsequenzen, die vorzugsweise im Bereich von 10–500, bevorzugter von 50–400 und ganz besonders bevorzugt von 100–300 variiert, wobei unter schiedliche Größen ihre genaue Identifikation, z. B. durch Massenspektrometrie, erlauben. Die löslichen Sonden, die ohne jede Tracermarkierung identifiziert werden können, können alternativ mit Markierungen bereitgestellt werden, die in den grundlegenden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung detektierbare oder aufzeichnungsfähige Tracer sind und in einer weiterentwickelten Ausführungsform, die eine empfindlichere Messung erlaubt, ein Paar terminaler Primermarkierungen sind, die eine Amplifikationsreaktion erlauben, während derer die Sonden mit einer Tracermarkierung versehen werden können, z. B. unter Verwendung tracermarkierte Primer oder markierte Nukleotide. Die löslichen Pools sind auf organisierte Weise in ihren eigenen Gesäßen untergebracht, die voneinander getrennt, lose miteinander verbunden oder voneinander trennbar sein können. Die organisierten Pools können auch in oder an einer kompakteren Struktur angebracht sein, worin die Gefäße mehr oder weniger starr miteinander verbunden sind, wie z. B. die Näpfe auf einer Mikrotiterplatte.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren sind die Pools löslicher Polynukleotidsequenzen aus charakterisierten, teilweise charakterisierten oder uncharakterisierten Genomen erhältlich. Grundsätzlich genügt für jedes Gen in einem charakterisierten Genom eine einzelne entsprechende Sonde für eine quantitative Bestimmung seiner Expression. Ein Pool wird grundsätzlich durch Restriktionsenzymfragmentierung eines genomischen Inserts hergestellt. Das Insert wird zur einfachen Vermehrung in einem Plasmid untergebracht. Die Sonden werden durch Fraktionierung ausgewählter Polynukleotidsequenzen mit Restriktionsenzymen hergestellt. Somit ist es eine zweckmäßige Art der Herstellung der Sonden, die Polynukleotidsequenz in ein Plasmid einzufügen, dieses Plasmid zu vervielfältigen und danach das Plasmid mitsamt seinem Insert zu schneiden. Alternativ können Sonden aus genomischen DNA- oder cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von PCR-Reaktionen oder -Amplifikation hergestellt werden. Da es das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, gleichzeitig die Expression von mehr als einem Gen zu messen, umfasst jeder Pool üblicherweise mehr als eine Sonde, vorzugsweise mindestens zehn Sonden, besonders bevorzugt ungefähr hundert oder mehr Sonden.
Wenn die Analytenpolynukleotide z. B. Expressionsprodukte eines uncharakterisierten Genoms sind, sollte mindestens eine Sonde für jedes zu quantifizierende Gen in dem uncharakterisierten Genom verwendet werden. Das bedeutet, dass organisierte Pools aus teilweise charakterisierten und uncharakterisierten Genomen aus mehr als einem Plasmid, vorzugsweise aus zwei Plasmiden, hergestellt werden sollten. Die genomischen Inserts der Plasmide sollten vorzugsweise verschieden sein, aber sie können von dem gleichen Insert ausgehend hergestellt werden, in welchem Fall sie einige teilweise überlappende Sequenzen haben können. Wenn die Sonden ausgehend von Plasmiden hergestellt werden, die die glei chen Sequenzen enthalten, können verschiedene Restriktionsenzyme verwendet werden, um die erfindungsgemäß erforderlichen Sonden mit verschiedenen Größen zu erhalten.
Wenn uncharakterisierte Genome der Untersuchungsgegenstand sind und keine kommerziellen Test-Kits verfügbar sind, wird empfohlen, dass ein großer Satz identischer organisierter Pools auf einmal hergestellt wird, um die Notwendigkeit zu vermeiden, den langwierigen präparativen Schritt zu wiederholen und eine Konzentration auf den analytischen Schritt zu ermöglichen. Dies ist auch die Basis für die Bereitstellung kommerzieller Test-Kits zur Untersuchung teilweise charakterisierter oder uncharakterisierter Genome.
In der grundlegenden Ausführungsform der vorliegenden Erfindung lässt man tracer- oder primermarkierte DNA-Sonden mit der RNA-Präparation, die analysiert werden soll, hybridisieren. Die Analytenpolynukleotidsequenzen oder RNA-Analyten, die in der zu untersuchenden Zell- oder Gewebeprobe vorliegen, werden durch an sich bekannte Verfahren isoliert. Grundsätzlich sind die anhand der Zell- oder Gewebeprobe zu bestimmenden Analytenpolynukleotide Messenger-RNAs (mRNA). Diese Analyten werden mindestens mit einer Affinitätsmarkierung versehen, wie z. B. Biotin, Histidinoligomeren, Haptenen oder Glykanen. Das Analytenpolynukleotid, z. B. RNA, ist vorzugsweise mit Biotin markiert.
Nach diesen Schritten der Herstellung der Reagenzien lässt man die Hybridisierungsreaktion zwischen den Sonden und den Analyten stattfinden. Hierbei bilden sich Hybriden auf eine molekular genaue quantitative Weise zwischen den löslichen Sonden und den affinitätsmarkierten Analyten. Da die Mengen der verschieden Sonden, die in den Pools vorliegen, bekannt sind, und weil es im Verhältnis zu den Analyten einen Überschuss an jeder Sonde gibt, ist es offenkundig, dass die Hybridisierungsreaktion zwischen den Analyten und den Sonden, die zu einem Hybriden führt, stöchiometrisch ist, und dass die zurückgewonnene Sondenmenge genau der Menge der in der Probe vorliegenden Analytenpolynukleotide entspricht. Natürlich braucht die Analytensequenz keine exprimierte mRNA-Sequenz zu sein. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, jede beliebige einzelsträngige und auch, nach einem Denaturierungsschritt, der den doppelsträngigen Analyten einsträngig macht, jede doppelsträngige Sequenz zu quantifizieren.
Wie oben beschrieben, bilden sich durch die Hybridisierung in der Lösung DNA:RNA-Hybriden. Danach werden die Hybriden mittels der RNA-Moleküle, die die Affinitätsmarkierung, vorzugsweise Biotin, tragen, anhand ihrer Affinität zu ihrem Affinitätspartner, Avidin oder Streptavidin, gewonnen. Die einzigen Sonden oder DNAs, die durch das die Abtrennung unterstützende Instrument gewonnen werden, müssen in einem solchen Hybriden vor liegen. Die gewonnenen Hybriden können durch Waschen von überschüssigen Sonden, einschließlich von solchen Sonden, die nicht imstande waren, mit einer affinitätsmarkierten Analytensequenz zu hybridisieren, gereinigt werden. In solchen Fällen liegt die Analytensequenz entweder deswegen, weil das Gen fehlt, oder weil es nicht exprimiert wurde, nicht in der Probe vor. Die gewonnenen Proben, die von der RNA abgetrennt oder freigesetzt werden können, werden gewünschtenfalls mit einer Markierung versehen. Redundante Affinitätsmarkierungen und mit Affinitätsmarkierungen versehene Analytensequenzen, die nicht imstande waren, zu hybridisieren, weil keine entsprechenden Sonden in dem Pool vorlagen, werden natürlich auf dem festen, die Abtrennung unterstützenden Instrument gebunden, aber sie können während der Elution und der nachfolgenden Trennverfahren von den Hybriden abgetrennt werden.
Grundsätzlich findet die Lösungshybridisierung unter Bedingungen statt, die die Hybridisierung in die Richtung der Hybridbildung treiben, einschließlich von DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA, PNA:DNA, PNA:RNA. Die bevorzugtesten Bedingungen variieren in Abhängigkeit von den Reagenziensonden, Analyten usw. Danach werden die die Affinitätsmarkierungen tragenden Hybriden durch Gewinnung oder Einfangen auf dem die Abtrennung unterstützenden Instrument unter Verwendung des Gegenstücks oder Affinitätspartners der Affinitätsmarkierung isoliert. Die Hybriden werden zurückgewonnen, d. h. sie werden aus der Hybridisierungslösung entfernt oder von ihr abgetrennt und können durch Waschung von anderen Reagenzien befreit werden. Die Sondenmoleküle, die keine Hybriden mit den affinitätsmarkierten Analyten gebildet haben, verbleiben in der Hybridisierungs- oder Waschlösung und werden demzufolge entfernt. Infolgedessen werden nur diejenigen Sonden, die imstande waren, mit einem Analytenpolynukleotid, das in der Zell- oder Gewebeprobe vorliegt, zu hybridisieren, d. h. nur diejenigen Sonden, die einen komplementärsträngigen Analyten in der Probe haben, durch das die Abtrennung unterstützende Instrument eingefangen und zurückgewonnen und können gewonnen werden. Natürlich werden solche affinitätsmarkierten Analyten, die keinen komplementären Strang unter den Sonden haben, auf dem die Abtrennung unterstützenden Instrument eingefangen, aber sie stören die Stöchiometrie des Hybridisierungsverfahrens nicht und stören auch die nachfolgenden analytischen Schritte nicht. Sie können z. B. zerstört oder entfernt werden, wenn die Sonden isoliert oder von dem Hybriden freigesetzt werden. Das bedeutet, dass die automatischen oder halbautomatisch detektierbaren oder aufzeichnungsfähigen, optional tracermarkierten Sonden, die anhand ihrer unterschiedlichen Größen identifizierbar sind, eingefangen oder zurückgewonnen und nachfolgend zum Aufzeichnen freigesetzt oder isoliert werden.
Nur diejenigen DNA-Sonden, die in einem Komplex oder einem Hybriden vorliegen, der einen affinitätsmarkierten RNA-Analytenstrang aus der Probe umfasst, werden auf dem die Abtrennung unterstützenden Instrument eingefangen und nachfolgend zur Aufzeichnung isoliert. Optionale, die Abtrennung unterstützende Instrumente sind im erfindungsgemäßen Verfahren erforderlich, um die zwischen den tracermarkierten Sonden und den affinitätsmarkierten Analyten gebildeten Hybriden zurückzugewinnen. Die die Abtrennung unterstützenden Instrumente, die feste Träger sind wie z. B. Mikropartikel, Microbeads, Latexpartikel, magnetische Partikel, Fäden, Pflöcke, Stäbchen, Mikronäpfe und Affinitätssäulen, werden mit dem Gegenstück oder den Gegenstücken oder dem Affinitätspartner oder den Affinitätspartnern der Affinitätsmarkierungen versehen oder beschichtet. Das die Abtrennung unterstützende Instrument kann Mittel zur Phasentrennung oder elektrophoretische Mittel zum Einfangen des Gegenstücks der Affinitätsmarkierung umfassen.
Die auf dem die Abtrennung unterstützenden Instrument zurückgewonnenen Hybriden werden anschließend von dem Instrument freigesetzt, zuerst durch Elution, dann durch Aufbrechen der Wasserstoffbrücken der Hybriden und der gewünschtenfalls markierten Sonden, und die gewünschtenfalls markierten Sonden, die von den Hybriden freigesetzt worden sind, werden isoliert, anhand ihrer Größen getrennt und durch Mittel, die ihre Quantifikation erlauben, aufgezeichnet. Da jede isolierte Sonde eine exprimierte mRNA darstellt, kann die Expression auf einer molekularen Grundlage quantifiziert werden. Alternativ werden zuerst die Bindungen der Hybriden aufgebrochen, und danach werden der feste Träger und die Lösung, die die Sonden enthält, voneinander durch ein geeignetes Verfahren getrennt, das von dem verwendeten Abtrennungshilfsmittel abhängt. Danach werden die Sonden, z. B. durch Zentrifugation, anhand ihrer Größen aufgetrennt und durch Mittel, die ihre Quantifikation erlauben, aufgezeichnet. Die gereinigten und isolierten Sonden auf dem die Abtrennung unterstützenden Instrument werden mit einer Lösung wie z. B. NaOH, NH₄OH oder Formamid eluiert, die imstande ist, die Bindungen zwischen den Polynukleotidsträngen aufzubrechen.
Wenn die Tracermarkierung fehlt, können die Sonden direkt mit Massenspektrometrie aufgezeichnet werden. Wenn die Markierung ein Tracer ist, z. B. eine fluoreszierende Substanz, kann die DNA-Sonde auch direkt aufgezeichnet werden, nachdem sie von der RNA abgetrennt worden ist, die keinerlei Tracermarkierung hat. Die optional tracermarkierten Reagenziensonden liegen jetzt in einer isolierten und freien Form vor, und ihre Menge entspricht genau der Menge der Analytennukleinsäure, die zuvor mit ihnen hybridisiert hatte.
Wenn die Markierung ein Paar terminaler Primer ist, kann die Sonde nach der Abtrennung von der RNA amplifiziert und entweder während oder nach der Amplifikation mit einer Tra cermarkierung versehen werden. Zum Beispiel kann nach einer optionalen Anzahl von Amplifikationszyklen die DNA-Sonde mit einer Tracermarkierung versehen und aufgezeichnet werden. Alternativ können die komplementären Primer mit Tracermarkierungen versehen werden, wodurch die Sonden während der Amplifikation mit Tracermarkierungen versehen werden. Die Amplifikation erlaubt die Aufzeichnung der Expression bei solch geringen Mengen, die bei Verwendung anderer Verfahren unterhalb der Detektionsgrenze liegen. In der weiterentwickelten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die eine empfindlichere Messung der Analytenpolynukleotide erlaubt, sind die Markierungen an den Sonden terminale Primersequenzen. Die terminal primermarkierten Sonden lässt man mit den affinitätsmarkierten Analytenpolynukieotiden auf die gleiche Weise wie bei der grundlegenden Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hybridisieren. Nach der stöchiometrischen Hybridisierungsreaktion werden die Hybriden auf einem die Abtrennung unterstützenden Instrument eingefangen, und die primermarkierten Sonden werden durch an sich bekannte Verfahren zurückgewonnen. Die Menge der zurückgewonnenen Sonden, die genau der Menge der in der Probe vorliegenden Analytenpolynukleotide entspricht, kann eine optionale Anzahl von Malen durch an sich bekannte PCR-Techniken amplifiziert werden. Danach oder während der Amplifikation werden die Sonden mit Tracern versehen, und die Menge und die Größe der Sonden werden aufgezeichnet. Da die Rückgewinnung der primermarkierten Sonde quantitativ ist und genau der Anzahl der Analytenmoleküle entspricht, und es bekannt ist, wie oft die Sonden amplifiziert, d. h. vervielfältigt oder kopiert wurden, ist es einfach, die Menge des Analyten in der ursprünglichen Probe zu berechnen. Dies erlaubt eine quantitative Bestimmung selbst solcher Analytenpolynukleotide, die ohne die Amplifikation unter der Detektionsgrenze und damit nicht aufzeichnungsfähig gewesen wären. Somit kann die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens in hohem Maß gesteigert werden. Dies ist ein großer Vorteil, wenn ein sehr empfindlicher Test benötigt wird, z. B., wenn die klinischen Proben nur einige wenige Zellen aus einer histologischen Gewebeprobe oder Gewebsbiopsie umfassen.
Somit kann das affinitätsselektierte Sondenprofil durch empfindliche automatische quantitative Aufzeichnung gemessen werden, nachdem man die Sonden anhand ihrer Größe voneinander getrennt hat, z. B. durch Kapillar- oder Gelelektrophorese oder Massenspektrometrie. Eine Sonde definierter Größe aus einem bestimmten Pool entspricht einem spezifischen Analytenmolekül. Daher kann das Transkriptionsprofil sehr genau hergeleitet werden.
Eine vergleichende quantitative Messung der Variationen in den Mengen verschiedener in Zell- oder Gewebeproben vorliegender Polynukleotide als Antwort auf inhärente Veränderungen infolge von inhärenten Kontrollmechanismen oder als Reaktion auf externe Stimuli, einschließlich von Pharmaka und Krankheitszuständen, erfordert mindestens zwei organisierte lösliche Pools, aber vorzugsweise mindestens einen organisierten Pool für jede zu testende Probe. Jeder Pool umfasst identische Polynukleotidsonden, aber die organisierten Pools, z. B. jeder auf seiner eigenen Mikrotiterplatte, werden optional mit einer aufzeichnungsfähigen Tracermarkierung bereitgestellt. Wenn Tracermarkierungen verwendet werden, ist es von Vorteil, unterscheidbare Tracer zu verwenden, z. B. Fluorophore mit verschiedenen Emissionswellenlängen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die löslichen Pools auf Mikrotiterplatten bereitgestellt. Jede Mikrotiterplatte ist ansonsten identisch, aber jede hat ihre eigenen aufzeichnungsfähigen Tracer, welche, wenn sie Fluorophore sind, vorzugsweise bei verschiedenen unterscheidbaren Emissionswellenlängen emittieren. Es ist möglich, ohne Tracermarkierungen die Mengen unter Verwendung von Massenspektrometrie zu vergleichen und computerbasierte automatische Systeme einzusetzen, um die aufgezeichneten Ergebnisse zu berechnen und zu vergleichen.
Das folgende Flussdiagramm des Verfahrens beschreibt, wie die vorliegende Erfindung auszuführen ist:
Präparative Schritte
Schritt 1 – Herstellung organisierter Pools löslicher DNA-Sonden mit unterschiedlichen Größen
Fall 1 – ein bekanntes Genom (Hefe oder Mensch)
Die DNA-Fragmente werden so ausgewählt, dass sie individuelle Gene repräsentieren, und ihre Größen werden so ausgewählt, dass sie in dem Größenfraktionierungsschritt eine gute Auflösung erlauben.
Fall 2 – unbekannte Genome (filamentöse Pilze, Trichoderma reesei)
Ein Satz repräsentativer Klone von ungefähr 50 kb Größe wird mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease gespalten, die eine 4 Rasenpaare lange Restriktionsendonukleasenerkennungsstelle erkennt, um einen Satz unterschiedlicher Fragmente zu erzeugen. In diesem Fall kann ein DNA-Fragment zwei Gene überspannen und somit mit zwei Analyten-RNAs hybridisieren. Es ist möglich, mehrere Fragmente für ein Gen zu haben. Alternativ können in einigen Fällen verschiedene Fragmente identischer Größe verwendet werden. Um ein komplettes Genom abzudecken, ist Redundanz erforderlich, infolgedessen werden Hunderte von löslichen DNA-Pools benötigt.
Schritt 2 – Endmarkierung der DNA-Sonden mit einer Tracermarkierung oder einem Fluorophor
Vorzugsweise werden zwei (oder mehr) Sätze der DNA mit unterscheidbaren Farbstoffen hergestellt. Dies erlaubt gleichzeitige vergleichende Untersuchungen von Variationen der Expressionsmuster oder Transkriptionsprofile infolge interner Mechanismen, z. B. Krankheitszustände, oder infolge externer Reize wie z. B. Pharmaka. Die Schritte 1 und 2 sind präparativ und die Grundlagen für die kommerziell wertvollen Test-Kits. Die DNA-Pools können in großen Mengen für eine große Anzahl von Experimenten hergestellt werden. Demzufolge sollte es keine Notwendigkeit geben, diese ziemlich aufwändige Phase oft zu wiederholen.
Analytische Schritte
Schritt 1 – Herstellung eines einzelsträngigen Polynukleotidanalyten
Die Isolation von RNA aus den Zellen wird unter geeigneten experimentellen Bedingungen unter Verwendung an sich bekannter Verfahren (Sambrook, J. et al., Molecular cloning – A laboratory Manual, 2. Ausg. (1989)) durchgeführt. Wenn der Polynukleotidanalyt doppelsträngig ist, muss der Analyt denaturiert werden, um die einzelsträngigen Sequenzen bereitzustellen, die im erfindungsgemäßen Verfahren benötigt werden.
Schritt 2 – Herstellung affinitätsmarkierter Analyten
Die isolierte mRNA wird affinitätsmarkiert, z. B. unter Verwendung eines chemischen, nicht enzymatischen Verfahrens biotinyliert. Das photoaktivierbare Reagenz Photobiotin ist hierzu zweckmäßig und kommerziell verfügbar. Da die RNA nicht in cDNA transkribiert oder auf andere Weise enzymatisch zur Markierung modifiziert wird, kann die RNA hergestellt und in starken Detergenzien wie z. B. SDS aufbewahrt werden. RNAsen werden durch SDS inhibiert, so dass es leicht ist, intakte RNA zu isolieren. Jedoch ist die Fragmentierung kein Problem, wenn sie nicht zu stark ist. Die Größe der RNA-Fragmente beeinträchtigt die Einfangfähigkeit nicht.
Schritt 3 – Hybridisierung in Lösung
Jeder der löslichen tracermarkierten Sonden-(DNA)-Pools wird mit einem Aliquot der affinitätsmarkierten Analyten-(RNA)-Präparation in Kontakt gebracht. Man lässt die Hybridisierung in der freien Lösung in dem kleinen Volumen, das in dem jeweiligen Pool-Abteil bereitgestellt ist, stattfinden. Dies ergibt eine schnelle und quantitative Reaktion.
Schritt 4 – Trennungsschritt
Man fügt Microbeads oder ein anderes die Abtrennung unterstützendes Instrument, das den Affinitätspartner, z. B. Avidin, trägt, zu, um die RNA-Moleküle einzufangen. Zur Entfernung freier DNA wird gewaschen.
Schritt 5 – Rückgewinnungsschritt
Es wird mit einer Lösung eluiert, die die DNA:RNA-Hybriden auflöst, wie z. B. Formamid oder NaOH. Nötigenfalls wird die einzelsträngige DNA präzipitiert und gewaschen. Die einzelsträngige DNA wird in einen Elektrophoresepuffer aufgenommen. Vorzugsweise werden solche Bedingungen verwendet, dass die Elektrophorese des Eluats direkt durchgeführt werden kann und die verschiedenen Sonden gleichzeitig aufgezeichnet werden können.
Schritt 6 – Aufzeichnung der Ergebnisse
Die Größe und die Menge der aus den DNA:RNA-Hybriden eluierten DNA werden durch Kapillar- oder Gelelektrophorese bestimmt. Massenspektroskopie kann möglicherweise ebenfalls verwendet werden. Die Unterschiede zwischen zwei RNA-Präparationen werden durch Hybridisierung von mit verschiedenen Farbstoffen markierten DNA-Fragmenten und Mischung der DNAs vor der Elektrophorese problemlos beobachtet.
Schritt 7 – Interpretation der Ergebnisse
Wenn das Genom bekannt ist (Fall 1), werden die Transkriptionsprofile direkt bestimmt. Im Fall 2 ist es einfach, alle Fragmente mit interessantem Verhalten zu klonieren und zu sequenzieren.
Schritt 8 – Optionale Amplifikation
Wenn ein sehr sensitives Assay benötigt wird, können die Reagenz-Polynukleotidsequenzen, d. h. die tracermarkierten Sonden, die von dem die Abtrennung unterstützenden Instrument eluiert wurden, nach dem quantitativen Selektionsschritt durch PCR amplifiziert werden. Wenn dieser Ansatz verwendet wird, sollten die Reagenz-Polynukleotidsequenzen, d. h. die Sonden, so modifiziert werden, dass sie eine gemeinsame Endsequenz enthalten, die die Amplifikation aller Sonden im gleichen Pool mit dem gleichen PCR-Primerpaar erlaubt, das mit einer Tracermarkierung versehen wird.
Die Tatsache, dass die Sonden unterschiedliche Größe haben und daher auch anhand ihrer Massen unter Verwendung von Massenspektrometrie aufgezeichnet werden können, erlaubt eine weitere Verbesserung des Verfahrens. Durch Verzicht auf die Verwendung von Tracermarkierungen kann das Verfahren vereinfacht und die Notwendigkeit teurer aufzeichnungsfähiger Markierungen vermieden werden. Ansonsten entspricht das Verfahren vollständig dem oben beschriebenen Verfahren und umfasst die folgenden Schritte, dass man nacheinander:

(a) einen oder mehrere organisierte Pools mit einer zuvor festgelegten optionalen Anzahl löslicher Polynukleotidsequenzen mit unterschiedlichen Größen bereitstellt, die ihre Identifikation oder Aufzeichnung erlauben, wobei diese Pools auf eine organisierte Weise in ihren eigenen Gefäßen, die getrennt oder verbunden sind, untergebracht sind;
(b) die in einer Zell- oder Gewebeprobe des Zielorganismus vorliegenden Analytenpolynukleotidsequenzen isoliert und mit mindestens einer Affinitätsmarkierung versieht;
(c) eine Hybridisierungsreaktion zwischen den löslichen Sonden aus Schritt (a) und den Analyten aus Schritt (b) stattfinden lässt, die zur Bildung von löslichen Hybriden zwischen Sonde und affinitätsmarkiertem Analyten führt;
(d) die in Schritt (c) gebildeten Hybriden zwischen Sonde und Analyt gewinnt, indem man diese Hybriden auf einem die Abtrennung unterstützenden Instrument einfängt, das mit dem Affinitätspartner der Affinitätsmarkierung der Analyten bereitgestellt wird;
(e) die Sonden von dem die Abtrennung unterstützenden Instrument zurückgewinnt;
(f) die Größe und Menge der Sonden durch Massenspektrometrie aufzeichnet.

Test-Kits
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Test-Kit. Das Test-Kit umfasst ein oder mehrere lösliche organisierte Pools mit einer zuvor festgelegten optionalen Anzahl von verschiedenen löslichen Polynukleotidsequenzen oder Sonden. Die Sonden werden gewünschtenfalls mit Markierungen, entweder Tracermarkierungen oder einem Paar von terminalen Primermarkierungssequenzen, versehen. Vorzugsweise sind die Tracermarkierungen endmarkierte detektierbare Tracermarkierungen.
Das Test-Kit umfasst lösliche organisierte Pools, wobei jeder Pool mehr als eine, vorzugsweise mehr als zehn, besonders bevorzugt ungefähr hundert oder mehr Sonden besitzt. Die Pools sind vorzugsweise auf organisierte Weise in ihren eigenen Gefäßen untergebracht, z. B. in Reagenzgläsern, Flaschen oder in den Näpfen oder Abteilungen einer Mikrotiterplatte. Auch wenn das Test-Kit zur Durchführung der erfindungsgemäßen quantitativen Bestimmung vorzugsweise eine Mikrotiterplatte oder eine entsprechende maßgeschneiderte Struktur ist, kann das Test-Kit eine optionale Anzahl von Reagenzgläsern, Flaschen usw. sein, die in mehr oder weniger fest festgelegten Arrangements organisiert sein können, einschließlich von Ständern und/oder anderen starren Strukturen. Die Test-Kits können nach Kundenwunsch modifiziert oder maßgeschneidert und mit geeigneten Markierungen und Gebrauchsanweisungen bereitgestellt werden.
Die Pools löslicher Polynukleotidsonden für die Test-Kits können aus DNA-Fragmenten hergestellt werden. Sie können synthetische Oligonukleotide und modifizierte DNAs sein. Wenn das Test-Kit zur Untersuchung charakterisierter Genome hergestellt wird, umfassen die Pools des Test-Kits vorzugsweise mindestens ein Polynukleotidfragment (Sonde) aus jedem in dem Genom zu studierenden Gen. Auch wenn uncharakterisierte Genome untersucht werden sollen, können die Pools zu allgemeineren oder spezifischeren Untersuchungen vorzugsweise in größeren Mengen hergestellt werden, wobei eine kommerzielle Herstellung keineswegs ausgeschlossen ist. Die Pools werden vorteilhafterweise hergestellt, indem man die gewünschten Teile des Genoms in ein Plasmid einfügt, das auf bequeme Weise vermehrt und mit geeigneten Restriktionsenzymen fragmentiert werden kann, um die gewünschten Sondenpools mit unterschiedlichen Größen bereitzustellen. Die Inserts können gewünschtenfalls mit den gewünschten Restriktionsenzymerkennungsstellen bereitgestellt werden. Auch für teilweise charakterisierte oder uncharakterisierte Genome können kommerzielle Test-Kits im Wesentlichen auf die gleiche Weise hergestellt werden. Es sollte festgehalten werden, dass auch ein uncharakterisiertes Genom durch dieses Verfahren effizient charakterisiert wird.
Wenn die Reagenz-Polynukleotidsonden von einem charakterisierten Genom stammen, ist bekannt, dass jedes Sondenmolekül einem bestimmten Gen entspricht, und jede Sonde wird spezifisch anhand ihrer Größe und ihres Pools identifiziert. Das Transkriptionsprofil kann somit direkt anhand der Expressionsniveaus der einzelnen Gene interpretiert werden. Wenn die Reagenz-Polynukleotidsonden schlecht charakterisiert sind, z. B. wenn sie von einem Organismus stammen, dessen Genom nicht sequenziert ist, können trotzdem immer noch wertvolle Ergebnisse erhalten werden. Die Sondenpools können in diesem Fall hergestellt werden, indem man z. B. große Klone von 10 bis 200 kb in unterschiedliche und erhebliche kleinere Fragmente spaltet. Diese kleineren Fragmente werden gewünschtenfalls markiert und wie oben beschrieben als Sonden verwendet. Das Transkriptionsprofil identifiziert in diesem Fall nicht direkt Gene, aber liefert sowohl quantitative als auch differenzielle Daten im Hinblick auf ein bestimmtes Sondenmolekül. Anhand dieser Daten ist es leicht, alle Fragmente mit interessantem Verhalten zu klonieren und zu sequenzieren. Hierdurch kann innerhalb eines kurzen Zeitraums eine Menge von Information effizient gesammelt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits kann auf einer Mikrotiterplatte hergestellt werden. In solch einer praktischen Ausführungsform der Erfindung können Pools mit DNA-Fragmenten von Hefe zur Herstellung der Test-Kits verwendet werden. Wenn jeder Pool z. B. 100 bis 300 Sonden oder Fragmente umfasst, ergibt dies eine hinreichend gute Auflösung. Wenn jede Sonde in dem Pool ein bestimmtes Hefegen repräsentiert, können die un gefähr 6300 Hefegene auf einer einzigen Mikrotiterplatte untergebracht werden, und es gibt immer noch Raum für eine Anzahl von Kontrollen. Die eingefangenen DNA-Sonden werden teilweise durch den Pool oder den Mikrotiternapf, zu dem sie gehören, und teilweise anhand ihrer Größe identifiziert.
Die optionale aufzeichnungsfähige Tracermarkierung wird vorteilhafterweise unter einer Gruppe von Tracern ausgewählt, die durch Fluoreszenz, Infrarotabsorption, elektromagnetische Eigenschaften, Radioaktivität und enzymatische Aktivität detektierbar sind. Die bevorzugte Tracermarkierung, die durch ihre Fluoreszenz aufzeichnungsfähig ist, ist ein Fluorochrom oder ein Fluorophor. Massenspektroskopie ist eine andere bevorzugte Aufzeichungsweise, die es erlaubt, ohne irgendwelche Tracermarkierungen Aufzeichnung und Quantifikation durchzuführen. Selbst wenn die Tracermarkierungen bevorzugte Ausführungsformen sind, sind sie für das erfindungsgemäße Verfahren nicht essentiell; das einzige Erfordernis für das erfindungsgemäße Test-Kit besteht darin, dass die Sonden in den löslichen organisierten Pools unterschiedliche Größen haben. Sie sind optional markiert, entweder mit Tracermarkierungen oder mit terminalen Primermarkierungen. Demgemäß wird ein funktionsfähiges Test-Kit von einem organisierten Pool terminal primermarkierter Sonden bereitgestellt, selbst wenn kein Tracer bereitgestellt wird.
In seiner einfachsten Form ist das erfindungsgemäße Test-Kit ein organisierter Pool mit löslichen markierten Sonden mit verschiedenen Größen. Es sollte festgehalten werden, dass dieses Test-Kit als solches vollständig ist, aber durch optionale Tracer, Affinitätspartner und/oder die Abtrennung unterstützende Instrumente ergänzt werden kann. Diese Hilfsmittel sind jedoch kein Erfordernis. Diese Hilfsmittel und Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind sogar kommerziell aus verschiedenen anderen Quellen erhältlich. Somit können das Verfahren und das Test-Kit der vorliegenden Erfindung für die spezifischen Bedürfnisse des Endverbrauchers maßgeschneidert werden, insbesondere so, dass sie für automatische oder halbautomatische Handhabung anwendbar sind.
Das Verfahren der Herstellung des Test-Kits, das demgemäß keine Immobilisierungsschritte umfassen muss, erlaubt die leichte Anpassung maßgeschneiderter Tests, wobei die Aufmerksamkeit auf bestimmte Gen-Untergruppen in einem bestimmten Organismus gerichtet wird. Das Test-Kit kann eine optionale Affinitätsmarkierung zur Markierung der Polynukleotide in der Zell- oder Gewebeprobe und optional ein die Abtrennung unterstützendes Instrument, das mit einem Gegenstück der Affinitätsmarkierung zur Markierung des Analyten versehen oder beschichtet ist, umfassen. Die optionalen Affinitätspartner, die die Affinitätsmarker für die Analyten und die Gegenstücke für das die Abtrennung unterstützende Instrument bereitstellen, umfassen, ohne Beschränkung darauf, z. B. Biotin und Avidin oder Streptavidin, Histidinoligomere und Metallchelate, Haptene und Antikörper oder Glykane und Lektine.
Das optionale die Abtrennung unterstützende Instrument, das in das Test-Kit mit aufgenommen werden oder unabhängig davon bereitgestellt werden kann, ist ausgewählt aus einer Gruppe von festen Trägern, die aus Mikropartikeln, Microbeads, Latexpartikeln, magnetischen Partikeln, Fäden, Pflöcken, Stäbchen, Mikronäpfen oder Affinitätssäulen besteht. Das die Abtrennung unterstützende Instrument kann Mittel zur Phasentrennung oder elektrophoretische Mittel zum Einfangen des Gegenstücks der Affinitätsmarkierung umfassen.
Zur vergleichenden Messung der Variationen der Expressionsmuster oder Transkriptionsprofile können organisierte Pools mit identischen Sondensätzen bereitgestellt werden. In diesem Fall wird jeder organisierte Pool und jedes Test-Kit optional mit gewünschtenfalls verschiedenen oder voneinander unterscheidbaren Tracermarkierungen bereitgestellt, wobei diese Markierungen bei verschiedenen Emissionswellenlängen emittieren. Wenn die Markierungen terminale Primermarkierungen sind, sind die Test-Kits identisch, aber nach der Amplifikation können die zurückgewonnenen und/oder amplifizierten Sonden mit voneinander unterscheidbaren Tracermarkierungen versehen werden. Alternativ kann das komplementäre Primerpaar mit einer Tracermarkierung versehen werden, was die Tracermarkierung während der Amplifikation erlaubt. Diese Hilfsreagenzien können optional in dem Test-Kit enthalten oder aus anderen kommerziellen oder nicht kommerziellen Quellen bereitgestellt sein. Um eine einfache vergleichende Messung von Variationen der Polynukleotidmengen in einer Probe zu ermöglichen, ist es zweckmäßig, Test-Kits herzustellen, die mit verschiedenen voneinander unterscheidbaren Tracermarkierungen bereitgestellt werden, die bei unterschiedlichen Emissionswellenlängen emittieren, und die mit automatischen oder halbautomatischen Instrumenten aufgezeichnet werden können.
Test-Kits zur vergleichenden quantitativen Messung von Variationen der Mengen verschiedener Polynukleotide, die in der Zell- oder Gewebeprobe vorliegen, als Reaktion auf inhärente Veränderungen oder externe Stimuli, einschließlich von Pharmaka und Krankheitsbildern, umfassen zweckmäßigerweise mindestens zwei feste Träger oder Mikrotiterplatten. Jeder feste Träger oder jede Mikrotiterplatte wird mit identischen Polynukleotidsondenpools bereitgestellt, optional mit den Tracermarkierungen versehen. Jeder feste Träger oder jede Mikrotiterplatte sollte optional mit ihrer eigenen unterscheidbaren Tracermarkierung versehen sein, was eine gleichzeitige Aufzeichnung von zu unterschiedlichen Zeitpunkten erhaltenen Zell- oder Gewebeproben erlaubt, z. B. vor oder nach einer Pharmakonbehandlung. Ein differentielles Transkriptionsprofiling, d. h. eine Analyse der Unterschiede zwischen zwei oder meh reren Analytenpolynukleotidpräparationen, ist ohne Weiteres aufzeichnungsfähig, indem man die Analytenproben mit Reagenz-Polynukleotidsonden, die mit verschiedenen, unterscheidbaren und automatisch aufzeichnungsfähigen Tracermarkierungen endmarkiert sind, hybridisiert. Nach dem Hybridisierungsschritt können die verschiedenen Proben gewünschtenfalls gemischt werden, und ihre Unterschiede können direkt beobachtet werden, indem man in jedem Peak das Verhältnis der Tracermarkierungen zueinander misst. Das Test-Kit kann auch mit mindestens einem Primerpaar zur Amplifikation der tracermarkierten Sonden, die im letzten Schritt erhalten werden, bereitgestellt werden, um die Sensitivität des Tests zu erhöhen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist verwendbar zur quantitativen und vergleichenden Messung von Variationen in der Quantität oder Qualität verschiedener charakterisierter, teilweise charakterisierter oder uncharakterisierter Polynukleotide in Zielzell- oder -Gewebeproben infolge inhärenter Veränderungen in Reaktion auf externe oder interne Stimuli. Die Verfahren und Test-Kits können verwendet werden, um die Wirkungen von Behandlungsmodalitäten, epidemiologischen Situationen, Hygienebedingungen oder Mikrobenpopulationen zu messen.
In seiner einfachsten und billigsten Form ist das erfindungsgemäße Test-Kit ansonsten das gleiche wie die oben beschriebenen Test-Kits, und es umfasst einen oder mehrere organisierte Pools mit einer zuvor festgelegten optionalen Anzahl von löslichen Polynukleotidsequenzsonden, die in verschiedenen Größen bereitgestellt werden, was ihre Identifikation und Aufzeichnung mit Massenspektrometrie erlaubt. Die Sonden können mit terminalen Primer-Markierungen bereitgestellt werden, um Amplifikation vor der quantitativen Messung durch massenspektrografische oder spektrometrische Mittel zu erlauben. Diese Pools unmarkierter Sonden werden auf eine organisierte Weise in ihren eigenen Gefäßen untergebracht, die getrennt oder miteinander verbunden sind.
Das die erfindungsgemäßen Reagenzien einschließende Test-Kit ist vorzugsweise anwendbar zur Durchführung automatischer oder halbautomatischer Verfahren, von denen ein Beispiel als Flussdiagramm in 10 dargestellt ist. Das Verfahren kann unterbrochen werden, und die Reagenzien können auf andere feste Träger übertragen werden, wenn die automatischen Geräte nicht vollständig kompatibel sind. Die ersten Schritte werden vorteilhafterweise in einer automatisierten Pipettierstation durchgeführt, wobei die biotinylierte Proben-RNA in jeden Pool pipettiert wird, wobei die Proben unterschiedlicher Größe in den Pools enthalten sind. Anschließend kann das Test-Kit unter Verwendung eines Lyophilisators getrocknet werden. Die Trocknung wird durchgeführt, um den Einfluss von Volumendifferenzen auszuschalten. Die optionale Lyophilisation erlaubt es, die Arbeit zu unterbrechen, bis es zweckmäßig ist, die Arbeit fortzusetzen.
Die Arbeit wird wieder aufgenommen, indem man einen geeigneten Hybridisierungspuffer den Pools in einer automatisierten Pipettierstation zusetzt. Die Platte wird mit geeigneten Mitteln, z. B. einem Film oder einer Folie, versiegelt, um im nachfolgenden Schritt Verdunstung zu verhindern. Wenn das Test-Kit mit einem geeigneten Hitzesiegel versehen wurde, wird es in einem automatisierten Thermoblock untergebracht, in dem die Temperatur wie erforderlich nach oben oder unten reguliert werden kann, um die Denaturierung und Hybridisierung der Sonden zu ermöglichen. Nach der Hybridisierung werden die Lösungen, die die Sonden:Analyt-Hybriden enthalten, in einem magnetischen Partikelverarbeitungsgerät untergebracht, um die Affinitätseinfang-, Wasch- und Elutionsschritte durchzuführen, indem man mit Streptavidin/Avidin beschichtete magnetische Beads von Schritt zu Schritt bewegt, z. B. auf einer KingFisher-Platte gemäß einem programmierten Protokoll. Die Eluate können optional auf eine neue Platte übertragen werden, wenn die automatisierten Stationen verschiedene Typen von Mikrotiterplatten verwenden. Die Näpfe können für den quantitativen Transfer mit einem Elutionspuffer gespült werden, und dann werden die kombinierten Lösungen in einem Lyophilisator eingedampft, was es ermöglicht, die Proben zu bewahren und die Aufzeichnung zu einem zweckmäßigeren Zeitpunkt durchzuführen. Anders ausgedrückt, kann das Verfahren ohne Weiteres an verschiedene Zeitpläne und Protokolle zur Durchführung der Bestimmung angepasst werden. Die Sondenfragmente, ein Größenstandard und Konzentrationsstandards werden entweder direkt oder nach einem zweckmäßigen Schritt automatisch in einen automatischen Analysator injiziert. Die Intensitäten der an die Sondenfragmente angehefteten Markierungen werden als Flächen bestimmt. Die Flächen der Konzentrationsstandards mit bekannten Mengen werden dann verwendet, um die absoluten Mengen jedes einzelnen Sondenfragments zu bestimmen.
Der experimentelle Entwurf und die allgemeinen Prinzipien der vorliegenden Erfindung werden detaillierter unter Verwendung von Plasmiden und Inserts, die im Labor der Erfinder verfügbar sind, beschrieben. Die Plasmide werden nur zu illustrativen Zwecken verwendet. Die Erfindung ist keineswegs auf diese Plasmide beschränkt. Die Prinzipien der Erfindung können geprüft werden, indem man das in den Beispielen verwendete Konstrukt durch andere Plasmide oder Inserts ersetzt, die in großer Zahl verfügbar sind. Der Fachmann kann die Prinzipien der Erfindung ohne Weiteres auf verschiedene Anwendungen anwenden.
Beispiel 1
Quantitative Messung
Ein Plasmid, pAS11, bestehend aus einem Vektorteil und einem Insertteil (cDNA), wird zur Herstellung eines Sondenpools verwendet.
Das Plasmid wurde aus einem pSP73-Klonierungsvektor (Promega, P2221) und einem Hefevektor pAS4, enthaltend Endoclucanase-5-cDNA (Saloheimo, A., et al., Mol. Microbiol. 13, 219–228, 1994), ein neues, kleines Endoglucanasegen, egl5, aus Trichoderma reesei, durch Expression in Hefe isoliert (Saloheimo et al., 1994), hergestellt. Die egl5-cDNA wurde durch EcoRI-teilweisen XhoI-Verdau aus pAS4 herausgelöst, die Enden wurden durch Auffüllen mit dem Klenow-Fragment (1008404, Boehringer Mannheim) abgestumpft und mit dem SmaI-verdauten pSP73-Vektor ligiert, um pAS11 zu erzeugen. Der Vektor enthielt einen T7-Promotor, der die In-vitro-Transkription erlaubte. Das Plasmid wurde auch zur Herstellung von RNA wie in den Modellbeispielen verwendet. Die Schritte in diesen Modellexperimenten unterschieden sich etwas von den in dem verallgemeinerten Verfahren der vorliegenden Erfindung beschriebenen Hauptschritten. Das Experiment folgte den nachfolgend dargestellten Schritten:
Präparative Schritte:
Schritt 1 – Herstellung von Sonden aus doppelsträngigen Polynukleotiden
Das pAS11-Plasmid, enthaltend ein Ampicillinresistenzgen, wurde in DH5α-Zellen über Nacht bei + 37°C in LB-Lösung, enthaltend 1% Glucose und 0,1 mg/l Ampicillin, kultiviert.
Schritt 2 – Reinigung und Überprüfung der Sondenpolynukleotide
Anschließend wurden die Plasmide gemäß dem Plasmid Maxi Protocol von QIAGEN^® (QIA-GEN^® Plasmid Purification Handbook, Januar 1999) gereinigt und analysiert.
Schritt 3 – Linearisierung der Plasmide
Das gereinigte Plasmid wurde durch Verdau mit EcoRI linearisiert, durch Agarosegelelektrophorese isoliert und dann unter Verwendung des QIAquick^TM Gel Extraction Kit Protocol (QIAquick^TM Spin Handbook, Januar 1999) extrahiert und gereinigt.
Schritt 4 – Herstellung der Analyten
Dem Insert entsprechende RNA wurde in vitro unter Verwendung des RiboMAX^TM Large Scale RNA Production System – T7 (Promega, P1300) hergestellt, und die hergestellte Menge wurde anhand ihrer UV-Adsorption gemessen.
Analytische Schritte:
Schritt 1 – Affinitätsmarkierung von Analytensequenzen
RNA wurde mit PHOTOPROBE^® Biotin SP-1000 gemäß dem Protokoll des Herstellers (VECTOR Laborstories) affinitätsmarkiert.
Schritt 2 – Fragmentierung der Proben
Eine Probe des Piasmids wurde mit dem Restriktionsenzym MspI geschnitten, was 21 Fragmente ergab, von denen 10 dem Insert und 11 dem Vektor entsprachen.
Schritt 3 – Endmarkierung der Sonde mit einer Tracermarkierung
Die DNA-Fragmente wurden an den Enden mit Fluoreszein-12-ddCTP, NEL-400 (NEN^® Life Science Products, Inc.) unter Verwendung des Klenow-Fragments (1008404, Boehringer Mannheim) markiert. Der Erfolg des Markierungsverfahrens wurde durch Analyse der DNA-Fragmente auf einem gelelektrophoretischen DNA-Sequenzierungsgerät ALF DNA Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech) mit der ALFwin Fragment Analyser 1,02 Software Package (Amersham Pharmacia Biotech) und unter Verwendung eines Sizer 50–500 als externer Kontrolle und eines Sizer 250 als interner Kontrolle (Katalognummern 27-4525-01 und 27-4527-01, Amersham Pharmacia Biotech) bestätigt (8a und 8b).
Schritt 4 – Hybridisierung in Lösung
Ein Aliquot der RNA-Probe (0,44 pM) wurde mit einem Aliquot (0,044 pM jedes Fragments) der endmarkierten DNA-Präparation in einem RNAse-freien Mikrozentrifugenröhrchen gemischt. Die SDS-Konzentration in dem Gemisch wurde auf 0,1% gehalten. Das Gemisch wurde unter Verwendung von 3 M Natriumacetat (1/10 V) und 94% Ethanol (2,5 V) gefiltert, pelletiert (20000 g), mit 70% EtOH gewaschen und in 25 μl Hybridisierungslösung gelöst: 0,6 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1% (Gew./Vol.) SDS und 0,02% (Gew./Vol.) FicoII, 0,02% (Gew./Vol.) Polyvinylpyrrolidon, 0,02% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (1 × Denhardtlösung). Das Gemisch wurde 3 Minuten lang auf 100°C erhitzt.
Schritt 5 – Ein optionaler Schritt im Zusammenhang mit der Hybridisierung
Die Probe wurde 2 Stunden lang auf 65°C erhitzt und dann in ein neues RNAse-freies Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Das Inkubationsröhrchen wurde einmal mit 25 μl Hybridisierungslösung gespült, und die Waschlösung wurde dem gleichen Röhrchen zugesetzt.
Schritt 6 – Einfangschritt
0,5 μl einer 5%igen (Gew./Vol.) Suspension von FLUORICON^TM Avidinpolystyrol-Assaypartikeln (IDEXX Laborstories, 31-040-1A) wurde zugesetzt, und die Inkubation wurde 30 Minuten lang bei 22°C fortgesetzt. Die Suspension der Partikel erfolgte in der Waschlösung: 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5), 0,5 M NaCl, 0,1% (Vol/Vol.) Tween 20.
Schritt 7 – Trennungsschritt
Die Mikropartikel wurden durch Zentrifugation (12000 g, 22°C) gewonnen und viermal mit 200 μl von 0,1 × SSC-0,2% SDS bei 50°C gewaschen (12000 g, 40°C).
Schritt 8 – Elutionsschritt
Die gebundene DNA wurde mit 200 μl 50 mM NaOH eluiert, gefällt, pelletiert und gewaschen, wie in Schritt 5 beschrieben, und in Wasser gelöst.
Schritt 9 – Rückgewinnungsschritt
Die eluierte DNA wurde auf einem Kapillarelektrophorese-DNA-Sequenzierungsgerät ABI PRISM^® 310, Genetic Analyser (Applied Biosystems) unter Verwendung von GeneScan^® Analysis Software (Applied Biosystems) und eines GeneScan-500 Größenstandards und bekannter Mengen eines kundenangefertigten Einzelgrößenstandards oder auf einem Gelelektrophorese-DNA-Sequenzierungsgerät ALF DNA Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech) mit dem ALFwin Fragment Analyser 1,02 Software Package (Amersham Pharmacia Biotec) und unter Verwendung eines Sizer 50–500 als externer Kontrolle und eines Sizer 250 als interner Kontrolle (Katalognr. 27-4525-01 und 27-4527-01, Amersham Pharmacia Biotech) analysiert.
Schritt 10 – Aufzeichnung der Ergebnisse
Das Ergebnis wurde aus dem Elektropherogramm und der Datendatei, wie in 8c dargestellt, ausgelesen.
Wie hier zu sehen, wurden im Vergleich zu 8b, in der alle Fragmente als Vergleich gezeigt sind, nur dem Insert entsprechende Fragmente gefunden. Die Quantifikation wurde unter Verwendung der Peakfläche des internen Standards berechnet, dessen Konzentration in jeder Probenspur bekannt war.
Beispiel 2
Vergleichende, quantitative Evaluation
RNA aus einem filamentösen Pilz, Trichoderma reesei, vor und nach der Induktion
In diesem Experiment wurde aus dem filamentösen Pilz Trichoderma reesei isolierte RNA unter zwei verschiedenen Bedingungen analysiert, nämlich vor und nach der Induktion extrazellulärer hydrolytischer Enzyme. Der in dem Experiment verwendete Trichoderma-reesei-Stamm war QM 9414 (in der VTT-Kollektion als VTT-D-74075 hinterlegt) und wurde kultiviert, mit α-Sophorose induziert und geerntet, wie beschrieben in Ilmén, M., Onnela, M.-L., Klemsdal, S., Keränen, S. und Penttilä, M., 1996, Functional analysis of the cellobiohydrolase I promoter of the filamentous fungus Trichoderma reesei. Mol. Gen. Genet. 253, Seiten 303–314.
Die pilzliche Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des TRlIol^® Reagenzverfahrens (Life Technologies; Gibco BRL) hergestellt. Weitere polyadenylierte RNA wurde unter Verwendung des Oligotex mRNA Spin-Column Protocol (QIAGEN^® Oligotex^TM Handbook August 1998) aus der Gesamt-RNA isoliert. Diese RNA wurde biotinyliert, wie in Beispiel 1, analytischer Schritt 1, oben, beschrieben. Die Sonden-DNA-Fragmente waren die gleichen wie in Beispiel 1. Das Insert in dem Plasmid enthielt das Gen für ein endoglucanasehydrolytisches Enzym, von dem bekannt war, dass es unter den verwendeten Bedingungen induziert wird.
Das Experiment folgte den analytischen Schritten 1–10, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Elektropherogramme (9a und 9b) zeigten, dass die der Endoglucanase entsprechenden Fragmente nach der Induktion der extrazellulären hydrolytischen Enzyme durch Sophorose dreimal häufiger waren.
Beispiel 3
Quantitative Messung kleiner Analytenmengen
Die präparativen Schritte der Sonden unterschieden sich von denen in den Beispielen 1 und 2, wie unten beschrieben, in dem experimentellen Entwurf zur Detektion sehr geringer RNA-Mengen.
Die Proben wurden durch eine PCR-Reaktion hergestellt (siehe 5). Für jedes Sondenfragment wurden zwei einzigartige Oligonukleotidsequenzen mit einer Länge von 16–24 Nukleotiden ausgewählt, die spezifisch zu der PCR-Amplifikation eines einzelnen DNA-Fragments führen, das einem bestimmten Gen entspricht. Die PCR-Primer enthielten zusätzlich an ihrem 5'-Ende eine weitere 16 Nukleotide lange Sequenz. Diese Sequenz war mit einer Hälfte der Primer identisch, d. h. mit allen Primern, die die Elongation in eine Richtung vermittelten, während eine andere Sequenz mit der anderen Hälfte der Primer identisch war, d. h. mit denjenigen, die die Elongation in die andere Richtung leiteten. Die beiden zusätzlichen 16-mere wurden in alle Proben während ihrer präparativen Amplifikation durch PCR eingebaut. In diesem Fall waren die Sonden nicht fluorophormarkiert.
Nach dem präparativen Verfahren, in dem die Sondenmoleküle hergestellt wurden, wurde das Experiment mit dem analytischen Teil fortgesetzt.
Schritt 1 – Herstellung des affinitätsmarkierten Analyten
Analyten-RNA wurde isoliert und mit Photobiotin affinitätsmarkiert, wie im analytischen Schritt 1 des Beispiels 1 beschrieben.
Schritt 2 – Hybridisierung in der Lösung
Die RNA-Probe wurde mit einem Pool amplifizierbarer DNA-Sonden gemischt, wie im analytischen Schritt 4 des Beispiels 1 oben beschrieben.
Schritt 3 – Hybridisierung der Lösung
Das Gemisch aus RNA-Probe und DNA-Sonde wurde unter Bedingungen inkubiert, die die Hybridisierung erlaubten, wie im analytischen Schritt 5 des Beispiels 1 beschrieben.
Schritt 4 – Einfangen
Biotinylierte RNA und DNA-RNA-Hybriden wurden auf avidinbeschichteten Partikeln eingefangen, wie in Beispiel 1 unter Schritt 6 (6) beschrieben.
Schritt 5 – Elution
Die DNA-Sondenmoleküle wurden eluiert, gefällt und gewaschen, wie in Beispiel 1 unter Schritt 7 oben beschrieben.
Schritt 6 – Amplifikation
Ein Primerpaar, den gemeinsamen 16 endständigen Nukleotiden der Sonden entsprechend, wurde zugesetzt. Primer 1 war unmarkiert und mit 4 pmol/μl zugesetzt, Primer 2 war mit dem Fluorophor 5'-markiert und mit 50 pmol/μl zugesetzt. Die Pufferbedingungen wurden an die Erfordernisse der verwendeten DNA-Polymerase angepasst (z. B. DeepVent^® DNA Polymerase, #M0258L, New England Biolabs^® Inc.). Ein PCR-Programm, das aus 25 Zyklen von z. B. 94°C, 1 Minute; 52°C, 30 Sekunden; 72°C, 1 Minute, bestand, wurde verwendet, um die Sonden zu amplifizieren und die fluoreszierende Markierung einzuführen (7).
Schritt 7 – Abtrennung von überschüssigem Primer
Überschüssiger Primer wurde durch Vakuumfiltration entfernt, z. B. durch Millipore Multiscreen96-PCR Filter Plate, Katalognr. MALAU 030 10 mit einem Vakuumansaugstutzen MAVM 096 OR) oder durch Gelchromatographie auf einer Zentrifugationssäule, z. B. QIAquick PCR Purification Kit, 28106) oder durch Ethanol- oder Propanolfällung.
Schritt 8 – Aufzeichnung
Die amplifizierten Sonden wurden durch Elektrophorese analysiert, wie in Beispiel 1 unter Schritt 9 oben beschrieben.
Beispiel 4
Analyse über Massenspektrometrie
Für die massenspektrometrische Analyse waren die verwendeten Sonden synthetische Oligonukleotide, in diesem Beispiel 30 Basenpaare lang. Sie unterschieden sich voneinander durch ihr Molekulargewicht infolge von Sequenzdifferenzen. Vier der Sonden wurden so entworfen, eine mRNA der in vitro transkribierten RNA, im Beispiel 1 beschrieben, zu detektieren, während vier als Kontrollen verwendet wurden und keine RNA-Präparation zu dieser korrespondierenden Sequenz hatten. Die analytischen Schritte waren wie folgt:
Schritt 1
Die Oligonukleotidsonden wurden mit der biotinylierten RNA-Präparation des Beispiels 1 in 20 μl des in Beispiel 1 beschriebenen Puffers vereinigt.
Schritt 2
Das Gemisch wurde 3 Minuten lang bei 100°C und 4 Stunden lang bei 68°C inkubiert.
Schritt 3
Die Lösung wurde unter Einstellung der NaCl-Konzentration auf 1 M auf 40 μl verdünnt, gefolgt von Affinitätseinfang an streptavidinbeschichtete magnetische Beads (Dynal Dynabeads M280 Streptavidin). Die Beads wurden viermal jeweils 15 Minuten lang mit 0,15 M Natriumcitrat, 0,1% SDS bei 68°C gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen der Beads mit RNAse-freiem Wasser.
Schritt 5
Die Beads wurden mit 200 μl 1 M NH₄OH bei Raumtemperatur eluiert.
Schritt 6
Das Eluat wurde lyophilisiert.
Schritt 7
Die lyophiliserte Lösung wurde in 100 l ultrareinem Wasser suspendiert.
Schritt 8
Die 8 Oligonukleotidsonden wurden auf einem MALDI-TOF-Massenspektrometer quantifiziert. Die acht Oligonukleotide mit den molekularen Gewichten 9320,1, 9251,0, 9249,0 und 9257,1 (diese vier entsprachen der RNA) und 8893,9, 9249,0, 9264,1 und 9296,1 (diese vier dienten als negative Kontrollen) wurden ohne Affinitätsselektion analysiert, wie oben beschrieben. Alle acht Massen wurden detektiert (9249,0 nur einmal). Bei Verwendung des Selektionsverfahrens mit biotinylierter RNA aus Beispiel 1 wurden nur die ersten vier Oligonukleotide identifiziert.
Beispiel 5
Halbautomatische Durchführung des Verfahrens
Die gleichen Sonden und mRNA-Reagenzien wie in Beispielen 1 und 2, oben, wurden in einem halbautomatischen Verfahren verwendet, das als Flussdiagramm in 10 dargestellt ist.
Schritt 1 – Aufbau und Plattenversiegelung
Eine automatisierte Pipettierstation wird zuerst verwendet, um die DNA-Sonden in den Pools zu kombinieren, und zweitens, um die biotinylierten Proben-RNAs in jeden Napf auf der Platte zu geben. Der Aufbau wird dann unter Verwendung eines Lyophilisators getrocknet, um den Einfluss der Volumina auszuschalten. Unter Verwendung einer automatisierten Pipettierstation wird der Aufbau dann in einen geeigneten Hybridisierungspuffer resuspendiert, der z. B. 0,6 M Natriumcitrat, 0,04 M Natriumphosphat, pH 7,0, 0,6 M NaCl, 0,5% SDS, 20% Formamid, 1 × Denhardtlösung, Dextransulfat, 2% enthält. Zur Vermeidung der Verdunstung im nachfolgenden Schritt wird die Platte danach mit einem Film versiegelt. Beispielsweise kann ein Hitzesiegel mit einem Thermoversiegler oder eine selbstklebende PCR-Siegelfolie verwendet werden.
Schritt 2 – Denaturierung und Hybridisierung
Die Platte wird in einem automatisierten Thermoblock positioniert, z. B. einem Thermozykler, in dem die Temperatur zuerst auf 100°C erhöht wird, um die doppelten Stränge der Sonden zu denaturieren. Dann wird die Temperatur schrittweise auf ein passendes Maß abgesenkt, z. B. 68°C, was die Hybridisierung der Sonden-DNA und der Proben-RNA erlaubt.
Schritt 3 – Affinitätseinfangung, Waschung und Elution
Nach der Hybridisierung wird eine magnetische Partikelverarbeitungseinrichtung, wie z. B. KingFisher (ThermoLabsystems) verwendet, um Affinitätseinfang-, Wasch- und Elutionsschritte durchzuführen, in denen streptavidin-/avidinbeschichtete magnetische Beads auf eine KingFisher-Platte von Schritt zu Schritt gemäß einem programmierten Protokoll bewegt werden. Auf der KingFisher-Platte sind die Lösungen für jeden Schritt zuvor an festgelegte Orte pipettiert.
Nach dem Hybridisierungsprozess wird der Inhalt der Platte an festgelegte Orte auf einer oder mehreren KingFisher-Platten übertragen. Im Anschluss an das Spülen der Näpfe wird die Lösung durch Einstellung der NaCl-Konzentration auf 1 M auf einen für den Affinitätseinfang geeigneten Wert eingestellt.
Schritt 4 – Puffereinstellung und Zugabe von Standards
Die Eluate werden auf eine neue Platte transferiert (dieser Schritt ist optional und wird nur verwendet, wenn die automatisierten Stationen verschiedene Arten von Mikrotiterplatten verwenden). Die Näpfe werden mit Elutionspuffer zum quantitativen Transfer gespült, und dann werden die zusammengefassten Lösungen in einem Lyophilisator eingedampft. Eine automatisierte Pipettierstation wird verwendet, um die getrockneten Sondenfragmente in einen Laufpuffer zu übertragen, der für den nachfolgenden Analysator geeignet ist (z. B. Wasser, wenn der Analysator der ABI 3100 ist), und um bekannte Mengen von Größenstandards und Konzentrationsstandards zuzusetzen.
Schritt 5 – Größenidentifikation und Quantifikation von Fragmenten
Die Sondenfragmente, die Größenstandards und die Konzentrationsstandards werden automatisch in einen Analysator injiziert, wie z. B. einen ABI 3100, Applied Biosystems oder einen BaseStation DNA Fragment Analyzer, MJ Research Inc. Die Software des Analysators wird verwendet, um die Größe der Fragmente zu spezifizieren. Die Intensitäten der fluoreszierenden Markierungen, die an die Sondenfragmente angeheftet sind, werden als Flächen bestimmt. Die Flächen der Konzentrationsstandards mit ihren bekannten Mengen werden dann verwendet, um die absoluten Mengen für jedes Sondenfragment zu bestimmen.

Claims

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Mengen von mehr als 1 verschiedenen Polynukleotidsequenzen (Analyten), die in einer Zell- oder Gewebeprobe vorliegen, durch Anwendung affinitätsunterstützter Lösungshybridisierung, dadurch gekennzeichnet, dass man in aufeinanderfolgenden Schritten: (a) einen oder mehrere organisierte Pools mit einer zuvor festgelegten optionalen Anzahl verschiedener löslicher Polynukleotidsequenzen (Sonden) bereitstellt, wobei die optionale Anzahl der Sonden größer als 1 ist, und die Sonden unterschiedliche Größen haben, die ihre Identifikation oder Aufzeichnung erlauben, sowie gewünschtenfalls eine oder mehrere Markierungen, die entweder Tracermarkierungen sind und eine direkte Aufzeichnung nach dem quantitativen Schritt (e) erlauben, oder die zwei terminale Primermarkierungen sind, die Amplifikation nach dem quantitativen Schritt (e) und optionale Markierung mit einem Tracer während oder nach der Amplifikation erlauben, wobei diese Pools auf eine organisierte Weise in ihren eigenen Gefäßen, die getrennt oder verbunden sind, untergebracht sind; (b) die in einer Zell- oder Gewebeprobe des Zielorganismus vorliegenden Polynukleotidsequenzen (Analyten) mit mindestens einer Affinitätsmarkierung bereitstellt; (c) eine Hybridisierungsreaktion zwischen den löslichen Sonden aus Schritt (a) und den Analyten aus Schritt (b) stattfinden lässt, die zur Bildung von Hybriden führt; (d) die in Schritt (c) gebildeten Hybriden gewinnt, indem man diese Hybriden auf einem die Abtrennung unterstützenden Instrument einfängt, das mit dem Affinitätspartner der Affinitätsmarkierung der Analyten bereitgestellt wird; (e) die optional markierten Sonden von den Hybriden und dem die Abtrennung unterstützenden Instrument freisetzt; (f) die Größe und Menge der freigesetzten nicht amplifizierten oder amplifizierten, optional mit einem Tracer markierten Sonden aufzeichnet.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn die Sonden keine Tracermarkierungen haben, die Größe und Menge der freigesetzten Sonden durch Massenspektrometrie aufgezeichnet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn die Sonden tracermarkiert sind, die Größe und Menge der freigesetzten tracermarkierten Sonden anhand ihrer elektrochemischen oder magnetischen oder massenspektrometrischen Eigenschaften, wie ihrer Fluoreszenz, ihrer Lumineszenz, ihrer Infrarotabsorption, ihrer Radioaktivität oder ihrer enzymatischen Reaktion, als solcher oder nach dem Inkontaktbringen mit anderen Reagenzien, aufgezeichnet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn die Sonden mit zwei terminalen Primermarkierungen bereitgestellt werden, die Größe und Menge der freigesetzten und nachfolgend amplifizierten Sonden, die gewünschtenfalls während oder nach der PCR-Reaktion mit einem Tracer markiert werden, anhand ihrer elektrochemischen, magnetischen oder massenspektrometrischen Eigenschaften, ihrer Fluoreszenz, ihrer Lumineszenz, ihrer Infrarotabsorption, ihrer Radioaktivität oder enzymatischen Reaktion, als solcher oder nach dem Inkontaktbringen mit anderen Reagenzien, und unter Verwendung von Massenspektrometrie, Kapillarelektrophorese oder Gelelektrophorese aufgezeichnet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden DNA-Fragmente, synthetische oder modifizierte Oligonukleotide sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Tracermarkierungen durch automatische oder semiautomatische Mittel oder Geräte aufzeichnungsfähige Markierungen sind.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Tracermarkierung ausgewählt ist unter den anhand von Fluoreszenz, Lumineszenz, Infrarotabsorption, elektromagnetischen Eigenschaften, Radioaktivität und enzymatischer Aktivität aufzeichnungsfähigen.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die anhand ihrer Fluoreszenz aufzeichnungsfähige Tracermarkierung ein Fluorochrom oder Fluorophor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyten in der Zell- oder Gewebeprobe mRNA umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die eine Affinitätsmarkierung und ihre Gegenstücke umfassenden Affinitätspaare Biotin und Avidin, Biotin und Streptavidin, Histidinoligomere und Metallchelate, Haptene und Antikörper, Rezeptoren und Liganden oder Glykane und Lektine sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das die Trennung unterstützende Instrument ausgewählt ist unter einer Gruppe von festen Trä gern, die aus Mikropartikeln, Mikrobeads, Latexpartikeln, magnetischen Partikeln, Fäden, Pflöcken, Stäbchen, Mikronäpfen und Affinitätssäulen besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zuvor festgelegte optionale Anzahl der löslichen Sonden in dem Pool 2 oder 3 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zuvor festgelegte optionale Anzahl der löslichen Proben in dem Pool größer als 5 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die löslichen Pools in Näpfen auf einer Mikrotiterplatte untergebracht sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine vergleichende, quantitative Bestimmung von Variationen in den Analytenmengen dadurch durchgeführt wird, dass man einen Satz von Verfahren bereitstellt, der mehrfache Test-Kits umfasst, mindestens eines für jede zu vergleichende Probe, wobei jedes dieser Test-Kits organisierte Pools mit identischen löslichen, gewünschtenfalls tracermarkierten, Sonden mit unterschiedlichen Größen enthält.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die individuellen Verfahren in dem Satz mit Tracermarkierungen bereitgestellt werden, die voneinander unterscheidbar sind.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass jede der Tracermarkierungen eine Fluoreszenzmarkierung ist, die bei einer anderen Emissionswellenlänge emittiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die mit einer Affinitätsmarkierung bereitgestellten Analyten auf dem festen Träger eingefangen werden, bevor man sie mit den Sondenpools in Kontakt bringt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein Test-Kit anwendet, das einen oder mehrere organisierte Pools mit einer zuvor festgelegten optionalen Anzahl von verschiedenen löslichen Polynukleotidsequenzen (Sonden) umfasst, wobei die optionale Anzahl der Sonden größer als 1 ist und wobei die Sonden zu den zu bestimmenden Analyten komplementäre Stränge, unterschiedliche Größen, die ihre Identifikation und Aufzeichnung erlauben, und optionale Markierungen haben, wobei diese optionalen Markierungen Tracermarkierungen oder Primermarkierungen sind, wobei diese Pools auf eine organisierte Weise in ihren eigenen Gefäßen, die getrennt oder verbunden sind, untergebracht sind.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Test-Kit einen oder mehrere organisierte Pools mit einer zuvor festgelegten optionalen Anzahl löslicher Sonden umfasst, die mit verschiedenen Größen bereitgestellt werden, was ihre Identifikation und Aufzeichnung durch Massenspektrometrie erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden mit mindestens zwei terminalen Primermarkierungen bereitgestellt werden, die ihre PCR-Amplifikation erlauben.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Test-Kit zusätzlich zu den Sonden mit terminalen Primern mit einem separaten Satz von Tracermarkierungen bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19, 20 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Tracermarkierung durch automatische oder semiautomatische Mittel oder Instrumente aufzeichnungsfähige Markierungen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19, 20, 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden mit unterschiedlichen Größen mit einer Tracermarkierung bereitgestellt werden, die ausgewählt ist unter den anhand von Fluoreszenz, Lumineszenz, Infrarotabsorption, elektromagnetischen Eigenschaften, Radioaktivität und enzymatischer Aktivität aufzeichnungsfähigen Tracermarkierungen.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Tracermarkierung, die anhand ihrer Fluoreszenz aufzeichnungsfähig ist, ein Fluorochrom oder ein Fluorophor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Test-Kit mindestens eine Affinitätsmarkierung und/oder ein die Trennung unterstützendes Instrument, bereitgestellt mit einem Gegenstück der Affinitätsmarkierung, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinitätspaare, die eine Affinitätsmarkierung und ihr Gegenstück umfassen, Biotin und Avidin, Biotin und Strep tavidin, Histidinoligomere und Metallchelate, Haptene und Antikörper oder Glykane und Lektine sind.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das die Trennung unterstützende Instrument ausgewählt ist unter einer Gruppe von festen Trägern, die aus Mikropartikeln, Mikrobeads, Latexpartikeln, magnetischen Partikeln, Fäden, Pflöcken, Stäbchen, Mikronäpfen und Affinitätssäulen besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden DNA-Fragmente, synthetische oder modifizierte Oligonukleotide sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die zuvor gewählte optionale Anzahl der löslichen Sonden in dem Pool 2 oder 3 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die zuvor gewählte optionale Anzahl der löslichen Sonden in dem Pool größer als 5 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass der organisierte Pool eine Mikrotiterplatte ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Satz mehrfacher Test-Kits umfasst, mindestens eines für jede Probe, in der eine Variation der Analytenmenge vergleichend und quantitativ bestimmt wird, wobei dieses Test-Kit Pools mit identischen, gewünschtenfalls tracermarkierten Sonden mit verschiedenen Größen enthält, die voneinander unterscheidbar sind.
Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Tracermarkierungen Fluorophore sind, die bei verschiedenen Emissionswellenlängen emittieren.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 19 bis 34 zur Bestimmung von Variationen in den Analytenmengen in einer Zell- oder Gewebeprobe infolge inhärenter Kontrollmechanismen oder als Reaktion auf externe Stimuli.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 19 bis 34 zur Bestimmung der Wirkung von Behandlungsmodalitäten, epidemiologischen Situationen, Hygienebedingungen oder Mikrobenpopulationen.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Bestimmung von Variationen in den Analystenmengen in einer Zell- oder Gewebeprobe infolge inhärenter Kontrollmechanismen oder als Reaktion auf externe Stimuli.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Bestimmung der Wirkung von Behandlungsmodalitäten, epidemiologischen Situationen, Hygienebedingungen oder Mikrobenpopulationen.