FI115139B - Menetelmä ja testipakkaus solu- tai kudosnäytteissä olevien polynukleotidien määrässä tapahtuvien vaihteluiden kvantitatiiviseen ja/tai vertailevaan arvioimiseen - Google Patents

Description

! 115139

Menetelmä ja testipakkaus solu- tai kudosnäytteissä olevien polynukleotidien määrässä tapahtuvien vaihteluiden kvantitatiiviseen ja/tai vertailevaan arvioimiseen Förfarande och testförpackning för kvantitativ och/eller jämförande bedömning av poly-nukleotidmängdernas variationer i cell- eller vävnadsprover

Keksintö koskee menetelmää solu- tai kudosnäytteissä olevien polynukleotidien määrän tai niiden määrien vaihteluiden kvantitatiiviseen ja/tai vertailevaan arvioimiseen käyttäen järjestetyissä pooleissa (joukoissa) olevia kooltaan selvästi erotettavissa olevia liukoisia polynukleotideja. Menetelmä mahdollistaa esimerkiksi transkriptioprofiileissa tai ekspres-siokuvioissa tapahtuvien määrien vaihteluiden kvantitatiivisen tai vertailevan arvioinnin. Keksintö koskee edelleen testipakkausta johon kuuluvat keinot ja reagenssit keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi. Menetelmän ja testipakkauksen käyttö erilaisiin diagnostisiin ja bioteknisiin tarkoituksiin esitetään myöskin.

Johtuen nopeasti kasvavaan perinnöllisen tiedon saatavuuden vaikutuksesta molekyylibiologiaan, terveydenhuoltoon, hoitotapoihin, tieteelliseen farmaseuttiseen tutkimustyöhön ja epidemiologisiin tutkimuksiin, jne., tiedemaailman kiinnostus on nykyään keskittynyt perinnöllisyyden keskeisten peruselementtien vaikutuksiin sekä niiden biologisiin rooleihin ja funktioihin. Perinnöllisyystieteen keskeisiä peruselementtejä koskevan uuden tiedon saannin hidastuessa, kiinnostus näiden peruselementtien vaikutusten ja biologisen roolin tutkimiseen on kasvanut vakaasti.

tt||' Bioinformatiikka, joka käsittelee elintoimintoja koskevaa ja genomiikassa, proteomiikassa, metabolomiikassa ja transkriptomiikassa, ym. kerääntynyttä tietoa matemaattisen täsmälli-sesti, on luonnut sellaisten uusien täsmällisten välineiden tarpeen, mitkä mahdollistavat kerääntyneen tiedon vaikutusten ja tärkeyden nopean ja kvantitatiivisen arvioinnin. .···. Kombinatoorinen kemia mahdollistaa valtavien uusien tai jo olemassa olevien yhdistemäärien nopean synteesin. Uusien tai jo olemassa olevien yhdisteiden tai muiden . ulkoisten ärsykkeiden vaikutusten ja potentiaalisen merkityksen nopea arviointi elävien ' / eliöiden, ihmisen tai koe-eläinten geenien ilmentymiseen on erittäin haluttua. Toisin sanoen, genomiikka, proteomiikka, metabolomiikka, transkriptomiikka, jne., sekä kombinatoorinen kemia yhdistettynä bio informatiikkaan on luonut sellaisten uusien ·;··: välineiden tarpeen, mitkä mahdollistavat näiden yhdisteiden vaikutusten ja biologisen ‘ , roolin nopean täsmällisen ja edullisesti kvantitatiivisen arvioimisen. Huomattava [ markkina-alue on itse asiassa kehittynyt transkriptioprofiloimista mahdollistavan 2 115139 teknologian ympärille. Transkriptioprofiileja käyttävät ei ainoastaan monen biotieteen perustutkimuksen monella saralla toimivat tiedemiehet vaan niitä käytetään myöskin teollisuuden tutkimuksessa ja tuotekehityksessä. Tunnettujen ja uusien lääkeaineiden vaikutukset ihmisten ja koe-eläinten geenien ilmentymiseen ovat nykyään farmaseuttiselle ja diagnostiselle teollisuudelle välttämätöntä tietoa, mutta sitä hyödyntävät myöskin monet muut biotekniikkateollisuuden sektorit.

Transkriptioprofiloinnissa oligomeeri-siruteknologia on tehokas työväline, joka on kuvattu esimerkiksi seuraavissa patenteissa US 6,040,138, US 5,556,752, US 5,770,722, US 5,807,522 tai patenttihakemuksessa WO 200003037. Patentissa US 6,040,138 kuvataan monien geenien ilmentymisen samanaikainen monitorointi, hybridisoimalla kohde-nukleiinihapot järjestetyn immobilisoitujen oligonukleotidikoettimien joukon kanssa. Patenteissa US 5,556,752 ja US 5,770,722 kuvataan nukleiinihapposekvenointimenetelmiä ja analyysimenetelmiä, joissa käytetään järjestettyjä nukleiinihappokirjastojoukkoja kiinteillä kantajilla ja hybridisaatioreaktioita sekä nukleaasi- tai ligaasireaktioita. Patenthakemuksessa WO 200003037 on kuvattu kohdepolynukleotidien seulonta niiden perinnöllisen funktion määrittämiseksi järjestetyssä joukossa. Patentissa US 5,807,522 on kuvattu monessa perinnöllisyystieteellisessä sovellutuksessa suuressa mittakaavassa tehtäviin hybridisaatiomäärityksiin soveltuvia määritettävien analyyttien alueista tehtyjä järjestetyttyjä mikrojoukkoja, mitkä sisältävät analyytille spesifisiä reagensseja.

Edellä kuvattujen mikrojoukkotekniikoiden yhteinen piirre on se, että koettimet, eli rea- i · * · ' ' gensseina käytettävät polynukleotidisekvenssit ovat immobilisoituja tai kytkettyjä kiinteään kantajaan. Koettimien immobilisointi toimii steerisenä esteenä ja estää hybridisointia

Ml tapahtumasta stökiometrisesti, mikä johtaa huonoon saantoon. Siten, edellä kuvatut : menetelmät ovat ainoastaan semikvantitatiivisia ja vaativat kaksinkertaista leimaamista ja •; · · · vertailevaa tarkistamista.

• · » t

Esimerkiksi epätarkat täplät johtavat riittämättömään resoluutioon, jolloin täplien vertaa-, , ; minen riittävällä tarkkuudella on mahdotonta. Vaikka tämä ei ole este edellämainitun tekniikan soveltamiselle, riittämättömästä resoluutiosta tulee ongelma kun kaivataan *;·* kvantitatiivisia tuloksia ja se selittää miksi varsinaisia kokeita on toistettava monta kertaa.

E' · Patenttihakemuksessa WO 98/51789 kuvataan käänteistranskriptiolla ja amplifikaatiolla ·;*: alaryhmiksi jaoteltujen lähetti-RNA:sta tehtyjen cDNA-kirjastojen valmistusta. Kirjastot ‘ . käytetään uusien geenien, proteiinien vuorovaikutusten, potentiaalisten lääkeaineiden .. . seulontaan ja/tai diagnoosin tekemiiseen. Tämä järjestelmä on riippuvainen PCR-teknii- • ·’ kasta ja erilaisista alukesarjoista. Mainittu järjestelmä lisää kvantitaatioon liittyviä ongel mia, vaikka se mahdollistaa pieninä määrinä läsnäolevien alassäädeltyjen sekvenssien 3 115139 tunnistamisen. Siten, vaikka tehokkaita välineitä keskeisten perinnöllisten peruselementtien biologisen roolin tutkimiseeen on olemassa, kvantitativisten tulosten saamisen ongelma on silti ratkaisematta. Lisäksi, aikaisemmat tekniikat eivät ole sovellettavissa karakterisoimattomien geenien vaikutusten monitoroimiseen.

Täten keksinnön päätarkoituksena on aikaansaada menetelmä ja testipakkaus, ei ainoastaan ekspressiokuvioiden tai transkriptioprofiilien kvantitoimiseksi ja niissä tapahtuvien vaihtelujen vertailevaan arvioimiseen, vaan myöskin aikaansaada erittäin herkkä testi, mikä mahdollistaa erittäin pienten, muuten detektiorajan alapuolelle jäävien analyyttipolynukleotidimäärien kvantitatiivisen arvioinnin. Tarkoituksena on aikaansaada todella kvantitatiivinen menetelmä ja testipakkaus, joissa tuloksena saadaan näytteessä oleva polynukleotidikopiomäärä ja jotka esimerkiksi mahdollistavat näytteessä olevan lähetti-RNA-kopioiden lukumäärän arvioimisen ja joita voidaan herkkyyden lisäämiseksi muunnella.

Keksinnön mukaisen menetelmän ja testipakkauksen etu on, että ne mahdollistavat transkriptioprofiilien tai ekspressiokuvioiden arvioinnin ei pelkästään karakterisoiduista vaan myöskin karakterisoimattomista genomeista.

Keksinnön lisäetuna on se, että analysoitavan analyytin, esimerkiksi polynukleotidival-misteen laatu ei ole ratkaiseva. RNA, jona yleensä tiedetään vaativan erikoiskäsittelyä johtuen sen epästabiilisuudesta, voidaan käyttää suoraan kvantitatiiviseen arviointiin.

Valmistaminen, joka ei vaadi immobilisointivaihetta yhdistettynä tiettyihin kaupallisesti . : saataviin reagensseihin tekee testipakkauksen helposti erikoistarpeisiin räätälöitäväksi : “': testiksi, jolloin huomio voidaan kohdistaa tietyssä eliössä olevien geenien alaryhmiin.

.··. Yhteenvetona todettakoon, että keksintö mahdollistaa eri ajankohtina, eri paikoista tai eri kohde-eliöistä otettujen näytteiden polynukleotidien muutosten ja variaatioiden . samanaikaisen vertailevan arvioinnin ja kvantitaation. Tämä on hyödyllistä erityisesti silloin, kun tutkitaan elintoimintoja ja samaan soluun tai kudokseen kohdistettuja • · •; · ‘ fysikaalisia ja kemiallisten ärsykkeitä.

I f I

;··· Keksinnön mukainen menetelmä ja testipakkaus ei pelkästään ole kvantitatiivinen, se voidaan myös tehdä erittäin herkäksi mahdollistamalla alassäädeltyjen .. , polynukleotidisekvenssien kvantitatiivien tunnistamisen. Esillä olevan keksinnön mukaisen • ’ menetelmän ja testipakkauksen karakteriset piirteet on määritetty patenttivaatimuksissa.

115139 4

Kuvio 1 esittää ilmaistavalla merkkiaineella varustetun tähdellä merkittyjä koettimia (P) sisältävän DNA-fragmenttikirjaston luomisen.

Kuvio 2A esittää ilmaistavalla merkkiaineella (tähti) varustetun koettimen (P) ja affiniteetti- eli biotiini-merkillä (B) varustetun yksisäikeisen RNA-analyyttisekvenssin välisen hybridisointitapahtuman ja hybridin (H) muodostumisen analyytin (A) ja koettimen (P) välillä.

Kuvio 2B esittää ilmaistavalla merkkiaineella (tähti) varustetun koettimen (P) ja affiniteetti- eli biotiinimerkillä (B) varustetun kaksisäikeisen polynukleotidin eli RNA-analyyttisekvenssin välisen hybridisaatiotapahtuman ja hybridien (H) muodostumisen analyyttien (A) ja koettimien (P) välillä.

Kuvio 3A kuvaa affiniteettimerkkiaineella (B) varustetun hybridin (H) sitoutumista kiin-teälle erotusapuvälineelle (SAT), joka on peitetty affiniteettimerkkiaineen (B) toisella osapuolella.

Kuvio 3B kuvaa affinitettimerkkiaineella (B) varustetun hybridin (H) sitoutumista kiinteälle erotusapuvälineelle (SAT), joka on peitetty affiniteettimerkkiaineen (B) toisella osapuolella. Affiniteettimerkkiaineella varustetun analyyttisekvenssin kanssa hybridoisoi-mattomat ilmaistavalla merkkiaineella varustetut koettimet eivät sitoudu. Erotusapuvälineet (SAT) sitovat sekä vapaata affiniteettimerkkiainetta että affiniteettimerkkiaineella varustettua analyyttia, johon koetinsekvenssi ei ole hybridisoitunut.

» •... · Kuvio 4 kuvaa ilmaistavalla merkkiaineella varustetun koettimen (P) eluointia erilleen kiinteältä erotusapuvälineeltä (SAT), jolloin affiniteettimerkkiaineella varustettu analyytti- ·;··: sekvenssi (A) jää erotusapuvälineelle (SAT) ja ilmaistavalla merkkiaineella varustettu :" ‘; koetin (P) joutuu liuokseen.

» · « ..,,: Kuvio 5 kuvaa koettimien PCR-synteesiä käyttäen alukkeita, joissa lisäksi on 16-meerin ... identtiset sekvenssit tai terminaaliset aluketunnistuskohdat (TPTs).

\: Kuvio 6 kuvaa terminaalisella alukkeella merkityn koetin ..... (TPT-P); affiniteettimerkkiaineella (B) varustetun analyytti (A)-hybridin sitoutumista erotusapuvälineelle (SAT). Terminaaliset alukkeet molemmissa koettimen (TPT-P) päissä on myös merkitty (Ps).

« ·

Kuvio 7 esittää miten suoritetaan eluoidun terminaalisella alukkeella merkityn koettimen 115139 5 (TPT-Ps) PCR-amplifikaatio käyttäen ilmaistavalla merkkiaineella varustettuja (tähti) alukkeita.

Kuvio 8 esittää tuloksia, jotka voidaan rekisteröidä elektroferogrammilta ja tietoja sisältävästä tiedostosta, joka on saatu keksintöä toteutettaessa esimerkin 1 mukaisesti.

Kuvio 8A esittää tuloksia, jotka on rekisteröity ulkoisella standardilla.

Kuvio 8B esittää tuloksia kaikista pASllMspEstä saaduista piikeistä.

Kuvio 8C esittää tuloksia, jotka on rekisteröity egl5:n lähetti-RNA:n selektiolla.

Kuvio 9 esittää tuloksia, jotka voidaan rekisteröidä elektroferogrammista ja tietoja sisältävästä tiedostosta, joka on saatu toteuttamalla keksinnön vertaileva prosessi esimerkin 2 mukaisesti.

Kuvio 9A esittää tuloksia, jotka saatiin käyttämällä indusoituja olosuhteita.

Kuvio 9B esittää tuloksia, jotka on saatu ei-indusoiduissa olosuhteissa.

Esillä olevassa keksinnössä käytettävillä määritteillä on se merkitys, joka niillä yleensä on . yhdistelmä-DNA tekniikassa ja nukleiinihappohybridisaatiotekniikassa. Joitakin määritteitä * < · · käytetään esillä olevassa keksinnössä kuitenkin laajemmassa merkityksessä ja jonkinverran

> I I

• ·· · poikkeavasti. Tämän vuoksi, jotkut määritteet on seuraavassa määritelty tarkemmin.

t I > • · •',,,ί Määrite "pooli" tarkoittaa liukoisten tai liukoisiksi saatettavien polynukleotidikoettimien *: *: alajoukkoa tai kirjastoa. Jokainen pooli käsittää valinnaisen määritellyn lukumäärän polynukleotidikoettimia. Tarkoituksenmukainen valinnainen lukumäärä on esimerkiksi noin 10 koetinta. Kuitenkin menetelmä voidaan toteuttaa niin harvalla kuin kahdella tai ,.,,: kolmella koettimella tai tarkoituksenmukaisesti viidellä tai useammalla koettimella jokaista poolia kohden. Testipakkaukset, joissa on satoja liukoisia koettimia käsittäviä pooleja voidaan valmistaa ja käyttää keksinnön mukaisessa kvantitatiivisessa tai vertailevassa menetelmässä. Vaikka olisi mahdollista valmistaa pooleja, jotka sisältävät tuhansia koet-timia, edullinen yläraja näyttää olevan noin 300 erilaista koetinta, jotta saataisiin tyydyt-tävä resoluutio. Eräässä esillä olevan keksinnön käytännön toteutusmuodossa, 100-300 . v hiivan DNA-fragmenttia, joista jokainen fragmentti edustaa tiettyä geeniä voidaan asettaa ’ ’ jokaiseen mikrotiitterilevyn kuoppaan. Tässä toteutusmuodossa hiivan 6300 geeniä voidaan asettaa ja tutkia yhdellä ainoalla mikrotiitterilevyllä, jolla edelleen on tilaa tietylle määrälle 115139 6 kontrolleja. Hybrideinä sitoutuvat DNA-koettimet identifioidaan osittain poolin tai mikrotiitterikuopan avulla ja osittain koon perusteella.

Kuten edellä on sanottu "liukoisille tai liukoiseen muotoon saatettaville koettimille" on ominaista niiden selvästi erotettavissa oleva koko, mikä mahdollistaa niiden täsmällisen tunnistamisen rekisteröitäessä tuloksia automaattisilla tai semiautomaattisilla keinoilla tai mittausvälineillä. Liukoisten koettimien koot voivat vaihdella noin 16 emäsparista moneen tuhanteen nukleotidiin. Koettimet on konstruoitu fraktioimalla valittuja polynukleotidisekvenssejä restriktioentsyymeillä. Tarkoituksenmukainen tapa valmistaa koettimia on sisällyttää polynukleotidisekvenssi plasmidiin ja monistaa mainittu plasmidi ja tämän jälkeen fragmentoida mainittu plasmidi insertteineen.

"Liukoiset koettimet" pooleja varten voidaan valmistaa karakterisoidusta, osittain karakterisoidusta tai täysin karakterisoimattomasta polynukleotidisekvenssikirjastosta, esimerkiksi sen kohdeorganismin genomista saaduista DNA-fragmenteista, jonka transkrip-tioprofiili on tarkoitus määrittää. Vaihtoehdossa, jossa käytetään hyvin karakterisoitua genomia koettimet järjestetään edullisesti pooleihin siten, että kaikilla koetinmolekyyleillä on selvästi erotettavissa oleva ja karakteristinen koko, joka mahdollistaa niiden tunnistamisen. Osittain karakterisoitujen genomien poolit konstruoidaan myöskin siten, että ne sisältävät tietyn lukumäärän nukleiinihappofragmentteja, joilla on selvästi erotettavissa olevat koot. Huomioitavaa on kuitenkin se, että koska nukleotidifragmentteja ei ole karakterisoitu, jotkut eri restriktioentsyymeillä saadut nukleotidifragmentit voivat sattumalta olla samankokoisia. Tämä tarkoittaa sitä, että koettimet ovat vain osittain tunnistettavissa koonsa perusteella. Kun testi toistetaan, tämä päällekkäisyys ilmenee ja •... · sellaiset koettimet, joita ei voida ilmaista ja sellaiset koettimet, joita ei voida tunnistaa 100 %:11a varmuudella voidaan poistaa ja korvata muilla tarkoituksenmukaisemmilla ’: · *: koettimilla. Myös täysin karakterisoimattomilla genomeilla voidaan kerätä paljon tietoa ja lyhyessä ajassa ainakin ne osat genomista, jotka on käytetty liukoisten järjestettyjen poolien valmistamiseksi tulevat hyvin karakterisoiduiksi.

• "Liukoinen järjestetty pooli" joka sisältää "liukoisia tai liukoiseen muotoon saatettavissa olevia polynukleotidikoettimia" voidaan sisällyttää minkälaiseen tahansa astiaan, joka voi :.‘ i olla täysin erillinen, vapaasti kiinnnitetty tai kiinteästi sidottu. Yksinkertaisimmassa ’: ’ ’ · muodossaan järjestetty pooli käsittää yhden tai useamman astian, esimerkiksi koeputken tai pullon, jotka voidaan yhdistää vapaasti esimerkiksi koeputkitelineeseen. Eräs käytännön .. . esimerkki, jossa järjestetyt poolit on asetettu astioihin, jotka on kytketty yhteen kiinteällä ’ ' tavalla aikaansaadaan mikrotiitterilevyn lokeroilla tai kuopilla. Kuten edellä on sanottu liukoiset poolit on edullisesti asetettu järjestetyllä tavalla esimerkiksi mikrotiitterilevyjen 115139 7 lokeroihin tai kuoppiin. Liukoiset poolit on järjestetty sellaisella tavalla, että jokainen pooli ja jokainen erilainen polynukleotidikoetin mainitussa poolissa on selvästi erotettavalla tavalla tunnistettavissa kokonsa perusteella. Mikrotiitterilevyt, lokeroineen tai kuoppineen ovat tyypillisiä, kaupallisesti saatavia toteutusmuotoja, jotka mahdollistavat poolien järjestämisen ja monen järjestetyn poolin samanaikaisen käsittelyn. Luonnollisesti, muita räätälöityjä, tarkoituksenmukaisia järjestettyjä pooleja, joissa on monia lokeroita voidaan kehittää ja konstruoida ja varustaa asianmukaisin merkein ja käyttöohjein.

"Koettimet" tai "koetinpoolit" tarkoittavat liukoisten polynukleotidisekvenssien eli DNA-fragmenttien ryhmää, jotka edullisesti ovat saatavissa kohdeorganismien genomisista DNA-sekvensseistä, mitkä sekvenssit voivat olla karakterisoituja, osittain karakterisoituja tai karakterisoimattomia. Koetin voi esimerkiksi olla cDNA:a, joka on kopioitu karakterisoidusta, osittain karakterisoidusta tai karakterisoimattomasta lähetti-RNA:sta. Koettimet voidaan myös syntetisoida oligomeereistä, jotka on valmistettu käyttäen luonnon DNA:ta mallina. Vaihtoehtoisesti DNA-koettimia, joilla on sattumanvaraiset sekvenssit voidaan valmistaa ja käyttää spesifisten ekspressiokuvioiden tutkimiseen. Luonnollisesti, jos ryhmä oligonukleotidikoettimia on valmistettu synteettisesti, on myös tarkoituksenmukaista valmistaa muunneltuja polynukleotidikoettimia, jolloin nukleotidi-sekvenssien sokerifosfaattirunko voidaan korvata peptideillä tai niin kutsutuilla suljetuilla (locked) nukleosidianalogeilla. Muunneltuja polynukleotideja ovat esimerkiksi peptidinukleiinihapot (PN A), jotka on kuvattu esimerkiksi patenttijulkaisussa WO 96/20212 tai suljetut nukleiinihapot (LNA), jotka on kuvattu esimerkiksi patenttijulkaisussa WO 99/14226. Mainittuja muunneltuja polynukleotidikoettimet voidaan '!!! tarkoituksenmukaisesti soveltaa keksinnön mukaisessa menetelmässä ja testipakkauksessa.

;;; Ne voidaan kopioida käyttämällä genomista DNA:ta tai cDNA:ta mallina, usein niillä on *···' paremmat ominaisuudet, kuten parempi stabiilisuus ja niiden etuna voi lisäksi olla se, että ’ ' ne voidaan helpommin kuin luonnolliset DNA-koettimet varustaa havainnollistamisen :...: mahdollistavilla merkkiaineilla.

·:·: Esillä olevan keksinnön välttämätön edellytys on se, että liukoisissa pooleissa olevilla koettimilla on selvästi erotettavissa olevat koot, jotka mahdollistavat koettimien rekiste-, röinnin ja mittaamisen massaspektrometrillä ja että ne voidaan valinnaisesti varustaa ' ; tunnistuskohdalla, joka joko on koettimen ilmaisemisen tai rekisteröinnin mahdollistava merkkiaineen sitomiskohta tai vaihtoehtoisesti koettimen monistamisen mahdollistava •; · · alukekohta. Keksinnön perussovellutusmuodossa tunnistuskohta on ilmaisemisen mahdol- listava kohta eli ilmaistavan tai rekisteröitävän merkkiaineen tai leiman kiinnityskohta. On huomattava, että kohta, johon merkkiaine voidaan kiinnittää on koettimen toisessa päässä, jotta merkkiaineella varustetun koettimen ja analyytin välinen hybridisaatioreaktio ei 8 1 15139 estyisi. Toisin sanoen koetin on edullisesti vain toisesta päästään varustettu merkkiaineen mahdollistavalla tunnistuskohdalla.

Keksinnön kehittyneemmässä sovellutusmuodossa, joka ei pelkästään mahdollista kvantitatiivista arviointia vaan jolla myöskin aikaansaadaaan huomattavasti herkempi testi, kiinnättämisen mahdollistava tunnistinkohta käsittää "terminaalisen alukesekvenssiparin". Nämä koettimien 3'- ja 5'-terminaalisiin päihin sijoitetut alukekohdat mahdollistavat koettimien amplifioinnin sen jälkeen kun affiniteettimerkillä varustettujen analyyttien kanssa hybridisoituneet koettimet on kvantitatiivisesti otettu talteen. Tässä sovellusmuodossa koettimet varustetaan merkkiainetunnisteella amplifioinnin aikana tai sen jälkeen.

Määrite "kohta joka mahdollistaa havainnollistamisen" tarkoittaa leimaa tai merkkiainetta, joka on näkyvä tai ilmaistavissa eli rekisteröitävissä sellaisenaan tai voidaan tehdä havainnollistettavaksi tai rekisteröitäväksi kun se saatetaan yhteen muiden reagenssien kanssa. Tunnistuskohdat, jotka mahdollistavat havainnollistamisen eli sellaiset leimat tai merkkiaineet, jotka voidaan rekisteröidä elektrokemiallisten tai magneettisten ominaisuuksien perusteella, fluoresenssin, luminesenssin, infrapuna-absorption, radioaktiivisuuden tai entsymaattisten reaktioden perusteella, ovat erityisen sopivia, mutta mitkä tahansa havainnollistamisen mahdollistavat tunnistuskohdat, jotka ovat helposti rekisteröitävissä automaattisin keinoin tai välinein voidaan käyttää. Täten massaspektrometriä .· ; käytettäessä koettimia ei tarvitse varustaa ilmaistavalla merkkiaineella, koska koettimet .;. ovat tunnistettavissa ja erotettavissa kokonsa puolesta.

Edulliset havainnollistamisen mahdollistavat tunnistuskohdat ovat erityisesti sellaisia fluo-rokromeja tai fluoroforeja, jotka emittoivat eri aallonpituuksilla. Mainitut fluoresoivat leimat voivat esimerkiksi olla tiolireaktiivisia fluoresoivia värejä, kuten 5-(2-((jodiasety-yli)amino)etyyli)aminonaftyleeni-l-sulfonihappo) (1,5-IEDANS) tai fluoreskeiini, Bodipy, FTC, Texas-punainen, fykoerytriini, rodamiini, karboksitetrametyylirodamiini, DAP1, indopyraaniväri, Kaskadi-sininen, Oreon-vihreä, eosiini, erytrosiini, pyridyylioksatsoli, bentsoksadiatsoli, aminonaftaleeni, pyreeni, maleimidi, kumariini, MBD, ·] . Lucifer-keltainen, propiidiumjodidi, porfyriini, CY3, CY5, CY9, lantaniidikryptaatti, lantanidikelaatti tai näiden havainnoinnin mahdollistavien aineiden johdannaiset tai analogit. Fluoresoivat polynukleotidikoettimet ovat erityisen hyödyllisiä automaattisessa tai osittain automatisoitavissa olevassa tulosten rekisteröinnissä yhdistettyinä läpivirtauksella : ‘ · ’: toimiviin mittausvälineisiin.

Määrite "analyytti" tarkoittaa polynukleotidisekvenssiä, erityisesti lähetti-RNA:a, jota 115139 9 tiettynä ajankohtana on läsnä tutkimus- ja tarkistuskohteena olevassa solu- tai kudosnäytteessä. Valmiste, joka sisältää analyyttipolynukleotidinäytettä muunnellaan siten, että siihen sisältyy sopiva affiniteettimerkkiaine.

Määrite "affiniteettimerkkiaineella varustettu kohta" tarkoittaa sitä, että analyyttipolynukleotidit on varustettu leimalla tai merkkiaineella, jolla on suuri affiniteetti toiseen aineeseen. Toisin sanoen, sillä on taipumus muodostaa vahvoja siteitä toiseen yhdisteeseen, joka siten on affiniteettileiman toinen osapuoli tai affiniteettipari. Siten vahvat siteet muodostuvat niin kutsuttujen affiniteettiparien välille, mikä mahdollistaa affiniteettiparin toimimisen haluttujen yhdisteiden sitomiskeinona. Hyödyllinen affiniteettipari on esimerkiksi biotiini-avidiini tai biotiini-streptavidiini, mutta muita synteettisiä tai ei-synteettisiä "affiniteettipareja" tai sitovia yhdisteitä voidaan myös soveltaa. Sopivia "affiniteettipareja" voidaan löytää esimerkiksi reseptoreiden ja ligandien, antigeenien ja vasta-aineiden sekä näiden fragmenttien joukosta. Edullisiin keksinnön mukaisiin "affiniteettimerkkiaineisiin" sisältyvät biotiini, histidiinioligomeerit, hapteenit, glykaanit, jne. Edulliset affiniteettimerkkiaineita vastaavat osapuolet ovat avidiini, streptavidiini, metallikelaatit, vasta-aineet, lektiinit, jne.

Edullisesti analyyttipolynukleotidit varustetaan affiniteettimerkkiaineella käyttäen kemiallista reaktiota, jossa esimerkiksi biotiinijäänteet sidotaan kovalenttisesti tutkittaviin poly-nukleotideihin tai nukleiinihappomolekyyleihin, minkä tuloksena saadaan muunneltu polynukleotidianalyytti eli biotinyloitu polynukleotidianalyytti. Jotta steeriset esteet eivät häiritsisi havainnollistamisen mahdollistavalla merkkiaineella varustetun koettimen ja ·· ; polynukleotidianalyytin välistä hybridisaattioreaktiota, polynukleotidianalyytit varustetaan affiniteettiparin pienemmällä osapuolella, kun taas suurempi osapuoli sidotaan kiinteään kantajaan tai erotusapu välineeseen. Transkriptioprofilointiin liittyvien tutkimusten *: * ’ i mahdollistamiseksi affiniteettimerkkiaineella varustettu analyttipolynukleotidisekvenssi on tyypillisesti lähetti-RNA-valmiste. Affiniteettimerkkiaine ja sitä vastaava toinen osapuoli tai sen pari muodostavat niin kutsutun affiniteettiparin, joka mahdollistaa , affiniteettimerkkiaineella varustetun yhdisteen sitomisen kiinteälle kantajalle, joka tässä ,. - · t tapauksessa on niin kutsuttu erotusapuväline.

4 f i ·,'· * Määrite "erotusapuväline" tarkoittaa mieluiten sellaisia kiinteitä kantajia kuin mikrohelmet, lateksipartikkelit, magneettipartikkelit, langat, tapit, tikut, mikrokuopat, affiniteettipylväät, jotka on varustettu tai peitetty affiniteettiparin toisella osapuolella tai

t I

;Vi "affiniteettimerkkiaineella". Valinnaisesti, erotusapuväline voi sisältää esimerkiksi ‘ 1 faasierotus- tai elektroforeesikeinoja, jotka ovat riippuvaisia affiniteettimerkkiaineita vastaavan toisen osapuolen läsnäolosta.

115139 ίο Määrite "kohdeorganismi" tarkoittaa yksisoluista tai monisoluista organismia, jolla on karakterisoitu, osittain karakterisoitu tai karakterisoimaton genomi, jonka transkriptioprofiili tai ekspressiokuvio on tarkoitus määrittää. Yksisoluiset organismit käsittävät mikroorganismeja kuten bakteerit, esimerkiksi Escherichia coli, hiivat, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae tai rihmasienet. Kohdeorganismi voi luonnollisesti olla minkä tahansa kasvin tai eläimen solu- tai kudosnäyte, mukaanlukien ihmisen; E. coli:n, S. cerevisiae:n ja ihmisen genomit ovat esimerkkejä genomeista, jotka tällä hetkellä ovat lähes täydellisesti karakterisoidut.

Keksintö kohdistuu menetelmään solu- ja kudosnäytteissä olevien erilaisten polynukleotidien lukumäärän vaihteluiden arvioimiseksi kvantitatiivisesti ja/tai vertailevasti ja niiden määrissä sisäisistä syistä tai ulkoisista ärsykkeistä tapahtuvien vaihtelujen kvantitointimiseksi ja arvioimiseksi, mitkä vaihtelut johtuvat sisäisistä syistä tai ovat ulkoisista ärsykkeistä johtuvia. Keksinnön mukaisen menetelmän perussovellutusmuodossa hybridisaatioreaktion annetaan tapahtua liuoksessa ja muodostunut hybridi sidotaan kiinteälle kantajalle, joka on varustettu tai peitetty affiniteettimerkkiainetta vastaavalla toisella osapuolella tai affiniteettiparilla. Peittäminen aikaansaadaan kemiallisin keinoin, konjugoimalla tai joskus erotusapuvälineen pintojen ja affiniteettimerkkiainetta vastaavan toisen osapuolen välisellä affiniteetillä, joka riittää stabiilin sidoksen aikaansaamiseksi. Edullisesti toisesta päästään havainnollistamisen ..,; mahdollistavalla kohdalla varustettu polynukleotidikoetin, joka on peräisin aikaisemmin t; karakterisoidusta, osittain karakterisoidusta tai karakterisoimattomasta poolista (kirjastosta) ’!!! saatetaan kosketukseen affiniteetti-merkkiaineella varustetun analysoitavasta näytteestä ;;; saadun polynukleotidisekvenssin eli analyytin kanssa.

< · * ' ‘ Yksi tai useampi pooli, jossa on ennestään määrätty, valinnainen edullisesti 10-300 välillä ·...· vaihteleva lukumäärä liukoisia polynukleotidisekvenssejä niin kutsuttuja liukoisia koettimia, joilla on selvästi erotettavissa olevat koot, jotka mahdollistavat niiden •: · *: rekisteröinnin massa-spektrometrillä, voidaan valinnaisesti varustaa tunnistuskohdalla, joka keksinnön perussovellutusmuodossa on ilmaistava tai rekisteröitävä merkkiaine ja . keksinnön kehittyneemmässä, herkemmän arvioinnin mahdollistavassa suoritusmuodossa ‘ ; terminaalinen aluketunnistuskohta. Liukoiset poolit on asetettu järjestetysti omiin astioihinsa, jotka voivat olla erillisiä, löyhästi kytkettyjä ja/tai irrotettavia. Järjestetyt ·:··: poolit voidaan myös asettaa kiinteään rakennelmaan, jossa astiat ovat enemmän tai • ’ · ‘; vähemmän kiinteästi yhteenliitettyjä kuten mikrotiitterilevyllä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä liukoisia polynukleotidisekvenssejä sisältävät poolit 115139 11 ovat saatavissa karakterisoiduista, osittain karakterisoiduista tai karakterisoimattomista genomeista. Yleensä yksi koetin jokaisen karakterisoidun genomin geeniä kohden, riittää määrittämään sen ilmentymisen. Pooli valmistetaan yleensä fragmentoimalla restriktioentsyymillä genominen insertti, joka on viety plasmidiin monistamisen helpottamiseksi. Koska keksinnön tarkoitus on usemman kuin yhden geenin ilmentymisen samanaikainen arviointi, jokainen pooli yleensä sisältää usemman kuin yhden, edullisesti vähintään 10 koetinta.

Jos analyyttipolynukleotidit ovat esimerkiksi karakterisoimattoman genomin ilmentymis-tuotteita käytetään yleensä yhtä tai useampaa edullisesti limittäistä koetinta, jotka edustavat karakterisoimattoman genomin jokaista geeniä. Tämä tarkoittaa sitä, että osittain karakterisoidusta tai karakterisoimattomasta genomista tehty järjestetty pooli valmistetaan edullisesti useammasta kuin yhdestä plasmidista, edullisesti ainakin kahdesta plasmidista. Plasmidin genomiset insertit voivat olla täysin erilaiset, mutta niillä tulisi edullisesti olla ainakin joitakin osittain limittäisiä sekvenssejä. Jos plasmidit sisältävät saman sekvenssin, niiden fragmentoitiin käytetään eri restriktioentsyymejä. Tällaisessakin tapauksessa saadaan osittain limittäisiä koettimia kahdesta muuten identtisestä plasmidista.

Karakterisoimattomien genomien ollessa tutkimuksen kohteena eikä kaupallisia testipakkauksia ole saatavissa, on suositeltavaa, että kerralla valmistetaan suuri määrä identtisiä järjestettyjä pooleja, jotta työlään preparatiivisen vaiheen toistaminen ei olisi tarpeen ja voitaisiin keskittyä analyyttiseen vaiheeseen. Tämä on myös perustana < · I · * * kaupallisten osittain tai täysin karakterisoimattomien testipakkausten valmistamisessa.

·...· Keksinnön perustana olevassa suoritusmuodossa ilmaistavalla tunnistuskohdalla tai aluke- kohdalla varustetut DNA-koettimet annetaan hybridisoitua analysoitavaksi tarkoitetun *:··· RNA-valmisteen kanssa. Se solu- tai kudosnäytteessä oleva analyyttipolynukleotidisek- venssi tai RNA-analyytti, mikä on tarkoitus määrittää, eristetään sinänsä tunnetuin menetelmin. Yleensä solu- tai kudosnäytteestä saadut määritettävät analyyttipolynukleotidit ovat tii>; lähetti-RNA:ta. Mainitut analyytit varustetaan vähintään yhdellä affiniteettimerkkiaineella, • » kuten biotiinilla, histidiinioligomeerillä, hapteenilla tai glykaanilla. RNA on edullisesti '; ‘ leimattu biotiinilla.

* · Näiden reagenssivalmistusvaiheiden jälkeen annetaan koettimien ja analyyttien välisen hy-bridisaatioreaktion tapahtua. Tämän seurauksena muodostuu molekyylitasolla .. , kvantitatiivisesti liukoinen ilmaistavalla merkkiaineella varustettu koetin: affiniteettimerkki- • ·" aineella varustettu analyytti-hybridi liukoisen ilmaistavalla merkkiaineella varustetun koettimen ja affiniteettimerkkiaineella varaustetun analyytin välillä. Koska pooleissa oleva 115139 12 koettimien lukumäärä on tunnettu, ja koska koettimia on ylimäärin analyytteihin verrattuna on selvä, että analyyttien ja koettimien välinen hybridisaatioreaktio on stökiometrinen ja talteenotettu koettimien lukumäärä vastaa täsmälleen näytteessä olevan analyyttipolynukleotidin määrää. Luonnollisesti, analyyttisekvenssin ei tarvitse olla ilmennetty lähetti-RNA-sekvenssi. On mahdollista kvantitoida mikä tahansa yksi- tai kaksi-säikeinen (denaturointivaiheen jälkeen) analyyttisekvenssi keksinnön mukaisella menetelmällä.

Liuoshybridisaatiolla muodostuu DNA.RNA-hybridejä. Tämän jälkeen, RNA-molekyylit, jotka on varustettu affiniteettimerkkiaineella, edullisesti biotiinilla, kerätään käyttäen hyväksi niiden affiniteettiä affiniteettipariinsa, avidiiniin tai streptavidiiniin. Ainoastaan DNA:affiniteettimerkkiaineella varustetussa RNA-hybridissä oleva DNA-koetin voidaan kerätä affiniteettimerkkiaineen, avidiinin avulla erotusapuvälineelle, muut DNA-koettimet jäävät liuokseen. Kerätyt hybridit voidaan pestä vapaaksi kaikista muista DNA-tuotteista eli koettimista, jotka eivät ole onnistuneet hybridoitumaan affiniteettimerkkiaineella varustetun analyyttisekvenssin kanssa, koska vastaava DNA ei ole läsnä. Talteenotettu DNA, mikä tämän jälkeen voidaan erottaa RNA:sta voidaan valinnaisesti varustaa ilmaistavalla merkkiaineella amplifikaation aikana tai sen jälkeen. Ylimäärä affiniteettimerkkiainetta ja affiniteettimerkkiaineella varustetut analyyttisekvenssit, jotka eivät ole onnistuneet hybridisoitumaan, koska niitä vastaavaa koetinta ei ollut läsnä poolissa, sitoutuvat luonnollisesti kiinteälle erotusapuvälineelle, mutta ne voidaan erottaa ;·) hybridistä, joka on muodostunut ilmaistavalla merkkiaineella varustetun koettimen ja affiniteettimerkkiaineella varustetun analyytin välillä, eluoinnin ja sitä seuraavan ’ · · ·, erotusprosessin aikana.

Yleensä, liuoshybridisaatio tapahtuu hybridien muodostumista edistävissä olosuhteissa.

[ ' Käytetystä reagenssikoettimien ja analyyttien koostumuksesta riippuen hybridit ovat DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA, PNA:DNA, PNA.RNA-hybridejä. Edullisimmat olosuhteet voivat vaihdella riippuen reaktioon osallistuvista analyyteistä ja reagensseistä. Tämän jälkeen, ne hybridit, jotka kantavat affiniteettimerkkiainetta eristetään sitomalla ’]: ne erotusapuvälineeseen käyttämällä affiniteettimerkkiainetta vastaavaa osapuolta eli : affiniteettiparia. Erotusapuvälineellä olevat hybridit otetaan talteen ja erotetaan ! hybridisaatioliuoksesta ja pestään valinnaisesti. Koetinmolekyylit, jotka eivät ole , muodostaneet hybridejä affiniteettimerkkiaineella varustetun analyytin kanssa jäävät joko hybridisaatio- tai pesuliouoksiin.

Siten ainostaan ne koettimet, jotka ovat onnistuneet hybridisoitumaan solu- tai kudosnäytteessä olleen analyyttipolynukleotidin kanssa eli ne koettimet, joilla on vastinsäikeen 115139 13 omaava analyytti näytteessä, sitoutuvat erotusapuvälineeseen ja otetaan talteen ja voidaan kerätä. Luonnollisesti, sellaiset affiniteettimerkkiaineella varustetut analyytit, joilla ei ole vastinsäiettä koettimien joukossa sitoutuvat erotusapuvälineeseen, mutta ne eivät häiritse hybridisaatioprosessin stökiometriaa ja niitä ei oteta talteen tai ne voidaan tuhota tai poistaa, kun koetin otetaan talteen. Tämä tarkoittaa sitä, että ainoastaan automaattisesti tai osittain automatisoitavissa olevalla tavalla ilmaistavat tai rekisteröitävät ilmaistavalla merkkiaineella varustetut koettimet, jotka voidaan tunnistaa niiden selvästi erotettavien kokojen perusteella tulevat sidotuiksi.

Jokainen ilmaistavalla merkkiaineella tai alukkeella varustettu DNA-koetin, joka voidaan kerätä tai sitoa erotusapuvälineen avulla sisältyy kompleksiin tai hybridiin, joka sisältää affiniteettimerkkiaineella vaustetun RNA-analyyttisäikeen ja ilmaistavalla merkkiaineella tai alukkeella valinnaisesti varustetun DNA- tai reagenssikoetinsäikeen. Valinnaisesti erotusapuvälineet tarvitaan keksinnön mukaisessa menetelmässä, jotta voitaisiin ottaa talteen ne hybridit, jotka muodostuvat ilmaistavalla merkkiaineella varustetun koettimen ja affiniteettimerkkiaineella varustetun analyytin välille. Erotusapuvälineet, jotka ovat kiinteitä kantajia, kuten mikropartikkeleita, mikrohelmiä, lateksipartikkeleita, magneettipar-tikkeleita, lankoja, tappeja, tikkuja, mikrokuoppia tai affiniteettipylväitä on varustettu tai peitetty affineteettimerkkiainetta vastaavalla osapuolella/puolilla tai affiniteettiparilla/pareilla). Mainitut vastineet tai affiniteettiparit ovat esimerkiksi avidiini, streptavidiini, metallikelaatit, vasta-aineet tai lektiinit. Erotusapuväline voi sisältää affiniteettimerkkiaineen sitomiskeinoja faasierottelun tai elektroforeesin avulla.

Tämän jälkeen, hybridit ensin eluoidaan erotusapuvälineeltä ja hybridin väliset sidokset ; katkotaan ja merkkiaineella varustetut koettimet, jotka ovat hybridisoituneet Y analyyttipolynukleotidien eli lähetti-RNA:n kanssa ja siten ovat sitoutuneet ’ ·; * *; erotusapuvälineelle kerätään ja otetaan talteen. Koska jokainen eristetty koetin edustaa yhtä ilmentynyttä lähetti-RNA:ta, ilmentyminen voidaan kvantitoida molekyylitasolla. Vaihtoehtoisesti hybridien sidokset voidaan ensin katkaista, minkä jälkeen kiinteä kantaja : t · t ja analyytin kanssa hybridoisoituneita koettimia sisältävä liuos kerätään ja mitataan kuten

* > I

* * ‘* on edellä kuvattu. Puhdistetut ja erotetut koettimet eromsapuvälineellä eluoidaan *;1 liuoksella, joka kykenee katkomaan polynukleotidisäikeiden väliset sidokset.

» » * » » t · Y’: Jos tunnistuskohta on ilmaistavissa oleva merkkiaine, esimerkiksi fluoresoiva yhdiste, DNA-koetin voidaan rekisteröidä suoraan kun se on erotettu RNArsta, jolla yksin ei ole » 'it’. mitään ilmaistavia merkkiaineita. Ilmaistavalla merkkiaineella varustetut reagenssikoet- > t timet ovat tämän jälkeen läsnä eristettyinä ja vapaassa muodossa ja niiden lukumäärä vastaa tarkasti niiden kanssa edellisessä vaiheessa hybridisoituneiden analyyttinukleiini-happojen määrää.

14 115139

Jos tunnistuskohta on terminaalinen alukepari, koetin voidaan amplifioida sen jälkeen kun se on erotettu RNA:sta ja se voidaan varustaa ilmaistavalla merkkiaineella joko amplifioin-nin aikana tai sen jälkeen. Esimerkiksi valinnaisen amplifiointisyklimäärän jälkeen DNA-koetin voidaan varustaa ilmaistavalla merkkiaineella ja rekisteröidä. Tämä mahdollistaa ilmentymisen rekisteröimisen niin pieninä määrinä, että ne ovat alle muiden menetelmien detektiorajan. Tässä kehittyneemmessä keksinnön sovellutusmuodossa, joka mahdollistaa herkemmän analyyttipolynukleotidien arvioinnin, koettimien tunnistuskohdat ovat terminaalisia alukesekvenssejä. Terminaalisilla alukkeilla varustettujen koettimien annetaan hybridisoitua affiniteettimerkkiaineella varustettujen analyyttipolynukleotidien kanssa samalla tavalla kuin keksinnön perussovellutusmuodossa. Stökiometrisen hybridi-saatioreaktion jälkeen, hybridit sidotaan erotusapuvälineelle ja alukemerkkiaineilla varustetut koettimet otetaan talteen sinänsä tunnetuin menetelmin. Talteenotettujen koettimien määrä, joka vastaa täsmälleen näytteessä olleiden analyyttipolynukleotidien määrää, voidaan amplifioida sinänsä tunnetuilla PCR-tekniikoilla niin monta kertaa kuin halutaan. Tämän jälkeen tai amplifioinnin aikana, koettimet varustetaan ilmaistavilla merkkiaineilla ja koettimien määrä ja koko rekisteröidään. Koska alukemerkkiaineella varustetun koettimen talteenotto on kvantitatiivista ja vastaa täsmälleen analyyttimolekyylien lukumäärää ja tiedetään kuinka monta kertaa koettimet amplifioitiin (toisinnettiin eli kopioitiin) on helppo laskea analyytin määrä alkuperäisessä näytteessä. Tämä mahdollistaa sellaistenkin analyyttipolynukleotidien kvantitatiivisen arvioinnin, mitkä ilman amplifiointia olisivat detektiorajan alapuolella ja siten eivät rekisteröitävissä.

*···' Siten keksinnön mukaisen menetelmän herkkyyttä voidaan suuresti lisätä. Tämä on suuri etu, jos tarvitaan erittäin herkkää testiä silloin kun esimerkiksi kliininen näyte sisältää vain • » * :... · muutaman solun histologisesta kudosnäytteestä tai kudoksen biopsiasta.

Siten, affiniteetilla valittu koetinprofiili voidaan arvioida herkällä automaattisella kvantitatiivisella ilmaistavan merkkiaineen rekisteröinnillä sen jälkeen kun koettimet on erotettu toisistaan niiden koon perusteella, esimerkiksi kapillaari- tai geelielektroforeesilla. Tietyn . · · · ( kokoinen koetin tietystä poolista vastaa spesifistä analyyttimolekyyliä ja siten transkrip- tioprofiili voidaan päätellä.

• · t

Komparatiivisen kvantitatiivisen arvioinnin suorittamiseksi eri solu- tai kudosnäyttessä .,.,: olevien polynukleotidien määrän vaihteluista, sisäisten kontrollimekanismien tai ulkoisten ^ ärsykkeiden, mukaanlukien lääkkeiden, sairaustilojen, jne. vaikutuksesta, tarvitaan vähintään kaksi järjestettyä poolia. Jokainen pooli sisältää samanlaiset polynukleotidikoet- 115139 15 timet, mutta jokainen pooli on esimerkiksi omalla mikrotiitterilevyllään, joista jokainen on varustettu omalla ilmaistavalla merkkiaineella. Ilmaistavien mekkiaineiden tulisi edullisesti olla toisistaan erotettavia, esimerkiksi fluoroforeja, joilla on erilaiset emissioaallonpituudet. Edullisessa sovellutusmuodossa liukoiset poolit on tehty mikrotiitterilevylle. Jokainen mikrotiitterilevy on muuten identtinen, mutta jokaisella mikrotiitterilevyllä, joita voi olla kaksi tai useampia, on niiden omat spesifisen ilmaistavat merkkiaineet, jotka edullisesti emittoivat eri erotettavissa olevilla emissioaallonpituuksilla.

Seuraava kaavio menetelmän vaiheista kuvaa miten esillä oleva keksintö suoritetaan:

Preparatiiviset vaiheet

Vaihe 1 Jäjestettyjen poolien valmistus liukoisista DNA-koettimista, joilla on selkeästi erotettavissa olevat koot.

Tapaus 1 - tunnettu genomi (hiiva tai ihminen) DNA-fragmentit valitaan niin, että ne edustavat yksittäisiä geenejä ja niiden koot valitaan siten, että se mahdollista hyvän resoluution kokoon perustuvassa fraktiointi- ja rekisteröintivaiheessa.

, . Tapaus 2 - tuntematon genomi (lihmasiem-Trichoderma reesei)

Joukko edustavia noin 50 kb:n kokoisia klooneja katkaistaan sopivilla restriktioendonuk-leaaseilla, jotka tunnistavat neljän emäksen restriktioendonukleaasikohtia, jotta aikaansaataisiin joukko selvästi erotettavissa olevia fragmentteja. Tässä tapauksessa DNA- % * *·*' fragmentti voi kattaa kaksi geeniä eli koostua kahdesta geenistä ja siten myös hybridisoitua kahden analyytti-RNA:n kanssa. On mahdollista käyttää monta fragmenttia yhtä geeniä kohden. Vaihtoehtoisesti, joissakin tapauksissa voidaan käyttää eri fragmentteja, joilla on \ samat koot. Genomin kattamiseksi kokonaisuudessaan tarvitaan ylimäärä fragmentteja eli t · ‘ ; tarvitaan satoja liukoisia DNA-pooleja.

t

Vaihe 2 - DNA-koettimien leimaaminen havainnollistamisen mahdollistavalla merkkiaineella tai fluoroforilla

Edullisesti valmistetaan kaksi (tai useampi) erotettavissa olevilla väreillä varustettuja DNA-erää. Tämä mahdollistaa ekspressiokuvioiden tai transkriptioprofiilien sisäisten 16 11 5139 mekanismien, esimerkiksi sairauteen liittyvien vaiheiden tai ulkoisten ärsykkeiden kuten lääkkeiden vaikutuksesta tapahtuvien vaihteluiden vertaavan tutkimisen.

Vaiheet 1 ja 2 ovat preparatiivisia ja ovat kaupallisesti arvokkaiden testipakkausten perusta. DNA-pooleja voidaan tehdä isoina määrinä suurta koemäärää varten. Siten ei ole tarpeellista toistaa tätä melkoisen vaivalloista vaihetta.

Analyyttiset vaiheet

Vaihe 1 - Yksisäikeisen polynukleotidianalyytin valmistaminen DNA:n eristäminen soluista tapahtuu tarkoituksenmukaisissa kokeellisissa olosuhteissa käyttäen sinänsä tunnettuja menetelmiä (Sambrook, J. et ai., Molecular cloning - A laboratory Manual, Second Edition (1989).

Jos polynukleotidianalyytti on kaksisäikeinen, se on denaturoitava, jotta aikaansaataisiin keksinnön mukaisessa menetelmässä tarvittava yksisäikeinen sekvenssi.

Vaihe 2 - Affiniteettimerkkiaineella varustettu analyytti

Eristetty lähetti-RNA varustetaan affiniteettimerkkiaineella eli se voidaan esimerkiksi ''· biotinyloida käyttäen kemiallisia ei-entsymaattisia prosesseja. Fotoaktivoitu reagenssi, ;. fotobiotiini, on tähän tarkoitukseen erityisen hyvin sovltuva ja on kaupallisesti saatavissa.

Koska RNA:ta ei muuteta cDNA:ksi, eikä sitä muutenkaan modifioida entsymaattisesti sen leimaamiseksi, RNA voidaan valmistaa ja säilyttää vahvoissa detergenteissä kuten SDS:ssä. RNAasien tiedetään inhiboituvan SDS:ssa ja siksi on helppo eristää RNA ehjänä säilytyksenkin jälkeen. Fragmentointi ei kuitenkaan ole ongelma, jollei se ole liian voimakas. RNA-fragmenttien koko ei vaikuta niiden sitomiskapasiteettiin.

':* Vaihe 3 - Liuoshybridisaatio . ·. : Jokainen liukoinen ilmaistavalla merkkiaineella valinnaisesti varustettu koetin (DNA) pooli saatetaan kosketukseen affiniteettimerkkiaineella varustetun analyytti (RNA) näyteosan . kanssa. Hybridisaation annetaan tapahtua vapaasti siinä pienessä liuostilavuudessa, joka ’:muodostuu jokaiseen poolilokeroon. Tämä antaa nopean ja kvantitatiivisen reaktion.

Vaihe 5 - Erotusvaihe 115139 17

Mikrohelmiä tai jotain toista erotusapuvälinettä, joka on varustettu affiniteettiparilla, esimerkiksi avidiinilla lisätään RNA-molekyylien sitomiseksi. Helmet pestään, jotta päästäisiin eroon vapaasta DNA:sta.

Vaihe 6 - Talteenottovaihe

Eluoidaan DNA:RNA-hybridin rikkovalla liuoksella, kuten formamidilla tai NaOH:lla. Jos se on välttämätöntä yksisäikeinen DNA saostetaan ja pestään. Yksisäikeinen DNA otetaan talteen elektroforeesipuskuriin. On edullista, että käytetyt olosuhteet ovat sellaiset, että elektroforeesi voidaan suorittaa suoraan eluaatista ja samanaikaisesti rekisteröidä eri koettimet.

Vaihe 7 - Tulosten rekisteröinti DNA:RNA-hybrideista eluoidun DNA:n koko ja määrä määritetään kapillaari- tai geeli-elektroforeesilla. Massa-spektroskopiaa voidaan mahdollisesti myös käyttää. Kahden RNA-valmisteen erot voidaan helposti ilmaista hybridisoimalla ne DNA-fragmentteihin, jotka on leimattu erilaisilla väreillä ja sekoittamalla DNA:t ennen elektroforeesia.

Vaihe 8 - Tulosten tulkinta

Jos genomi on tunnettu (tapaus 1), transkriptioprofiili tulee suoraan määritetyksi. Tapauk- sessa 2 on yksinkertaista kloonata ja sekvensoida kaikki ne fragmentit, jotka käyttäytyvät 'S· mielenkiintoisella tavalla.

• · « · » « · * • ♦ . 1 · \ Vaihe 9 - Valinnainen amplifikaatio

Jos tarvitaan erittäin herkkä määritysmenetelmä, niin reagenssipolynukleotidisekvenssit eli ilmaistavalla merkkiaineella varustetut koettimet, jotka on eluoitu erotusapuvälineestä voidaan amplifioida PCR.llä kvantitatiivisen selektiovaiheen jälkeen. Jos tätä lähestymystapaa nm noudatetaan, reagenssipolynukleotidisekvenssit eli koettimet pitäisi muunnella niin, että ne sisältävät yhteisen terminaalisen sekvenssin, joka mahdollistaa kaikkien samassa poolissa ; ‘ 1, · olleiden koettimien amplifikaation samalla PCR-alukeparilla.

• Reagenssipakkaus eli testi-kitti : .: Keksintö koskee myös testipakkausta. Testipakkaus sisältää yhden tai useamman järjes- 115139 18 tetyn poolin, jossa on ennalta määrätty valinnainen määrä liukoisia polynukleotidisekvens-sejä tai koettimia. Koettimet on varustettu tunnistuskohdilla, joko ilmaistavilla merkkiaineilla tai terminaalisella alukemerkkiainesekvenssillä. Edullisesti, ilmaistavat merkkiaineet ovat vain päästään leimattuja ilmaistavia merkkiaineita.

Reagenssipakkaus sisältää liukoisen järjestetyn poolin, jossa jokainen pooli sisältää enemmän kuin yhden edullisesti enemmän kuin kymmenen koetinta. Poolit on edullisesti asetettu järjestetyllä tavalla omiin astioihinsa, esimerkiksi koeputkiin, pulloihin tai kuoppiin eli lokeroihin mikrotiitterilevyllä. Joskin testipakkaus esillä olevan kvantitatiivisen vertailevan arvioinnin suorittamiseksi edullisesti on mikrotiitterilevy tai vastaava räätälöity rakennelma, testipakkaus voi valinnaisesti käsittää valinnaisen määrän koeputkia, pulloja, jne., jotka voidaan ryhmittää enemmän tai vähemmän kiinteään järjestelmään, joka sisältää telineen ja/tai mikrotiitterilevyt. Testipakkaukset voidaan valmistaa haluttuun muotoon tai räätälöidä ja varustaa tarkoituksenmukaisin merkein ja käyttöohjein.

Testipakkausta varten liukoiset polynukleotidipoolit voidaan valmistaa DNA-fragmenteista. Ne voivat olla synteettisiä oligonukleotidejä ja muunneltua DNA:a. Kun testipakkaus valmistetaan karakterisoidun genomin tutkimista varten, testipakkauksen poolit edullisesti sisältävät vähintään yhden polynukleotidifragmentin (koettimen) jokaisesta geenistä, jota on aikomus tutkia genomista. Myöskin silloin kun karakterisoimatonta genomia aiotaan tutkia, poolit voidaan edullisesti valmistaa suurempina määrinä. Yleisempiä ja spesifisempiä tutkimuksia varten kaupallinen

* * I

tuottaminen ei ole millään tavalla poissuljettua. Poolit on edullisesti valmistettu ..!: * insertoimalla halutut genomin osat plasmidiin, jotka voidaan monistaa helpolla tavalla ja ·,./ fragmentoida sopivin restriktioentsyymein, jotta aikaansaataisiin pooleihin halutut, koonsa :perusteella selkeästi erotettavissa olevat koettimet. Insertit voidaan valinnaisesti varustaa \··*: halutulla restriktioentsyymikohdalla. Myös osittain kakrakterisoitu tai karakterisoimaton kaupallinen testipakkaus voidaan aikaansaada suurin piirtein samalla tavalla. On huomattava, että myös karakterisoimaton genomi voidaan erittäin nopeasti saada • karakterisoitua tällä menetelmällä.

1 · M ♦

Jos reagenssipolynukleotidikoetin on peräisin karakterisoidusta genomista, jokaisen koetin-:, ‘ · I molekyylin tiedetään vastaavan tiettyä geeniä ja jokainen koetin voidaan spesifisesti tun- nistaa kokonsa ja poolinsa avulla. Transkriptioprofiili voidaan siten suoraan tulkita yksit-täisten geenien ekspressiotasona. Jos reagenssipolynukleotidikoettimet ovat heikosti karak-. terisoituja, esimerkiksi jos ne ovat peräisin organismista, jonka genomia ei vielä ole ' * sekvensoitu, arvokkaita tuloksia voidaan kuitenkin saada. Koetinpoolit voidaan tässä tapauksessa luoda esimerkiksi katkaisemalla isoja 10 - 200 kb:n klooneja täsmällisiksi 115139 19 mutta huomattavasti pienemmiksi fragmenteiksi. Nämä pienemmät fragmentit varustetaan valinnaisesti leimalla ja käytetään koettimina kuten edellä on kuvattu. Transkriptioprofiilit eivät tässä tapauksessa suoraan tunnista geenejä, mutta antavat sekä kvantitatiivista ja differentiaalista tietoa koskien tiettyä koetinmolekyyliä. Näiden lukujen avulla on helppo kloonata ja sekvensoida kaikki fragmentit, jotka käyttäytyvät mielenkiintoisella tavalla.

Edullisessa sovellutusmuodossa testipakkaus voidaan valmistaa mikrotiitterilevylle. Tällaisessa tapauksessa voidaan esimerkiksi valmistaa DNA-fragmenttipooleja hiivasta. Jos jokainen pooli sisältää esimerkiksi 100 - 300 koetinta, testipakkauksella saadaan tarpeeksi hyvä resoluutio ja jokainen koetin poolissa edustaa yhtä tiettyä hiivageeniä. Näin ollen hiivan 6300 geeniä voidaan asettaa yhdelle ainoalle mikrotiitterilevylle ja levyllä on vielä tilaa usealle kontrollille.

Ilmaistava merkkiaine on edullisesti valittu ryhmästä ilmaistavia merkkiaineita, jotka on osoitettavissa fluoresenssilla, infrapuna-absorptiolla, elektromagneettisten ominaisuuksien perusteella, radioaktivisuuden perusteella tai entsymaattisen aktiivisuutensa perusteella. Edullinen ilmaistava merkkiaine, joka voidaan rekisteröidä fluoresenssin avulla on fluoro-kromi tai fluorofori.

Joskin ilmaistava merkkiaine on olennainen keksinnön mukaisessa menetelmässä, ainoa todella olennaisen välttämätön testipakkauksen piirre on se, että testipakkauksessa olevat • poolit sisältävät koettimia, joilla on selvästi erotettavissa olevat kokoerot ja jotka valin- •' · naisesti ovat varustettuja joko ilmaistavalla merkkiaineella tai tunnistuskohdalla, joka mahdollistaa merkkiaineen kiinnittämisen tai terminaalisella aluketunnistuskohdalla. ,*«*, Toimiva testipakkaus varustetaan järjestetyllä poolilla, jossa on terminaalisilla alukkeilla * ’ ‘. varustettuja koettimia vaikkei ilmaistavaa merkkiainetta ole.

» * *···’ Siten, keksinnön mukainen testipakkaus yksinkertaisimmassa muodossaan on järjestetty pooli, jossa on liukoisia tunnistuskohdalla varustettuja tai varustamattomia koettimia, joilla *'”· on selvästi erotettavissa olevat koot. On huomattava, että mainittu testipakkaus on sellai- senaan käyttökelpoinen, mutta se voidaan täydentää valinnaisilla ilmaistavilla ; merkkiaineilla, affiniteettipareilla ja/tai erotusapuvälineillä. Mainitut lisäreagenssit eivät kuitenkaan ole välttämättömiä. Mainitut lisäreagenssit ja keinot keksinnön mukaisen . menetelmän suorittamiseksi ovat saatavissa kaupallisesti monesta muusta lähteestä. Täten • keksinnön mukainen testi- tai testipakkaus voidaan räätälöidä loppukäyttäjän tarpeisiin • soveltuvaksi.

Testipakkauksen valmistusmuoto, jonka edellä mainituista syistä ei tarvitse sisältää 115139 20 immobilisointivaiheen välineitä, mahdollistaa räätälöityjen testien helpon soveltamisen kiinnittämällä huomio tiehyissä organismeissa olevien geenien alaryhmiin. Testipakkaus voi sisältää valinnaisen affiniteettimerkkiaineen, joka mahdollistaa solu- tai kudosnäytteessä olevien polynukleotidien varustamisen affiniteettimerkkiaineella ja valinnaiset erotusapuvälineet, jotka on varustettu tai peitetty analyytin leimaamiseen käytetyn affiniteettimerkkiaineen vastaavalla toisella osapuolella. Valinnaiset affiniteettiparit, jotka antavat analyytille affiniteettimerkin ja erotusapuvälineelle tätä vastaavan toisen osapuolen ovat esimerkiksi biotiini ja avidiini tai streptavidiini, histidiinioligomerit ja metallikelaatit, hapteenit ja vasta-aineet tai glykaanit ja lektiinit, jne.

Valinnaiset erotusapuvälineet, jotka voidaan sisällyttää testipakkaukseen tai toimittaa erillisinä, on valittu ryhmästä kiinteitä kantajia, joihin kuuluvat mikropartikkelit, mikrohelmet, lateksipartikkelit, magneettipartikkelit, langat, tapit, tikut, mikrokuopat ja affiniteettipylväät. Erotusapuvälineisiin voi sisältyä faasierottelun suorittamiskeinoja tai elektroforeettisia välineitä affiniteettimerkkiainetta vastaavan osapuolen sitomiseksi.

Ekspressiokuvioiden tai transkriptioprofiilien vaihteluiden arvioimiseksi järjestetyissä pooleissa on edullista valmistaa identtiset koetinerät. Tässä tapaukseessa jokainen järjestetty pooli tai testipakkaus varustetaan erilaisella ja selvästi erotettavissa olevalla ilmaistavalla merkkiaineella, mikä merkkiaine edullisesti emittoi eri emissioaallonpituuksilla. Jos merkkiaineet ovat terminaalisia alukemerkkiaineita reagenssipakkaukset ovat samanlaiset mutta amplifikaation jäkeen talteenotetut ja/tai amplifioidut koettimet voidaan varustaa ' * erotettavissa olevilla ilmaistavilla merkkiaineilla, jotka valinnaisest voidaan sisällyttää testipakkaukseen tai hankkia muista kaupallisista tai ei-kaupallisista lähteistä. Jotta kuiten-. f t kin aikaansaataisiin helppo ja kvantitatiivinen ja/tai vertaileva vaihteluiden arvioiminen, on tarkoituksenmukaista valmistaa sellainen testipakkaus, joka on varustettu erilaisilla erotettavissa olevilla ilmaistavilla merkkiaineilla, jotka emittoivat eri emissioaallonpituuk-.' *', silla ja mitkä voidaan rekisteröidä automaattisilla tai osittain automaatisoitavilla koeväli- neillä.

I » t t * ,,, Tällaiset testipakkaukset ovat hyödyllisiä eri solu- tai kudosnäytteissä olevien polynukleo- ;·* tidien määrien sisäisistä muutoksista tai ulkoisista ärsykkeistä johtuvien vaihteluiden vertailevaan tai kvantitatiiviseen arviointiin. On tarkoituksenmukaista käyttää vähintään *;*; kahta kiinteää kantajaa tai mikrotiitterilevyä. Jokainen kiinteä kantaja tai mikrotiitterilevy varustetaan identtisillä polynukleotidikoetinpooleilla, jotka on varustettu ilmaistavilla merkkiaineilla.

Jokainen kiinteä kantaja pitäisi varustaa omalla erotettavissa olevalla ilmaistavalla merkki- 21 Π5139 aineella, joka mahdollistaa samanaikaisen rekisteröinnin eri solu- tai kudosnäytteistä, jotka on otettu eri aikoina esimerkiksi ennen tai jälkeen lääkeainekäsittelyn. Differentiaalinen transkriptioprofilointi eli kahden tai useamman analyyttipoly nukleotidi valmisteen erojen analysointi voidaan helposti rekisteröidä hybridisoimalla analyyttinäytteet eri erotettavissa olevilla ja automaattisesti rekisteröitävillä ilmaistavilla merkkiaineilla terminaalisesti leimattujen reagenssipolynukleotidikoettimien kanssa. Hybridisointivaiheen jälkeen eri näytteet voidaan valinnaisesti sekoittaa ja niiden erot voidaan ilmaista suoraan mittaamalla ilmaistavien merkkiaineiden suhde toisiinsa eri piikeissä. Testipakkaus voidaan myös varustaa ainakin yhdellä amplifioimiseen tarkoitetulla alukeparilla, jotka edellisessä vaiheessa oli käytetty testin herkistämiseksi ennen koettimien varustamista ilmaistavalla merkkiaineella.

Keksinnön mukainen menetelmä on käyttökelpoinen eri kohdesolu- tai kudosnäytteissä tapahtuvien, sisäisistä muutoksista tai ulkoisista ärsykkeistä, kuten lääkkeistä, patologisista tiloista, jne. johtuvien karakterisoitujen tai karakterisoimattomien polynukleotidien määrässä ja laadussa tapahtuvien vaihteluiden kvantitatiiviseen ja vertailevaan arviointiin. Menetelmää ja testipakkausta voidaan käyttää hoitotapojen vaikutusten, epidemiologisten tilanteiden, hygieenisten olosuhteiden ja mikrobipopulaatioiden evaluoimiseksi.

Keksinnön kokeellinen rakenne ja yleinen periaate kuvataan tarkemmin käyttäen keksijöiden laboratoriosta saatavia plasmideja ja inserttejä. Plasmideja käytetään ainoastaan havainnollistamiseen. Keksintö ei millään tavalla ole rajattu mainittuihin ' plasmideihin. Keksinnön periaatteet voidaan tarkistaa korvaamalla esimerkeissä käytetyt Γ konstruktit toisilla plasmideilla ja konstrukteilla, joita on runsaasti saatavissa. Alan • i ammattimiehet voivat helposti soveltaa keksinnön periaatteita eri sovellutuksissa.

f * i · ’ * <' * Esimerkki 1.

,1 \ Kvantitatiivinen evaluointi • »

Plasmidin, pASll, joka sisältää vektoriosia ja inserttiosan (cDNA), käyttö koetin-. poolin luomiseksi

I I

Plasmidi luodaan (Promega, P2221) kloonausvektorista pSP73 ja hiivavektorista pAS4, ;’’.i joka sisältää endoglukanaasi-5 cDNA.ta (Saloheimo, A., et ai., Mol. Microbiol. 13, 219-228, 1994), joka on uusi, pieni endoglukanaasigeeni, joka on eristetty hiiva-ilmen- ‘ , netystä Trichoderma reesei:n egll5:sta (Saloheimo et ai, 1994). pAS4:stä osittaisella , ’ / EcoRI-Xhol -digestiolla saatu egl5-cDNA, jonka päät täytetään käyttäen ♦ » : ‘ Klenow-fragmenttia (1008404 Boehringer-Mannheim) ja kiinnitetään ja ligoidaan SmalMa hajotettuun pSP73 vektoriin pASll luomiseksi. Vektori sisältää T7 promoottorin, joka 115139 22 mahdollistaa in vitro transkription. Plasmidi käytetään myös RNA:n valmistamiseen malliesimerkissä. Näissä mallikokeissa vaiheet eroavat jonkin verran keksinnön yleistetyssä menetelmässä kuvatuista päävaiheista. Kokeessa läpikäydään seuraavat vaiheet:

Preparatiiviset vaiheet:

Vaihe 1 - Koettimien valmistaminen kaksisäikeisistä poly nukleotideistä DH5a-soluja, joissa on pASl 1 -plasmidi, joka sisältää ampisilliiniresistenssigeenin, kasvatetaan yön yli +37°C:ssa LB-liuoksessa, joka sisältää 1% glukoosia ja 0,1 mg/1 ampisil-liinia.

Vaihe 2 - Polynukleotidikoettimien puhdistus ja varmistaminen Tämän jälkeen plasmidit puhdistetaan ja analysoidaan käyttäen menetelmää Plasmid Maxi Protocol of QIAGENR (QIAGEN^ Plasmid Purification Handbook, Nov. 1998).

Vaihe 3 - Plasmidien linearisointi

Puhdistettu plasmidi linearisoidaan digestoimalla ZTcoRLllä, eristetään agaroosigeelielektro-foreesilla ja ekstrahoidaan ja puhdistetaan käyttäen menetelmää QIAquick^M Gel Extraction Kit Protocol (QIAquick^M spin Handbook, Jan. 1999).

•,,, · Vaihe 4 - Analyyttien valmistus • * ·:··.· RNA, joka vastaa inserttiä valmistetaan in vitro käyttäen järjestelmää RiboMAX^M Large

Scale RNA Production System - T7 (Promega, P1300) ja tuotettu määrä mitataan UV-adsorption avulla.

... Analyyttiset vaiheet: • > ·,’·: Vaihe 1 - Analyyttisekvenssien varustaminen affiniteettimerkkiaineella »

• I

RNA varustetaan affiniteettimerkkiaineella käyttäen tuotetta PHOTOPROBE^ Biotin .. . SP-1000 valmistajan (VECTOR Laboratories) ohjeiden mukaisesti.

Vaihe 2 - Koettimien fragmentointi 23 7 7 5 7 3 9

Plasmidinäyte katkotaan restriktioentsyymin Mspl avulla 21 fragmentiksi, joista 10 vastaa inserttiä ja 11 vastaa vektoria.

Vaihe 3 - Koettimen pään leimaaminen ilmaistavalla merkkiaineella DNA-fragmenttien päät leimataan yhdisteellä Fluorescein-12-ddCTP, NEL-400 (NEN^ Life Science Products, Inc.) käyttäen Klenow-fragmenttia (1008404 Boehringer-Mann-heim). Leimaamisen onnistuminen vahvistetaan analysoimalla DNA-fragmentti geelielektroforeesilla käyttäen järjestelmää DNA sequencer ALF DNA Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech), joka on varustettu järjestelmällä ALFwin Fragment Analyser 1.02 Software Package (Amersham Pharmacia Biotech) ja käyttää ulkoista kontrollia Sizer 50-500 ja sisäistä kontrollia Sizer 250 (cat.no. 27-4525-01 ja 27-4527-01, Amersham Pharmacia Biotech) (Kuviot 8a ja 8b).

Vaihe 4 - Liuoshybridisaatio

Osa RNA-näytteestä (0,44 pmol) sekoitetaan päästään leimatun DNA-valmisteen (0,044 pmol jokaisesta fragmentista) kanssa RNAasi-vapaassa mikrosentrifugiputkessa. Seoksen SDS-pitoisuus pidetään 0,l%:ssa. Seos saostetaan käyttäen 3M natriumasetaattia (l/10xV) ja 94% etanolia (2,5xV), pelletoidaan (20000xg), pestään 70%:11a EtOHilla ja liuotetaan 25 μ\ hybridisaatioliuosta, joka sisältää seuraavia aineita: 0,6 M NaCl, 20 mM natrium-fosfaatti (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1% (paino/volyymi) SDS ja 0,02% ·,,,· (paino/volyymi) Ficoll, 0,02% (paino/volyymi) polyvinyylipyrrolidoni, 0,02% t (paino/volyymi) naudan seerumialbumiini (1 x Denhardtin liuosta). Seos lämmitetään •: · *: 100 ° C: een 3 minuutiksi.

Vaihe 5 - Hybridisaatioon liittyvä valinnainen vaihe « » ... Näyte inkuboidaan 65°C:ssa 2 tuntia ja sitten se siirretään RNAasi-vapaaseen mikrosentri- fugiputkeen. Inkubointiputki huuhdotaan kerran 25 /ulilla hybridisaatioliuosta ja pesuliuos :. ‘ · i lisätään samaan putkeen.

Vaihe 6 - Sitomisvaihe * 1 0,5 μ\ suspensiota (5 % (paino/volyymi) FLUORICONTM Avidin-Polystyrene Assay Parti cles (IDEXX Laboratories, 31-040-IA)) lisätään ja inkubointia jatketaan 30 minuuttia 24 11 51 3 9

22°C:ssa. Partikkelisuspensio pidetään pesuliuoksessa: 20mM natriumfosfaattipuskuri (pH

7,5), 0,15 M NaCl, 0,1% (volyymi/volyymi) Tween 20.

Vaihe 7 - Erotus vaihe

Mikropartikkelit kerätään sentrifugoimalla (12000xg, 22°C) ja pestään neljä kertaa 200 /il:11a 0,lxSSC-0,2% SDS-liuosta 50°C:ssa (12000xg, 40°C).

Vaihe 8 - Eluointivaihe

Sidottu DNA eluoidaan 200 /il: 11a 50 mM NaOH, saostetaan, pelletoidaan ja pestään kuten on kuvattu vaiheessa 5 ja liuotetaan veteen.

Vaihe 9 - Talteenotto vaihe

Eluoitu DNA analysoidaan kapillaarielektroforeesilaitteella DNA sequencer ABI PRISM^ 310, Genetic Analyser (Applied Biosystems) käyttäen järjestelmää GeneScan^ Analysis Software (Applied Biosystems) ja standardia Gene Scan-500 Size Standard ja tunnettua määrää räätälöityä yhden koon standardia tai geelielektroforeesi DNA sekvennointijärjestelmällä ALF DNA Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech), joka on varustettu laitteella ALFwin Fragment Analyser 1.02 Software Package . (Amersham Pharmacia Biotech) ja käyttäen ulkoista kontrollia Sizer 50-500 ja tunnettua määrää sisäistä kontrollia Sizer 250 (cat.no. 27-4525-01 ja 27-4527-01, Amersham • · ·

Pharmacia Biotech).

Vaihe 10 - Tulosten rekisteröinti

Tulokset luetaan elektroferogrammista ja tulostiedostosta kuten esitetään kuviossa 8c.

• · ·

Kuten voidaan todeta vain ne fragmentit, jotka vastaavat inserttiä voidaan todeta päinvastoin kuin kuviossa 8b, jossa kaikki fragmentit näytetään vertailun vuoksi. Kvanti-.··, tointi lasketaan käyttäen huipun (piikin) aluetta sisäisenä standardina, mikä pitoisuus ’!* jokaisessa näyttevanassa (lane) on tunnettu.

‘Esimerkki 2.

Vertaileva, kvantitatiivinen evaluointi . . . Rihmasienestä Trichoderma reesei peräisin oleva RNA ennen induktiota tai sen ‘ ’ jälkeen 25 115139 Tässä kokeessa rihmasienestä Trichoderma reesei eristetty RNA analysoidaan kahdessa eri olosuhteessa, ennen tai jälkeen näiden ekstrasellulaaristen hydrolyyttisten entsyymien indusointia. Kokeessa käytetty Trichoderma reesei kanta on QM 9414 (talletettu VTT: n kokoelmaan tunnuksella VTT-D-74075) ja se kasvatetaan α-soforoosilla ja otetaan talteen kuten on kuvattu julkaisussa Ilmen, M., Onnela, M.-L., Klemsdal, S., Keränen, S. ja Penttilä, M. 1996. Functional analysis of the cellobiohydrolase I promoter of the filamentous fungus Trichoderma reesei. Mol. Gen. Genet. 253, sivut 303-314.

Sienen kokonais-RNA valmistetaan käyttäen TRIzol^ Reagent-menetelmää (Life Technologies; Gibco BRL). Edelleen poly(A)+-RNA eristetään kokonais-RNA:sta käyttäen menetelmää Oligotex mRNA Spin-Column Protocol (QIAGEN^ Oligotex™ Handbook August 1998). Tämä RNA biotinyloidaan kuten on kuvattu edellä esimerkin 1, analyyttisessä vaiheessa 1. Koetin DNA-fragmentit ovat samat kuin esimerkissä 1. Plasmidin insertti sisältää endoglukanaasigeenin koodaman hydrolyyttisen entsyymin, jonka tiedetään indusoituvan käytetyissä olosuhteissa.

Kokeessa käydään analyyttisten vaiheiden 1-10 läpi kuten on kuvattu esimerkissä 1.

Elektroferogrammeissa (Kuviot 9a ja 9b) nähdään, että ne fragmentit jotka vastaavat endo-glukanaasia ovat kolme kertaa yleisempiä sen jälkeen kun ekstrasellulaariset hydrolyyttiset entsyymit on indusoitu soforoosilla.

• · » ·

Esimerkki 3.

• · · · Pienten ananlyyttimäärien kvantitatiivinen evaluointi •... · Esimerkki esittää pienten RNA määrien osoittamisessa käytettyä koerakennelmaa ‘: ’ *: Tässä koettimien valmistuksen preparatiiviset vaiheet eroavat esimerkin 1 ja 2 vaiheista.

t *

Koettimet valmistetaan PCR-reaktion avulla (katso kuvio 5). Jokaista koetinfragmenttia varten valitaan sellaiset kaksi uniikkia 16 - 24 nukleotidin pituista * · oligonukleotidisekvenssiä, jotka spesifisesti johtavat yksittäisen tiettyä geeniä vastaavan DNA-fragmentin PCR-amplifikaatioon. PCR-alukkeet sisältävät lisäksi 5’-päässään toisen 16 nukleotidin pituisen sekvenssin. Tämä sekvenssi on samanlainen alukkeiden toisella puolella eli kaikissa niissä alukekohdissa, jotka ohjaavat pitenemistä yhteen suuntaan, kun taasen toinen sekvenssi on identtinen alukkeiden toisen puolen kanssa eli niiden, jotka .. ohjaavat pitenemistä toiseen suuntaan. Kaksi 16-meerin osaa sisällytetään lisäksi kaikkiin ‘ ‘ koettimiin niiden preparatiivisen amplifioinnin aikana PCR:llä.

26 115139 Näitä koettimia tässä tapauksessa ei vielä ole fluoroforilla leimattuja.

Tämän koetinmolekyylien luomiseen tähtäävän preparatiivisen prosessin jälkeen, koe etenee analyyttiseen osaan.

Vaihe 1 - Affiniteettimerkkiaineella varustettu analyytti

Analyytti-RNA eristetään ja varustetaan affiniteettimerkkiaineella fotobiotiinilla kuten on kuvattu esimerkin 1 analyyttisessä vaiheessa 1.

Vaihe 2 - Liuoshybridisaatio Näyte-RNA sekoitetaan amplifioitavissa olevien DNA-koettimien kanssa kuten on kuvattu Esimerkin 1 analyyttisessä vaiheessa 4.

Vaihe 3 - Liuoshybridisaatio Näyte RNA - koetin DNA-seos inkuboidaan olosuhteissa, jotka mahdollistavat hybridisaation kuten edellä olevassa Esimerkin 1 vaiheessa 5 on kuvattu.

. Vaihe 4 - Sitominen ·;;; Biotinyloitu RNA ja DNA:RNA-hybridit kerätään avidiinilla peitetyille partikkeleille ’··>‘ kuten edellä on kuvattu vaiheessa 6 (Kuvio. 6).

t »

Vaihe 5 - Eluointi • ·

Koetin-DNA-molekyylit eluoidaan, saostetaan ja pestään kuten edellä Esimerkin 1 •;. · | vaiheissa 7 on esitetty.

» · • > Vaihe 6 - Amplifiointi : Alukepari, joka vastaa koettimien yhteistä 16 nukleotidin aluketta lisätään. Aluke 1 on leimaamaton ja sitä lisätään 4x pmol/μΐ, aluke 2 on 5'-päästään leimattu fluoroforilla ja sitä lisätään 50 pmol/μΐ. Puskurointiolosuhteet säädetään DNA-polymeraasille (esimerkiksi DeepVent^ DNA Polymerase, #M0258L, New England Biolabs^ Inc.) (vaatimuksille) sopiviksi. PCR-ohjelma, joka käsittää 25 sykliä esimerkiksi käyttäen 94°C, 1 min; 52°C, 115139 27 30 s; 72°C, 1 min käytetään amplifioimaan koettimia ja viemään fluoresoiva leima (Kuvio 7).

Vaihe 7 - Alukeylimäärän erottaminen

Ylimäärä aluketta poistetaan geelikromatografialla spin-pylväässä (tuottajan kuvaama tuote) (tai propanolisaostuksella).

Vaihe 8-Rekisteröinti

Amplifioidut koettimet analysoidaan elektroforeesilla kuten edellä on kuvattu Esimerkin 1 vaiheessa 9.

• I 1 » · · 1

• I r M

• · • ·

Claims (29)

115139 28

1. Menetelmä solu- tai kudosnäytteen polynukleotidien määrän kvantitatiiviseen määrittämiseen ja/tai määrässä tapahtuvien muutosten vertailevaan arvioimiseen käyttäen affini-teettierotukseen perustuvaa täysin tai osittain automatisoitavissa olevaa liuoshybridisaatiota valinnaisesti yhdistettynä PCR-tekniikkaan, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää peräkkäiset vaiheet, joissa: (a) eristetään solu- tai kudosnäytteen analyyttipolynukleotidisekvenssit ja varustetaan mainitut analyyttisekvenssit vähintään yhdellä affmiteettimerkillä; (b) saatetaan vaiheessa (a) valmistetut affmiteettimerkillä varustetut analyyttisekvenssit kosketukseen vähintään yhden mutta edullisesti usemman järjestetyn poolin kanssa, jotka poolit ovat ennalta valmistettavissa erillisiin tai toisiinsa liittyneisiin astioihin, ja sisältävät ennalta määrätyn, valinnaisen lukumäärän, kuitenkin useamman kuin yhden, edullisesti useamman kuin kymmenen, liukoisen koetinpolynukleotidisekvenssin, jotka koettimet ovat kooltaan toisistaan selkeästi erotettavissa, mikä mahdollistaa niiden suoran rekisteröinnin, ja valinnaisesti varustettuina tunnistuskohdilla, jotka kohdat on varustettu tai voidaan varustaa merkkiaineella kvantitatiivisen talteenottovaiheen (e) jälkeen tai jotka kohdat ovat kaksi terminaalista alukesekvenssiä, joiden avulla mahdollistetaan koettimien monistus ja valinnainen varustaminen merkkiaineella kvantitatiivisen talteenottovaiheen (e) jälkeen; (c) annetaan hybridisaatioreaktion tapahtua vaiheessa (b) toisiinsa kosketukseen saatettujen analyytti- ja koetinsekvenssien välillä, mikä reaktio johtaa liukoisen affiniteettimerkkiaineella varustetun koetin : analyytti-hybridin muodostumiseen; • (d) eristetään vaiheessa (c) muodostuneet koetin:analyytti-hybridit sitomalla ne erotus- : * apuvälineelle affiniteettimerkkiä vastaavan osapuolen avulla; ja , ; (e) otetaan talteen valinnaisesti merkkiaineella varustettu koetin erotusapuvälineeltä; " ; (f) rekisteröidään talteenotettujen monistamattomien tai monistettujen koonsa perusteella .,,; erotettavien tai erotettujen valinnaisesti tunnistuskohdalla varustettujen koettimien määrä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polynukleotidi-koettimet valitaan DNA-fragmenttien, synteettisten oligonukleotidien ja modifioidun DNA:n joukosta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valinnainen ' : ilmaistava tunnistuskohta valitaan ryhmästä, joka koostuu automaattisilla tai osittain auto matisoiduilla välineillä tai laitteilla rekisteröitävistä merkkiaineista.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ilmaistava merkkiainekohta valitaan joukosta, joka on ilmaistavissa fluoresenssin, luminesenssin, 115139 29 infrapuna-absorption, elektromagneettisten ominaisuuksien, massan, radioaktiivisuuden ja entsymaattisen aktiivisuuden perusteella.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tunnistuskohta, , joka on rekisteröitävissä fluoresenssinsa avulla on fluorokromi tai fluorofori.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polynukleotidi-analyytti solu- tai kudosnäytteessä on lähetti-RNA.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että affiniteettimerkit ja niitä vastaavat osapuolet tai affiniteettiparit ovat biotiini ja avidiini, biotiini ja strept-avidiini, histidiinioligomeerit ja metallikelaatit, hapteenit ja vasta-aineet, reseptorit ja ligandit tai glykaanit ja lektiinit.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erotusapuväline valitaan kiinteiden kantajien joukosta, joka koostuu mikrohiukkasista, mikrohelmistä, lateksihiukkasista, magneettihiukkasista, langoista, tapeista, tikuista, mikrokuopista ja affiniteettipyl väistä.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että astiat liukoisia pooleja varten ovat mikrotiitterilevyn lokeroita tai kuoppia.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään vähin- ’ -_ tään kahta identtistä järjestettyä poolia, jotka saatetaan kontaktiin eri aikoina, tai eri pai- ”! koista otettujen solu- tai kudosnäytteiden affiniteettimerkkittyjen nukleotidisekvenssien ’ · · · ’ kanssa ja verrataan eri järjestetyistä pooleista saadut tulokset.

*... · 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kussakin jär jestetyssä poolissa olevat koettimet varustetaan ilmaistavilla merkkiaineilla, jotka ovat ‘: toisistaan erotettavissa.

/ . 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toisistaan ero- ' ; tenavissa olevat merkkiaineet emittoivat eri emissioaallonpituuksilla.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että affiniteetti-’·*: merkillä varustettu analyyttisekvenssi sidotaan ensin erotusapuvälineelle ja vasta tämän jälkeen saatetaan kosketukseen pooleissa olevien koettimien kanssa. so 115139

14. Testipakkaus, joka mahdollistaa solu- tai kudosnäytteen polynukleotidien määrän kvantitatiivisen määrittämisen ja/tai polynukleotidien määrässä tapahtuvien muutosten vertailevan arvioimisen affiniteettierotukseen perustuvalla täysin tai osittain automatisoitavissa olevalla liuoshybridisaatiolla, joka valinnaisesti voidaan yhdistää, tunnettu siitä, että testipakkaus sisältää yhden tai useamman, omiin erillisiin tai toisiinsa kytkettyjen astioihin sijoitetun järjestetyn poolin, joissa pooleissa on ennalta määrätty valinnainen lukumäärä, kuitenkin useampi kuin yksi, edullisesti useampi kuin kymmenen, liukoisia koetinsekvenssejä, jotka ovat kooltaan toisistaan erotettavissa, mikä mahdollistaa niiden rekisteröimisen ja jotka ovat valinnaisesti varustettuna tunnistuskohdilla, jotka on varustettu tai voidaan varustaa merkkiaineella tai terminaalisella alukesekvenssillä, joiden avulla mahdollistetaan koettimien monistus.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että koettimet voidaan rekisteröidä suoraan koonsa perusteella tai voidaan valinnaiset varustaa merkkiaineella, joka on rekisteröitävissä automaattisilla tai osittain automatisoitavilla välineillä.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että ilmaistava tunnistuskohta valitaan ryhmästä, joka on ilmaistavissa fluoresenssin, luminesenssin, infra-puna-absorption, elektromagneettisten ominaisuuksien, radioaktiivisuuden ja entsymaatti-sen aktiivisuuden avulla.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että tunnistus- ,:, kohta, joka on rekisteröitävissä fluoresenssinsa avulla on fluorokromi tai fluorofori. "I

18. Patenttivaatimuksen 14 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että testipakkaus, '···’ jossa on kahdella terminaalisella PCR-alukkeella varustut koettimet on valinnaisesti varustettu erillisellä ilmaistavalla merkkiainesarjalla. • 1

19. Patenttivaatimuksen 14 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää valinnaisesti ainakin yhden affiniteettimerkin ja/tai erotusapuvälineen varustettuna affini-' ’ ‘: teettimerkin affiniteettiparilla.

‘ ; 20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että affiniteetti- merkit ja niitä vastaavat osapuolet jotka muodostavat affiniteettiparin ovat biotiini ja avi-•:'1: diini, biotiini ja streptavidiini, histidiinioligomeerit ja metallikelaatit, hapteenit ja vasta- • “ ': aineet, reseptorit ja ligandit tai glykaanit ja lektiinit.

21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että erotusapu- 3i 115139 väline valitaan kiinteiden kantajien joukosta, joka koostuu mikrohiukkasista, mikrohel-mistä, lateksihiukkasista, magneettihiukkasista, langoista, tapeista, tikuista, mikrokuopista ja affiniteettipylväistä.

22. Patenttivaatimuksen 14 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että polynukleo-tidikoettimet ovat DNA-fragmentteja, synteettisiä oligonukleotideja tai modifioitua DNA:ta.

23. Patenttivaatimuksen 14 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että järjestetty pooli on mikrotiitterilevy.

24. Patenttivaatimuksen 14 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että siihen sisältyy vähintään kaksi identtistä järjestettyä poolia, joissa eri pooleissa olevat verrattavat koetti-met on varustettu toisistaan erotettavissa olevilla rekisteröitävillä merkkiaineilla.

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että toisistaan erotettavissa olevat rekisteröitävät merkkiaineet emittoivat eri emissioaallonpituuksilla.

26. Patenttivaatimusten 14-25 mukaisen testipakkauksen käyttö sisäisistä kontrollimekanismeista tai ulkopuolisista ärsykkeistä johtuvien solu- tai kudosnäytteiden polynukleo-tidien määrien muutosten arvioimiseen.

27. Patenttivaatimusten 14-25 mukaisen testipakkauksen käyttö hoitomodaliteetin tehon, ' · · epidemiologisten tilanteiden, hygieenisten olosuhteiden tai mikrobiologisten populaatioiden arviointiin.

28. Patenttivaatimusten 1-13 mukaisen menetelmän käyttö sisäisistä kontrollimekanis-meistä johtuvan tai ulkopuolisista ärsykkeistä johtuvien solu- ja kudosnäytteiden poly-nukleotidien määrien muutosten arvioimiseen. 1

” 29. Patenttivaatimusten 1-13 mukaisen menetelmän käyttö hoitomodaliteetin tehon, epi- ' . demiologisten tilanteiden, hygieenisten olosuhteiden tai mikrobiologisten populaatioiden ‘ ; arviointiin. 32 11 51 39