ES2391792T3 - Método para la diferenciación de EII y SII y la distinción adicional entre tipos patológicos de EII - Google Patents

Abstract

Método in vitro para la determinación de perfiles de expresión génica en una muestra tomada de un cuerpohumano en un método para la diferenciación entre enfermedad inflamatoria del intestino (EII) y síndrome del intestinoirritable (SII) en un paciente, en el que al menos dos genes marcadores se eligen de los siguientes genes y sus correspondientes proteínas:Gen: SEQ.ID.NO. N.º DE REG. DE PROTEÍNASLC6A14 NM_007231 NP_009162SLC26A2 NM_000112 NP_000103GRO-1 NM_001511 NP_001502MMP-7 BC003635 NP_002414MAP-17 NM_005764 NP_005755RegIV BC017089 NP_114433vanina 1 NM_004666 NP_004657y en el que se determinan los niveles de expresión de dichos al menos dos genes y sus correspondientes proteínas paraobtener un perfil de expresión y en el que el perfil de expresión se compara con los perfiles de expresión de muestras depacientes con EII y SII conocidos.

Description

Metodo para la diferenciacion de Ell y Sll y la distincion adicional entre tipos patologicos de Ell

La presente invencion se refiere a un metodo para su uso en el diagnostico de enfermedad inflamatoria del intestino usando un enfoque multigenico. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un metodo para su uso e n el 5 diagnostico y/o la diferenciacion de enfermedad inflamatoria del intestino (Ell) de sindrome del intestino inflamatorio (Sll) determinando la expresion de al menos un gen o genes marcadores especificos, por ejemplo usando oligonucleotidos que amplifican especificamente dichos genes marcadores, o determinando la expresion de las correspondientes proteinas, por ejemplo usando anticuerpos que reconocen especificamente las proteinas codificadas por dicho gen o genes marcadores especificos. El metodo de diagnostico puede usarse ventajosamente en el diagnostico y la diferenciacion

10 tempranos de estas enfermedades debido a la precision y reproducibilidad mejoradas.

Antecedentes de la invencion

La enfermedad inflamatoria del intestino (Ell) describe un estado de inflamacion intestinal con recaida cronica. La comprension actual de la patogenia de la enfermedad sugiere una interaccion compleja de multiples factores ambientales y geneticos. Provoca una morbilidad significativa en poblaciones de origen europeo, teniendo las dos formas principales

15 (enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (CU)) una prevalencia combinada de 150-250/10.000. Ambas formas de Ell tienen una incidencia maxima al comienzo de la vida adulta pero puede desarrollarse en cualquier etapa. Afectan a ambos sexos en una extension aproximadamente igual. Los factores de riesgo ambientales para el desarrollo de Ell estan escasamente definidos. El factor mejor caracterizado es el tabaquismo, que aumenta claramente el riesgo de desarrollar la enfermedad de Crohn pero protege frente a la colitis ulcerosa, por motivos que no estan claros.

20 El tratamiento de la enfermedad es un compromiso a largo plazo tanto para el paciente como para el medico, puesto que actualmente no hay ninguna cura para ningun estado. Aproximadamente el 30% de los pacientes con Ell se someten a cirugia durante su vida y los pacientes con Ell de larga evolucion corren un riesgo considerable de desarrollar cancer colorrectal. Tres de cada diez pacientes con Ell no responden a la principal terapia medica disponible hoy en dia, incluso cuando se usan dosis altas, provocando efectos secundarios considerables.

25 La colitis ulcerosa provoca normalmente sintomas de diarrea hemorragica y urgencia fecal. La inflamacion implica al recto, y puede extenderse de manera continua a partes de, o todo el co lon proximal. El examen histologico revela un infiltrado de celulas inflamatorias cronicas, que se limitan a las capas superficiales de la mucosa colonica. Los granulomas no son una caracteristica. La enfermedad de Crohn es bastante mas pleomorfica. Se caracteriza patologicamente por segmentos discontinuos de inflamacion transmural, que pueden afectar a cualquier parte del tracto gastrointestinal

30 desde la boca hasta el ano, pero que implican de la manera mas comun la region ileocecal. Los granulomas son un distintivo histologico pero las caracteristicas clinicas son bastante variables dependiendo del sitio de afectacion del intestino. Si el colon esta inflamado, los sintomas pueden imitar exactamente a los de la colitis ulcerosa.

Es obvio que una posibilidad de distinguir que clinicamente CU de EC colonica en un estadio temprano proporcionaria enormes beneficios tanto al paciente como al medico. Permitiria el disefo de regimenes de tratamiento precisos, impe

35 diria el uso de medicamentos innecesarios y reduciria los costes de tratamiento.

El sindrome del intestino irritable, o Sll, tambien es un trastorno gastrointestinal en el que los musculos lisos de la pared intestinal se vuelven hipersensibles a desencadenantes tales como estres o incluso cafe y provocan meteorismo, nauseas, vomitos y estrefimiento o diarrea. Desafortunadamente, como muchos de los sintomas son similares a los de Ell, Sll a menudo se diagnostica mal.

40 Existen unos cinco millones de casos de Sll en los EE.UU. solo. Permitir que se distinga Sll de los casos de Ell mas graves reduciria el numero de visitas innecesarias al medico por parte de los pacientes con Sll que se sospecha que tienen Ell. Tambien ayudaria al medico a elegir el tipo de tratamiento mas apropiado.

La bibliografia de patentes indica que los metodos disponibles para distinguir entre diferentes formas de Ell, y en particular la diferenciacion entre CU y EC, aparte de los ejemplos facilitados anteriormente de diferentes procedimientos de

45 examen, se han centrado en metodos basados en anticuerpos.

Por ejemplo, el documento WO 03/036262 describe un metodo y kit que se proporcionan para la diferenciacion de EC de otras dolencias gastrointestinales, tales como CU y Sll, usando la presencia de anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae fecales (ASCA) como marcador para la enfermedad de Crohn. El kit incluye un inmunoensayo ligado a enzimas y otro inmunoensayo que utiliza anticuerpos especificos para inmunoglobulinas humanas para la medicion de ASCA

50 endogenos totales en una muestra fecal humana.

El documento WO01/58927 describe metodos de diagnostico para detectar enfermedades asociadas con una respuesta de autoantigeno frente a hTM en tejido afectado, y en particular CU.

Otro enfoque de anticuerpos estudiado intensamente (veanse las patentes estadounidenses 5.691.151; 5.830.675; y 6.033.864) son los autoanticuerpos frente a neutrofilos (anticuerpos citoplasmaticos anti-neutrofilos perinucleares atipi

55 cos) P-ANCA. Se encuentran principalmente en CU (50-67%) pero tambien en EC (6-15%). Se penso que la combina

cion de ANCA y ASCA seria muy util en pacientes con colitis indeterminada. Pero un hallazgo notable fue que aproximadamente el 50% de los pacientes con colitis indeterminada son pacientes seronegativos. Esto significa que no desarrollan anticuerpos para ASCA yANCA y, por tanto, no pueden diagnosticarse durante, en promedio, casi 10 afos (Bossuyt X., Clin Chem 2006, 52:2, 171-181)

El documento WO 2004/001073 describe los siete genes referidos en la presente invencion como marcadores de diagnostico para CU. La expresion de estos marcadores a nivel de ARN se determina en biopsias de mucosa del colon.

Sumario de la invencion

Sigue existiendo una necesidad de metodos mejorados para la seleccion precisa, rapida y fiable de pacientes que notifican problemas gastrointestinales, y para distinguir entre pacientes con Ell y sin Ell, por ejemplo pacientes que padecen Sll. Seria particularmente deseable, tanto desde una perspectiva de un paciente como de un hosp ital, si pudiera realizarse una primera seleccion antes de que el paciente se remita a un examen ileocolonoscopico.

Tambien existe una necesidad de diagnostico de colitis ulcerosa, en particular en el contexto de la distincion entre colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn en pacientes con Ell.

Un objetivo de la presente invencion es poner a disposicion metodos segun se reivindica para estos fines. Un objetivo particular es poner a disposicion un metodo que hace posible alcanzar un diagnostico fiable en un estadio temprano de la enfermedad. Otro objetivo es poner a disposicion un metodo para un metodo fiable y aun simplificado y menos invasivo para seguir la respuesta al tratamiento y que confirme la mejora en un paciente que se somete a tratamiento.

Otro objetivo es hacer posible realizar una primera seleccion usando tecnicas de toma de muestras no invasivas o minimamente invasivas, en contraposicion a las biopsias o el examen ileocolonoscopico usados normalmente. Tambien el examen con enema de bario debe clasificarse como procedimiento invasivo, debido a las considerables molestias y tension que se ejercen sobre el paciente. Tambien es un objetivo poner a disposicion metodos segun se exponen en las reivindicaciones para distinguir entre Ell y Sll, y EC y CU tambien en casos dificiles, en los que el cuadro clinico puede ser muy similar.

Objetivos adicionales subyacentes a la invencion, asi como las soluciones ofrecidas por la invencion y las ventajas asociadas resultaran evidentes para un experto tras el estudio de la descripcion, los ejemplos y las reivindicaciones.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que una diferenciacion entre Ell y Sll, y en el caso de haber determinado que el paciente padece Ell, una distincion adicional entre CU y EC, se hace posible mediante un enfoque multigenico en el que se estudian los perfiles de expresion genica en una muestra tomada del cuerpo humano, preferiblemente tomada de heces o sangre de un paciente, o una muestra de biopsia obtenida de una zona inflamada en los intestinos.

La presente invencion se basa en la identificacion de posibles genes marcadores que o bien colectivamente o bien en subgrupos, forman la base para una distincion entre Ell y Sll.

Una realizacion de la invencion, confirmada experimentalmente, es que la cuantificacion de los niveles de expresion de varios genes especificos y las correspondientes proteinas pueden utilizarse en la determinacion de manera precisa y sencilla, usando muestras de heces o sangre, si el paciente padece Ell, y en un analisis de seguimiento usando una biopsia, determinar si el paciente esta afectado de CU o EC

Mas especificamente, se proporcionan metodos que permiten la deteccion de siete (7) marcadores distintos, individualmente o en subgrupos de los mismos, usando oligonucleotidos especificos de genes o anticuerpos para la cuantificacion de los niveles de expresion de dichos marcadores. Los oligonucleotidos o anticuerpos estan disefados para reconocer especificamente la correspondiente secuencia genica o proteina marcadora. Se da a conocer un ensayo y kit para la deteccion y monitorizacion del estado de expresion de dichos siete genes marcadores o subconjuntos de los mismos en una muestra biologica. Los genes marcadores son (numeros de registro entre parentesis): SLC6A14 (NM 007231); SLC26A2 (NM 000112); GRO-1 (NM 001511); MMP-7 (BC003635); MAP-17 (NM 005764); ReglV (BC017089) tambien conocido como GlSP, y vanina 1 (NM 004666).

Los resultados obtenidos por los inventores indican quevanina 1 es un gen marcador preferido cuando se analiza el ARN en una muestra de sangre. Tambien los marcadores SLC26A2, MAP-17 muestran utilidad en sangre.

El ensayo es preferiblemente un metodo y kit para la cuantificacion de ARN basado en metodos de PCR.

Alternativamente, el ensayo es un ensayo basado en anticuerpos, sin cultivo para la deteccion de dichas proteinas marcadoras.

Otra realizacion de la presente invencion es, por tanto, un metodo para detectar eficazmente CUo EC en un estadio temprano usando anticuerpos que se unen especificamente a proteinas expresadas porlos genes humanos SLC6A14, SLC26A2, GRO-1, MMP-7, MAP-17, Reg lV y vanina 1 en una muestra tomada del cuerpo humano. Los resultados obtenidos por los inventores indican que GRO-1 y ReglV son las proteinas marcadoras preferidas cuando la fuente de la muestra son heces humanas, y vanina 1, GRO-1 y MMP-7 cuando la muestra es sangre.

Otra realizacion de la presente invencion es un metodo para diagnosticar CU y EC midiendo el nivel de expresion de las proteinas SLC6A14, SLC26A2, GRO-1, MMP-7, MAP-17, Reg lV y vanina 1 en una muestra mediante una reaccion de union antigeno-anticuerpo usando un anticuerpo que se une especificamente a una proteina expresada a partir de g enes humanos que codifican para SLC6A14, SLC26A2, GRO-1, MMP-7, MAP-17, Reg lV y vanina 1.

Realizaciones adicionales de la invencion son metodos para la determinacion de la respuesta de un paciente a un tratamiento, la tasa de mejora durante el tratamiento y para estimar el pronostico para la recuperacion.

Breve descripcion de los dibujos

La invencion se dara a conocer en detalle en la siguiente descripcion, los ejemplos y los dibujos, en los que

La figura 1 muestra los perfiles de expresion de 10 casos de Sll y 10 de Ell derivados de analisis en tiempo real de muestra de heces. Se representan graficamente los siete marcadores diferentes en el eje x, y se representan graficamente los correspondientes valores de delta Ct del analisis PCR en el eje y (1 = SLC6A14; 2 = SLC26A2; 3 = GRO1; 4 = MMP-7; 5 = MAP17; 6 = GlSP; 7 = vanina 1).

La figura 2 muestra los perfiles de expresion en muestras de heces y biopsia derivados de analisis de PCR en tiempo real. Se representan graficamente los siete marcadores diferentes en el eje x, y se representan graficamente los correspondientes valores de delta Ct del analisis PCR en el eje y (1 = SLC6A14; 2 = SLC26A2; 3 = GRO1; 4 = MMP-7; 5 = MAP17; 6 = GlSP; 7 = vanina 1). [db = derivado de biopsia; dh = derivado de heces]

La figura 3 muestra los perfiles de expresion en muestras de biopsia derivados de analisis en tiempo real. Se representan graficamente los siete marcadores diferentes en el eje x, y se representan graficamente los correspondientes valores de delta Ct del analisis PCR en el eje y (1 = SLC6A14; 2 = SLC26A2; 3 = GRO1; 4 = MMP-7; 5 = MAP17; 6 = GlSP; 7 = vanina 1).

La figura 4 muestra un grafico ROC como resultado del analisis en tiempo real de 18 pacientes sin Ell y 63 con Ell con los siete marcadores seguido por un analisis con un algoritmo de clasificacion. El area bajo la curva ROC (AUC) de 0,903 ilustra el alto potencial discriminatorio de todos los marcadores en conjunto.

La figura 5 muestra un grafico ROC como resultado del analisis en tiempo real de 18 pacientes sin Ell y 63 con Ell con solo dos marcadores (GRO-1 y Reg lV) seguido por un analisis con un algoritmo de clasificacion. El area bajo la curva ROC (AUC) de 0,892 ilustra el alto potencial discriminatorio de estos marcadores solos.

Descripcion detallada

Antes de que se describa y se de a conocer la presente invencion, ha de entenderse que un experto en la tecnica apreciara inmediatamente que la presente invencion esta bienadaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y las ventajas mencionados, asi como aquellos objetos, fines y ventajas inherentes en el presente documento. Los presentes ejemplos, junto con los metodos, procedimientos, tratamientos, moleculas y compuestos especificos descritos en el presente documento son representativos actualmente de realizaciones preferidas, son a modo de ejemplo y no pretender ser limitaciones del alcance de la invencion.

Tambien ha de entenderse que la terminologia usada en el presente documento es para los fines de describir realizaciones particulares solo, y no pretende ser limitativa. Debe observarse que, tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/o", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una secuencia" incluye mas de una de tales secuencias y similares.

En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hara referencia a varios terminos que deben definirse para tener los siguientes significados:

Tal como se usa en e l presente documento, el termino "cebador de ADN complementario" significa un oligonucleotido, que se aparea con el molde de ARN en una orientacion particular para permitir la sintesis de una hebra de ADN naciente en presencia de transcriptasa inversa en la muestra biologica en las condiciones descritas en el presente documento.

Tambien tal como se usa en el presente documento, las "condiciones" en las que se sintetiza una hebra de ADN incluyen la presencia de nucleotidos, cationes y agentes de tamponamiento apropiados en cantidades y a temperaturas tales que el molde de ARN y el cebador de ADN se aparearan y se incorporaran oligonucleotidos en una hebra de ADN sintetizada si no se inhibe la transcriptasa inversa por el farmaco inhibidor de transcriptasa inversa. Se exponen condiciones a modo de ejemplo en los ejemplos a continuacion. Se han optimizado las condiciones descritas a partir de otros protocolos de sintesis de RT/ADNc. Se sabe generalmente que pueden establecerse otras condiciones para la optimizacion de una reaccion de transcriptasa inversa particular basandose en protocolos bien conocidos por un experto habitual en la tecnica.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "par de cebadores" se refiere a dos cebadores, teniendo uno una designacion directa y teniendo el otro una designacion inversa con relacion a sus or ientaciones respectivas en una molecula de ADN bicatenario que consiste en una secuencia sentido y una antisentido, de manera que en las condicio

nes de amplificacion descritas en el presente documento, el cebador directo se aparea con y ceba la amplificacion de la secuencia sentido y el cebador inverso se aparea con y ceba la amplificacion de la secuencia antisentido. Pueden seleccionarse cebadores para su uso en la reaccion de amplificacion basandose en, tener una minima complementariedad con otros cebadores en la reaccion (para minimizar la formacion de dimeros de cebadores) y tener valores de Tm con el intervalo de temperaturas de reaccion apropiado para el metodo de amplificacion, preferiblemente PCR. Ademas, pueden seleccionarse cebadores para aparearse con regiones especificas del molde de ARN de manera que el producto de amplificacion de ADN resultante oscila en tamafo entre 100 y 500 pares de bases de longitud y lo mas preferiblemente de aproximadamente 300 pares de bases de longitud.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos "detectar" o "deteccion" del ADN amplificado se refieren a determinar cualitativa o cuantitativamente la presencia de la hebra de ADN amplificada, que solo se sintetiza si la transcriptasa inversa es resistente al farmaco inhibidor de transcriptasa inversa afadido a la mezcla de ensayo. La amplificacion del ADN sintetizado puede detectarse mediante cualquier metodo para la deteccion de ADN conocido en la tecnica. Por ejemplo, la deteccion del ADN amplificado puede ser mediante ensayo de hibridacion por transferencia de tipo Southern, mediante visualizacion de los productos de amplificacion de ADN de peso molecular especifico sobre geles de agarosa tefidos con bromuro de etidio, mediante medicion de la incorporacion de nucleotidos radiomarcados en la hebra de ADN sintetizada mediante autorradiografia o medicion de centelleo.

En el metodo de la presente invencion, la amplificacion por PCR se consigue preincubando todos los reactivos de la PCR y una muestra que contiene un acido nucleico diana en presencia de cebadores especificos de genes apropiados y una enzima polimerasa termoestable. La mezcla de reaccion resultante se calienta de forma ciclica en condiciones que permiten la formacion y amplificacion de productos de extension de cebadores.

Los reactivos requeridos para la PCR los conocen los expertos en la tecnica, y generalmente incluyen al menos dos cebadores de oligonucleotido que son suficientemente complementarios a regiones conservadas del acido nucleico diana para hibridarse con las mismas, cuatro nucleosidos trifosfato diferentes, un agente de polimerizacion termoestable y cualquier cofactor requerido para el agente de polimerizacion. Nucleosidos trifosfato preferidos son los desoxirribonucleosidos trifosfato dATP, dCTP, dGTP y dTTP o dUTP, denominados colectivamente dNTP. Los nucleosidos trifosfato estan disponibles comercialmente.

Los cebadores incluyen oligonucleotidos que se producen de manera natural o producidos de manera sintetica que pueden aparearse con el acido nucleico diana y que actuan como punto de inicio de la sintesis de acido nucleico en condiciones apropiadas, es decir, en presencia de nucleosidos trifosfato, un agente de polimerizacion, temperatura, pH y tampon adecuados. Los cebadores tienen secuencias suficientemente complementarias al acido nucleico diana para hibridarse con el mismo, y son de suficiente longitud, normalmente de desde 10-60 nucleotidos, para cebar la sintesis de productos de extension en presencia de un agente de polimerizacion. Tambien pueden producirse cebadores de manera sintetica mediante sintesis automatica, mediante metodos bien conocidos por un experto habitual en la tecnica.

Se conocen bien las consideraciones de disefo para cebadores en la tecnica. Se seleccionan cebadores para que sean sustancialmente complementarios a las secuencias de las hebras del acido nucleico especifico que va a amplificarse, de manera que el producto de extension sintetizado a partir de un cebador, cuando se separa de su complemento, puede servir como molde para el producto de extension del otro cebador. Preferiblemente, los cebadores son exactamente complementarios con la region diana. Se subraya que los pares de cebadores facilitados en la presente memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones pueden sustituirse por cebadores funcionalmente equivalentes, que presentan especificidad frente a los genes marcadores, sin apartarse del alcance de la invencion.

Los presentes inventores recogieron muestras de heces (muestras de materia fecal) de 33 pacientes con CU y24 con EC para el analisis con PCR en tiempo real para determinar si podrian discriminar entre CU y EC tal como se describe para material de biopsia. Sorprendentemente, los inventores descubrieron que los perfiles de expresion de estos marcadores eran sustancialmente iguales para CU y EC en la muestra de heces. Como muestras de control, se usaron algunos casos de Sll. Estos mostraron un patron de expresion diferente para los genes como las dos formas principales de Ell. Los inventores analizaron en total 18 casos de Sll frente a los 63 casos de E ll. Los resultados en la figura 1 muestran una clara diferencia en el perfil de expresion entre Sll y Ell para 10 casos de Sll y 10 de Ell.

Otro hecho sorprendente fue que los genes que estan regulados por incremento para CU en biopsias estaban ahora regulados por disminucion en muestras de heces (el marcador 6 y tambien en cierta medida el marcador 5). Tambien el marcador 2 (SLC26A2) estaba originariamente regulado por disminucion en CU pero se encontro que ahora estaba regulado por incremento en comparacion con el marcador 1 (SLC14A6). En la figura 2, se muestran los perfiles de expresion de muestras de heces y biopsia de 3 pacientes con Sll, 3 con CU y 3 con EC.

En el caso de los pacientes con Sll, el perfil de expresion de los genes no cambia entre las diferentes muestras. Sin embargo, cuando se comparan los perfiles en los casos de CU, puede observarse una tendencia opuesta de las dos curvas, especialmente en cuanto a la expresion contraria de los marcadores 2, 5 y 6. Tambien para EC, el patron de expresion cambia en las biopsias (vease la figura 3).

Las proteinas transportadoras de solutos (SLC, solute carrier proteins) comprenden una familia muy grande de moleculas de transporte dependientes de energia y tienen papeles fisiologicos criticos en el transporte de nutrientes y pueden

utilizarse como mecanismo para aumentar la absorcion de farmacos. Sin embargo, existe una comprension limitada de estas proteinas a nivel molecular debido a la ausencia de estructuras cristalinas de alta resolucion.

En total, el 1-2% de los adultos y el 6-8% de los nifos que padecen de calculos renales tienen cistinuria, un defecto en el transporte de aminoacidos, que conduce a altas concentraciones de cistina en la orina. Se han implicado dos genes, el miembro 1, transportador de aminoacidos basicos y neutros, cisteina, de la familia de transportadores de solutos 3 (SLC3A1) que codifica para la proteina relacionada con el sistema de transportador de aminoacidos, y el miembro 9 de la familia de transportadores de solutos 7 (SLC7A9). Se cree que estos dos transportadores de solutos estan implicados en la formacion de calculos que pueden conducir en ultima instancia a infeccion de las vias urinarias, y eventualmente, a insuficiencia renal.

Los inventores han identificado ahora dos transportadores de solutos (SLC6A14 y SLC26A2) conocidos cuya expresion se altera significativamente en Ell.

La quimiocina CXC, oncogen alfa relacionado con el crecimiento (Gro-alfa tambien conocido como GRO 1) es tal como se describe una citocina y como tal puede alterar las respuestas migratorias de numerosos tipos celulares en zonas locales de inflamacion. Se ha descrito que se sobreexpresa en corneas inflamadas humanas (Spandau et al ., 2003) y ademas, tambien se ha mostrado que ratas inducidas quimicamente para que presenten inflamacion del intestino, muestran niveles regulados por incremento de GRO 1 (Hirata et al., 2001). Usando un enfoque de microalineamiento de ADNc, Heller et al., 1997 describen la participacion novedosa de la quimiocina Gro-alfa en artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria del intestino. Keiichi et al., 2006 notificaron un aumento de las concentraciones circulantes del oncogen relacionado con el crecimiento (GRO)-a en pacientes con Ell. Aunque se describe en lsaacs et al., 1992, que la expresion de GRO1 en CU es mayor que la observada en EC, en el presente documento se ha demostrado que existe una correlacion inversa de CU frente a EC con respecto a los niveles de expresion de GRO 1. En ultimo lugar, Lawrence et al., 2001 describen la identificacion de GRO 1 como que esta regulado por incremento en CU, pero el disefo del estudio fue tal que las muestras de biopsia se combinaron antes del analisis, por tanto no fue posible saber si GRO 1 estaba regulado por incremento en mas de 1 paciente.

Se descubrio por primera vez la matrilisina o (metaloproteinasa de la matriz 7) en el utero de rata en involucion; tambien se ha conocido como metaloproteinasa uterina, supuesta metaloproteinasa (Pump-1) y metaloproteinasa de la matriz 7 (MMP-7). Es el miembro mas pequefo (28 kDa) de una familia de 15 MMP que en conjunto pueden degradar la mayor parte de las macromoleculas de la matriz extracelular. Esta familia se revisa brevemente; todos los miembros son metaloproteinasas de zinc que se producen en forma zimogena con el zinc del sitio activo bloqueado por cistina. La matrilisina puede degradar una amplia gama de gelatinas, proteoglicanos y glicoproteinas de la matriz y puede activar otras varias MMP incluyendo colagenasa (revisado en Woessner, 1996).

La matrilisina se expresa frecuentemente en diversos tipos de cancer incluyendo canceres de colon, estomago, prostata y cerebro. Estudios previos han sugerido que la matrilisina desempefa papeles importantes en la progresion y metastasis del cancer de colon. Recientemente, se ha descrito por Newell et al., 2002 que existe un aumento de la expresion de matrilisina en diferentes estadios de neoplasia asociada a CU. Este trabajo, sin em bargo, no determina si tal expresion aumentada es un resultado de CU o se debe mas bien a la presencia de neoplasia.

La proteina asociada a membrana 17 (MAP-17) o conocida si no como DD96 se identifico originariamente como regulada por incremento en carcinomas con un posible papel en la modulacion de la replicacion celular y el crecimiento tumoral. Nuevos hallazgos mostraron que tambien desempefa un papel en la expresion en superficie de receptores escoba (scavenger receptors) de clase B tipo l en higado regulando PDZK1, lo que da como resultado un nuevo nombre SPAP para la proteina asociada a PDZK1 pequefa (ldentification of small PDZK1-associated protein, DD96/MAP-17, as regulator of PDZK1 and plasma high density lipoprotein levels; Silver et al. J Biol Chem 2003, 278 (31), pags. 28528-32).

Reg lV es una proteina secretada y miembro de la familia multigenica Reg que se ha implicado funcionalmente en la regeneracion, proliferacion y diferenciacion del pancreas, el higado y la mucosa gastrointestinal. Reg lV en particular esta regulado por incremento en tumores malignos del tracto gastrointestinal y esta asociado con la diferenciacion intestinal y neuroendocrina de carcinomas de estomago y gastricos (carcinoma colorrectal, adenocarcinomas de colon); (ReglV activates the epidermal growth factor receptor/Akt/Ap-1 signaling pathway in colon adenocarcinomas; Bishnupuri et al ., Gastroenterology 2006 130 (1), pags. 137-49).

La panteteinasa (EC 3.5.1.) es una enzima ubicua que se ha mostrado in vitro que recircula el acido pantotenico (vitamina B5) y produce cisteamina, un potente antioxidante. La enzima esta codificada por el gen de la vanina 1 y se expresa ampliamente en tejidos de raton. La vanina 1 es una panteteinasa anclada a GPl, y por consiguiente una ectoenzima. Se ha sugerido que vanina/panteteinasa podrian estar implicadas en la regulacion de algunas funciones inmunitarias quiza en el contexto de la respuesta al estres oxidativo (Pitari et al., 2000).

Se describen metodos para analizar la calidad y la cantidad del ARNm transcrito en varios manuales de laboratorio (por ejemplo, enSambrook y Russell, 2001) y se conocen bien por un experto en la tecnica. Estos metodos comprenden la proteccion de ribonucleasas, extension de cebadores, transferencia de tipo Northern, hibridacion por inmunotransferencia puntual y PCR convencional o en tiempo real.

Tradicionalmente, se ha medido la cantidad de un ARNm particular producido, y por tanto el estado de activacion de un gen mediante transferencia de tipo Northern. Se separa el ARN total aislado de una muestra mediante electroforesis en gel de agarosa, y se trata con sonda con una sonda de ADN complementario especifica para el gel de interes. En la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) convencional, se somete a transcripcion inversa el ARN total aislado de la celula o el tejido que va a analizarse para dar un ADNc de primera hebra (RT-PCR), que se usa entonces como molde para amplificar un amplicon bicatenario con cebadores de oligonucleotidos especificos diana. En ambas tecnicas, la deteccion se basa en marcadores detectables, tales como colo rantes fluorescentes o isotopos radiactivos. Tambien las tecnicas desarrolladas recientemente conocidas como microalineamientos o chips de ADN se basan en hibridar el ADN diana con cebadores especificos diana complementarios, lavar el ADN no unido y cuantificar el ADN diana unido. Las sondas y los cebadores usados en las reacciones de hibridacion pueden disefarse basandose en la secuencia de nucleotidos del gen marcador o la secuencia de aminoacidos de la proteina traducida, correspondiente al gen marcador. Se describe un metodo de hibridacion cuantitativa conveniente para determinar variaciones en las cantidades de ARN expresado en la solicitud de patente internacional WO 2002/055734.

Preferiblemente, la "expresion genica de marcadores" puede cuantificarse con PCR en tiempo real, tambien denominada PCR cuantitativa en tiempo real. El metodo sigue el patron general de la reaccion en cadena de la polimerasa, pero la region amplificada del ADN diana se cuantifica tras cada tanda de amplificacion usando colorantes fluorescentes, tales como verde SYBR que se intercalan con sondas de oligonucleotidos de ADN modificado o ADN bicatenario que fluorescen cuando se hibridan con un ADN complementario. Frecuentemente, la PCR en tiempo real se combina con transcripcion inversa para cuantificar ARNm de baja abundancia. Pueden analizarse los datos mediante software informatico, tal como sistemas rapidos de PCR en tiempo real de Applied Biosystems 7500 o 7500, para calcular la expresion genica relativa entre varias muestras, o el numero de copias de ARNm basandose en una curva patron. La cuantificacion relativa (CR) se usa comunmente para comparar los niveles de expresion de alelos de tipo natural con mutados o los niveles de expresion de un gen en diferentes tejidos. La CR determina el cambio en la expresion de un gen diana en una muestra de prueba con relacion a la misma secuencia en una muestra basal o de calibrador (una muestra usada como base para resultados comparativos). La muestra de calibrador puede ser un control no tratado o una muestra a tiempo cero en un estudio de transcurso temporal. Usando un control endogeno o intrinseco, es posible normalizar la cuantificacion de una diana de ADNc para las diferencias en la cantidad de ADNc afadido a cada reaccion. Normalmente, se usan genes de mantenimiento tales como 1-actina, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y ARN ribosomico (ARNr) como controles endogenos, porque sus niveles de expresion son relativamente estables. Se necesitan reacciones duplicadas por muestra y un control endogeno para garantizar la significacion estadistica.

Los anticuerpos especificos de proteinas se purifican preferiblemente a partir de antisuero obtenido inmunizando proteina antigenica en un animal. Mas preferiblemente, los anticuerpos especificos de proteinas son anticuerpos policlonales purificados a partir del suero obtenido inmunizando proteina antigenica en un conejo.

Para sintetizar un anticuerpo que reconoce especificamente una proteina, en primer lugar se adquiere la proteina. La proteina puede sintetizarse usando secuencias de aminoacidos conocidas o producirse en tipos de proteinas recombinantes mediante metodos de ingenieria genetica. Por ejemplo, puede prepararse proteina recombinante mediante un metodo que comprende preparar un vector de expresion que expresa la proteina en forma de una proteina recombinante usando la secuencia de bases del gen expuesto en la base de datos GenBank del programa NlH; obtener un transformante mediante la transformacion del vector de expresion en E. coli para producir proteina recombinante; y cultivar el transformante para aislar/purificar la proteina recombinante humana.

Puede realizarse el diagnostico Ell (por ejemplo, CU y EC) mediante una reaccion de union antigeno-anticuerpo usando los anticuerpos especificos para las proteinas adjuntas en esta invencion, determinando la expresion de estas proteinas en una muestra. El nivel de expresion puede detectarse mediante una tecnica conocida en la tecnica, incluyendo ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELlSA), radioinmunoensayo (RlA), ensayo de tipo sandwich y analisis por inmunotransferencia de tipo Western o inmunotransferencia sobre un gel de poliacrilamida asi como ensayos inmunohistoquimicos.

Como muestra (especimen), se usan preferiblemente tejidos, liquidos corporales, lo mas preferiblemente sangre y heces.

Una realizacion de la invencion es un metodo para su uso en la diferenciacion entre enfermedad inflamatoria del intestino (Ell) y sindrome del intestino irritable (Sll) en un paciente, en el que se determinan los niveles de expresion de al menos dos marcadores en una muestra tomada de dicho paciente, eligiendose dichos marcadores del grupo que comprende los siguientes genes y sus correspondientes proteinas (tabla 1):

Tabla 1.

Gen:

SEQ.lD.NO. N.D DE REG. DE PROTEiNA

SLC6A14 NM 007231

NP 009162

SLC26A2 NM 000112

NP 000103

GRO-1

NM 001511 NP 001502

MMP-7

BC003635 NP 002414

MAP-17

NM 005764 NP 005755

ReglV

BC017089 NP 114433

vanina 1

NM 004666 NP 004657

Otra realizacion de la invencion es un metodo en el que, en caso de que este indicada enfermedad inflamatoria del intestino, se realiza una diferenciacion entre colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn determinando los niveles de expresion de al menos dos marcadores en una muestra tomada de dicho paciente, eligiendose dichos marcadores del grupo presentado en la tabla 1 anteriormente.

Ademas, segun una realizacion de la invencion se monitoriza la actividad patologica, y se realiza una distincion entre una fase activa y pasiva decolitis ulcerosa o enfermedadde Crohn, basandose en el patron de expresion de dicho al menos u n ma rcador; un g en o corresp ondiente protein a de fragmentos de los mis mos. Preferibl emente, se us an SLC6A14 y GRO-1, o alternativamente o en combinacion de los mismos con Reg lV y vanina 1.

En los metodos anteriores, dicha muestra es preferiblemente una de una muestra de materia fecal, sangre, plasma, suero y muestras de biopsia, lo mas preferiblemente una muestra de materia fecal o una muestra de sangre.

Preferiblemente, la determinacion se realiza en primer lugar en una muestra de materia fecal, con el fin de discriminar entre Sll y Ell. Si esta indicada Ell, se realiza un analisis adicional con una muestra de biopsia, con el fin de discriminar entre CU y EC. El analisis de las muestras tanto de materia fecal como de biopsia puede repetirse con el fin de monitorizar la progresion de la enfermedad o la recuperacion del paciente.

Segun una realizacion de la invencion, se determinan los niveles de expresion usando al menos dos anticuerpos que pueden identificar dichas al menos dos proteinas o un fragmento de las mismas, poniendo en contacto al menos una parte de dicha muestra con dichos al menos dos anticuerpos; ymonitorizacion de la extension de la reaccion entre la muestra y los anticuerpos puestos en contacto.

Segun una realizacion de la invencion, las etapas de puesta en contacto y monitorizacion se llevan a cabo mediante la extraccion de las proteinas de la muestra y la realizacion de un ensayo para determinar la cantidad de al menos dos de las proteinas enumeradas en la misma.

Preferiblemente, la reaccion de union antigeno-anticuerpo se detecta mediante una tecnica cualquiera seleccionada del grupo que consiste en ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELlSA), radioinmunoensayo (RlA), ensayo de tipo sandwich, inmunotransferencia de tipo Western, analisis por inmunotransferencia o un metodo inmunohistoquimico.

Alternativamente, las etapas de puesta en contacto y monitorizacion se llevan a cabo mediante la reaccion inmunohistoquimica de la muestra del paciente y los anticuerpos y luego mediante la deteccion de las reacciones en la muestra.

Segun la invencion, los anticuerpos son policlonales o monoclonales.

Tambien se da a conocer un kit adecuado para su uso en la diferenciacion entre enfermedad inflamatoria del intestino y sindrome del intestino irritable en un paciente, comprendiendo dicho kit al menos dos anticuerpos que pueden identificar al menos dos proteinas o fragmentos de proteina elegidos del grupo que comprende las proteinas presentadas en la tabla 1 anteriormente, y medios para detectar la extension de la reaccion de los anticuerpos con una muestra.

Ademas, se da a conocer un kit adecuado para la diferenciacion entre colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, comprendiendo preferiblemente dicho kit al menos dos anticuerpos que pueden identificar al menos dos proteinas o fragmentos de proteina elegidos del grupo que comprende las proteinas presentadas en la tabla 1 anteriormente, detectando la extension de la reaccion de los anticuerpos con las proteinas directamente en liquidos corporales en los que los anticuerpos se acoplan a una matriz solida, y conteniendo ademas instrucciones para su uso.

En un kit tal como se da a conocer en el presente documento, se compara el patron de expresion de dichas al menos dos proteinas con un patron convencional con el fin de determinar si un paciente que padece colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn padece dicha enfermedad en su forma activa o pasiva.

Ademas, el kit incluye la proteina, fragmento de proteina o peptido proporcionado como control en una cantidad conocida.

El kit es adecuado para su uso en un inmunoensayo competitivo, y comprende ademas una fase solida, y la proteina, fragmento de proteina o fragmento de peptido se une a la fase solida. Dicha fase solida comprende preferiblemente uno

o mas de nitrocelulosa, celulosa, vidrio, plastico, placas demicrotitulacion ypocillos, tales como pocillos de microtitulacion.

Preferiblemente, se lleva a cabo la tecnica de ELlSA que usa anticuerpos especificos de las proteinas SLC6A14, SLC26A2, GRO-1, MMP-7, MAP-17, Reg lV y vanina 1 a traves de las siguientes etapas:

1) colocar un anticuerpo especifico en un reactor recubierto con una muestra y un grupo de control para inducir una reaccion antigeno-anticuerpo;

2) detectar un producto de la reaccion antigeno-anticuerpo usando un conjugado de anticuerpo secundario-marcadory una disolucion de sustrato de revelado de color de una sustancia de marcaje; y

3) comparar el resultado de deteccion de la muestra con el del grupo de control.

Puede analizarse una gran cantidad de la muestra usando una tecnica conocida tal como ELlSA, microchip biologico o sistema de microalineamiento automatico. El microchip biologico puede detectar un antigeno para la proteina de anticuerpo especifico fijando la proteina de anticuerpo especifico en un microchip biologico, provocando una reaccion entre el mismo y una muestra recogida de un individuo.

Tambien, se da a conocer un kit para diagnosticar CU y EC que comprende la combinacion de al menos dos de estos genes usando anticuerpos que reaccionan especificamente con los al menos dos genes elegidos.

El kit de diagnostico comprende un portador o fase solida, tal como una membrana de efecto mecha. Los ejemplos de materiales adecuados para una membrana de efecto mecha de este tipo incluyen, pero no se limitan a nailon, poliester, celulosa, polisulfona, poli(difluoruro de vinilideno), acetato de celulosa, poliuretano, fibra de vidrio, nitrocelulosa o similares. La fase solida tambien puede estar en forma de un microportador, particulas, membranas, tiras, papel, peliculas, perlas o placas, tales como placas de microtitulacion.

El kit de diagnostico puede diagnosticar CU y EC analizando cuantitativa y cualitativamente un antigeno de la proteina de anticuerpo mediante la reaccion de union antigeno-anticuerpo. La reaccion de union antigeno-anticuerpo puede detectarse mediante una tecnica conocida generalmente en la tecnica, incluyendo ELlSA, RlA, ensayo de tipo sandwich, inmunotransferencia de tipo Western sobre un gel de poliacrilamida y analisis por inmunotransferencia. Por ejemplo,el kit de diagnostico puede proporcionarse para usarse para ELlSA usando una placa de microtitulacion de 96 pocillos recubierta con proteina de anticuerpo monoclonal recombinante. Otro ejemplo seria el uso de tiras reactivas de diagnostico para muestras de heces o sangre.

Los controles contenidos en el kit de diagnostico incluyen controles positivos y controles negativos.

Los anticuerpos usados en el diagnostico de las diferentes muestras pueden ser policlonales o monoclonales, y pueden prepararse mediante metodos ahora bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos policlonales producidos frente al extracto del ejemplo 2 o 3 inmunizando un animal tal como un conejo y luego purificando los anticuerpos segun practicas convencionales, mientras que pueden prepararse anticuerpos monoclonales frente a dichos extractos, por ejemplo, segun el metodo de Kohler yMilstein (Nature (1975) 256:495) inmunizando un animal tal como un raton, extrayendo los esplenocitos del bazo del mismo, fusionandolos con celulas de mieloma de raton para preparar hibridomas, y seleccionando y subclonando los hibridomas, segun practicas bien conocidas.

En una realizacion preferida, el inmunoensayo usado en el metodo de la presente invencion es del tipo de ELlSA de tipo sandwich. En una mas realizacion preferida, el inmunoensayo de ELlSA de tipo sandwich implica el pretratamiento de la muestra con un tampon especifico (tampon de clarificacion) que contiene una colesterol esterasa pancreatica para disminuir la interferencia de los lipidos circulantes de la muestra en la cuantificacion de proteinas. En otra realizacion preferida, el inmunoensayo es un ensayo de inm unotransferencia de tipo Western (especialmente preferido con un control interno).

Como la sustancia de marcaje de anticuerpo secundario, se usan preferiblemente sustancias de marcaje conocidas que inducen un desarrollo de color, y los ejemplos de la sustancia de marcaje util en la pr esente invencion incluyen peroxidasa del rabano (HRP), fosfatasa alcalina, oro coloidal, fluoresceina tal como isotiocianato de poli-L-lisina-fluoresceina (FlTC) o isotiocianato de rodamina B (RlTC), y un colorante. En la presente invencion, se usa conjugado de anticuerpo de cabra anti-lgG de conejo-HRP (conjugado lgG-HRP), por ejemplo.

Preferiblemente, el cromogeno usado varia segun la sustancia de marcaje que implica el desarrollo de color, y ejemplos que pueden utilizarse del mismo incluyen 3,3�,5 5�-tetrametil-bencidina (TMB), 2,2�-azino-bis(acido 3-etilbenzotiazolin-6sulfonico) (ABTS) y o-fenilendiamina (OPD).

Mas preferiblemente, se proporciona el cromogeno en un estado en el que esta disuelto en una disolucion tampon (Na-Ac 0,1 M, pH 5,5). El cromogeno tal como TMB se descompone por la HRP usada como sustancia de marcaje del conjugado de anticuerpo secundario para producir un precipitado que desarrolla color. Se observa a simple vista el nivel de precipitacion del precipitado que desarrolla color, determinando de ese modo la presencia de un antigeno de proteina.

La disolucion de lavado incluye preferiblemente una disolucion de tampon fosfato, NaCl y Tween 20, mas preferiblemente una disolucion tampon que contiene disolucion de tampon fosfato 0,02 M, NaCl 0,13 M y Tween 20 al 0,05%. Tras la reaccion de union antigeno-anticuerpo, se suministra una cantidad apropiada de la disolucion de lavado al reactor que ha experimentado la reaccion entre el anticuerpo secundario y el conjugado antigeno-anticuerpo. Se realiza repetidamente un lavado con la disolucion de lavado de 3 a 6 veces. Se usa preferiblemente un tampon fosfato que contiene

BSA al 0,01% como disolucion de bloqueo y se usa preferiblemente una disolucion de acido sulfurico 2 N como disolucion de detencion de la reaccion enzimatica.

Se describira a continuacion el metodo dediagnostico de CU y EC enun estadio temprano mediante la deteccion de antigenos de SLC6A14, SLC26A2, GRO-1, MMP-7, MAP-17, Reg lV y vanina 1 en una muestra usando el kit de diagnostico. Se hacen reaccionar anticuerpos y muestras en los grupos de control positivoynegativo, respectivamente,y se lavan con la disolucion de lavado. Entonces, el conjugado de anticuerpo secundario marcado con una sustancia de marcaje que produce un color mediante la reaccion con el sustrato, se afade al producto resultante y se lava de nuevo con la disolucion de lavado. Entonces, se afade la disolucion que contiene el sustrato a la produccion resultante para inducir un desarrollo de color. Entonces, se mide la absorbancia a 450 nm. En este caso, la absorbancia promedio de la disolucion de antigeno patron A debe ser mayor que o igual a 0,000 y menor que o igual a 0,200. La absorbancia promedio dela disolucion de antigeno patron F debeser mayor que o igual a 1,200 y menor que o igual a 3,000. El valor medio entre los valores de absorbancia de las disoluciones de antigeno patron A y F se fija como un valor de punto de corte para usarse entonces para determinar muestras como muestras positivas o negativas. Cuando la absorbancia de una muestra es mayor que la de la disolucion de antigeno patron F, se diluye la muestra y entonces se mide de nuevo la absorbancia de la misma. La muestra que tiene una absorbancia mayor que el valor de punto de corte se identifica como positiva, y la muestra que tiene una absorbancia menor que el valor de punto de corte se identifica como negativa.

Se confirmo que el kit de diagnostico de CU/EC que contiene los anticuerpos especificos humanos para SLC6A14, SLC26A2, GRO-1, MMP-7, MAP-17, Reg lV y vanina 1, que es una nueva herramienta de diagnostico inmunologica que usa la sangre o heces del paciente (biopsia), tenia mayor precision y reproducibilidad. De manera convencional, se usa una combinacion entre endoscopia, histologia, historial de enfermedades y anticuerpos P-ANCA para el diagnostico de Ell lo que no es, sin embargo, de precision muy elevada (Bossuyt, X., Clin Chem 52 2006). Sin embargo, la prueba para el diagnostico temprano de CU y EC segun la presente invencion mostro una precision de diagnostico de aproximadamente el 95 al 97%, que es mayor de manera estadisticamente significativa que las pruebas convencionales. Por tanto, el metodo de diagnostico segun la presente invencion puede usarse de manera muy ventajosa para el diagnostico temprano de CU y EC y el diagnostico de Sll debido a que tienen alta precision y reproducibilidad.

Ejemplos

La presente invencion se ilustrara a continuacion en detalle mediante los siguientes ejemplos, sin estar limitada en modo alguno en alcance a las realizaciones especificas descritas en el presente documento.

Ejemplo 1. Recogida y almacenamiento de tejidos

Se tomaron biopsias de tejido de colon, heces y muestras de sangre de pacientes que padecian CU, EC o Sll y de voluntarios sanos.

1.1 Para el trabajo con ARN:

Se tomaron muestras de heces de pacientes que padecian CU, EC o Sll (de 5 a 10 pacientes cada uno). Se mezclaron las muestras de heces en una razon 1:1 con disolucion RNAlater® (Ambion lnc./Applied Biosystems) y se mantuvieron a

t.a. hasta su uso.

1.2 Para el trabajo con proteina:

Se tomaron muestras de heces de pacientes que padecian CU, EC o Sll. Se congel aron directamente las muestras de heces a -20DC hasta su uso. Alternativamente, se mezclan las muestras con un tampon apropiado en una razon 1:1.

Ejemplo 2. Extraccion de ARN de muestras de heces para el analisis de PCR en tiempo real

2.1 Aislamiento de ARN:

Se aislo el ARN total de todas las muestras de heces de pacientes homogeneizando en primer lugar las biopsias usando un homogeneizador de motor Pellet Pestle segun el protocolo del fabricante (Kimble / Kontes, Kimble Glass lnc.). A partir del homogeneizado, se aislo el ARN total usando el kit RNeasy® de Qiagen segun las directrices del fabricante (Qiagen Nordic AB).

2.2 Sintesis de ADNc:

Se usaron dos microgramos de cada muestra de ARN para una sintesis de ADNc de primera hebra usando 10 pM del cebador oligo-dT VN-T20 (5�-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT N V-3�). Se suministraron el tampon, los desoxinucleotidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y la enzima transcriptasa inversa (Superscript ll) por lnvitrogen y se realizaron las reacciones segun las directrices del fabricante. Se preincubo la mezcla de reaccion para la sintesis de primera hebra excluyendo la enzima durante 10 min. a 65DC en una maquina de PCR (PCR sprint de Hybaid), se enfrio bruscamente en hielo, y entonces se afadio la enzima Superscript ll y se incubo durante 1,5 horas a 42DC en una maquina de PCR.

2.3 Analisis por PCR en tiempo real de ADNc derivado de muestras de heces:

Se realizo el analisis por PCR en tiempo real en una maquina de PCR de Applied Biosystems 7500 usando material de ADNc de 1a hebra diluido 1:10 derivado de cada muestra de heces y la mezcla madre de verde SYBR de Applied Biosystems segun las recomendaciones del fabricante. Se disefaron cebadores para amplificar los siete genes marcadores y el control interno, dando como resultado fragmentos que oscilaban entre 106-160 pb de tamafo. (Son necesarios

5 fragmentos pequefos yaque los fragmentos de mas de 400 pb tienden a no proporcionar sefales fiables). Usando software proporcionado para su uso con el analisis de PCR en tiempo real (SDS 4.0; ensayo de cuantificacion relativa), se obtuvieron los denominados valores de "delta Ct" para todos los marcadores para cada muestra de heces analizada.

Para este tipo de analisis, se usaron cebadores especiales para PCR en tiempo real que proporcionaron el tamafo de fragmento indicado:

10 Tabla 2.

1.

y-actina 150 pb 5. MMP7 140 pb

2.

SLC6A14 145 pb 6. MAP17 143 pb

3.

SLC26A2 106 pb 7. GlSP 160 pb

4.

GRO1 125 pb 8. vanina 7 144 pb

Entonces se determino el perfil de expresion representando graficamente los valores de delta Ct para cada marcador frente a cada marcador y analizando el grafico (veanse los resultados). 15 Los cebadores, directos e inversos, usados en los experimentos se presentan en la tabla 3. Tabla 3.

Gen

cebador�dnrecoo cebador�nnverso

SLC6A14 SLC26A2 GRO-1

5�-GAG CAA AGA GGT GGA TAT TCT GGC-3� 5�-CAC CTA AAG CT A TTA TGC AGG AGG-3� 5�-CTC CCC AGT CAG GGT ATG GAA TTG-3� 5�-CTC CTC AAT TCA TGA CCT GTG GGC-3� 5�-CAA CAT GAG AAA TGT TGA CCA CAC-3�

MMP-7 MAP17 Reg lV

5�-GCC AAT GAG A TC ATT GTG AAG GCA-3� 5�-CAC T GT TCT TCC ACT CCA TTT AGC-3� 5�-GAC ATC TAC CCA CTG CAA GTA TAG-3� 5�-CCA TCG AAG AGT ACC TTC CAT CTG-3� 5�-CTT TAA ACT CAG GAT AGA TGC CAG-3�

Vanina 1 y-actina

5�-GTT C CT GGT C CT C GT TGC A AT CGC-3� 5�-GGT GA T ATC A TC A TG AGA CCC AGC-3� 5�-GGC ATA GAT CAC TAC TGC AAG TGC-3� 5�-CCA ACT CAA AGC AAG TAA CAG CCC ACG G-3�

5�-CCA ACT GAC TGA TAG AC T C TG AGC-3�

5�-GTG CAG GGG-3�

GGT A TT AA C GTG TCA

Los datos de ARN muestran que GRO-1 y Reg lV son una buena combinacion para la discriminacion de Ell y Sll a nivel de ARN en heces (vease por ejemplo la figura 5). Ademas, los datos de ARN de muestras de sangre muestran que va

20 nina 1 tiene un buen potencial discriminatorio. Los marcadores SLC26A2, MAP-17 y vanina 1 pueden detectarse bien en sangre a nivel de ARN. Los marcadores GRO-1, MMP-7 y ReglV. SLC14A6 pudieron detectarse, pero a un nivel menor, cuando se expresan en sangre a nivel de ARN.

A partir del hecho de que MMP-7, ReglV y GRO-1 son proteinas secretoras, los inventores concluyen que la expresion a nivel de proteina seria mas facil de detectar, y esto podria usarse para confirmar el desempefo de los datos de ARN en sangre.

Respecto al ARN en sangre, debe observarse que la discriminacion de Ell y Sll ya era fiable usando solo un marcador, vanina 1. La AUC era de 0,867.

Ejemplo 3. Extraccion de proteinas

3.1 Extraccion de proteinas a partir de muestras de biopsia

Las muestras de biopsia fijadas obtenidas han de centrifugarse, eliminarse el fijador y lavarse con PBS. Entonces se afadio el tampon de extraccion (fosfatode potasio 100 mM, pH 7,8; DTT 1 mM; PMSF 0,5 mM) yse homogeneizo la muestra usando un homogeneizador Pellet Pestel segun el protocolo del fabricante. Entonces se afadio el 0,1-0,2% de Triton-X-100 y se incubo la mezcla durante 5 min. a 4DC para lisar las celulas. Tras la centrifugacion de 5 min. a 4DC, se transfirio el sobrenadante ( = extracto) a un tubo nuevo y se almaceno el extracto tras congelacion rapida a -80DC hasta su utilizacion.

3.2 Extraccion de proteinas a partir de muestras de heces

Se afadieron tampon de extraccion (fosfato de potasio 100 mM, pH 7,8; DTT 1 mM; PMSF 0,5 mM) y perlas de vidrio a las muestras de heces y se agitaron meticulosamente en vortex. Entonces se afadio el 0,1-0,2% de Triton-X-100 y se incubo durante 5 min. a 4DC para lisar las celulas. Tras la centrifugacion durante 5 min. a 4DC, se transfirio el sobrenadante ( = extracto) a un tubo nuevo y se almaceno el extracto a -80DC hasta su uso

3.3 Extraccion de proteinas a partir de sangre

Al suero congelado, se le afadio la misma cantidad de tampon de extraccion 2x (fosfato de potasio 200 mM, pH 7,8; DTT 2 mM; P MSF 1 mM) m as el 0,2-0,4% de Triton-X-100 y se incubo la mezcl a durante 5 min. a 4DC para lisar las celulas. Tras centrifugacion durante 5 min. a 4DC, se transfirio el sobrenadante ( = extracto) a un tubo nuevo y se congelo rapidamente el extracto y se almaceno a -80DC hasta su utilizacion.

En lugar de extraer las proteinas a partir de la sangre o elsuero, puede usarse directamente el suero para recubrir las placas de ELlSA.

Ejemplo 4. Analisis por inmunotransferencia de tipo Western de las muestras con anticuerpos policlonales

Para cada paciente y muestra, se separo el extracto de proteina (normalizado a 10 !g de proteina total/carril) ocho veces mediante SDS-PAGE desnaturalizante al 12 o el 15% yse transfirio a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (Hybond-P; 0,8 mA/cm2 durante 60 min.; Amersham Pharmacia Biotech) mediante transferencia semiseca usando un aparato de electrotransferencia (Bio-Rad). Entonces se disecciono la membrana en ocho bandas para la reaccion con anticuerpos especificos para las proteinas de PROT. lD. 1-7 y beta-tubulina. Se diluyeron los anticuerpos en tampon de bloqueo. Posteriormente se lavaron las membranas, se incubaron con reactivo de deteccion ECL-Plus y se expusieron a pelicula Hyperfilm ECL (ambos de Amersham Pharmacia Biotech). Se obtuvieron anticuerpos primarios dirigidos contra Reg lV y MMP-7 de Abcam, GRO-1 de RDS y SLC6A14, SLC26A2, MAP-17 y vanina 1 se sintetizaron por proveedores comerciales. Se normaliz aron los co ntenidos de pr oteina mediante hibridacion paralela con un a nticuerpo contra alfa-tubulina. Se expusieron todas las inmunotransferencias de tipo Western a la pelicula durante periodos de tiempo variables, y solo se seleccionaron las peliculas que generaron niveles de intensidad inferiores a la saturacion para la evaluacion densitometrica y estadistica. Se garantizo la linealidad en experimentos independientes usando diferentes cantidades de material y multiples exposiciones a la pelicula (datos no mostrados).

Como control positivo, tambien se analizaron las proteinas recombinantes de PROT . lD. 1-7 (obtenidas de la misma fuente que los anticuerpos) de la misma manera.

Ejemplo 5: Analisis de ELlSA usando anticuerpos policlonales producidos contra las pr oteinas marcadoras

En primer lugar, se recubrieron pocillos con la muestra. En segundo lugar, se recubrieron pocillos de placas de ELlSA con los anticuerpos policlonales especificos frente a las siete proteinas, PROT lD NO 1-7. La tercera etapa fue la deteccion de la presencia de union antigeno-anticuerpo especifica en las muestras.

5.1 Recubrimiento con muestra en los pocillos

Se usaron los extractos de proteina obtenido a partir de muestras de biopsias de colon, heces y sangre como muestras. Para obtener una curva patron para la medicion de valores de punto de corte, se prepararon disoluciones de antigeno patron 1 a 7 con las diluciones A, B, C, D, E, F y G a diversas concentraciones de 0 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml, 80 ng/ml, 160 ng/ml, 320 ng/ml y 640 ng/ml, respectivamente.

Se distribuyeron 100 !l de las muestras de proteina respectivas a una placa de fondo plano de ELlSA de 96 pocillos respetada y se hicieron reaccionar a 37DC durante 4 horas, seguido por el lavado 4 veces con una disolucion de tampon de lavado (PBS que incluia Tween 20 al 0,05%, pH 7,4). En este caso, se usaron las disoluciones de antigeno patron preparadas anteriormente como grupos de control positivoy seusaron suerosde conejos normales como grupos de control negativo.

5.2 Adicion de los anticuerpos policlonales

Se pusieron anticuerpos policlonales especificos frente a las proteinas de PROT. lD 1-7 en cad a pocillo recubierto con las muestras, se cubrieron con una tapa y se permitio que estuvieran en reposo a 4DC durante de 16 a 18 horas. Se diluyeron los anticuerpos policlonales en tampon carbonato 0,5 M (pH 9,6) a una concentracion de 5 !g/ml y se afadieron 100 !l de la disolucion diluida a cada pocillo. Como grupo de control, se diluyo 500 veces el suero de conejo normal que no se infecto con las proteinas, en una disolucion de tampon carbonato y se distribuyo a cada pocillo (100 pl/ pocillo).

Entonces, se lavaron los pocillos de la placa 4 veces con una disolucion de tampon de lavado. Con el fin de bloquear los sitios de union a proteina no especifica , se distribuyo una disolucion de bloqueo (disolucion de tampon PBS (pH 7,4) que contenia un 2% de BSA) a cada pocillo (300 pl/ pocillo) y se permitio que estuviera en reposo a 37DC a las 2 horas.

5.3 Deteccion del complejo antigeno-anticuerpo

Se afadieron 100 !l de una dilucion de 10.000 veces de anticuerpo secundario de cabra anti-lgG de conejo conjugado con peroxidasa del rabano a cada pocillo, y se permitio que la placa estuviera en reposo a 37DC durante 1 hora, seguido por e l l avado 4 vec es co n un a dis olucion d e tamp on de l avado. Po steriormente, se dis olvio 1 mg de 3,3 �,5,5�tetrametilbencidina (TMB) (Sigma Co., EE.UU.) como sustrato en 10 ml de una disolucion de tampon citrato (pH 5,0) y se afadieron al mismo 2 !l de peroxido de hidrogeno al 35%, preparando de ese modo una disolucion de sustrato. Se distribuyeron 100 !l de la disolucion de sustrato preparada a cada pocillo y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 15 minutos sin exposicion a la luz. Posteriormente, se afadieron 50 !l de una disolucion de H2SO4 2 N para detener la reaccion y se midio la absorbancia a 450 nm.

Para cada muestra sometida a prueba con una de las proteinas de PROT. lD 1-7, se dedujo la absorbancia por el antigeno como el resto obtenido restando la absorbancia de los pocillos recubiertos solo con la proteina como grupo de control positivo y PBS como grupo de control negativo de la absorbancia de la muestra.

De la misma manera, tras calcularse los valores de absorbancia de las disoluciones patron, se fijo el valor medio entre los valores de absorbancia de las disoluciones de antigeno patron A y F para cada proteina como un valor de punto de corte. Se identifico la muestra que tenia una absorbancia mayor que el valor de punto de corte como positiva, y se identifico la muestra tenia una absorbancia menor que el valor de punto de corte como negativa.

Basandose en el valor de punto de corte, se compararon los valores de absorbancia de las muestras respectivas para determinar si son positivas o negativas.

Bibliografia

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Claims (15)

1. REIvINDICaCIoNES

   1. Metodo in vitro para la determinacion de perfiles de expresion genica en una muestra tomada de un cuerpo humano en un metodo para la diferenciacion entre enfermedad inflamatoria del intestino (Ell) y sindrome del intestino irritable (Sll) en un paciente, en el que al menos dos genes marcadores se eligen de los siguientes genes y sus correspondientes proteinas:

   Gen: SEQ.lD.NO. N.D DE REG. DE PROTEiNA

   SLC6A14 NM 007231 NP 009162

   SLC26A2 NM 000112 NP 000103

   GRO-1 NM 001511 NP 001502

   MMP-7 BC003635 NP 002414

   MAP-17 NM 005764 NP 005755

   ReglV BC017089 NP 114433

   vanina 1 NM 004666 NP 004657

   y en el que se determinan los niveles de expresion de dichos al menos dos genes y sus correspondientes proteinas para

   obtener un perfil de expresion y en el que el perfil de expresion se compara con los perfiles de expresion de muestras de pacientes con Ell y Sll conocidos.

2. 2.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que se determina el nivel de expresion de los siete marcadores.

3. 3.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que uno de dichos al menos dos marcadores es SLC26A2 y en el que SLC26A2 se expresa a un nivel menor en Ell en comparacion con en Sll.

4. 4.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que uno de dichos al menos dos marcadores es GRO-1 y en el que GRO-1 se expresa a un nivel mayor en Ell en comparacion con en Sll.

5. 5.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha muestra es una de una muestra de heces, sangre, plasma, suero y una muestra de biopsia.

6. 6.

   Metodo segun la reivindicacion 5, en el que la muestra es una muestra de heces y uno de dichos al menos dos marcadores es MAP-17 y en el que MAP-17 se expresa a un nivel menor en Ell en comparacion con en Sll.

7. 7.

   Metodo segun la reivindicacion 5, en el que la muestra es una muestra de heces y uno de dichos al menos dos marcadores es ReglV y en el que ReglV se expresa a un nivel menor en Ell en comparacion con en Sll.

8. 8.

   Metodo segun la reivindicacion 5, en el que dicha muestra es una muestra de heces y dichos al menos dos marcadores son SLC6A14 y GRO-1 yen el que SLC6A14 se expresa a un nivel menor que GRO-1 en Ell y a un nivel mayor que GRO-1 en Sll.

9. 9.

   Metodo segun la reivindicacion 5, en el que dicha muestra es una muestra de heces y dichos al menos dos marcadores son GRO-1 y MAP-17 y en el que GRO-1 se expresa a un nivel mayor que MAP-17 en Ell y a un nivel menor que MAP-17 en Sll.

10. 10.

    Metodosegun la reivindicacion 5, en el que dicha muestra es una muestra de heces y dichos al menos dos marcadores son GRO-1 y ReglV y en el que GRO-1 se expresaa un nivel mayor que ReglV en Ell y a un nivel menor que ReglV en Sll.

11. 11.

    Metodo segun la reivindicacion 5, en el que la muestra es una muestra de sangre y uno de dichos al menos dos marcadores es vanina 1.

12. 12.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que, en un caso en el que se indica Ell, sedetermina el perfil de ex presion de al menos dos de los genes marcadores en una muestra de biopsia y se usa para la diferenciacion entre colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC) y en el que

    SLC6A14 se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC; SLC26A2 se expresa a un nivel menor en CU en comparacion con EC; GRO-1 se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC; MMP-7 se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC;

    MAP-17 se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC; ReglV se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC; y vanina 1 se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC

13. 13.

    Metodo segun la reivindicacion 12, en el que se usa el perfil de expresion genica de al menos dos marcadores para una distincion entre una fase activa y pasiva de colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.

14. 14.

    Metodo segun la reivindicacion 13, en el que dichos al menos dos marcadores son SLC6A14 y GRO-1.

15. 15.

    Metodo segun la reivindicacion 13, en el que dichos al menos dos marcadores son ReglV y vanina 1.